ES2967947T3 - Polímeros de glicano y métodos relacionados de los mismos - Google Patents

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Abstract

En el presente documento se describen composiciones de polímeros de glicano y métodos para fabricarlos y fabricarlos. También se proporcionan métodos para tratar una enfermedad o trastorno con una preparación de polímero de glicano. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Polímeros de glicano y métodos relacionados de los mismos
Antecedentes
La microbiota de los seres humanos es compleja y varía según el individuo dependiendo de la genética, la edad, el sexo, el estrés, la nutrición y la dieta. La microbiota realiza muchas actividades y puede influir en la fisiología del huésped. La modulación de la microbiota intestinal puede alterar la función de la comunidad y la interacción con el huésped. En la técnica se conocen un número limitado de bacterias probióticas y se documenta cierta asociación con beneficios para la salud cuando los seres humanos toman bacterias probióticas. Algunos alimentos se consideran alimentos “prebióticos” y contienen sustancias que pueden promover el crecimiento de ciertas bacterias que se cree que son beneficiosas para el huésped humano. Los resultados de los ensayos clínicos con estas sustancias son contradictorios con respecto a su eficacia y su influencia en la salud humana se describe generalmente como modesta.
Los documentos WO 2016/172657 y WO 2016/122889 se refieren al uso de polímeros de glicano para modular la producción de metabolitos microbianos. El documento WO 2010/129839 se refiere al uso de alfa-(1,6)oligodextrano ramificado en alfa-(1,2) para mejorar la salud de un sujeto o tratar enfermedades relacionadas con el colesterol aumentando el nivel de ácidos grasos de cadena corta. El documento EP 1597978 se refiere al uso de una preparación de polímero de glicano para aumentar los niveles de ácidos grasos de cadena corta y tratar diversos trastornos intestinales.
Por tanto, se necesitan aportaciones novedosas que puedan modular la microbiota y mejorar la salud humana.
Sumario de la invención
La materia de la invención es tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. Cualquier materia que se encuentre fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona con fines de información solo.
Los métodos de tratamiento con una preparación de polímero de glicano o composiciones de la misma se usan indistintamente con una preparación de polímero de glicano o composiciones de la misma para su uso en un método de tratamiento.
Se describen en el presente documento métodos de tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno con una preparación de polímero de glicano, y composiciones de la misma.
En un aspecto, la invención proporciona una preparación de polímero de glicano para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno asociado con un nivel no deseado de un metabolito, en donde el metabolito es trimetilamina (TMA) o N-óxido de trimetilamina (TMAO), y en donde la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste en aterosclerosis, enfermedad cardiovascular, riesgo cardiovascular en VIH, aterosclerosis de la carótida, cardiopatía crónica, insuficiencia cardíaca crónica, enfermedad renal crónica, enfermedad vascular crónica, cáncer colorrectal, cardiopatía coronaria, arteriopatía coronaria (CAD), diabetes (tipo II), enfermedad renal en estadio terminal, VIH, enfermedad inflamatoria del intestino, ataque isquémico, síndrome metabólico, enfermedad de hígado graso no alcohólica (NAFLD), obesidad, síntomas intestinales agudos inducidos por radiación (RIAIS) y accidente cerebrovascular, comprendiendo dicho método:
seleccionar una preparación de polímero de glicano basándose en o con el conocimiento de que modula la producción o el nivel del metabolito, y
administrar una cantidad de la preparación de polímero de glicano eficaz para dar como resultado una modulación del nivel del metabolito, tratando de ese modo la enfermedad o trastorno,
en donde la preparación de polímero de glicano comprende glucosa y al menos un enlace alfa-glicosídico, opcionalmente, en donde el enlace alfa-glicosídico es un enlace alfa-1,3-glicosídico, enlace alfa-1,4-glicosídico, o una combinación de los mismos, y
en donde el grado de polimerización (DP) medio de la preparación es de entre DP3-15.
En una realización, el polímero de glicano es un sustrato para un constituyente microbiano del colon o el intestino.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una curva de SEC representativa entre 16 y 20,5 minutos de una muestra de g lu l00 que muestra el PM promedio y el PM al 10 % de absorción máxima en los bordes tanto delantero como trasero de la curva. La figura 2 es una región anomérica representativa de un espectro de HSQC de 1H-13C de una muestra de glu100 que muestra la distribución de la señal de enlaces glicosídicos alfa y beta.
Las figuras 3A-3C son una región anomérica representativa de un espectro de HSQC de 1H-13C de muestras de glu50gal50 (figura 3A), glu100 (figura 3B) y gal 100 (figura 3C), que demuestran el efecto aditivo de los picos de huellas dactilares.
Las figuras 4A-4C son cromatogramas de GC representativos de tres glicanos permetilados e hidrolizados representativos, glu50gal50 (figura 4A), man52glu29gal19 (figura 4B) y glu100 (figura 4C), que muestran la distribución de regioquímica tal como se asigna mediante comparación con patrones conocidos.
La figura 5 es un gráfico que muestra un perfil de SEC procesado que compara lactosa (gris, beta-galacto-1,4-glucosa) con un glicano preparado mediante el tratamiento de lactosa con beta-galactosidasa tal como se describe en el ejemplo 2 (negro).
La figura 6 es un gráfico que muestra un perfil de SEC procesado que compara celobiosa (gris, beta-gluco-1,4-glucosa) con un glicano preparado mediante el tratamiento de celobiosa con beta-glucosidasa tal como se describe en el ejemplo 4 (negro). El cambio en la intensidad de pico máxima de los materiales DP2 está provocado por la formación de alo-celobiosas (por ejemplo, beta-gluco-1,6-glucosa) que hace que el Mw aparente promedio de los materiales DP2 cambie ligeramente.
Las figuras 7A-7B son gráficos que muestran perfiles de SEC procesados que comparan (figura 7A) maltobiosa (gris, alfa-gluco-1,4-glucosa) con un glicano preparado mediante el tratamiento de maltobiosa con alfaglucosidasa tal como se describe en el ejemplo 5 (negro), y (figura 7B) maltobiosa (gris) con un glicano del ejemplo 18 purificado mediante fermentación de levadura tal como se describe en el ejemplo 9 (negro). Aunque la levadura puede digerir la maltosa, algunos materiales DP2 permanecen debido a trans-glicosilación en la que la maltosa (alfa-gluco-1,4-glucosa) se convierte en alo-maltosas (por ejemplo, alfa-gluco-1,6-glucosa; alfa-gluco-1,3-glucosa) que la levadura digiere menos eficazmente.
La figura 8 es un gráfico que muestra un perfil de SEC procesado que compara melibiosa (gris, alfa-galacto-1,6-glucosa) con un glicano preparado mediante el tratamiento de melibiosa con alfa-galactosidasa tal como se describe en el ejemplo 3 (negro). El cambio en la intensidad de pico máxima de los materiales DP2 está provocado por la formación de alo-melibiosas (por ejemplo alfa-galacto-1,4-glucosa) que hace que el Mw aparente promedio de los materiales DP2 cambie ligeramente.
La figura 9 es una imagen que muestra el análisis de electroforesis de hidratos de carbono asistida por fluoróforo (FACE) de una mezcla de reacción de hidrólisis inversa de glucosa por beta-glucosidasa. El carril 1 es proteína pura, y los carriles 2-4 son reacciones en trimetilfosfato, dimetil éter de dietilenglicol y dimetil éter de tetraetilenglicol respectivamente tal como se describe en el ejemplo 7.
La figura 10 es un gráfico que muestra la comparación de SEC de datos sin procesar de un glicano preparado tratando lactosa con beta-galactosidasa después de 300 minutos con un glicano preparado tratando lactosa con beta-galactosidasa en presencia de d-galactosa después de 1200 minutos (es decir, en conversión máxima a DP>3) tal como se describe en el ejemplo 8. El perfil muestra que la adición de D-galactosa ralentiza la reacción significativamente pero también cambia la distribución de producto hacia cantidades aumentadas de oligosacáridos DP>3
La figura 11 es un gráfico que muestra datos de SEC procesados relacionados con los resultados del fraccionamiento con carbón de un glicano con la intención de eliminar el monómero de una muestra sin fraccionamiento adicional. Las tres curvas representan el glicano original, la fracción de monómero eliminada del original (p.m. del pico aparente -200) mediante disolución de EtOH al 1 % y la fracción restante mediante una elución con EtOH al 50 %.
La figura 12 es una representación esquemática de la síntesis de oligosacáridos por medio de transglicosilación selectiva de sustrato tal como se describe en el ejemplo 6. En cada reacción, la selectividad enzimática para la transglicosilación del monómero de extremo no reductor conduce a mezclas distintas de productos. En este diagrama, “A” y “B” podrían representar diferentes monómeros, diferentes estereoquímicas del enlace glicosídico, diferentes regioquímicas del enlace glicosídico, o cualquier combinación de los mismos.
La figura 13 es un gráfico que muestra una curva de SEC de un glicano preparado tratando lactosa con betagalactosidasa después de 300 minutos tal como se describe en los ejemplos 11-18.
La figura 14 es un gráfico que muestra una curva de SEC de un glicano preparado tratando lactosa con betaglucosidasa después de 300 minutos tal como se describe en los ejemplos 11-18.
La figura 15 es un gráfico que muestra los genomas totales anotados y usados en el análisis genómico del Human Microbiome Project y el porcentaje de genomas por géneros que codifican para cada uno de los metabolitos indicados.
Las figuras 16A-16B son gráficos que muestran el porcentaje de genomas que codifican para familias CAZy significativamente enriquecidas en productores de butirato (P <0,001, suma de rangos de Wilcox, corregido por FDR e identificado en > 10 % de los productores de butirato). (Figura 16A) Porcentaje de productores de butirato y no productores de butirato que codifican para al menos 1 enzima de la familia indicada. (Figura 16B) Porcentaje de productores de butirato y no productores de butirato que codifican para cualquier CAZyme que esté significativamente enriquecida individualmente en productores de butirato.
La figura 17 es un gráfico que muestra las familias más abundantes en los productores de butirato, ordenadas por el recuento génico promedio. El gráfico representa la media /- d. e.
Las figuras 18A-18B son gráficos que muestran el porcentaje de genomas que codifican para familias CAZy significativamente agotados en genomas positivos para TMA-liasa (P <0,05, suma de rangos de Wilcox, corregido por FDR). (Figura 18A) Porcentaje de genomas positivos y negativos para TMA-liasa que codifican para al menos 1 enzima de la familia indicada. (Figura 18B) Porcentaje de genomas positivos y negativos para TMA-liasa que codifican para cualquier CAZyme que esté significativamente agotada en genomas positivos para TMA-liasa.
La figura 19 es un gráfico que muestra las familias más abundantes en genomas negativos para TMA-liasa, ordenadas por el recuento génico promedio. El gráfico representa la media /- d. e.
Las figuras 20A-20B son gráficos que muestran el porcentaje de genomas que codifican para familias CAZy significativamente agotados en genomas positivos para ureasa (P <0,05, suma de rangos de Wilcox, corregido por FDR). (Figura 20A) Porcentaje de genomas positivos y negativos para ureasa que codifican para al menos 1 enzima de la familia indicada. (Figura 20B) Porcentaje de genomas positivos y negativos para ureasa que codifican para cualquier CAZyme que esté significativamente agotada en genomas positivos para ureasa.
La figura 21 es un gráfico que muestra las familias más abundantes en genomas negativos para ureasa, ordenadas por el recuento génico promedio. El gráfico representa la media /- d. e.
Las figuras 22A-22B son gráficos que muestran los resultados del modelo de regresión lineal LASSO de la producción de SCFA en función de la composición de glicanos, permitiendo todos los términos de interacción de 2° orden. Producción de SCFA en un modeloex vivo(figura 22A) y de una comunidad definida (figura 22B). Las figuras 23A-23B son gráficos que muestran la abundancia relativa de una cepa deBacteroides cellulolyticusen una comunidad definida compuesta por 15 cepas, cultivadas en presencia de hidratos de carbono durante 48 horas (figura 23A y figura 23B, círculos negros), o en presencia de los hidratos de carbono indicados con una preparación de polímero de glicano añadida (por ejemplo, Glu100) a las 18 horas (figura 23B, triángulos grises). Se muestra la abundancia relativa promedio ± desv. est.
Las figuras 24A-24B son gráficos que muestran la abundancia relativa de una cepa deBacteroides cellulolyticusen una comunidad definida compuesta por 14 cepas. La figura 24A muestra la abundancia relativa deB. cellulolyticuscultivado en presencia de diversos hidratos de carbono durante 48 horas (círculos negros), o en presencia de los hidratos de carbono indicados conB. cellulolyticusañadido a las 18 horas (triángulos grises). La figura 24B muestra la abundancia relativa deB. cellulolyticuscultivado en la misma comunidad definida compuesta por 14 cepas, en presencia de diversos hidratos de carbono yB. cellulolyticusañadido a las 18 horas (círculos negros), o en presencia de los hidratos de carbono indicados conB. cellulolyticusañadido a las 18 horas y preparación de polímero de glicano añadida (Glu, triángulos grises). Se muestra la abundancia relativa promedio ± desv. est.
Las figuras 25A-25D son gráficos que muestran los resultados del análisis de secuenciación de ARNr 16S para el panel de bacterias examinadas en el ejemplo 23 y la correlación con la producción de butirato. Tal como se muestra, varios taxones están altamente correlacionados con los niveles de butirato. (Figura 25A) Clostridiaceae (rho = 0,406 valor de p 0,003), (figura 25B)Lachnospiraceae roseburia(rho = 0,333 valor de p 0,018), (figura 25C)Bacteroides fragilis(rho = 0,483 valor de p 0), (figura 25D) Turicibacteraceae turicibacter (rho = 0,554 valor de p = 0).
Las figuras 26A-26F son gráficos que muestran los resultados del análisis de secuenciación de ARNr 16S para el panel de bacterias examinadas en el ejemplo 23 y la correlación con la producción de acetato. En el ensayoex vivo,varios taxones están altamente correlacionados con los niveles de acetato. Tal como se muestra, varios taxones están altamente correlacionados con los niveles de acetato. (Figura 26A) Clostridiaceae (rho = 0,428 valor de p = 0,002), (figura 26B)Bacteroides uniformis(rho = 0,525 valor de p = 0), (figura 26C) Ruminococcaceae OsciNospira (rho = -0,791 valor de p = 0), (figura 26D)Bacteroides ovatus(rho = 0,405 valor de p 0,004), (figura 26E) Bacteroidales Rikenellaceae (rho = -0,739 valor de p = 0), (figura 26F) Clostridiales Ruminococcaceae (rho = -0,83 valor de p = 0).
Las figuras 27A-27D son gráficos que muestran los resultados del análisis de secuenciación de ARNr 16S para el panel de bacterias examinadas en el ejemplo 23 y la correlación con la producción de propionato. Tal como se muestra, varios taxones están altamente correlacionados con los niveles de propionato. (Figura 27A)Bacteroides ovatus(rho = 0,678 valor de p 0), (figura 27B)Bifidobacterium(rho = -0,781 valor de p =0), (figura 27C)Ruminococcus bromii(rho = -0,72 valor de p 0), (figura 27D)Bacteroides uniformis(rho = 0,559 valor de p = 0).
Figura 28. Número de genes de CAZyme detectados en bacterias formadoras y no formadoras de esporas (media) para cada familia y subfamilia de CAZyme. Solo se muestran familias donde los genes estaban enriquecidos significativamente en bacterias formadoras de esporas y se detectaron en > 10 % de los genomas bacterianos formadores de esporas (P <0,05, suma de rangos de Wilcox, corregido por FDR).
Figuras 29. Porcentaje de genomas que codifican para familias CAZy enriquecidos significativamente en genomas de bacterias formadoras de esporas frente a bacterias no formadoras de esporas (P <0,001, suma de rangos de Wilcox, corregido por FDR e identificado en > 10 % de formadores de esporas). (A) Porcentaje de bacterias formadoras de esporas y no formadoras de esporas que codifican para al menos 1 enzima de la familia indicada. (B) Porcentaje de bacterias formadoras de esporas y no formadoras de esporas que codifican para cualquier familia o subfamilia CAZyme que está significativamente enriquecida individualmente en bacterias formadoras de esporas.
Las figuras 30A-30H son gráficos que muestran el porcentaje de genomas que codifican para familias CAZy significativamente enriquecidas en genomas convertidores de metabolitos (figuras 30A, 30C, 30E, 30G) y gráficos que muestran las familias más abundantes en genomas convertidores de metabolitos, ordenadas por el recuento génico promedio (figuras 30B, 30D, 30F, 30H). Se representa el porcentaje de: genomas convertidores y no convertidores de ácidos biliares secundarios (figura 30<a>), genomas que codifican para familias CAZy codificados exclusivamente en bacterias no productoras de indol (figura 30C), genomas que codifican para familias CAZy agotadas significativamente en genomas productores de p-cresol (figura 30E) y genomas que codifican para familias CAZy significativamente agotadas en genomas productores de propionato (figura 30G). Se representan gráficos que muestran las familias más abundantes en: genomas convertidores de ácidos biliares secundarios (figura 30B), genomas negativos para indol (figura 30D), genomas negativos para p-cresol (figura 30F) y genomas negativos para propionato (figura 30H). El gráfico representa la media /- d. e.
Las figuras 31A y 31B son gráficos que muestran el crecimiento de la abundancia relativa de bacterias Lachnospiraceae en una comunidadex vivocuando se cultivan en presencia de melibiosa (por ejemplo, melibiosa-1) (figura 31A) o rafinosa (por ejemplo, rafinosa-1) (figura 31B) con alfa-galactooligosacáridos sintetizados por medio de alfa-galactosidasa y o bien melibiosa o bien rafinosa. La figura 31A representa que las enzimas 19 y 20 son alfa-galactosidasas codificadas en genomas bacterianos de Lachnospiraceae y mostraron un enriquecimiento específico para esos taxones (melibiosa-enz19-1 y melibiosa-enz20-1) en comparación con las alfa-galactosidasas que se originaron en otras especies (melibiosa-enz16-1 y melibiosa-enz17-1), que no mostraron el mismo enriquecimiento específico para las bacterias Lachnospiraceae. La figura 31B representa que la enzima 19 es una alfa-galactosidasa codificada en genomas bacterianos de Lachnospiraceae y mostró un enriquecimiento específico para esos taxones (rafinosa-enz19-1) en comparación con una alfa-galactosidasa que se originó en una especie diferente (rafinosa-enz16-1), que no mostró el mismo enriquecimiento específico para las bacterias Lachnospiraceae.
Las figuras 32A-32D son gráficos que muestran el crecimiento de la abundancia relativa de bacterias Bifidobacterium (figura 32A), Bacteroides (figura 32B) y Roseburia (figura 32C) en una comunidadex vivocuando se cultivan en presencia de lactulosa (lactulosa-1) y beta-galactooligosacáridos sintetizados por medio de betagalactosidasa GH42 (enz23) y lactulosa (lactulosa-enz23-1). La enzima 23 es una beta-galactosidasa codificada en el genoma bacteriano de una especie de Bifidobacteria y los beta-galactooligosacáridos sintetizados usando esta enzima (lactulosa-enz23-1) mostraron un enriquecimiento de Bifidobacterium, Roseburia y Bacteroides en comparación con la lactulosa sola. Los beta-galactooligosacáridos GH42 muestran enriquecimiento en glicosidasas GH42 de los genomas de Bacteroides y Firmicute (figura 32D), comensales comunes del microbioma intestinal.
Descripción detallada de la invención
La presente invención presenta, al menos en parte, métodos de tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno (por ejemplo, tal como se describe en el presente documento) con una preparación de polímero de glicano. En un primer aspecto, la invención proporciona una preparación de polímero de glicano para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno asociado con un nivel no deseado de un metabolito, en donde el metabolito es trimetilamina (TMA) o N-óxido de trimetilamina (TMAO), y en donde la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste en aterosclerosis, enfermedad cardiovascular, riesgo cardiovascular en VIH, aterosclerosis de la carótida, cardiopatía crónica, insuficiencia cardíaca crónica, enfermedad renal crónica, enfermedad vascular crónica, cáncer colorrectal, cardiopatía coronaria, arteriopatía coronaria (CAD), diabetes (tipo II), enfermedad renal en estadio terminal, VIH, enfermedad inflamatoria del intestino, ataque isquémico, síndrome metabólico, enfermedad de hígado graso no alcohólica (NAFLD), obesidad, síntomas intestinales agudos inducidos por radiación (RIAIS) y accidente cerebrovascular,
comprendiendo dicho método:
seleccionar una preparación de polímero de glicano basándose en o con el conocimiento de que modula la producción o el nivel del metabolito, y
administrar una cantidad de la preparación de polímero de glicano eficaz para dar como resultado una modulación del nivel del metabolito, tratando de ese modo la enfermedad o trastorno,
en donde la preparación de polímero de glicano comprende glucosa y al menos un enlace alfa-glicosídico, opcionalmente, en donde el enlace alfa-glicosídico es enlace alfa-1,3-glicosídico, enlace alfa-1,4-glicosídico, o una combinación de los mismos, y
en donde el grado de polimerización (DP) medio de la preparación es de entre DP3-15.
En unas realizaciones, la preparación de polímero de glicano se selecciona basándose en que modula un nivel no deseado de un metabolito, en donde el metabolito es trimetilamina (TMA) o N-óxido de trimetilamina (TMAO). El nivel no deseado de metabolito puede ser demasiado alto o demasiado bajo. En algunas realizaciones, el metabolito está asociado con un efecto deseado (por ejemplo, beneficioso) sobre la salud del sujeto. En otras realizaciones, el metabolito está asociado con un efecto no deseado (por ejemplo, perjudicial) sobre la salud del sujeto. En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento incluyen aumentar un metabolito. En otras realizaciones, los métodos incluyen disminuir un metabolito. En algunas realizaciones, el metabolito es un metabolito microbiano (por ejemplo, bacteriano). En algunas realizaciones, se modula un primer metabolito (por ejemplo, producido por los taxones A) para modular un segundo metabolito (por ejemplo, producido por los taxones B). En algunas realizaciones, el segundo metabolito está asociado con una enfermedad o trastorno. El nivel no deseado de metabolito puede producirse en cualquiera parte del cuerpo de un sujeto (por ejemplo, el tracto GI, incluido el colon y los intestinos, la materia fecal, la sangre, el cerebro, el sistema nervioso, un órgano, incluido el corazón, el hígado y los riñones, la orina, y otra parte). En algunas realizaciones, se modula la producción de metabolitos de la microbiota (por ejemplo, en el intestino) y tiene un efecto local sobre los niveles del metabolito (por ejemplo, una disminución o un aumento local del metabolito). En algunas realizaciones, se modula la producción de metabolitos de la microbiota (por ejemplo, en el intestino) y tiene un efecto sistémico sobre los niveles del metabolito (por ejemplo, una disminución o un aumento sistémico del metabolito). En algunas realizaciones, la modulación de un primer metabolito (por ejemplo, metabolito A, por ejemplo, en el intestino) conduce a una modulación de un segundo metabolito (por ejemplo, metabolito B, por ejemplo, en un sitio del cuerpo distinto del intestino). En algunas realizaciones, se administran preparaciones de polímeros de glicano a sujetos que lo necesitas, en donde los polímeros de glicano son sustratos (por ejemplo, sustratos preferidos) para una maquinaria de glicosidasa específica de una clase de productores de metabolitos microbianos. En algunas realizaciones, se administran preparaciones de polímeros de glicano a sujetos que lo necesitan, en donde los polímeros de glicano son sustratos (por ejemplo, sustratos preferidos) para una maquinaria de glicosidasa específica de una clase de no productores de un metabolito microbiano. En algunas realizaciones, se modula el equilibrio (por ejemplo, la abundancia relativa de taxones microbianos en un sitio del cuerpo, tal como, por ejemplo, el intestino) de productores de metabolitos con respecto a no productores de metabolitos para modular los niveles de metabolitos producidos por el sitio. En algunas realizaciones, la modulación del equilibrio de productores con respecto a no productores para modular los niveles de metabolitos tratar una enfermedad o trastorno que está asociado con una desregulación del metabolito. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una disbiosis del sitio, tal como el intestino. Se proporcionan además en el presente documento preparaciones de polímeros de glicano que son sustratos (por ejemplo, sustratos preferidos) de productores o no productores de metabolitos microbianos. En algunas realizaciones, las preparaciones de polímeros de glicano se adaptan al perfil de enzima glicosidasa de unos taxones microbianos o productores o no productores de metabolitos, respectivamente, es decir, los polímeros de glicano son sustratos (por ejemplo, sustratos preferidos) de las glicosidasas presentes en el genoma del productor o no productor. En algunas realizaciones, las glicosidasas están enriquecidas o son exclusivas de una clase (por ejemplo, el productor de metabolitos) con respecto a la otra clase (por ejemplo, el no productor). Se proporcionan además en el presente documento coformulaciones (por ejemplo, simbióticos) de polímeros de glicano adaptados y taxones microbianos con un repertorio de glicosidasas (perfil de glicosidasas) capaz de usar (preferentemente) los polímeros de glicano como sustrato. En algunas realizaciones, las coformulaciones se usan para aumentar el injerto de taxones microbianos en un sitio microbiano, tal como, por ejemplo, el intestino.
Los polímeros de glicano descritos en el presente documento pueden adaptarse para dirigirse a un microbio intestinal particular, por ejemplo, un microbio intestinal humano. En algunas realizaciones, se seleccionan enzimas glicósido hidrolasa (glicosidasa) para adaptar un polímero de glicano a un microbio particular. En algunas realizaciones, se determina el perfil de glicósido hidrolasa (glicosidasa) de un microbio y se adapta un polímero de glicano al mismo, por ejemplo, usando (por ejemplo,in vitro)una o más glicósido hidrolasa (glucosidasa) así identificadas para producir una preparación de polímero de glicano en condiciones que son adecuadas para producir polímeros de glicano. Las glicósido hidrolasas pueden aislarse (y opcionalmente inmovilizarse, por ejemplo, sobre un sustrato adecuado). En algunas realizaciones, las glicósido hidrolasas pueden extraerse de un microbio (por ejemplo, un extracto microbiano que comprende glicósido hidrolasas). En algunas realizaciones, pueden usarse células microbianas (por ejemplo, bacterias) que comprenden glicósido hidrolasas en su superficie y/o intracelularmente). En algunas realizaciones, pueden usarse sobrenadantes que comprenden glicósido hidrolasas (por ejemplo, de cultivos microbianos). En algunas realizaciones, el perfil de glicósido hidrolasa (glicosidasa) de un microbio particular no se conoce o no se ha determinado, pero se usan enzimas derivadas del microbio (por ejemplo, en forma aislada, extraída, de célula completa, de sobrenadante, etc.) para producir los polímeros de glicano en los métodos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, las preparaciones de polímeros de glicano producidas tal como se describe en el presente documento son sustratos específicos para un microbio particular (o un grupo de microbios, por ejemplo, un grupo de microbios con un perfil de glicosidasas comparable o similar) y su maquinaria de glicosidasa. En algunas realizaciones, las preparaciones de polímeros de glicano se fermentan específicamente por el microbio o grupo de microbios, por ejemplo, en el tracto GI de un sujeto humano (por ejemplo, los polímeros de glicano se fermentan a una velocidad más rápida o en mayor grado en comparación con otro microbio (o grupo de microbios), por ejemplo, con un perfil de glicosidasas diferente). En algunas realizaciones, las preparaciones de polímeros de glicano confieren una ventaja de crecimiento al microbio particular. En algunas realizaciones, los polímeros de glicano pueden utilizarse para modular la producción de un metabolito microbiano, por ejemplo, un metabolito producido por el microbio particular, o un metabolito microbiano que no produce el microbio particular. En este último caso, el microbio particular puede competir con otro microbio, uno que produce un metabolito microbiano no deseado, y la competencia exitosa por el microbio particular puede conducir a niveles más bajos del metabolito microbiano. En algunas realizaciones, los polímeros de glicano pueden usarse para promover el injerto en la microbiota de un sujeto (por ejemplo, la microbiota intestinal, por ejemplo, la microbiota colónica) de un microbio particular que se administra a un sujeto que necesita el injerto. En algunas realizaciones, los polímeros de glicano confieren una ventaja de crecimiento al microbio particular que le permite competir exitosamente por, por ejemplo, espacio y nutrientes, para injertarse más exitosamente en la microbiota existente del sitio de injerto (por ejemplo, el intestino).
Definiciones
La presente invención se describirá con respecto a realizaciones particulares y con referencia a ciertas figuras, pero la invención no se limita a las mismas sino únicamente por las reivindicaciones. Los términos expuestos a continuación en el presente documento generalmente deben entenderse en su sentido común a menos que se indique lo contrario.
“Abundancia” de un taxón microbiano tal como se usa en el presente documento es un término relativo y se refiere a la presencia relativa de un taxón microbiano con respecto a otros taxones en una comunidad en un nicho microbiano definido, tal como el tracto GI, o en todo el organismo huésped (por ejemplo, un modelo de enfermedad humano o de animal de laboratorio).
“Adquirir” o “adquisición”, tal como se usan los términos en el presente documento, se refiere a obtener posesión de un valor, por ejemplo, un valor numérico, una imagen o una entidad física (por ejemplo, una muestra), “adquiriendo directamente” o “adquiriendo indirectamente” el valor o la entidad física. “Adquirir directamente” significa realizar un proceso (por ejemplo, realizar un método o protocolo de síntesis o analítico) para obtener el valor o la entidad física. “Adquirir indirectamente” se refiere a recibir el valor o la entidad física de otra parte o fuente (por ejemplo, un laboratorio externo que adquirió directamente la entidad física o el valor). Adquirir directamente un valor o entidad física incluye realizar un proceso que incluye un cambio físico en una sustancia física o el uso de una máquina o dispositivo. Los ejemplos de adquisición directa de un valor incluyen la obtención de una muestra de un sujeto humano. Adquirir directamente un valor incluye realizar un proceso que usa una máquina o dispositivo, por ejemplo, un espectrómetro de RMN para obtener un espectro de RMN.
“Distinto”, tal como se usa en el presente documento, por ejemplo, con referencia a una especie en un polímero de glicano, pretende indicar que es química y/o estructuralmente diferente de otro. Por ejemplo, dos azúcares son “distintos” si son químicamente diferentes, por ejemplo, una fucosa y una xilosa, o estructuralmente diferentes, por ejemplo, cíclico frente a acíclico, forma L frente a D. Dos dímeros son distintos si consiste en los mismos dos monómeros pero un par contiene un enlace alfa-1,4 y el otro contiene un enlace beta-1,6. Las entidades distintas pueden tener cualquier otra característica o propiedad distintiva adecuada que puede detectarse mediante métodos conocidos en la técnica y/o descritos en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, un “régimen de dosificación”, “régimen de dosis” o “régimen de tratamiento” es una modalidad de administración de fármacos que logra un objetivo terapéutico. Un régimen de dosificación incluye la definición de uno, dos, tres o cuatro de: una vía de administración, una dosis unitaria, una frecuencia de dosificación y una duración del tratamiento.
“Disbiosis” se refiere a un estado desequilibrado de la microbiota, por ejemplo, dentro del tracto GI, en el que la diversidad normal, la proporción de un primer taxón bacteriano con respecto a un segundo taxón bacteriano y/o la función (por ejemplo, la producción de un metabolito) de la red ecológica se ve alterada o perturbada. Este estado no deseado, por ejemplo, enfermizo, puede deberse a varios factores que incluyen, pero no se limitan a, una disminución o un aumento en la diversidad de la microbiota (por ejemplo, taxones bacterianos), el sobrecrecimiento de uno o más patógenos o patobiontes o el cambio a una comunidad microbiana ecológica que ya no proporciona una función esencial al sujeto huésped y, en una realización, por tanto ya no promueve la salud o que está asociada con síntomas no deseados en el sujeto. En una realización, la producción de un metabolito se modula para contribuir al desarrollo de una enfermedad o trastorno.
Por los términos “cantidad eficaz” y “cantidad terapéuticamente eficaz” de una composición (tal como, por ejemplo, una composición farmacéutica) o un agente farmacológico, quiere decirse una cantidad suficiente de la composición o agente para proporcionar el efecto deseado. En algunas realizaciones, un médico u otro profesional de la salud decide la cantidad y el régimen de dosificación apropiados. Una cantidad eficaz también se refiere a una cantidad de una composición (tal como, por ejemplo, una composición farmacéutica) o un agente farmacológico que previene el desarrollo o la recaída de una afección médica.
“Injerto microbiano” o simplemente “injerto” se refiere al establecimiento (por ejemplo, crecimiento) de taxones microbianos en un nicho objetivo (por ejemplo, el intestino humano, tal como el colon o los intestinos) que o bien están subrepresentados (por ejemplo, en relación con un sujeto de referencia sano) o bien ausentes (por ejemplo, indetectables) en un sujeto humano antes del injerto (por ejemplo, administrando los taxones microbianos al sujeto, por ejemplo, en forma de un simbiótico descrito en el presente documento). Los taxones microbianos injertados pueden establecerse durante un período transitorio o demostrar estabilidad a largo plazo en la microbiota que puebla el sujeto después del injerto de los taxones microbianos. En algunas realizaciones, los taxones microbianos injertados pueden inducir un cambio ambiental en el nicho objetivo que representa un cambio de una disbiosis a un estado de salud.
“Fructooligosacárido” o “FOS”, tal como se usan los términos en el presente documento, se refieren a un polímero de fructosa, que comprende opcionalmente glucosa terminal, de la siguiente secuencia: (Fru)n-Glc que consiste en uno o más de: enlaces glicosídicos beta 2,1, beta 2,6, alfa 1,2 y beta-1,2, en donde n normalmente es 3-10. Las variantes incluyen uniones de tipo inulina p-1,2 y de tipo levano p-2,6 entre unidades de fructosilo en la cadena principal. En una realización, el FOS se prepara mediante un método descrito en cualquiera de las referencias 8,24,25, 61,67,69, 72,170 o 176-186, o 21,29, 170, 176 o 222 de Meyer, Biotechnological Production of Oligosaccharides - Applications in the Food Industry, capítulo dos, Food technology and Industry, 2015, (Meyer 2015). En una realización, el FOS es un FOS descrito en Sangeethaet al.,o preparado mediante un método descrito en Sangeethaet al.2005, 2014 encontrado en Diez-Municioet al.,2014, Synthesis of novel bioactive lactose-derived oligosaccharides by microbial glycoside hydrolases, 2014, Microbial Biotecnhology, 7:315-313 (Diez-Municioet al.2014). En una realización, el FOS se prepara a partir de una enzima deB. macerans, Z. mobilis, L. reutri, A. niger, A. japónicas, A. foetidus, A. sydowi, b A. Pullans, C. purpurea, F. oxysporum P. citrinum, P. frecuentens, P. spinulosum, P. rigulosum, P. parasítica, S. brevicaulis, S. cerevisiaeoK. marxianus.En unas realizaciones, se produce FOS mediante la acción enzimática de una fructosiltransferasa, pfructofuranosidasa (EC 3.2.1.26), inulosuscrasa (EC 2.4.1.9), levansucrasa (EC 2.4.1.10) o endoinulinasa.
“Galactooligosacárido” o “GOS”, tal como se usan los términos en el presente documento, se refieren a una mezcla de sustancias producidas a partir de lactosa, con de dos a ocho unidades de sacárido, en la que una de las unidades es una glucosa terminal y las unidades restantes son galactosa y disacáridos que comprenden dos unidades de galactosa. En una realización, GOS es una mezcla de oligómeros de galactopiranosilo (DP= 3-8) unidos principalmente por enlaces p-(1,4) o p-(1,6), aunque también pueden estar presentes bajas proporciones de uniones p(1,2) o p-(1,3). Los residuos de glucosilo terminales están unidos mediante enlaces P-(1,4) a unidades de galactosilo. GOS se sintetiza mediante la acción inversa de p-galactosidasas (EC 3.2.1.23) sobre la lactosa en concentraciones relativamente altas de lactosa. En una realización, se sintetiza GOS mediante la acción enzimática de una p-galactosidasa deBifidobacterium,por ejemplo,Bifidobacterium longum, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces marxianus, Aspergillus sp.,por ejemplo,Aspergillus oryzae, Escherichia coliK-12,Bacillus circulans, Lactobacillus bulgaricus, S. singularis, S. thermophilesoC. laurentii.En una realización, GOS es un GOS dado a conocer o preparado mediante un método descrito en cualquiera de las referencias 8,105, 196-206 o 105,120, 198, 202-205 o 223-227 de Meyer 2015. En una realización, Go S es un GOS descrito en o preparado mediante un método descrito en Panesaret al.2006 o Torreset al2010, 2014 encontrado en Diez-Municioet al.2014.
“Glucooligosacárido” o “GLOS”, tal como se usan los términos en el presente documento, se refieren a un polímero de subunidades de glucosa. Las principales uniones en GLOS son (Glc)n [a(1^2), a(1^3), a(1^4) y a(1^6)]. En una realización, GLOS se prepara con dextransacarasa (EC 2.4.1.5). En una realización, pueden usarse enzimas de bacterias(L. mesenteroides; L. citreum)para producir GLOS. En una realización, GLOS es un GLOS descrito en, o preparado mediante un método descrito en, cualquiera de las referencias Remaudet al.,1992, Chung y Day, 2002 o Kimet al.,2014 encontrado en Diez-Municioet al.,2014, Synthesis of novel bioactive lactose-derived oligosaccharides by microbial glycoside hydrolases, 2014, Microbial Biotecnhology, 7:315-313.
Tal como se usa en el presente documento, una “preparación de polímero de glicano” (también denominada “preparación de polímeros de glicano”, “preparación de glicano” o “polímero de glicano”) es una preparación que comprende polímeros de glicano que presenta un efecto deseado (por ejemplo, un efecto terapéutico). En algunas realizaciones, las preparaciones de polímeros de glicano no contienen uno o más oligosacáridos que se producen de manera natural, que incluyen: gluccooligosacárido, mananooligosacárido, inulina, lichnosa, maltotretraosa, nigerotetraosa, nistosa, sesemosa, estaquiosa, isomaltotriosa, nigerotriosa, maltotriosa, melezitosa, maltotriulosa, rafinosa, kestosa, fructooligosacárido, 2'-fucosillactosa, galactooligosacárido, glicosilo, idraparinux, isomaltooligosacárido, maltodextrina, xilooligosacárido, agar, agarosa, ácido algínico, ácido algurónico, alfa-glicano, amilopectina, amilosa, arabioxilano, betaglucano, callosa, capsulano, carragenina, celodextrina, celulina, celulosa, quitina, nanofibrillas de quitina, complejo de quitina-glucano, quitosano, crisolaminarina, curdlano, ciclodextrina, alfa-ciclodextrina, dextrano, dextrina, almidón dialdehído, ficoll, fructano, fucoidano, galactoglucomanano, galactomanano, galactosaminogalactano, goma gellan, glucano, glucomanano, glucoronoxiland, glicocálix, glucógeno, hemicelulosa, hipromelosa, icodextrina, kefirano, laminarina, lentinano, polisacárido de levano, liquenina, manano, mucílago, goma natural, paramilón, ácido péctico, pectina, pentalmidón, fitoglucógeno, pleurano, poligeenano, polidextrosa, porfirano, pululano, esquizofilano, sefarosa, sinistrina, sizofirano, sugammadex, goma welan, goma xantham, xilano, xiloglucano, zimosano y similares. En algunas realizaciones, un polímero de glicano existe como una sal, por ejemplo, una sal farmacéuticamente aceptable.
Una “subunidad de glicano”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la unidad individual de una especie de glicano dada a conocer en el presente documento, por ejemplo, los bloques de construcción a partir de los cuales se prepara la especie de glicano. En una realización, una subunidad de glicano es un monómero. En una realización, una subunidad de glicano es un dímero. En una realización, una subunidad de glicano es un monosacárido. En una realización, una subunidad de glicano es un disacárido. En algunas realizaciones, la subunidad de glicano es un hidrato de carbono y puede seleccionarse de un alcohol de azúcar, un ácido graso de cadena corta, un ácido de azúcar, un iminoazúcar, un desoxiazúcar y un aminoazúcar. En algunas realizaciones, la subunidad de glicano es eritrosa, treosa, eritulosa, arabinosa, lixosa, ribosa, xilosa, ribulosa, xilulosa, alosa, altrosa, galactosa, glucosa, gulosa, idosa, manosa, talosa, fructosa, psicosa, sorbosa, tagatosa, fucosa, fuculosa, ramnosa, manoheptulosa, sedoheptulosa y similares. En algunas realizaciones, la subunidad de glicano es glucosa, galactosa, arabinosa, manosa, fructosa, xilosa, fucosa o ramnosa. En unas realizaciones, un glicano comprende subunidades de glicano distintas, por ejemplo, un primer y un segundo monosacárido, o un primer y un segundo disacárido. En unas realizaciones, un glicano comprende subunidades de glicano distintas, por ejemplo, una primera, una segunda, una tercera, una cuarta y/o una quinta subunidad de glicano distinta.
Tal como se usa en el presente documento, “una molécula de enzima glicosidasa” comprende un polipéptido que conserva o tiene una actividad de la enzima glicosidasa, por ejemplo, conserva o tiene al menos aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 99,9 % de la tasa de recambio de la enzima glicosidasa, o conserva o tiene al menos aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 99,9 % de la especificidad de la enzima glicosidasa, o conserva o tiene al menos aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 99,9 % de la afinidad por una subunidad de glicano de la enzima glicosidasa. En algunas realizaciones, una molécula de enzima glicosidasa comprende un polipéptido que tiene una actividad de la enzima glicosidasa que es al menos aproximadamente el 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 300 %, 400 % o 500 % de la tasa de recambio de la enzima glicosidasa o tiene al menos el 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 300 %, 400 % o 500 % de la afinidad por una subunidad de glicano de la enzima glicosidasa. En algunas realizaciones, la molécula de enzima glicosidasa es un fragmento (por ejemplo, un fragmento activo) de la enzima glicosidasa. En algunas realizaciones, la molécula de enzima glicosidasa difiere en al menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100 o más residuos de aminoácido en comparación con la enzima glicosidasa. En algunas realizaciones, la molécula de enzima glicosidasa comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100 mutaciones de aminoácidos (por ejemplo, deleciones, adiciones o sustituciones) en comparación con la enzima glicosidasa.
Las “enzimas glicosidasas” tal como se usan en el presente documento incluyen glicosidasas (también denominadas “glicósido hidrolasa” (GH)), glicosiltransferasas (GT) y lisasas.
Tal como se usa en el presente documento, “glicotaxones” se refieren a microbios bacterianos (por ejemplo, microbios intestinales humanos) agrupados según la presencia o ausencia (por ejemplo, falta de) una función metabólica (por ejemplo, enzimática). En algunas realizaciones, los taxones pueden agruparse según la función enzimática CAZy glicosidasa/glicohidrolasa (GH) o CAZy glicosiltransferasa (GT). En algunas realizaciones, los taxones bacterianos pueden pertenecer a cualquiera de glicotaxones clase 1, glicotaxones clase 2, glicotaxones clase 3, glicotaxones clase 4, glicotaxones clase 5, glicotaxones clase 6 o glicotaxones clase 7. En algunas realizaciones, los glicotaxones clase 1 contienen los taxones bacterianos que contienen los genesbuty/obuk.En algunas realizaciones, los glicotaxones clase 2 contienen taxones bacterianos negativos para el gencutC.En algunas realizaciones, los glicotaxones clase 3 contienen taxones bacterianos negativos para el genureasa.En algunas realizaciones, los glicotaxones clase 4 excluyen una o más enzimas asociadas a la producción de propionato elegidas de propionato cinasa, propionato CoA-transferasa, propionato-CoA ligasa, propionil-CoA carboxilasa, metilmalonil-CoA carboxi transferasa, (S)-metilmalonil-CoA descarboxilasa, metilmalonatosemialdehído deshidrogenasa y propanal deshidrogenasa. En algunas realizaciones, los glicotaxones clase 5 contienen enzimas asociadas a la producción de ácidos biliares (por ejemplo, producción de ácidos biliares secundarios) elegidas de 7alfa-hidroxiesteroide deshidrogenasa, 12alfa-hidroxiesteroide deshidrogenasa, 7betahidroxiesteroide deshidrogenasa (NADP+), 2beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa, 3beta-hidroxicolanato 3-deshidrogenasa (NAD+), 3alfa-hidroxicolanato deshidrogenasa (NADP+), 3beta-hidroxicolanato 3-deshidrogenasa (NADP+), 3alfa-hidroxiácido biliar-CoA-éster 3-deshidrogenasa, 3alfa-hidroxicolanato deshidrogenasa (NAD+), ácido biliar CoA-transferasa, 7alfa-deshidratasa de ácidos biliares y CoA ligasa de ácidos biliares. En algunas realizaciones, los glicotaxones clase 6 excluyen una o más enzimas asociadas a la producción de indol (por ejemplo, triptofanasa). En algunas realizaciones, los glicotaxones clase 7 excluyen una o más enzimas asociadas a la producción de p-cresol elegidas de 4-hidroxifenilacetato descarboxilasa y aldehído ferredoxina oxidorreductasa.
“Isomaltooligosacárido” o “IMOS”, tal como se usan los términos en el presente documento, se refieren a una mezcla de oligosacáridos con residuos de glucosa predominantemente unidos en a-(1,6) con un grado de polimerización (DP) que oscila entre 2-6, y oligosacáridos con una mezcla de enlaces glicosídicos a-(1,6) y ocasionalmente a-(1,4), tales como panosa. En una realización, IMOS comprende residuos de glucosilo unidos a maltosa o isomaltosa mediante enlaces glicosídicos a-(1,6). En una realización, se produce un IMOS usando almidón como materia prima. En una realización, se produce a partir de almidón de maíz y consiste en isomaltosa, isomaltriosa y panosa. En una realización, IMOS es el producto de una reacción de transferencia enzimática, usando una combinación de enzimas inmovilizadas en donde el almidón se licua usando a-amilasa (EC 3.2.1.1) y pululanasa (EC 3.2.1.41), y, en una segunda fase, la producto intermedio se procesa mediante tanto p-amilasa (EC 3.2.1.2) como a-glucosidasa (EC 3.2.1.20). La beta-amilasa hidroliza en primer lugar el almidón licuado a maltosa. La actividad transglucosidasa de la a-glucosidasa produce entonces mezclas de isomaltooligosacáridos que contienen oligosacáridos con residuos de glucosa unidos tanto en a-(1,6) como en a-(1,4). En una realización, IMOS es un IMOS descrito en, o preparado mediante un método descrito en, cualquiera de las referencias 2, o 217-219 o 12, 152, 159 o 236 de Meyer 2015. En una realización, IMOS es un IMOS descrito en, o preparado mediante un método descrito en Panesaret al.2006 o Torreset al2010, 2014 encontrado en Diez-Municioet al.,2014. En una realización, se sintetiza IMOS mediante la hidrólisis enzimática de almidón por una a-amilasa o pululanasa; o una p-amilasa y a-glucosidasa en secuencia. En una realización, j” [ ’ ]
se sintetiza IMOS mediante una enzima deA. niger, Bacillus spp., B. subtilis, stearothermophilus, T. maritime, A. carbonariousoL. mesenteroides.
Tal como se usa en el presente documento, una preparación de polímero de glicano “aislada” o “purificada” es sustancialmente pura y está libre de contaminantes, por ejemplo, patógenos, enzimas o material biológico por lo demás no deseado, o compuestos orgánicos o inorgánicos tóxicos o por lo demás no deseados. En algunas realizaciones, los compuestos, composiciones o preparaciones puros o aislados pueden contener trazas de disolventes y/o sales (tal como menos del 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, menos del 0,5 % o el 0,1 % en p/p, p/v, v/v o % molar). Los compuestos purificados son o preparaciones contienen al menos aproximadamente el 60 % (en p/p, p/v, v/v o % molar), al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 % en p/p, p/v, v/v o % molar del/de los compuesto(s) de interés. Por ejemplo, una preparación purificada (sustancialmente pura) o aislada de polímeros de glicano es una que tiene al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o 100 % del polímero de glicano en p/p, p/v, v/v o % molar (por ejemplo, sin incluir ningún disolvente, tal como, por ejemplo, agua, en el que la preparación de polímero de glicano puede disolverse) y separada de los componentes que lo acompañan, por ejemplo, durante la fabricación, extracción/purificación y/o procesamiento (por ejemplo, de manera que el polímero de glicano esté sustancialmente libre de compuestos no deseados). La pureza puede medirse mediante cualquier método convencional apropiado, por ejemplo, mediante cromatografía en columna (por ejemplo, cromatografía de exclusión molecular (SEC)), cromatografía en capa fina (TLC), cromatografía de gases (GC), cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) o espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN). Purificado o pureza también puede definir un grado de esterilidad que es seguro para la administración a un sujeto humano, por ejemplo, que carece de agentes infecciosos o tóxicos viables.
“Microbioma”, tal como se usa en el presente documento, se refiere al contenido genético de las comunidades de microbios (“microbiota”) que viven en y sobre un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano), tanto de manera sostenible como transitoria, incluidos eucariotas, arqueas, bacterias y virus (incluidos virus bacterianos (por ejemplo, fagos)), en donde el “contenido genético” incluye ADN genómico, ARN tal como ARN ribosómico y ARN mensajero, el epigenoma, plásmidos y todos los demás tipos de información genética. En algunas realizaciones, microbioma se refiere específicamente al contenido genético de las comunidades de microorganismos en un nicho.
“Microbiota”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la comunidad de microorganismos que aparecen (de manera sostenible o transitoria) en y sobre un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano), incluidos eucariotas, arqueas, bacterias y virus (incluidos virus bacterianos, por ejemplo, fagos). En algunas realizaciones, microbiota se refiere específicamente a la comunidad microbiana en un nicho.
“Patobiontes” o “patógenos (oportunistas)”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a organismos simbióticos capaces de provocar enfermedades sólo cuando están presentes ciertas condiciones genéticas y/o ambientales en un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano).
Tal como se usa en el presente documento, el término “patógeno” (por ejemplo, “bacterias patógenas”) se refiere a una sustancia, microorganismo o condición que tiene la capacidad de provocar una enfermedad. En ciertos contextos, los patógenos también incluyen microbios (por ejemplo, bacterias) que están asociados con una enfermedad o afección pero para los cuales no se ha establecido o aún no se ha establecido una relación causal (directa). Tal como se usa en el presente documento, el término “patógenos” se refiere a virus, parásitos y bacterias u otros patógenos que pueden provocar infecciones en un sujeto, por ejemplo, un ser humano.
Tal como se usa en el presente documento, una “composición farmacéutica” es una composición o preparación que tiene actividad farmacológica u otro efecto directo en la mitigación, el tratamiento o la prevención de enfermedades, y/o una forma de dosificación terminada o formulación de la misma y es para uso humano. Una composición farmacéutica normalmente se produce en condiciones de buenas prácticas de fabricación (GMP). Las composiciones farmacéuticas pueden ser estériles o no estériles. Si no son estériles, tales composiciones farmacéuticas normalmente cumplen con las especificaciones y criterios microbiológicos para productos farmacéuticos no estériles descritos en la Farmacopea de EE. UU. (USP) o la Farmacopea Europea (EP). Las composiciones farmacéuticas pueden comprender además o pueden coadministrarse con agentes activos adicionales, tales como, por ejemplo, agentes terapéuticos adicionales. Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender, por ejemplo, agentes terapéuticos adicionales, polifenoles, sustancias prebióticas, bacterias probióticas, excipientes, disolventes, portadores farmacéuticamente aceptables o cualquier combinación de los mismos. Cualquier preparación de polímero de glicano descrita en el presente documento puede formularse como una composición farmacéutica.
El término “sujeto” (en algunos casos “paciente”) tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier sujeto humano. El término no indica ninguna edad o género en particular. Los sujetos pueden incluir mujeres embarazadas. Los sujetos pueden incluir un recién nacido (un recién nacido prematuro, un recién nacido a término), un lactante de hasta un año de edad, niños pequeños (por ejemplo, de 1 año a 12 años), adolescentes (por ejemplo, de 13 a 19 años), adultos (por ejemplo, de 20 a 64 años) y adultos mayores (de 65 años o más). Un sujeto no incluye un animal agrícola, por ejemplo, animales de granja o ganado, por ejemplo, ganado vacuno, caballos, ovejas, cerdos, pollos, etc.
Una “disminución sustancial” tal como se usa en el presente documento (por ejemplo, con respecto a un biomarcador o metabolito) es una disminución del 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %. %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,9 % o 100 %.
Un “aumento sustancial” tal como se usa en el presente documento (por ejemplo, con respecto a un biomarcador o metabolito) es un aumento del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 250 %, 300 %, 350 %, 400 %, 450 %, 500 %, 550 %, 600 %, 650 %, 700 %, 750 %, 800 %, 850 %, 900 %, 950 %, 1000 % o más del 1000 %.
El término “sustrato”, tal como se usa en el presente documento en relación con los términos enzima glicosidasa y/o molécula de enzima glicosidasa, se refiere a un polímero de glicano que es el producto de, o tiene la estructura de, un polímero de glicano preparado por una molécula de enzima glicosidasa; y es el sustrato de una enzima glicosidasa, por ejemplo, una glicosidasa expresada en un microbio intestinal humano. En unas realizaciones, la molécula de enzima glicosidasa, en las condiciones de reacción apropiadas, cataliza la polimerización de subunidades de glicano para formar el sustrato, y la enzima glicosidasa, en las condiciones de reacción apropiadas, escinde un enlace entre subunidades de glicano (En unas realizaciones, el mismo enlace formado por la molécula de enzima glicosidasa) del sustrato. En una realización, la molécula de enzima glicosidasa y la enzima glicosidasa tienen la misma secuencia de aminoácidos primaria, por ejemplo, son la misma enzima. En unas realizaciones, el sustrato tiene una o más de las siguientes propiedades:
i) es suficientemente similar a un sustrato que se produce de manera natural de la enzima glicosidasa de modo que la tasa de recambio para el sustrato y la enzima glicosidasa es al menos el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 99 % de la de al menos un sustrato que se produce de manera natural de la enzima glicosidasa. La tasa de rotación puede expresarse, por ejemplo, en cuanto a enlaces glicosídicos escindidos por unidad de tiempo, por ejemplo, por minuto u hora, o tasa de despolimerización del polímero de glicano por unidad de tiempo, por ejemplo, hora o minuto; ii) su constante de unión para la enzima glicosidasa es al menos el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 99%de la de al menos un sustrato que se produce de manera natural de la enzima glicosidasa, y en realizaciones no es más de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 50 o 100 veces mayor que la de al menos un sustrato que se produce de manera natural de la enzima glicosidasa; y iii) su motivo de unión para la enzima glicosidasa, su motivo de unión para la molécula de enzima glicosidasa y al menos un sustrato que se produce de manera natural de la enzima glicosidasa comparten una o más de una subunidad de glicano específica, por ejemplo, un dímero de azúcar específico, un punto de ramificación del azúcar específico, una configuración alfa o beta específica, una regioquímica específica, por ejemplo, una unión 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5- o 1,6; y iv) el sustrato promueve el crecimiento o metabolismo de un microbio intestinal humano que expresa la molécula de enzima.
“Sintético”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto o preparación artificial, tal como una preparación de polímero de glicano, que no se produce de manera natural. En una realización, se usa un catalizador polimérico no enzimático descrito en el presente documento para sintetizar los glicanos de la preparación en condiciones de reacción adecuadas, por ejemplo, mediante una reacción de polimerización que crea oligómeros a partir de subunidades de glicano individuales que se añaden a la reacción. En algunas realizaciones, el catalizador polimérico no enzimático actúa como un agente de hidrólisis y puede romper enlaces glicosídicos. En otras realizaciones, el catalizador polimérico no enzimático puede formar enlaces glicosídicos. En una realización, se usa una molécula de enzima glicosidasa descrita en el presente documento para sintetizar los glicanos de la preparación en condiciones de reacción adecuadas, por ejemplo, mediante una reacción de polimerización que crea oligómeros a partir de subunidades de glicano individuales que se añaden a la reacción. En algunas realizaciones, la molécula de enzima glicosidasa actúa como agente de hidrólisis y puede romper enlaces glicosídicos. En otras realizaciones, la molécula de enzima glicosidasa puede formar enlaces glicosídicos. En una realización, se usa síntesis de oligosacáridos en fase sólida para sintetizar los glicanos de la preparación en condiciones de reacción adecuadas, por ejemplo, mediante una reacción de polimerización que crea oligómeros a partir de subunidades de glicano individuales que se añaden a la reacción. Las preparaciones de polímeros de glicano sintéticos también pueden incluir polímeros de glicano que no están aislados de una fuente natural de oligo o polisacáridos. Debe entenderse que, aunque la preparación de polímero de glicano no esté aislada de una fuente de oligo o polisacárido natural, las subunidades de glicano que constituyen el polímero de glicano pueden aislarse, y a menudo se aíslan, de fuentes naturales de oligo o polisacárido, incluidas las enumeradas en el presente documento, o se sintetizande novo.
Los términos “tratar” y “tratamiento”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a la administración de un agente o composición a un sujeto (por ejemplo, un sujeto sintomático aquejado de una afección, trastorno o enfermedad adverso) para afectar una reducción de la gravedad y/o frecuencia de un síntoma, eliminar un síntoma y/o su causa subyacente, y/o facilitar la mejora o reparación de un daño, y/o prevenir una afección, trastorno o enfermedad adverso en un sujeto asintomático (por ejemplo, un sujeto humano) que es susceptible a una condición, trastorno o enfermedad adverso particular, o que se sospecha que desarrolla o está en riesgo de desarrollar la afección, trastorno o enfermedad.
Un “producto de nutrición terapéutica” es un producto alimenticio que proporciona un efecto terapéutico, o bien cuando se administra solo o bien en combinación con una segunda terapia (por ejemplo, una terapia farmacológica), en cuyo caso proporciona un efecto terapéutico aditivo o sinérgico o alivia o reduce efectos negativos de la segunda terapia (por ejemplo, reducción de efectos secundarios). Un producto de nutrición terapéutico forma parte de una dieta recomendada (por ejemplo, por un médico o dietista u otro experto en dietética, nutrición humana) y la regulación de una dieta (por ejemplo, basándose en la afección médica y las necesidades individuales de un sujeto).
“Xilooligosacárido” o “XOS”, tal como se usan los términos en el presente documento, se refieren a oligómeros de azúcar de unidades de xilosa unidas por p-(1,4). El número de residuos de xilosa varía desde 2 hasta 10, pero consisten principalmente en xilobiosa, xilotriosa y xilotetraosa. También pueden estar presentes arabinofuranosilo, ácido glucopiranosilurónico o su derivado de 4-O-metilo (sustituyentes de 2- o 3-acetilo o fenólicos) y dan como resultado XOS ramificado. En una realización, el XOS es principalmente lineal (XOS unido en P-(1,4) (principalmente xilobiosa, xilotriosa y xilotetraosa), así como algunos oligosacáridos con residuos de arabinosa ramificados. En una realización, se prepara XOS con p-xilanasas de materiales lignocelulósicos. En una realización, el xilano se hidroliza enzimáticamente a xilooligosacáridos mediante una endo-p-1,4-xilanasa (EC 3.2.1.8) o mediante beta-xilosidasa (EC 3.2.1.9). En una realización, se prepara XOS mediante la degradación enzimática de xilanos, por ejemplo, mediante una endo-p-1,4-xilanasa, exo-p-1,4-xilosidasa, aglucuronosidasa, a-L-arabinofuranosidasa, acetilxilano esterasa, esterasa de ácido ferúlico o esterasa de ácido p-cumárico En una realización, XOS es un XOS dado a conocer o preparado mediante un método descrito en cualquiera de las referencias 152, 159, 162, 179, 214-216 o 232 de Meyer 2015. En una realización, XOS es un XOS descrito en o preparado mediante un método descrito en Casci y Rostal, 2006, encontrado en Diez-Municioet al.,2014. En una realización, el XOS se sintetiza mediante una xilanasa de cualquiera deT. reesei, T. harzianu, T. viride, T. koningii, T. longibrachiatum, P. chyrosporium,G. trabeumoA. oryzae.
Cuando el término “que comprende” se usa en la presente descripción y reivindicaciones, no excluye otros elementos. Para los fines de la presente invención, el término “que consiste en” se considera una realización preferida del término “que comprende”. Si a continuación en el presente documento se define que un grupo comprende al menos un cierto número de realizaciones, esto también debe entenderse que da a conocer un grupo que preferiblemente consiste únicamente en estas realizaciones.
Cuando se usa un artículo indefinido o definido para referirse a un nombre singular, por ejemplo, “un”, “una” o “el/la”, esto incluye un plural de ese nombre a menos que se indique específicamente algo más.
Las reivindicaciones y la divulgación que se refieren a métodos de tratamiento o diagnóstico se consideran una divulgación equivalente de realizaciones y reivindicaciones a “compuesto, composición, producto, etc. para uso en ...” o “uso de un compuesto, composición, producto, etc. en la fabricación de un medicamento, composición farmacéutica, composición de diagnóstico, etc. para...” e indica que tales compuestos, composiciones, productos, etc. van a usarse en métodos de diagnóstico o terapéuticos que pueden ponerse en práctica en el cuerpo humano o animal. Si una realización o una reivindicación se refiere por tanto a un “método de tratamiento mediante la administración de un compuesto a un ser humano o animal del que se sospecha que padece una enfermedad”, esto se considera también una divulgación de un “uso de un compuesto en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un ser humano o animal del que se sospecha que padece una enfermedad” o “un compuesto para su uso en el tratamiento de un ser humano o animal del que se sospecha que padece una enfermedad”. Como ejemplo: una referencia a un método de tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno asociado con un nivel no deseado de un metabolito (por ejemplo, un ácido graso de cadena corta (SCFA), amoníaco, trimetilamina (TMA), N-óxido de trimetilamina (TMAO), un soluto urémico, lipopolisacárido (LPS) o un ácido biliar) mediante la administración de una cantidad de una preparación de polímero de glicano se considera una divulgación de (i) una preparación de polímero de glicano para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno asociado con un nivel no deseado de un metabolito (por ejemplo, un ácido graso de cadena corta (SCFA), amoníaco, trimetilamina (TMA), N-óxido de trimetilamina (TMAO), un soluto urémico, lipopolisacárido (LPS) o un ácido biliar) o (ii) uso de una composición de glicano en la fabricación de un medicamento para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno asociado con un nivel no deseado de un metabolito (por ejemplo, un ácido graso de cadena corta (SCFA), amoníaco, trimetilamina (TMA), N-óxido de trimetilamina (TMAO), un soluto urémico, lipopolisacárido (LPS) o un ácido biliar).
Siempre que se haga referencia a un método de tratamiento de un individuo o una población de individuos mediante la administración de, por ejemplo, una composición de glicano como referencia, en una realización preferida, contempla una etapa analítica, de diagnóstico y similares en el curso de tal tratamiento que puede ayudar a determinar, por ejemplo, si un individuo o población será susceptible a un determinado tratamiento debido a su composición de microbioma, si fue exitoso, etc. A modo de ejemplo: una referencia a un método de tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno asociado con un nivel no deseado de un metabolito (por ejemplo, un ácido graso de cadena corta (SCFA), amoníaco, trimetilamina (TMA), N-óxido de trimetilamina (TMAO), un soluto urémico, lipopolisacárido (LPS) o un ácido biliar) mediante la administración de una cantidad de una preparación de polímero de glicano se considera también una divulgación de tal método, en donde, en una realización preferida el sujeto, por ejemplo, (i) se someterá a prueba inicialmente para determinar la naturaleza y el nivel del metabolito antes de comenzar con el tratamiento, (ii) se someterá a prueba la composición de su microbioma para adaptar la administración de la composición de glicano a la composición de la enzima glicosidasa microbiana en el intestino, (iii) se someterá a prueba en el curso del tratamiento para monitorizar el efecto de la administración de la composición de glicano sobre el nivel de metabolito, etc.
Los términos “obtenible por”, “producible por” o similares se usan para indicar que una reivindicación o realización se refiere a un compuesto, composición, producto, etc.per se, es decir, que el compuesto, composición, producto, etc. puede obtenerse o producirse mediante un método que se describe para la fabricación del compuesto, composición, producto, etc., pero que el compuesto, composición, producto, etc. puede obtenerse o producirse también por métodos distintos al descrito. Los términos “obtenido por”, “producido por” o similares indican que el compuesto, composición, producto se obtiene o se produce mediante un método específico mencionado. Debe entenderse que los términos “obtenible por”, “producible por” y similares también dan a conocer los términos “obtenido por”, “producido por” y similares como una realización preferida de “obtenible por”, “producible por” y similares.
Debe entenderse además que la presente divulgación, como realizaciones preferidas, también da a conocer cómo pueden combinarse los aspectos y realizaciones individuales descritos en el presente documento. Por ejemplo, la tabla 3 da a conocer una asociación entre metabolitos y filos y cepas, mientras que la tabla 5 da a conocer una asociación entre metabolitos y enfermedades. Por tanto, el experto en la técnica considerará esta información en conjunto y comprenderá sobre qué microorganismos debe influirse para, por ejemplo, reducir el nivel de un metabolito con el fin de tratar una determinada enfermedad.
Tal como se usan en el presente documento, “homología” e “identidad de secuencia” (usados indistintamente en el presente documento) son medidas de la similitud de una secuencia (por ejemplo, secuencias de aminoácidos o secuencias de ácidos nucleicos) con otra secuencia. Los cálculos de “homología” o “identidad de secuencia” entre dos secuencias (los términos se usan indistintamente en el presente documento) se realizan tal como sigue. Las secuencias se alinean para fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos para una alineación óptima y las secuencias no homólogas pueden descartarse para fines de comparación). La alineación óptima se determina como la mejor puntuación usando el programa GAP en el paquete de software GCG con una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización por hueco de 12, una penalización por extensión de hecho de 4 y una penalización por hueco de desplazamiento de marco de 5. Los residuos de aminoácidos o los nucleótidos en posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes se comparan entonces. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (tal como se usa en el presente documento, la “identidad” de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a “homología” de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias.
Métodos de preparación de polímeros de glicano
Los siguientes aspectos y realizaciones para preparar un polímero de glicano son para fines ilustrativos. Puede producirse una preparación de polímero de glicano usando cualquier método conocido en la técnica. Las composiciones de polímeros de glicano pueden comprender los glicanos descritos en el presente documento, fibras dietéticas, tales como, por ejemplo, FOS (fructo-oligosacárido), otros azúcares (por ejemplo, monómeros, dímeros, tales como, por ejemplo, lactulosa) y alcoholes de azúcar, y opcionalmente otros componentes, tales como, por ejemplo, polifenoles, ácidos grasos, péptidos, micronutrientes, etc., tales como los descritos en el documento WO 2016/172658, “MICROBIOME REGULATORS AND RELATED USES THEREOF”, y microbios, tales como bacterias.
Las preparaciones de glicano describas en el documento WO 2016/122889 “GLYCAN THERAPEUTICS AND RELATED METHODS THEREOF” y el documento WO 2016/172657, “GLYCAN THERAPEUTICS AND METHODS OF TREATMENT”, son adecuadas para su uso en los métodos y las composiciones descritos en el presente documento.
Pueden generarse preparaciones que comprende polímeros de glicano usando un catalizador no enzimático, por ejemplo, el catalizador polimérico descrito en el documento WO 2012/118767, “POLYMERIC ACID CATALYSTS AND USES THEREOF” o mediante otros métodos adecuados. Pueden usarse otros catalizadores de ácido (por ejemplo, catalizadores sólidos). Pueden encontrarse métodos para preparar los catalizadores poliméricos y de soporte sólido descritos en el presente documento en el documento WO 2014/031956, “pOlYMERIC And SOLID-SUPPORTED CATALYSTS, AND METHODS OF DIGESTING CELLULOSIC MATERIALS USING SUCH CATALYSTS”. Los glicanos generados, por ejemplo, usando el catalizador, por ejemplo tal como se describe en el documento WO 2016/007778, “OLIGOSACCHARIDE COMPOSITIONS AND METHODS FOR PRODUCING THEREOF” son adecuados para los métodos y composiciones descritos en el presente documento.
En algunas realizaciones, se preparan polímeros de glicano usando síntesis de oligosacáridos en fase sólida, por ejemplo, usando una variedad de grupos de protección para lograr la síntesis de glicanos. Se describen métodos a modo de ejemplo en “Solid-Phase Oligosaccharide Synthesis and Combinatorial Carbohydrate Libraries”, Peter H. Seeberger y Wilm-Christian Haase, American Chemical Society, 2000; y “Opportunities and challenges in synthetic oligosaccharide and glycoconjugate research”, Thomas J. Boltjeet al.,Nat Chem. 1 de noviembre de 2009; 1(8): 611-622.
En algunas realizaciones, pueden sintetizarse polímeros de glicano usando un catalizador enzimático (por ejemplo, una glicosidasa o glicosiltransferasa, o bien aislada o bien expresada en bacterias), tal como se describe en el presente documento, para sintetizar los glicanos mediante una reacción de polimerización que crea oligómeros a partir de subunidades de glicano individuales que se añaden a la reacción. Se describen métodos a modo de ejemplo en “Synthesis and Purification of Galacto-Oligosaccharides: State of the Art”, Carlos Veraet al.,World J. Microbiol Biotechnol. 2016; 32:197; “Synthesis of Novel Bioactive Lactose-Derived Oligosaccharides by Microbial Glycoside Hidrolases”, Marina Diez-Municioet al.,Microbial Biotechnol. 2014; 7(4), 315-331; y “Methods of Improving Enzymatic Trans-Glycosiltion for Synthesis of Human Milk Oligosaccharide Biomimetics”, Birgitte Zeuneret al.,J. Agric. Food Chem. 2014, 62, 9615-9631, documento WO 2005/003329 “NOVEL GALACTOOLIGOSACCHARIDE COMPOSITION AND THE PREPARATION THEREOF”.
En algunas realizaciones, pueden prepararse preparaciones de glicano usando polímeros de glicano, tales como almidón y otras fibras, tales como fibras dietéticas (tales como las descritas en el presente documento) y sometiéndolos a un catalizador (por ejemplo, un catalizador de ácido, un catalizador sólido o polimérico, un catalizador enzimático) para cambiar una o más propiedades del glicano (o fibra), por ejemplo, el grado de polimerización (por ejemplo, despolimerización), el grado de ramificación (por ejemplo, desramificación) o la distribución de enlaces glicosídicos (por ejemplo, añadiendo nuevos tipos de enlaces glicosídicos o eliminando enlaces existentes). Se describe un método a modo de ejemplo para jarabe de maíz en la publicación de patente estadounidense n.° 2016/0007642, ejemplo 101. Pueden usarse otros métodos, tales como los usados para la preparación de almidón resistente (por ejemplo, descritos en M.G. Sajilataet al.,“Resistant Starch - A Review,” Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety - vol. 5, 2006, y la publicación de patente estadounidense n.° 2006/0257977, “Slowly digestible starch”), tales como, por ejemplo, tratamiento térmico, tratamiento enzimático, tratamiento químico, o una combinación de los mismos, para producir las preparaciones de glicano descritas en el presente documento.
Subunidades de glicano
Los siguientes aspectos y realizaciones de subunidades de glicano son para fines ilustrativos y proporcionan información referente a la preparación de polímero de glicano para su uso en el método de la invención. La presente invención presenta métodos de preparación o métodos de fabricación de una preparación de un polímero de glicano que es un sustrato para un microbio intestinal (por ejemplo, un microbio intestinal humano). Los materiales de partida para dichos métodos son subunidades de glicano que comprenden monómeros de azúcar (por ejemplo, monosacáridos), dímeros de azúcar (por ejemplo, disacáridos), trímeros de azúcar (por ejemplo, trisacáridos), o combinaciones de los mismos.
El material de partida puede comprender un azúcar de furanosa o un azúcar de piranosa. En algunas realizaciones, el material de partida comprende una tetrosa, una pentosa, una hexosa o una heptosa. En algunas realizaciones, el material de partida comprende glucosa, galactosa, arabinosa, manosa, fructosa, xilosa, fucosa y ramnosa. Los materiales de partida de subunidades de glicano pueden estar en su forma o bien L o bien D, en la configuración alfa o beta y/o una forma desoxi, cuando sea aplicable, y cualquier combinación de los mismos. Las subunidades de glicano usadas en los métodos descritos en el presente documento pueden incluir un monosacárido, tal como un monosacárido C5 o un monosacárido C6. En algunas realizaciones, el monosacárido es un monosacárido C5. En algunas realizaciones, el monosacárido es un monosacárido C6. Las subunidades de glicano pueden incluir un disacárido, tal como un disacárido que comprende un monosacárido C5 o un monosacárido C6. En algunas realizaciones, el disacárido comprende un monosacárido C5. En algunas realizaciones, el disacárido comprende dos monosacáridos C5. En algunas realizaciones, el disacárido comprende un monosacárido C6. En algunas realizaciones, el disacárido comprende dos monosacáridos C6. En algunas realizaciones, el disacárido comprende uno de un monosacárido C5 y uno de un monosacárido C6. El material de partida de subunidad de glicano usado en el presente documento puede ser un monosacárido seleccionado de glicoaldehído, glicolaldehído, gliceraldehído, dihidroxiacetona, eritrosa, treosa, eritulosa, arabinosa, lixosa, ribosa, xilosa, ribulosa, xilulosa, alosa, altrosa, galactosa, glucosa, gulosa, idosa, manosa, talosa, fructosa, psicosa, sorbosa, tagatosa, fucosa, fuculosa, ramnosa, manoheptulosa, sedoheptulosa, ácido neuramínico, ácido N-acetilneuramínico, N-acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina, fructosamina, galactosamina, glucosamina, sorbitol, glicerol, eritritol, treitol, arabitol, xilitol, manitol, sorbitol, galactitol, fucitol y ácido láctico.
El material de partida de la subunidad de glicano usado en el presente documento puede ser un disacárido o una subunidad más grande seleccionada de acarviosina, N-acetil-lactosamina, alolactosa, celobiosa, quitobiosa, glactosa-alfa-1,3-galactosa, gentiobiosa, isomaltosa, isomaltosa, isomaltulosa, kojibiosa, lactitol, ácido lactobiónico, lactosa, lactulosa, laminaribiosa, maltitol, maltosa, manobiosa, melibiosa, melibiulosa, neohesperidosa, nigerosa, robinosa, rutinosa, sambubiosa, soforosa, sucralosa, sacarosa, acetato isobutirato de sacarosa, octaacetato de sacarosa, trehalosa, turanosa, vicianosa y xilobiosa
En algunas realizaciones, la subunidad de glicano es una subunidad de glicano inactivada. En algunas realizaciones, la subunidad de glicano es una subunidad de glicano activada, por ejemplo, activada con un nucleósido, nucleótido (por ejemplo, UTP, UDP, UMP, GTP, GDP, GMP, ATP, ADP, AMP, CTP, CDP, CMP) o grupo fosfato. En algunas realizaciones, la subunidad de glicano es un UDP azúcar o un UMP azúcar.
En algunas realizaciones, la subunidad de glicano está sustituida o derivatizada con un grupo acetilo, éster de acetato, semiéster de sulfato, éster de fosfato o un grupo acetal cíclico de piruvilo, o se ha derivatizado de otra forma en, por ejemplo, uno o más grupos hidroxilo o grupos amina.
En algunas realizaciones, la subunidad de glicano comprende un aminoazúcar, desoxiazúcar, iminoazúcar, ácido de azúcar o alcohol de azúcar. Los aminoazúcares a modo de ejemplo incluyen acarbosa, N-acetilmanosamina, ácido N-acetilmurámico, ácido N-acetilneuramínico, ácido N-acetiletalosaminurónico, arabinopiranosil-N-metil-N-nitrosourea, D-fructosa-L-histidina, ácido N-glicolineuramínico, cetosamina, kidamicina, manosamina, 1B-metilseleno-N-acetil-D-galactosamina, ácido murámico, muramil dipéptido, fosforribosilamina, PUGNAc, sialil-Lewis A, sialil-Lewis X, validamicina, voglibosa, N-acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina, aspartilglucosamina, bacilitiol, daunosamina, desosamina, fructosamina, galactosamina, glucosamina, meglumina y perosamina. Los desoxiazúcares a modo de ejemplo incluyen 1-5-ahidroglucitol, cladinosa, colitosa, 2-desoxi-D-glucosa, 3-desoxiglucasona, desoxirribosa, didesoxinucleótido, digitalosa, fludesoxiglucosa, sarmentosa y sulfoquinovosa. Los iminoazúcares a modo de ejemplo incluyen castanospermina, 1-desoxinojirimicina, iminoazúcar, miglitol, miglustat y swainsonina. Los ácidos de azúcar a modo de ejemplo incluyen ácido N-acetilneuramínico, ácido N-acetiltalosamnurónico, ácido aldárico, ácido aldónico, ácido 3-desoxi-D-mano-oct-2-ulosónico, ácido glucurónico, ácido glucosaminurónico, ácido glicérico, ácido N-glicolilneuramínico, ácido idurónico, ácido, ácido isosacarínico, ácido pangámico, ácido siálico, ácido treónico, ácido ulosónico, ácido urónico, ácido xilónico, ácido glucónico, ácido ascórbico, ácido cetodesoxioctulosónico, ácido galacturónico, ácido galactosaminurónico, ácido manurónico, ácido manosaminurónico, ácido tartárico, ácido múcico, ácido sacárico, ácido láctico, ácido oxálico, ácido succínico, ácido hexanoico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido butírico, ácido cítrico, ácido glucosamínico, ácido málico, ácido succinámico, ácido sebácico y ácido cáprico. Los alcoholes de azúcar a modo de ejemplo incluyen metanol, etilenglicol, glicerol, eritritol, treitol, arabitol, ribitol, xilitol, manitol, sorbitol, galactitol, iditol, volemitol, fucitol, inositol, maltotritol, maltotetraitol y poliglicitol. En algunas realizaciones, el material de partida de subunidad de glicano es una sal (por ejemplo, una sal farmacéuticamente aceptable), tal como, por ejemplo, una sal de clorhidrato, yodhidrato, bromhidrato, fosfato, sulfato, metanosulfato, acetato, formiato, tartrato, malato, citrato, succinato, lactato, gluconato, piruvato, fumarato, propionato, aspartato, glutamato, benzoato, ascorbato.
Una subunidad de glicano usada en un método descrito en el presente documento puede obtenerse de cualquier fuente comercialmente conocida o producirse según cualquier método conocido en la técnica. En algunas realizaciones, puede usarse hidrólisis para generar los monosacáridos u oligosacáridos constituyentes que son adecuados para producir los glicanos descritos en el presente documento. Unidades de glicano, tales como, por ejemplo, monosacáridos, pueden existir en muchas formas diferentes, por ejemplo, confórmeros, formas cíclicas, formas acíclicas, estereoisómeros, tautómeros, anómeros e isómeros.
Preparación de polímeros de glicano usando un catalizador polimérico no enzimático
Los siguientes aspectos y realizaciones para preparar polímeros de glicano usando un catalizador polimérico no enzimático son para fines ilustrativos.
Condiciones de reacción
En algunas realizaciones, se permite que la unidad de glicano y el catalizador (por ejemplo, catalizador polimérico o catalizador de soporte sólido) reaccionen durante al menos 1 hora, al menos 2 horas, al menos 3 horas, al menos 4 horas, al menos 6 horas, al menos 8 horas, al menos 16 horas, al menos 24 horas, al menos 36 horas, o al menos 48 horas; o entre 1-24 horas, entre 2-12 horas, entre 3-6 horas, entre 1-96 horas, entre 12 72 horas, o entre 12-48 horas.
En algunas realizaciones, el grado de polimerización del uno o más oligosacáridos producidos según los métodos descritos en el presente documento puede regularse mediante el tiempo de reacción. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el grado de polimerización del uno o más oligosacáridos aumenta al aumentar el tiempo de reacción, mientras que, en otras realizaciones, el grado de polimerización del uno o más oligosacáridos disminuye al disminuir el tiempo de reacción.
Temperatura de reacción
En algunas realizaciones, la temperatura de reacción se mantiene en el intervalo de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 150 °C. En determinadas realizaciones, la temperatura es de desde aproximadamente 30 °C hasta aproximadamente 125 °C, de aproximadamente 60 °C a aproximadamente 120 °C, de aproximadamente 80 °C a aproximadamente 115 °C, de aproximadamente 90 °C a aproximadamente 110 °C, de aproximadamente 95 °C a aproximadamente 105 °C o de aproximadamente 100 °C a 110 °C.
Cantidad de unidades de glicano
La cantidad de la unidad de glicano usada en los métodos descritos en el presente documento en relación con la cantidad de disolvente usada puede afectar a la velocidad de reacción y al rendimiento. La cantidad de la unidad de glicano usada puede caracterizarse mediante el contenido de sólidos secos. En determinadas realizaciones, el contenido de sólidos secos se refiere a los sólidos totales de una suspensión como porcentaje en una base de peso seco. En algunas realizaciones, el contenido de sólidos secos de la unidad de glicano es de entre aproximadamente el 5 % en peso y aproximadamente el 95 % en peso, entre aproximadamente el 10 % en peso y aproximadamente el 80 % en peso, entre aproximadamente el 15 % en peso y aproximadamente el 75 % en peso o entre aproximadamente el 15 % en peso y aproximadamente el 50 % en peso.
Cantidad de catalizador
La cantidad del catalizador usado en los métodos descritos en el presente documento puede depender de varios factores incluidos, por ejemplo, la selección del tipo de unidad de glicano, la concentración de la unidad de glicano y las condiciones de reacción (por ejemplo, temperatura, tiempo y pH). En algunas realizaciones, la razón en peso del catalizador con respecto a la unidad de glicano es de aproximadamente 0,01 g/g a aproximadamente 50 g/g, de aproximadamente 0,01 g/g a aproximadamente 5 g/g, de aproximadamente 0,05 g/g a aproximadamente 1,0 g/g, de aproximadamente 0,05 g/g a aproximadamente 0,5 g/g, de aproximadamente 0,05 g/g a aproximadamente 0,2 g/g o de aproximadamente 0,1 g/g a aproximadamente 0,2 g/g.
Disolvente
En determinadas realizaciones, los métodos de uso del catalizador se llevan a cabo en un entorno acuoso. Un disolvente acuoso adecuado es agua, que puede obtenerse de diversas fuentes. Generalmente, son preferibles fuentes de agua con menores concentraciones de especies iónicas (por ejemplo, sales de sodio, fósforo, amonio o magnesio), ya que tales especies iónicas pueden reducir la eficacia del catalizador. En algunas realizaciones, cuando el disolvente acuoso es agua, el agua tiene una resistividad de al menos 0,1 megaohmios-centímetros, de al menos 1 megaohmios-centímetros, de al menos 2 megaohmios-centímetros, de al menos 5 megaohmioscentímetros o de al menos 10 megaohmios-centímetros.
Contenido de agua
Además, a medida que progresa la reacción de deshidratación de los métodos, se produce agua con cada acoplamiento de la una o más unidades de glicano. En determinadas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento pueden incluir además monitorizar la cantidad de agua presente en la mezcla de reacción y/o la razón de agua con respecto a monómero o catalizador a lo largo de un periodo de tiempo. En algunas realizaciones, el método incluye además eliminar al menos una porción del agua producida en la mezcla de reacción (por ejemplo, eliminado al menos aproximadamente cualquiera del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 %, tal como mediante filtración a vacío). Sin embargo, debe entenderse que la cantidad de agua con respecto a monómero puede ajustarse basándose en las condiciones de reacción y el catalizador específico usado.
Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para eliminar el agua en la mezcla de reacción, incluidos, por ejemplo, mediante filtración a vacío, destilación a vacío, calentamiento y/o evaporación. En algunas realizaciones, el método comprende incluir agua en la mezcla de reacción.
En algunos aspectos, se proporcionan en el presente documento métodos de producción de una composición de oligosacárido: combinando una unidad de glicano y un catalizador que tiene restos ácidos e iónicos para formar una mezcla de reacción, en donde se produce agua en la mezcla de reacción; y eliminando al menos una porción del agua producida en la mezcla de reacción. En determinadas variaciones, al menos una porción del agua se elimina para mantener un contenido de agua en la mezcla de reacción de menos del 99 %, menos del 90 %, menos del 80 %, menos del 70 %, menos del 60 %, menos del 50 %, menos del 40 %, menos del 30 %, menos del 20 %, menos del 10 %, menos del 5 % o menos del 1 % en peso.
En algunas realizaciones, el grado de polimerización del uno o más oligosacáridos producidos según los métodos descritos en el presente documento puede regularse ajustando o controlando la concentración de agua presente en la mezcla de reacción. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el grado de polimerización del uno o más oligosacáridos aumenta al disminuir la concentración de agua, mientras que, en otras realizaciones, el grado de polimerización del uno o más oligosacáridos disminuye al aumentar la concentración de agua. En algunas realizaciones, el contenido de agua de la reacción se ajusta durante la reacción para regular el grado de polimerización del uno o más oligosacáridos producidos.
En un ejemplo, a un matraz de fondo redondo equipado con un agitador superior y un condensador de trayectoria corta con camisa pueden añadírsele uno o más mono, di, tri u otros oligosacáridos junto con el 1-50 % (1-10 %, 1-20 %, 1-30 %, 1-40 %, 1-60 %, 1-70 %) en peso seco de uno o más de los catalizadores descritos en el presente documento. Puede añadirse agua u otro disolvente compatible (0,1-5 equiv., 1-5 equiv., 1-4 equiv., 0,1 4 equiv.) a la mezcla seca y la suspensión puede combinarse a velocidad lenta (por ejemplo, 10-100 rpm, 50 200 rpm, 100-200 rpm) usando una paleta de tamaño que coincida lo más posible con los contornos del matraz de fondo redondo seleccionado. La mezcla se calienta hasta 70-180 °C (70-160 °C, 75-165 °C, 80-160 °C) bajo una presión de vacío de 10-1000 mbar. La reacción puede agitarse durante de 30 minutos a 6 horas, eliminando constantemente el agua de la reacción. El progreso de la reacción puede monitorizarse mediante HPLC. La masa sólida obtenida mediante el proceso puede disolverse en un volumen de agua suficiente para crear una disolución de aproximadamente 50 Brix (gramos de azúcar por 100 g de disolución). Una vez que se completa la disolución, puede retirarse el catalizador sólido mediante filtración y la disolución de oligómero puede concentrarse hasta aproximadamente 50-75 Brix, por ejemplo, mediante evaporación rotatoria. Opcionalmente, puede usarse un disolvente orgánico y los disolventes inmiscibles en agua pueden eliminarse mediante extracción bifásica y los disolventes miscibles en agua pueden eliminarse, por ejemplo, mediante evaporación rotatoria concomitante a la etapa de concentración.
Preparación de polímeros de glicano usando una molécula de enzima glicosidasa
Los siguientes aspectos y realizaciones para preparar un polímero de glicano usando una molécula de enzima glicosidasa son para fines ilustrativos.
Condiciones de reacción
Un polímero de glicano producido usando los métodos descritos en el presente documento puede generarse mediante condensación (por ejemplo, hidrólisis inversa) y/o transglicosilación de un enlace glicosídico catalizadas por una molécula de enzima glicosidasa (por ejemplo, una hidrolasa, transferasa o liasa). En algunas realizaciones, una característica de un polímero de glicano producido según los métodos descritos en el presente documento puede regularse mediante una condición de reacción, por ejemplo, tiempo de reacción, temperatura de reacción, concentración o cantidad de una subunidad de glicano, concentración o cantidad de una molécula de enzima glicosidasa, disolvente o una etapa de procesamiento adicional, por ejemplo, tal como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, las condiciones de reacción de los métodos descritos en el presente documento reflejan condiciones fisiológicas, por ejemplo, pH de entre 5 y 7,5 y una temperatura de entre 35 °C y 60 °C. En algunas realizaciones, las condiciones de reacción de un método descrito en el presente documento se desvían de las condiciones fisiológicas.
Tiempo de reacción
En algunas realizaciones, se permite que la molécula de enzima glicosidasa y un material de partida (por ejemplo, una subunidad de glicano) reaccionen durante al menos 5 minutos, al menos 10 minutos, al menos 15 minutos, al menos 30 minutos, al menos 1 hora, al menos 2 horas, al menos 3 horas, al menos 4 horas, al menos 6 horas, al menos 8 horas, al menos 16 horas, al menos 24 horas, al menos 36 horas o al menos 48 horas. En algunas realizaciones, se permite que la molécula de enzima glicosidasa y un material de partida (por ejemplo, una subunidad de glicano) reaccionen entre 1-24 horas, entre 2-12 horas, entre 3-6 horas, entre 1-96 horas, entre 12-72 horas o entre 12-48 horas. En algunas realizaciones, el grado de polimerización (DP) de un polímero de glicano producido según los métodos descritos en el presente documento puede regularse mediante el tiempo de reacción. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el grado de polimerización de un polímero de glicano aumenta al aumentar el tiempo de reacción, mientras que, en otras realizaciones, el grado de polimerización de un polímero de glicano disminuye al disminuir el tiempo de reacción.
Temperatura de reacción
En algunas realizaciones, la temperatura de reacción se mantiene en el intervalo de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 150 °C. En determinadas realizaciones, la temperatura es de desde aproximadamente 4 °C hasta aproximadamente 30 °C, de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 125 °C, de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 125 °C, de aproximadamente 60 °C a aproximadamente 120 °C, de aproximadamente 80 °C a aproximadamente 115 °C, de aproximadamente 90 °C a aproximadamente 110 °C, de aproximadamente 95 °C a aproximadamente 105 °C o de aproximadamente 100 °C a 110 °C. En algunas realizaciones, la temperatura de reacción es temperatura ambiente (por ejemplo, aproximadamente 25 °C). En algunas realizaciones, la temperatura de reacción es temperatura fisiológica (por ejemplo, aproximadamente 30 °C). En algunas realizaciones, la temperatura de reacción es de aproximadamente 60 °C.
En algunas realizaciones, la reacción se ralentiza o se detiene sustancialmente después de un periodo de tiempo aumentando la temperatura, por ejemplo, a través de la desnaturalización de la enzima. En algunas realizaciones, la reacción se ralentiza o se detiene sustancialmente aumentando la temperatura hasta más de aproximadamente 45 °C, aproximadamente 50 °C, aproximadamente 60 °C aproximadamente 70 °C, aproximadamente 80 °C, aproximadamente 90 °C, aproximadamente 100 °C, aproximadamente 110 °C o más.Concentración o cantidad de una subunidad de glicano
La concentración o cantidad de una subunidad de glicano usada en los métodos descritos en el presente documento en relación con la cantidad disolvente usada puede afectar a la velocidad de reacción y al rendimiento. En algunas realizaciones, la concentración o cantidad de una subunidad de glicano es de aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 25 mg/ml, aproximadamente 50 mg/ml, aproximadamente 75 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 200 mg/ml, aproximadamente 300 mg/ml, aproximadamente 400 mg/ml, aproximadamente 500 mg/ml, aproximadamente 750 mg/ml, aproximadamente 1 g/ml, o más.
La cantidad de la subunidad de glicano usada puede caracterizarse mediante el contenido de sólidos secos. En determinadas realizaciones, el contenido de sólidos secos se refiere a los sólidos totales de una suspensión como porcentaje en una base de peso seco. En algunas realizaciones, el contenido de sólidos secos de la subunidad de glicano es de entre aproximadamente el 5 % en peso y aproximadamente el 95 % en peso, entre aproximadamente el 10 % en peso y aproximadamente el 80 % en peso, entre aproximadamente el 15 % en peso y aproximadamente el 75%en peso o entre aproximadamente el 15%en peso y aproximadamente el 50 % en peso.
Concentración o cantidad de una molécula de enzima glicosidasa
La concentración o cantidad de la molécula de enzima de glicano usada en los métodos descritos en el presente documento puede depender de varios factores incluidos, por ejemplo, la selección del tipo de subunidad de glicano, la concentración de la subunidad de glicano y las condiciones de reacción (por ejemplo, temperatura, tiempo y pH). En algunas realizaciones, la concentración o cantidad de la molécula de enzima glicosidasa es de aproximadamente 0,1 U/ml, aproximadamente 0,5 U/ml, aproximadamente 1 U/ml, aproximadamente 5 U/ml, aproximadamente 10 U/ml, aproximadamente 25 U/ml, aproximadamente 50 U/ml o mayor. En algunas realizaciones, la concentración o cantidad de la molécula de enzima glicosidasa es de entre 0,1-5 U/ml, entre 1 25 U/ml o 1-50 U/ml. En algunas realizaciones, la razón en peso de la molécula de enzima glicosidasa con respecto a la subunidad de glicano es de aproximadamente 0,01 g/g a aproximadamente 50 g/g, de aproximadamente 0,01 g/g a aproximadamente 5 g/g, de aproximadamente 0,05 g/g a aproximadamente 1,0 g/g, de aproximadamente 0,05 g/g a aproximadamente 0,5 g/g, de aproximadamente 0,05 g/g a aproximadamente 0,2 g/g o de aproximadamente 0,1 g/g a aproximadamente 0,2 g/g.
Disolvente
En algunas realizaciones, el disolvente de la reacción es un disolvente biocompatible. En determinadas realizaciones, el disolvente de la reacción es un disolvente acuoso, por ejemplo, agua o una mezcla de agua. En algunas realizaciones, el disolvente de la rección es agua o una mezcla de agua y un disolvente miscible tal como acetona, etanol, isopropanol, polietilenglicol, t-butanol u otro disolvente. En algunas realizaciones, el disolvente de la reacción es un disolvente orgánico (por ejemplo, un disolvente orgánico puro).
Puede añadirse un disolvente a la mezcla de reacción con el fin de aumentar la velocidad de reacción o el rendimiento global de la reacción, por ejemplo, a través del aumento de la accesibilidad de una molécula de enzima glicosidasa a una subunidad de glicano. Los disolventes a modo de ejemplo incluyen un disolvente orgánico tal como DMSO y tolueno.
Componentes de la reacción de adición
La mezcla de reacción puede comprender un componente adicional tal como una sal, un detergente, un metal, un quelante, un ácido, una base, un cofactor, una coenzima, una vitamina, un aminoácido, un grupo prostético, un nucleósido, un nucleótido, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la mezcla de reacción comprende un cofactor o coenzima tal como NAD+, NADH, NADP+, NADPH, FAD, FADH, coenzima A, biotina, piridoxal fosfato o metilcobalamina. En algunas realizaciones, la inclusión de un componente adicional mejora el rendimiento de la reacción, la tasa de recambio de la enzima, la estabilidad de la enzima, la estabilidad de la subunidad de glicano, la estabilidad del polímero de glicano, o cualquier combinación de los mismos.
Enzimas glicosidasas
En el presente documento se describen métodos de preparación de preparaciones de polímeros de glicano que son sustratos para una enzima glicosidasa, por ejemplo, una enzima glicosidasa presente en un microbio intestinal humano. En sus entornos naturales, por ejemplo, expresados por una bacteria intestinal en el intestino de un sujeto, las glicosidasas usan polímeros de glicano como sustratos, por ejemplo, reconocen polímeros de glicano específicos e hidrolizan enlaces glicosídicos en el polímero de glicano. Esta hidrólisis puede conducir a la liberación de monómeros o dímeros del polímero de glicano, un acortamiento del polímero de glicano y/o una desramificación (por ejemplo, la eliminación de un punto de ramificación glicosídico del polímero de glicano). La acción de la glicosidasa proporciona al microbio productos de degradación de glicano que puede convertir en energía. Este proceso se conoce como fermentación de glicano. Muchas glicosidasas son específicas, por ejemplo, tienen motivos de reconocimiento al final de la cadena de glicano (por ejemplo, exoglicosidasas) o dentro (por ejemplo, endoglicosidasas), pueden reconocer azúcares específicos o combinaciones de azúcares (por ejemplo, glu-glu o glu-gal) y además pueden ser selectivos en estereoquímica y/o regioquímica (por ejemplo, reconocimiento de enlaces glicosídicos alfa frente a beta, y/o enlaces 1->2 frente a 1->3 frente a 1->6). Algunas enzimas glicosidasas son más promiscuas, teniendo una variedad más amplia de sustratos de polímeros de glicano.
En entornos artificiales y en condiciones adecuadas, las enzimas glicosidasas pueden producir polímeros de glicano, por ejemplo mediante reacción de condensación y/o reacciones de transglicosilación. Los polímeros de glicano que se producen pueden tener un mayor grado de polimerización que los aportes, pueden presentar ramificación y variedad estereoquímica y/o regioquímica (con respecto a los enlaces y uniones alfa-beta glicosídicos). Las enzimas glicosidasas a modo de ejemplo incluyen hidrolasas, transferasas o liasas. Una enzima glicosidasa puede caracterizarse de diversos modos, tal como por su secuencia, tamaño o función. En algunas realizaciones, una enzima glicosidasa está asociada con una bacteria de un taxón particular. En algunas realizaciones, una enzima glicosidasa tiene una designación de familia CAZy (es decir, la designación de familia proporcionada por la base de datos Carbohydrate Active enZYme (http://www.cazy.org/)), por ejemplo, familia de glicosilhidrolasa (GH) o familia de glicosiltransferasa (GT), basándose en el análisis de información genómica, estructural y bioquímica. En algunas realizaciones, una enzima glicosidasa (por ejemplo, una enzima glicosidasa que se produce de manera natural, por ejemplo, expresada por un microbio intestinal) es una molécula de enzima glicosidasa (por ejemplo, una glicosidasa usada en los métodos de preparación de un polímero de glicano descritos en el presente documento). En algunas realizaciones, la molécula de enzima glicosidasa es el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % 99 % o 100 % idéntica a la enzima glicosidasa (por ejemplo, por secuencia de ADN, secuencia de ARN o secuencia de aminoácidos). En otras realizaciones, la molécula de enzima glicosidasa comprende una deleción, secuencia adicional, mutación puntual, cambios de aminoácidos conservadores o no conservadores, optimización de codones, etiquetas de purificación, mutaciones promotoras de plegamiento/estabilidad, etc. en comparación con la enzima glicosidasa. En algunas realizaciones, la enzima glicosidasa es miembro de una familia GH CAZY. En algunas realizaciones, la enzima glicosidasa es miembro de una familia GT CAZY. En algunas realizaciones, la molécula de enzima glicosidasa está relacionada con (o derivatizada de) la enzima glicosidasa que tiene una o más modificaciones de secuencia (por ejemplo, secuencia de ADN, ARN o aminoácidos), tales como las descritas en el presente documento.
En algunas realizaciones, la enzima glicosidasa o la molécula de enzima glicosidasa está presente en un microbio intestinal humano. La enzima glicosidasa puede aislarse del microbio. En algunas realizaciones, las glicosidasas están presentes en un sobrenadante microbiano, presentes en un extracto microbiano, presentes en una masa de células microbianas o están aisladas hasta una pureza esencial (por ejemplo, fracción enzimática esencialmente pura). En algunas realizaciones, la enzima glicosidasa proviene de microbios intestinales humanos. En algunas realizaciones, la enzima glicosidasa proviene de una levadura, un hongo o una bacteria. En una realización, la enzima glicosidasa proviene de una bacteria, tal como una bacteria intestinal humana. En algunas realizaciones, el taxón bacteriano es uno de Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Fusobacteria, Spirochaetes, Synergistetes, Tenericutes, Proteobacteria, Verrucomicrobia, Euroarchaeota, por ejemplo, un taxón bacteriano descrito en la tabla 2. En algunas realizaciones, el microbio intestinal humano es una especie con los taxones bacterianos Actinobacteria. En algunas realizaciones, el microbio intestinal humano es una especie con los taxones bacterianos Bacteroidetes. En algunas realizaciones, el microbio intestinal humano es una especie con los taxones bacterianos Firmicutes. En algunas realizaciones, el microbio intestinal humano es una especie con los taxones bacterianos Fusobacteria. En algunas realizaciones, el microbio intestinal humano es una especie con los taxones bacterianos Spirochaetes. En algunas realizaciones, el microbio intestinal humano es una especie con los taxones bacterianos Synergistetes. En algunas realizaciones, el microbio intestinal humano es una especie con los taxones bacterianos Tenericutes. En algunas realizaciones, el microbio intestinal humano es una especie con los taxones bacterianos Proteobacteria. En algunas realizaciones, el microbio intestinal humano es una especie con los taxones bacterianos Verrucomicrobia. En algunas realizaciones, el microbio intestinal humano es una especie con los taxones bacterianos Euroarchaeota. En algunas realizaciones, el microbio intestinal humano es distinto de un Bifidobacterium o un Lactobacillus. En algunas realizaciones, el polímero de glicano (por ejemplo, producido mediante un método descrito en el presente documento) es un sustrato para una enzima glicosidasa de un microbio intestinal humano de una determinada familia CAZy (por ejemplo, una familia de glicosilhidrolasa (GH) o una familia de glicosiltransferasa (GT)). En algunas realizaciones, el polímero de glicano es un sustrato para una enzima glicosidasa de un microbio intestinal humano de una determinada familia de glicosilhidrolasa (GH) (por ejemplo, una de GH1 a GH135) o familia de glicosiltransferasa (GT) (por ejemplo, una de GT1 a GT101). En algunas realizaciones, las preparaciones de polímeros de glicano se seleccionan para que sean sustratos para un microbio intestinal humano con un perfil de glicosidasas particular (por ejemplo, expresa (o alberga en su genoma) uno o más genes de glicosidasa, por ejemplo, de una o más familias CAZy). En algunas realizaciones, las moléculas de enzima glicosidasa se usan en los métodos descritos en el presente documento para producir polímeros de glicano que comprenden funciones de una o más de las enzimas glicosidasa presentes en el microbio particular (o grupo de microbios). En algunas realizaciones, la molécula de enzima glicosidasa comprende las mismas funciones que la enzima glicosidasa (por ejemplo, la enzima presente en el microbio intestinal). En algunas realizaciones, la molécula de enzima glicosidasa tiene similitud estructural o un cierto grado de similitud de secuencia con la enzima glicosidasa. Puede generarse una molécula de enzima glicosidasa mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, usando técnicas convencionales de clonación, genética, expresión de proteínas, purificación de proteínas o procesamiento de proteínas.
Las moléculas de enzima glicosidasa adecuadas para los métodos de preparación de polímeros de glicano descritos en el presente documento pueden seleccionarse basándose en sus homólogos de enzima glicosidasa que están presentes en un microbio y, por tanto, el polímero de glicano o la preparación del mismo puede adaptarse a la enzima glicosidasa (perfil de enzimas glicosidasa) del microbio como sustratos adaptados.
En algunas realizaciones, el polímero de glicano (por ejemplo, producido mediante un método descrito en el presente documento) es un sustrato para una enzima glicosidasa de un microbio intestinal humano seleccionada de las familias CAZy GT5, GH94, GH13.9, GH13.39, GH13.36, GH113.0 y GH112. En algunas realizaciones, el polímero de glicano es un sustrato para una enzima glicosidasa de un microbio intestinal humano seleccionada de las familias CAZy GT2, GT4, GT5, GT35, GT51, GH1, GH2, GH3, GH4, GH13, subfamilia 9 de GH13, subfamilia 31 de GH13, GH18, GH23, GH25, GH28, GH31, GH32, GH36, GH51, GH73, GH77 y GH94. En algunas realizaciones, el polímero de glicano es un sustrato para una enzima glicosidasa de un microbio intestinal humano seleccionada de las familias CAZy GT11, GT10, GH92, GH51, GH35, GH29, GH28, GH20, GH130, subfamilia 8 de GH13 y subfamilia 14 de GH13. En algunas realizaciones, el polímero de glicano es un sustrato para una enzima glicosidasa de un microbio intestinal humano seleccionada de las familias CAZy GT2, GT4, GH2, GH23, GH3, GT8, GT51, GT9, GH1, GH92, GH73, GH31, GH20, GH28, GT25, GT28, GT35, GH18, GH13, GH36, GH97, GH105, GH25, GH4, GH32, GH78, GH29, GH51, GT10 y GH77. En algunas realizaciones, el polímero de glicano es un sustrato para una enzima glicosidasa de un microbio intestinal humano seleccionada de las familias CAZy GT3, GH97, subfamilia 24 de GH43, GH27, GH133, subfamilia 8 de GH13 y GH13. En algunas realizaciones, el polímero de glicano es un sustrato para una enzima glicosidasa de un microbio intestinal humano seleccionada de las familias CAZy GT2, GT4, GH2, GH23, GH3, GT51, GH1, GT8, GH92, GT9, GH73, GH31, GH20, GH28, GT35, GT28, GH18, GH13, GH97, GH25, GH36, GH4, GH105, GH32, GH78, GH29, GT25, GH51, GH77, GH88, GH24.
En algunas realizaciones, la enzima glicosidasa o molécula de enzima glicosidasa es distinta de una de la familia CAZy GH1, GH2, GH3, GH4, GH5, GH8, GH9, GH10, GH11, GH12, GH13, GH14, GH16, GH26, GH28, GH30, GH31, GH32, GH35, GH42, GH43, GH44, GH50, GH51, GH57, GH62, GH63, GH68, GH70, GH97, GH100, GH116, GH119 o GH122.
En algunas realizaciones, el método descrito en el presente documento comprende además la identificación de un perfil de glicosidasas (por ejemplo, de la familia CAZy (por ejemplo, una familia GT o una familia GH)) de un microbio particularin silico.En algunas realizaciones, la identificación de un perfil de glicosidasas se lleva a cabo según los métodos de los ejemplos 11-15. Por ejemplo, puede predecirse la capacidad para modular un metabolito de un genoma secuenciado a partir de una serie de especies bacterianas comensales aisladas de microbiomas intestinales humanos sanos, por ejemplo, como parte del Human Microbiome Project, por ejemplo, producir butirato, convertir urea en amoníaco a través de ureasa, o convertir colina en TMA.
En algunas realizaciones, el polímero de glicano es un sustrato para una enzima glicosidasa presente en un microbio (por ejemplo, un microbio intestinal humano) que modula el nivel de (por ejemplo, produce) un metabolito microbiano. Los metabolitos a modo de ejemplo incluyen ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico, ácido isovalérico, ácido ascórbico, ácido láctico, triptófano, serotonina, indol, ácido succínico, trimetilamina (TMA), TMAO (N-óxido de trimetilamina), ácido desoxicólico, sulfato de etilfenilo, acetilaldehído, peróxido de hidrógeno, amoníaco, ácidos biliares, lipopolisacárido (LPS) y/o butanodiona. En algunas realizaciones, el metabolito es ácido butírico (por ejemplo, butirato), trimetilamina (TMA) o amoníaco. En algunas realizaciones, el metabolito es ácido butírico (por ejemplo, butirato). En algunas realizaciones, el metabolito es ácido acético (por ejemplo, acetato). En algunas realizaciones, el metabolito es ácido propiónico (por ejemplo, propionato). En algunas realizaciones, el metabolito es trimetilamina (TMA). En algunas realizaciones, el metabolito es amoníaco. En algunas realizaciones, el metabolito es lipopolisacárido (LPS). En algunas realizaciones, el metabolito es ácido biliar (por ejemplo, un ácido biliar secundario). En algunas realizaciones, puede detectarse un aumento o disminución sustancial de un metabolito. En algunas realizaciones, la enzima glicosidasa o la molécula de enzima glicosidasa es distinta de alfa o beta-galactosidasa, alfa o beta-glucosidasa, alfa o beta-xilosidasa, alfa o beta-manosidasa o alfa o betafructofuranosidasa. En algunas realizaciones, la enzima glicosidasa o la molécula de enzima glicosidasa es distinta de alfa o beta-galactosidasa.
Métodos de generación de moléculas de enzima glicosidasa
Las moléculas de la enzima glicosidasa pueden producirse mediante expresión en células huésped recombinantes, pero también mediante otros métodos tales como transcripción y traducciónin vitroy síntesis química.
Para la expresión celular, pueden insertarse uno o más ácidos nucleicos (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que codifican para una molécula de enzima glicosidasa en un vector replicable para clonación o expresión. El vector puede ser, por ejemplo, un plásmido, cósmido, genoma viral, fagémido, genoma de fago u otra secuencia que se replica de manera autónoma. La secuencia de ácido nucleico codificante apropiada puede insertarse en el vector mediante una variedad de procedimientos. Por ejemplo, pueden diseñar por ingeniería genética sitios de endonucleasas de restricción apropiados (por ejemplo, usando PCR). Luego pueden usarse digestión de restricción y ligación para insertar la secuencia de ácido nucleico codificante en una ubicación apropiada. Los componentes del vector generalmente incluyen uno o más de un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción.
La molécula de enzima glicosidasa puede producirse de manera recombinante opcionalmente mediante fusión con uno o más componentes diferentes, tales como una secuencia señal, un epítopo o resto de purificación o un marcador.
Para la expresión bacteriana, la molécula de enzima glicosidasa puede producirse con o sin una secuencia señal. Por ejemplo, puede producirse dentro de células para que se acumule en cuerpos de inclusión o en la fracción soluble. También puede secretarse, por ejemplo, mediante la adición de una secuencia señal procariota, por ejemplo, una secuencia líder apropiada. Las células huésped bacterianas a modo de ejemplo para la expresión incluyen cualquier cepa transformable deE. coliK-12 (tal comoE. coliBL21, C600, ATCC 23724;E. coliHB101 NRRLB-11371, ATCC-33694;E. coliMM294 ATCC-33625;E. coliW3110 ATCC-27325), cepas deB. subtilis, Pseudomonasy otros bacilos. En algunas realizaciones, la célula huésped bacteriana se selecciona de un taxón proteolítico, por ejemplo, un taxón que expresa pocas o ninguna enzima glicosidasa endógena.
Las moléculas de enzima glicosidasa pueden expresarse en una célula huésped de levadura, por ejemplo,Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, HanseulaoPichia pastoris.Para la expresión en levaduras, las moléculas de enzima glicosidasa también pueden producirse intracelularmente o mediante secreción, por ejemplo, usando el líder de invertasa de levadura o un líder de factor alfa (incluidas formasSaccharomycesyKluyveromyces),o el líder de fosfatasa ácida, o el líder de glucoamilasa deC. albicans(documento EP 362.179 publicado el 4 de abril de 1990).
Tanto los vectores de expresión como los de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Tales secuencias se conocen bien para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas; el origen del plásmido 2^ es adecuado para levaduras.
Los vectores de expresión y clonación normalmente contienen un gen o marcador de selección. Los genes de selección típicos codifican para proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas (tal como el marcador URA3 enSaccharomyces)o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica para la D-alanina racemasa para bacilos.
Los vectores de expresión y clonación contienen habitualmente un promotor operativamente unido a la secuencia de ácido nucleico que codifica para la molécula de enzima glicosidasa para dirigir la síntesis de ARNm. Los promotores a modo de ejemplo adecuados para su uso con huéspedes procariotas incluyen los sistemas promotores de p-lactamasa y lactosa (Changet al.,Nature, 275:615 (1978); Goeddelet al.,Nature, 281:544 (1979)), fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); documento EP 36.776) y promotores híbridos tales como el promotor tac (deBoeret al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)). Los promotores para uso en sistemas bacterianos también pueden contener una secuencia de Shine-Dalgarno ubicada apropiadamente. El sistema de polimerasa T7 también puede usarse para dirigir la expresión de una secuencia codificante de ácido nucleico colocada bajo el control del promotor T7. Todavía se describen otros métodos, vectores y células huésped adecuados para su adaptación a la síntesis de moléculas de enzima glicosidasa en células recombinantes en Molecular Cloning: A Laboratory, tercera edición, Sambrooket al.(eds.), Cold Spring Harbor Press, (2001) (ISBN: 0879695773).
Una vez expresadas en células, las moléculas de enzima glicosidasa pueden recuperarse del medio de cultivo, cuerpos de inclusión o lisados celulares. Las células pueden alterarse mediante diversos medios físicos o químicos, tales como ciclos de congelación y descongelación, sonicación, alteración mecánica o agentes de lisis celular (por ejemplo, detergentes).
Las moléculas de enzima glicosidasa pueden purificarse a partir de otras proteínas o polipéptidos celulares que pueden encontrarse en lisados celulares o en el medio celular. Pueden emplearse diversos métodos de purificación de proteínas y tales métodos se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); y Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, Nueva York (2010) (ISBN: 1441928332). Los ejemplos de procedimientos de purificación incluyen: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A Sepharose para eliminar contaminantes tales como IgG; y columnas de afinidad (por ejemplo, columnas quelantes de metales para unir formas de la proteína etiquetadas con epítopos y columnas con diversos ligandos para unir cualquier resto de purificación que esté asociado con la enzima glicosidasa). Un método de purificación puede incluir una combinación de dos etapas diferentes de cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo, cromatografía de intercambio catiónico seguida de cromatografía de intercambio aniónico, o viceversa. Las moléculas de enzima glicosidasa pueden eluirse de la resina de intercambio iónico mediante una variedad de métodos que incluyen gradientes o etapas de sal y/o pH. En algunas realizaciones, las moléculas de enzima glicosidasa incluyen un resto de purificación (tal como etiquetas de epítopo e identificadores de afinidad). Tales restos pueden usarse para cromatografía de afinidad y opcionalmente pueden eliminarse mediante escisión proteolítica.
Pueden unirse sustituyentes aniónicos o catiónicos a matrices con el fin de formar soportes aniónicos o catiónicos para cromatografía. Los sustituyentes de intercambio aniónico incluyen grupos dietilaminoetilo (DEAE), aminoetilo cuaternario (QAE) y amina cuaternaria (Q). Los sustituyentes catiónicos incluyen carboximetilo (CM), sulfoetilo (SE), sulfopropilo (SP), fosfato (P) y sulfonato (S). Están disponibles resinas de intercambio iónico de celulosa tales como De23, DE32, DE52, CM-23, c M-32 y CM-52 de Whatman Ltd. (Maidstone, Kent, Reino Unido). También se conocen SEFADEX™ y otros intercambiadores iónicos reticulados. Por ejemplo, están disponibles DEAE-, QAE-, CM- y SP-SEPHADEX™ y DEAE-, Q-, CM- y S-SEPHAROSE™ y SEPHAROSE™ Fast Flow de Pharmacia AB. Están disponibles copolímeros de metacrilato de etilenglicol derivatizados con DEAE y CM, tales como TOYOPEARL DEAE-650S o M y TOYOPEARL CM-650S o M, de Toso Haas Co. (Filadelfia, PA, EE. UU.).
Una superficie de intercambio catiónico es una superficie de intercambio iónico con ligandos cargados negativamente unidos covalentemente y que, por tanto, tiene cationes libres para el intercambio con cationes en una disolución en contacto con la superficie. Las superficies a modo de ejemplo incluyen resinas de intercambio catiónico, tales como aquellas en donde los grupos unidos covalentemente son carboxilato o sulfonato. Las resinas de intercambio catiónico disponibles comercialmente incluyen CMC-celulosa, SP-Sephadex™ y Fast S-Sepharose™ (Farmacia).
Una superficie de intercambio aniónico es una superficie de intercambio iónico con grupos cargados positivamente unidos covalentemente, tales como grupos amino cuaternarios. Una superficie de intercambio aniónico a modo de ejemplo es una resina de intercambio aniónico, tal como DEAE celulosa, TMAE, QAE Sephadex™ y Fast Q Sepharose™ (Farmacia).
Un esquema de purificación a modo de ejemplo para moléculas de enzima glicosidasa incluye lisar células deE. colien tampón de lisis seguido de filtración en profundidad. Luego, el material se somete a cromatografía de intercambio catiónico (CEX). Luego, el eluato de CEX se hace fluir sobre un medio de intercambio aniónico en una etapa de cromatografía de intercambio aniónico (AEX). El AEX FT puede someterse a una etapa de pulido. Luego, el material puede procesarse mediante ultrafiltración/diafiltración, por ejemplo, para concentrar o desalar el material. Pueden seleccionarse membranas de ultrafiltración/diafiltración basándose en el corte de peso molecular nominal (“NMWCO”) para retener la proteína en el material retenido, permitiendo al mismo tiempo que materiales de bajo peso molecular tales como sales pasen al filtrado. Puede usarse cualquier disolución tampón o agua estéril durante la etapa final de intercambio de tampón, por ejemplo, dependiendo del pH final deseado y la conductividad del producto.
Una molécula de enzima glicosidasa puede comprender una o más modificaciones de secuencia conservadoras. Tales modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de aminoácidos. Pueden introducirse modificaciones mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras son aquellas en las que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales betaramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, uno o más residuos de aminoácidos dentro de una enzima glicosidasa pueden reemplazarse con otros residuos de aminoácidos de la misma familia de cadenas laterales y la molécula de enzima glicosidasa alterada puede someterse a prueba usando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.
Etapas de procesamiento adicionales
Los siguientes aspectos y realizaciones relacionados con etapas de procesamiento adicionales son para fines ilustrativos.
Opcionalmente, la preparación puede someterse a etapas de procesamiento adicionales. Las etapas de procesamiento adicionales pueden incluir, por ejemplo, etapas de purificación. Las etapas de purificación pueden incluir, por ejemplo, separación, dilución, concentración, filtración, desalación o intercambio iónico, separación cromatográfica o decoloración, o cualquier combinación de los mismos.
Decoloración
En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento incluyen además una etapa de decoloración. Un polímero de glicano producido puede someterse a una etapa de decoloración usando cualquier método conocido en la técnica, incluido, por ejemplo, tratamiento con un absorbente, carbón activado, cromatografía (por ejemplo, usando resina de intercambio iónico), hidrogenación y/o filtración (por ejemplo, microfiltración).
En determinadas realizaciones, un polímero de glicano producido se pone en contacto con un material absorbente del color a una temperatura particular, a una concentración particular y/o durante un período de tiempo particular.
En algunas realizaciones, la masa de la especie absorbente del color en contacto con un polímero de glicano es menos del 50 % de la masa del polímero de glicano, menos del 35 % de la masa del polímero de glicano, menos del 20 % de la masa del polímero de glicano, menos del 10 % de la masa del polímero de glicano, menos del 5 % de la masa del polímero de glicano, menos del 2 % de la masa del polímero de glicano o menos del 1 % de la masa del polímero de glicano.
En algunas realizaciones, un polímero de glicano se pone en contacto con un material absorbente del color. En determinadas realizaciones, un polímero de glicano se pone en contacto con un material absorbente del color durante menos de 10 horas, menos de 5 horas, menos de 1 hora o menos de 30 minutos. En una realización particular, se pone en contacto un polímero de glicano con un material absorbente del color durante 1 hora. En determinadas realizaciones, el polímero de glicano se pone en contacto con un material absorbente del color a una temperatura de 20 a 100 grados Celsius, de 30 a 80 grados Celsius, de 40 a 80 grados Celsius o de 40 a 65 grados Celsius. En una realización particular, el polímero de glicano se pone en contacto con un material absorbente del color a una temperatura de 50 grados Celsius.
En determinadas realizaciones, el material absorbente del color es carbón activado. En una realización, el material absorbente del color es carbón activado en polvo. En otras realizaciones, el material absorbente del color es una resina de intercambio iónico. En una realización, el material absorbente del color es una resina de intercambio catiónico de base fuerte en forma de cloruro. En otra realización, el material absorbente del color es poliestireno reticulado. En aun otra realización, el material absorbente del color es poliacrilato reticulado. En determinadas realizaciones, el material absorbente del color es Amberlite FPA91, Amberlite FPA98, Dowex 22, Dowex Marathon MSA o Dowex Optipore SD-2.
Intercambio iónico/desalación (desmineralización)
En algunas realizaciones, el polímero de glicano producido se pone en contacto con un material para eliminar sales, minerales y/u otras especies iónicas. En determinadas realizaciones, el polímero de glicano se hace fluir a través de un par de columnas de intercambio aniónico/catiónico. En una realización, la columna de intercambio aniónico contiene una resina de intercambio de base débil en forma de hidróxido y la columna de intercambio catiónico contiene una resina de intercambio de ácido fuerte en forma protonada.
Separación y concentración
En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento incluyen además aislar los polímeros de glicano producidos. En determinadas variaciones, aislar polímeros de glicano comprende separar al menos una porción de los polímeros de glicano de al menos una porción de la molécula de enzima glicosidasa, usando cualquier método conocido en la técnica, incluidos, por ejemplo, centrifugación, filtración (por ejemplo, filtración a vacío, filtración por membrana) y sedimentación por gravedad. En algunas realizaciones, aislar los polímeros de glicano comprende separar al menos una porción de los polímeros de glicano de al menos una porción de cualquier azúcar sin reaccionar, usando cualquier método conocido en la técnica, incluidos, por ejemplo, filtración (por ejemplo, filtración por membrana), cromatografía (por ejemplo, fraccionamiento cromatográfico), solubilidad diferencial y centrifugación (por ejemplo, centrifugación diferencial).
En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento incluyen además una etapa de concentración. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el polímero de glicano aislado se somete a evaporación (por ejemplo, evaporación a vacío) para producir una preparación concentrada de polímero de glicano. En otras realizaciones, el polímero de glicano aislado se somete a una etapa de secado por pulverización para producir un polvo de oligosacárido. En determinadas realizaciones, el polímero de glicano aislado se somete tanto a una etapa de evaporación como a una etapa de secado por pulverización.
Fraccionamiento
En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento incluyen además una etapa de fraccionamiento. Los polímeros de glicano preparados y purificados pueden separarse posteriormente por peso molecular usando cualquier método conocido en la técnica, incluido, por ejemplo, cromatografía de líquidos de alto rendimiento, adsorción/desorción (por ejemplo, cromatografía de carbón activado a baja presión) o filtración (por ejemplo, ultrafiltración o diafiltración).
En determinadas realizaciones, los polímeros de glicano producidos se fraccionan mediante adsorción sobre un material carbonoso y posterior desorción de fracciones lavando el material con mezclas de un disolvente orgánico en agua a una concentración del 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 50%o 100 %. En una realización, el material de adsorción es carbón activado. En otra realización, el material de adsorción es una mezcla de carbón activado y un agente de carga tal como tierra de diatomeas o Celite 545 en una porción del 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o 50 % en volumen o peso.
En realizaciones adicionales, los polímeros de glicano producidos se separan mediante pase a través de un sistema de cromatografía de líquidos de alto rendimiento. En determinadas variaciones, los polímeros de glicano producidos se separan mediante cromatografía de afinidad iónica, cromatografía de interacción hidrófila o cromatografía de exclusión molecular, incluidas permeación en gel y filtración en gel.
En otras realizaciones, los materiales de bajo peso molecular se eliminan mediante métodos de filtración. En determinadas variaciones, los materiales de bajo peso molecular pueden eliminarse mediante diálisis, ultrafiltración, diafiltración o filtración de flujo tangencial. En determinadas realizaciones, la filtración se realiza en un aparato de tubo de diálisis estático. En otras realizaciones, la filtración se realiza en un sistema de filtración de flujo dinámico. En otras realizaciones, la filtración se realiza en cartuchos de filtración accionados por fuerza centrífuga.
Otras etapas de procesamiento pueden incluir cualquiera de las descritas en los ejemplos del presente documento. En algunas realizaciones, se usa fermentación de levaduras para eliminar los constituyentes sin reaccionar, por ejemplo, monómeros o dímeros de azúcar, o subproductos de reacción, tales como monómeros de azúcar.
Propiedades de la preparación de glicano
El glicano puede tener una cualquiera o más de las características y propiedades dadas a conocer en los documentos WO2016/122889, WO2016/172657, WO 2016/007778 y WO2016/172658, y cualquiera característica y propiedad dadas a conocer en el presente documento.
Los glicanos producidos mediante los métodos descritos en el presente documento pueden comprender oligosacáridos. En algunas realizaciones, los glicanos comprenden homo-oligosacáridos (u homoglicanos), en donde todos los monosacáridos en un polímero son del mismo tipo.
En algunas realizaciones, los glicanos comprenden hetero-oligosacáridos (o heteroglicanos), en donde está presente más de un tipo de monosacárido en el polímero. En algunas realizaciones, los glicanos tienen una o más de las propiedades descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, la preparación de glicano tiene una o más de las propiedades en masa descritas en el presente documento.
Grado de polimerización (DP)
En algunas realizaciones, se producen preparaciones de polímeros de glicano, por ejemplo, usando un método descrito en el presente documento, que son polidispersas, presentando un intervalo de grados de polimerización. Opcionalmente, las preparaciones pueden fraccionarse, representando por ejemplo el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o más del 98 % de especies cortas (aproximadamente DP1-2), medias (aproximadamente DP3-10), largas (aproximadamente DP11-18) o muy largas (aproximadamente DP>18). En una realización, se proporciona una preparación de polímero de glicano polidispersa y fraccionada que comprende al menos el 85 %, el 90 % o al menos el 95 % de especies de longitud media con un DP de aproximadamente 3-10. En una realización, se proporciona una preparación de polímero de glicano polidispersa y fraccionada que comprende al menos el 85 %, el 90 % o al menos el 95 % especies de longitud larga con un DP de aproximadamente 11-18. En una realización, se proporciona una preparación de polímero de glicano polidispersa y fraccionada que comprende al menos el 85 %, el 90 % o al menos el 95 % de especies de longitud muy larga con un DP de aproximadamente 18-30.
Opcionalmente, las preparaciones pueden fraccionarse, representando por ejemplo el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o más del 98 % de glicanos cortos (aproximadamente DP1-2) o medios (aproximadamente DP3-10) en la preparación. Alternativamente, o además del fraccionamiento, la fracción de DP pequeño (por ejemplo, monómeros y dímeros) se somete a fermentación enzimática, por ejemplo con levaduras adecuadas para descomponer estos azúcares. En una realización, se prepara una preparación de polímero de glicano polidispersa y fraccionada usando un método descrito en el presente documento, que comprende al menos el 85 %, el 90 % o al menos el 95 % de glicanos con un DP de aproximadamente 3-10. En algunas realizaciones, aproximadamente el 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o aproximadamente el 97 % de los polímeros de glicano de la preparación de glicano tienen un DP de al menos DP3, DP4, DP5, DP6 o DP7. En algunas realizaciones, aproximadamente el 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o aproximadamente el 97 % de los polímeros de glicano de la preparación de glicano tienen un DP de desde aproximadamente DP3 hasta aproximadamente DP10, desde aproximadamente DP3 hasta aproximadamente DP8, desde aproximadamente DP3 hasta aproximadamente DP6, desde aproximadamente DP3 hasta aproximadamente DP5, desde aproximadamente DP3 hasta aproximadamente DP4, desde aproximadamente DP2 hasta aproximadamente DP4, desde aproximadamente DP2 hasta aproximadamente DP5, desde aproximadamente DP2 hasta aproximadamente DP6, desde aproximadamente DP2 hasta aproximadamente DP8 o desde aproximadamente DP2 hasta aproximadamente Dp10. En algunas realizaciones, menos del 1 %, 2 %, 3 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 % o menos del 50 % de los polímeros de glicano de la preparación de glicano tienen un DP de DP2 o menos.
En algunas realizaciones, aproximadamente el 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o aproximadamente el 97 % de la preparación de polímero de glicano tiene un DP de entre 2 y 25, entre 3 y 25, entre 4 y 25, entre 5 y 25, entre 6 y 25, entre 7 y 25, entre 8 y 25, entre 9 y 25, entre 10 y 25, entre 2 y 30, entre 3 y 30, entre 4 y 30, entre 5 y 30, entre 6 y 30, entre 7 y 30, entre 8 y 30, entre 9 y 30 o entre 10 y 30. En una realización, la preparación de polímero de glicano tiene un grado de polimerización (DP) de al menos 3 y menos de 30 unidades de glicano.
En algunas realizaciones, aproximadamente el 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o aproximadamente el 97 % de la preparación de polímero de glicano tiene un DP de al menos 5 y menos de 30 unidades de glicano. En algunas realizaciones, aproximadamente el 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o aproximadamente el 97 % de la preparación de polímero de glicano tiene un DP de al menos 8 y menos de 30 unidades de glicano. En algunas realizaciones, aproximadamente el 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o aproximadamente el 97 % de la preparación de polímero de glicano tiene un DP de al menos 10 y menos de 30 unidades de glicano. En algunas realizaciones, aproximadamente el 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o aproximadamente el 97 % de la preparación de polímero de glicano tiene un DP de entre 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 unidades de glicano. En algunas realizaciones, aproximadamente el 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o aproximadamente el 97 % de la preparación de polímero de glicano tiene un DP de entre 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 unidades de glicano. En algunas realizaciones, aproximadamente el 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o aproximadamente el 97 % de la preparación de polímero de glicano tiene un DP de entre 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 unidades de glicano.
El rendimiento de conversión para la una o más unidades de glicano (por ejemplo, azúcares) en los métodos descritos en el presente documento puede determinarse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, incluida, por ejemplo, cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). El rendimiento de conversión promedio puede determinarse mediante métodos conocidos por el experto en la técnica, por ejemplo exclusión por tamaño, afinidad iónica, química hidrófila o hidrófoba. Estos métodos se basan generalmente en la separación cromatográfica de materiales mediante un sistema de HPLC equipado con una química de columna apropiada. La separación cromatográfica de materiales de partida de productos permite entonces la comparación directa del área bajo la curva de esos materiales que puede luego convertirse en un porcentaje de rendimiento de conversión. El ejemplo 15 describe enfoques de IAC y SEC específicos que pueden usarse para determinar el rendimiento de conversión. En una realización preferida, la conversión tal como se menciona en el presente documento se determina mediante el método de SEC del ejemplo 15.
En algunas realizaciones, el rendimiento de conversión para una preparación de polímero de glicano con polímeros de glicano de un DP de más de DP1 (DP>1) después de combinar la una o más subunidades de glicano con la molécula de enzima glicosidasa es mayor de o igual a aproximadamente el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % (tal como se determina en una base de peso/peso como porcentaje de las subunidades de glicano de entrada). En algunas realizaciones, el rendimiento de conversión para una preparación de polímero de glicano con polímeros de glicano de un DP de al menos DP2 después de combinar la una o más subunidades de glicano con la molécula de enzima glicosidasa es mayor de o igual a aproximadamente el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % (tal como se determina en una base de peso/peso como porcentaje de las subunidades de glicano de entrada).
En algunas realizaciones, el rendimiento de conversión para una preparación de polímero de glicano con polímeros de glicano de un DP de al menos DP3 después de combinar la una o más subunidades de glicano con la molécula de enzima glicosidasa es mayor de o igual a aproximadamente el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % (tal como se determina en una base de peso/peso como porcentaje de las subunidades de glicano de entrada).
En algunas realizaciones, el rendimiento de conversión para una preparación de polímero de glicano con DP > 1 después de combinar la una o más unidades de glicano con el catalizador (por ejemplo, a las 2, 3, 4, 8, 12, 24 o 48 horas después de combinar la una o más unidades de glicano con el catalizador) es mayor de aproximadamente el 50 % (por ejemplo, mayor de aproximadamente el 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 98 %). En algunas realizaciones, el rendimiento de conversión para una preparación de polímero de glicano con > DP2 después de combinar la una o más unidades de glicano con el catalizador (por ejemplo, a las 2, 3, 4, 8, 12, 24 o 48 horas después de combinar la una o más unidades de glicano con el catalizador) es mayor del 30 % (por ejemplo, mayor del 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 98 %).
En una realización, aproximadamente el 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o aproximadamente el 97 % de la preparación de polímero de glicano tiene un DP de al menos 2. En una realización, aproximadamente el 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o aproximadamente el 97 % de la preparación de polímero de glicano tiene un DP de al menos 3.
DP promedio
En algunas realizaciones, la preparación de polímero de glicano tiene un grado de polimerización promedio (DP promedio) de aproximadamente DP2, DP3, DP4, DP5, DP6, DP7, DP8 o DP9. En algunas realizaciones, la preparación de polímero de glicano tiene un grado de polimerización promedio (DP promedio) de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 10, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 6, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 4, entre aproximadamente 3 y aproximadamente 10, entre aproximadamente 3 y aproximadamente 8, entre aproximadamente 3 y aproximadamente 6, o entre aproximadamente 3 y aproximadamente 4.
En algunas realizaciones, aproximadamente el 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o aproximadamente el 97 % de la preparación de polímero de glicano tiene un grado de polimerización promedio (Dp ) de aproximadamente DP5, DP6, DP7, Dp8, DP9, DP10, DP11 o DP12. En algunas realizaciones, el DP promedio de la preparación de polímero de glicano es de entre aproximadamente DP5 y DP10, entre aproximadamente Dp6 y DP10, entre aproximadamente DP6 y DP12, entre aproximadamente DP6 y DP14, entre aproximadamente DP8 y DP12, entre aproximadamente DP8 y DP14, entre aproximadamente DP8 y DP16, entre aproximadamente DP10 y DP16, entre aproximadamente DP10 y DP18, entre aproximadamente DP4 y DP18, entre aproximadamente DP6 y DP18 o entre aproximadamente DP8 y DP18.
La distribución del grado de polimerización (DP) (o promedio) de una preparación de polímero de glicano puede determinarse mediante métodos conocidos por el experto en la técnica, por ejemplo usando mediciones de cromatografía de afinidad iónica (IAC) o de exclusión por tamaño (SEC) del peso molecular (PM) seguido por una conversión matemática en DP promedio. Estos métodos se basan generalmente en la separación cromatográfica de materiales basándose en un sistema de HPLC equipado con una química de columna sensible a la masa tal como columnas de exclusión por tamaño o de afinidad iónica seguido por una conversión informática de esa distribución en un PM promedio mediante comparación con un conjunto de patrones con PM conocido. Una vez determinado el PM promedio, la división de ese valor entre el peso promedio de la unidad de repetición de glicano permite el cálculo del DP promedio. El ejemplo 15 describe enfoques de IAC y SEC específicos que pueden usarse para determinar el DP promedio tal como se menciona en el presente documento. En una realización preferida, el DP promedio tal como se menciona en el presente documento se determina mediante el método de SEC del ejemplo 15.
Peso molecular promedio
En algunas realizaciones, aproximadamente el 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o aproximadamente el 97 % de los polímeros de glicano de la preparación tienen un peso molecular promedio de aproximadamente 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800 g/mol y menos de 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900 y 5000 g/mol.
El peso molecular (PM) promedio puede determinarse mediante métodos conocidos por el experto en la técnica, por ejemplo, cromatografía de afinidad iónica (IAC) o cromatografía de exclusión molecular (SEC). Estos métodos se basan generalmente en la separación cromatográfica de materiales basándose en un sistema de HPLC equipado con una química de columna sensible a la masa tal como columnas de exclusión por tamaño o de afinidad iónica seguido por una conversión informática de esa distribución en un PM promedio mediante comparación con un conjunto de patrones con PM conocido. El ejemplo 15 describe enfoques de IAC y SEC específicos que pueden usarse para determinar el PM promedio tal como se menciona en el presente documento. En una realización preferida, el PM promedio tal como se menciona en el presente documento se determina mediante el método de SEC del ejemplo 15.
Grado de ramificación (DB)
En algunas realizaciones, la estructura de las preparaciones de glicano oscila entre lineal y ramificada. Los glicanos ramificados pueden contener al menos una subunidad de glicano que se une por medio de un enlace glicosídico alfa o a beta para formar una ramificación. La tasa de ramificación o grado de ramificación (DB) puede variar, de manera que los polímeros de glicano de una preparación comprenden al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos aproximadamente 6 puntos de ramificación en el polímero de glicano. En algunas realizaciones, los polímeros de glicano de la preparación de glicano no están ramificados (DB=0).
En algunas realizaciones, la estructura de las preparaciones de glicano (por ejemplo oligo- o polisacáridos) osicla entre lineal y altamente ramificada. Los glicano no ramificados pueden contener solo uniones alfa o solo uniones beta. Los glicanos no ramificados pueden contener al menos una unión alfa y al menos una beta. Los glicanos ramificados pueden contener al menos una unidad de glicano que se une por medio de un enlace glicosídico alfa o uno beta para formar una ramificación. La tasa de ramificación o grado de ramificación (DB) puede variar, de manera que aproximadamente cada 2a, 3a, 4a, 5a, 6a, 7a, 8a, 9a, 10a, 15a, 20a, 25a, 30a, 35a, 40a, 45a, 50a, 60a o 70a unidad comprenda al menos un punto de ramificación. Por ejemplo, el glucógeno animal contiene un punto de ramificación aproximadamente cada 10 unidades.
En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de polímeros de glicano en donde la preparación comprende una mezcla de glicanos ramificados, en donde el grado de ramificación promedio (DB, puntos de ramificación por residuo) es de 0, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 0,95, 0,99, 1 o 2. En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de polímeros de glicano en donde el grado de ramificación promedio es de al menos 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3 o al menos 0,4. En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de polímeros de glicano en donde el grado de ramificación promedio es de entre aproximadamente 0,01 y 0,1, 0,01 y 0,2, 0,01 y 0,3, 0,01 y 0,4, 0,01 y 0,5, 0,01 y 0,6, o entre aproximadamente 0,01 y 0,7. En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de polímeros de glicano en donde el grado de ramificación promedio es de entre aproximadamente 0,05 y 0,1, 0,05 y 0,2, 0,05 y 0,3, 0,05 y 0,4, 0,05 y 0,5, 0,05 y 0,6, o entre aproximadamente 0,05 y 0,7. En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de polímeros de glicano en donde el grado de ramificación promedio no es 0. En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de polímeros de glicano en donde el grado de ramificación promedio no es de entre al menos 0,1 y menos 0,4 o al menos 0,2 y menos 0,4. En algunas realizaciones, las preparaciones de polímeros de glicano comprenden glicanos lineales. En algunas realizaciones, las preparaciones de polímeros de glicano comprenden glicanos que presentan una estructura ramificada o de ramificación en ramificación.
En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de polímeros de glicano en donde el grado de ramificación (DB) promedio no es 0, sino que es de al menos 0,01, 0,05, 0,1 o al menos 0,2, u oscila entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 0,2 o entre aproximadamente 0,05 y 0,1.
El grado de ramificación (DB) de una preparación de polímero de glicano puede determinarse mediante métodos conocidos por el experto en la técnica, por ejemplo, análisis de permetilación. Estos métodos se basan generalmente en la funcionalización química de grupos hidroxilo libres de un glicano seguido por hidrólisis con ácido total y análisis de GC-EM de los monómeros aislados. Por tanto, la fracción de monómeros con múltiples grupos hidroxilos no funcionalizados puede interpretarse que es igual a la fracción de unidades de polímero que se enlazaron a más de otra unidad, por ejemplo, la fracción ramificada. El ejemplo 15 describe enfoques de permetilación específicos que pueden usarse para determinar el DB tal como se menciona en el presente documento. En una realización preferida, el DB tal como se menciona en el presente documento se determina mediante la permetilación del ejemplo 15.
Uniones y enlaces glicosídicos
Las uniones entre las subunidades de glicano individuales que se encuentran en preparaciones de polímeros de glicano pueden incluir alfa 1->2, alfa 1->3, alfa 1->4, alfa 1->5, alfa 1->6, alfa 2->1, alfa 2->3, alfa 2->4, alfa 2->6, beta 1->2, beta 1->3, beta 1->4, beta 1->5, beta 1->6, beta 2->1, beta 2->3, beta 2->4 y beta 2->6.
En algunas realizaciones, las preparaciones de polímeros de glicano comprenden solo uniones alfa. En algunas realizaciones, los polímeros de glicano comprenden solo uniones beta. En algunas realizaciones, los polímeros de glicano comprenden mezclas de uniones alfa y beta.
En algunas realizaciones, la razón de enlace glicosídico alfa:beta en una preparación es de aproximadamente 1:1, 2:1, 3:1, 4:1 o 5:1. En algunas realizaciones, la razón de enlace glicosídico beta:alfa en una preparación es de aproximadamente 1:1, 2:1, 3:1, 4:1 o 5:1.
En algunas realizaciones, la razón de enlace glicosídico alfa:beta en una preparación es de aproximadamente 0,1:1, 0,2:1, 0,3:1, 0,4:1, 0,5:1, 0,6:1, 0,7:1, 0,8:1, 0,9:1, 1:1, 1,2:1, 1,5:1, 1,7:1, 2:1, 2,2:1, 2,5:1, 2,7:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 o aproximadamente 10:1.
En algunas realizaciones, los polímeros de glicano de la preparación de polímero de glicano comprenden tanto enlaces glicosídicos alfa como beta seleccionados del grupo que consiste en enlace glicosídico 1->2, un enlace glicosídico 1->3, un enlace glicosídico 1->4, un enlace glicosídico 1->5 y un enlace glicosídico 1->6. En algunas realizaciones, la preparación de polímero de glicano comprende al menos dos o al menos tres enlaces glicosídicos alfa y beta 1->2, enlaces glicosídicos alfa y beta 1->3, enlaces glicosídicos alfa y beta 1->4, enlaces glicosídicos alfa y beta 1->5 y/o enlaces glicosídicos alfa y beta 1->6.
En algunas realizaciones, los polímeros de glicano de la preparación de glicano comprenden sustancialmente todas las subunidades de glicano configuradas en alfa o beta, opcionalmente comprendiendo aproximadamente el 1 %, 2 %, 3 %, 4 % 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % o 20 % de la otra configuración respectiva.
En algunas realizaciones, las preparaciones de polímeros de glicano comprenden al menos el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, al menos el 99,9 % o incluso el 100 % de glicanos con enlaces glicosídicos alfa. En algunas realizaciones, las preparaciones de polímeros de glicano comprenden al menos el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, al menos el 99,9 % o incluso el 100 % de glicanos con enlaces glicosídicos beta. En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de polímeros de glicano en donde al menos el 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % o al menos el 85 % de glicanos con enlaces glicosídicos que son enlaces glicosídicos alfa, al menos el 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % o al menos el 85 % de glicanos con enlaces glicosídicos que son enlaces glicosídicos beta, y en donde el porcentaje de enlaces glicosídicos alfa y beta no excede el 100 %.
En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de polímeros de glicano en donde al menos el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, al menos el 99,9 % o incluso el 100 % de los enlaces glicosídicos del glicano son uno o más de: enlaces glicosídicos 1->2, enlaces glicosídicos 1->3, enlaces glicosídicos 1->4 y enlaces glicosídicos 1->6. En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de polímeros de glicano en donde al menos el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, al menos el 20 % o el 25 % de cada uno de los enlaces glicosídicos del glicano son enlaces glicosídicos 1->2, 1->3, 1->4 y 1- >6. Opcionalmente, las preparaciones de polímeros de glicano comprenden además al menos el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % o al menos el 85 % de enlaces glicosídicos del glicano que se seleccionan del grupo que consiste en: enlaces glicosídicos alfa 2->1, alfa 2->3, alfa 2->4, alfa 2->6, beta 2->1, beta 2->3, beta 2->4 y beta 2- >6.
En algunas realizaciones, los polímeros de glicano de la preparación de glicano comprenden al menos dos enlaces glicosídicos seleccionados del grupo que consiste en alfa 1->2 y alfa 1->3, alfa 1->2 y alfa 1->4, alfa 1->2 y alfa 1->6, alfa 1->2 y beta 1->2, alfa 1->2 y beta 1->3, alfa 1->2 y beta 1->4, alfa 1->2 y beta 1->6, alfa 1->3 y alfa 1->4, alfa 1->3 y alfa 1->6, alfa 1->3 y beta 1->2, alfa 1->3 y beta 1->3, alfa 1->3 y beta 1->4, alfa 1->3 y beta 1->6, alfa 1->4 y alfa 1->6, alfa 1->4 y beta 1->2, alfa 1->4 y beta 1->3, alfa 1->4 y beta 1->4, alfa 1->4 y beta 1->6, alfa 1->6 y beta 1->2, alfa 1->6 y beta 1->3, alfa 1->6 y beta 1->4, alfa 1->6 y beta 1->6, beta 1->2 y beta 1->3, beta 1->2 y beta 1->4, beta 1->2 y beta 1->6, beta 1->3 y beta 1->4, beta 1->3 y beta 1->6, y beta 1->4 y beta 1->6.
La distribución de las uniones y enlaces glicosídicos puede determinarse mediante métodos conocidos por el experto en la técnica, por ejemplo, espectroscopía de resonancia magnética nuclear bidimensional (RMN 2D). Estos métodos se basan generalmente en cuantificaciones del área bajo la curva (AUC) de picos de diagnóstico para un tipo de unión dado. El ejemplo 15 describe enfoques de RMN 2D específicos que pueden usarse para determinar las uniones y enlaces glicosídicos tal como se menciona en el presente documento. En una realización preferida, las uniones y enlaces glicosídicos se determinan usando el método de RMN 2D del ejemplo 15.
Formas L y D
En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de polímeros de glicano en donde al menos una subunidad de glicano es un azúcar en forma L. En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de glicanos en donde al menos una subunidad de glicano es un azúcar en forma D. En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de glicanos en donde las subunidades de glicano son azúcares en forma L o D tal como se producen de manera natural o son más comunes (por ejemplo D-glucosa, D-xilosa, L-arabinosa).
En algunas realizaciones, la preparación de polímeros de glicano (por ejemplo, oligosacáridos y polisacáridos) comprende una mezcla deseada de formas L y D de subunidades de glicano, por ejemplo, de una razón deseada, tal como: 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 de formas L con respecto a L o de formas D con respecto a L.
En algunas realizaciones, la preparación de polímeros de glicano comprende una mezcla deseada de formas L y D de unidades de glicano, por ejemplo de una razón deseada, tal como: 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:14, 1:16, 1:18, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:100, 1:150 de formas L con respecto a D o de formas D con respecto a L.
En algunas realizaciones, la preparación de polímeros de glicano comprende glicanos con sustancialmente todas las formas L o D de subunidades de glicano, opcionalmente que comprende aproximadamente el 1 %, 2 %, 3 %, 4 % 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % o 20 % de la otra forma respectiva.
Contenido de unidades de glicano
En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de polímeros de glicano en donde al menos una subunidad de glicano es una tetrosa, una pentosa, una hexosa o una heptosa. Opcionalmente, las subunidades de glicano implicadas en la formación de los glicanos de la preparación de polímero de glicano varían. Los ejemplos de subunidades de glicano de monosacárido incluyen hexosas, tales como glucosa, galactosa y fructosa, y pentosas, tales como xilosa. Los monosacáridos tienen generalmente la fórmula química: Cx(H2O)y, donde convencionalmente x > 3. Los monosacáridos pueden clasificarse por el número x de átomos de carbono que contienen, por ejemplo: diosa (2) triosa (3) tetrosa (4), pentosa (5), hexosa (6) y heptosa (7). Las subunidades de glicano de monosacárido pueden existir en una forma acíclica (cadena abierta). Los monosacáridos de cadena abierta con el mismo gráfico molecular pueden existir como dos o más estereoisómeros. Los monosacáridos también pueden existir en una forma cíclica a través de una reacción de adición nucleófila entre el grupo carbonilo y uno de los hidroxilos de la misma molécula. La reacción crea un anillo de átomos de carbono cerrado por un átomo de oxígeno puente. En estas formas cíclicas, el anillo tiene habitualmente 5 (furanosas) o 6 átomos (piranosas).
En algunas realizaciones, la preparación de polímeros de glicano comprende una mezcla deseada de diferentes subunidades de glicano de monosacárido, tal como una mezcla de una diosa (2), una triosa (3), tetrosa (4), pentosa (5), hexosa (6) o heptosa (7). En algunas realizaciones, los polímeros de glicano de la preparación de polímero de glicano comprenden una mezcla deseada de una pentosa (5) y una hexosa (6).
En algunas realizaciones, la preparación de polímeros de glicano comprende una mezcla deseada de dos, tres, cuatro o cinco subunidades de glicano diferentes, tal como una mezcla de, por ejemplo, i) una o más subunidades de glicano seleccionadas de monosacáridos, seleccionados de glucosa, una galactosa, una arabinosa, una manosa, una fructosa, una xilosa, una fucosa y una ramnosa; ii) una o más subunidades de glicano seleccionadas de disacáridos seleccionados de acarviosina, n-acetilactosamina, alolactosa, celobiosa, quitobiosa, galactosa-alfa-1,3-galactosa, gentiobiosa, isomalt, isomaltosa, isomaltulosa, kojibiosa, lactitol, ácido lactobiónico, lactosa, lactulosa, laminaribiosa, maltitol, maltosa, manobiosa, melibiosa, melibiulosa, neohesperidosa, nigerosa, robinosa, rutinosa, sambubiosa, soforosa, sucralosa, sacarosa, acetato isobutirato de sacarosa, octaacetato de sacarosa, trehalosa, turanosa, vicianosa y xilobiosa; iii) una o más subunidades de glicano seleccionadas de aminoazúcares seleccionados de acarbosa, N-acetilmanosamina, ácido N-acetilmurámico, ácido N-acetilneuramínico, ácido N-acetiletalosaminurónico, arabinopiranosil-N-metil-N-nitrosourea, D-fructosa-L-histidina, ácido N-glicolineuramínico, cetosamina, kidamicina, manosamina, 1B-metilseleno-N-acetil-D-galactosamina, ácido murámico, muramil dipéptido, fosforribosilamina, PUGNAc, sialil-Lewis A, sialil-Lewis X, validamicina, voglibosa, N-acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina, aspartilglucosamina, bacilitiol, daunosamina, desosamina, fructosamina, galactosamina, glucosamina, meglumina y perosamina; iv) una o más subunidades de glicano seleccionadas de desoxiazúcares seleccionados de 1-5-ahidroglucitol, cladinosa, colitosa, 2-desoxi-D-glucosa, 3-desoxiglucasona, desoxirribosa, didesoxinucleótido, digitalosa, fludesoxiglucosa, sarmentosa y sulfoquinovosa; v) una o más subunidades de glicano seleccionadas de iminoazúcares seleccionados de castanospermina, 1-desoxinojirimicina, iminoazúcar, miglitol, miglustat y swainsonina; una o más subunidades de glicano seleccionadas de ácidos de azúcar seleccionados de ácido N-acetilneuramínico, ácido N-acetiltalosamnurónico, ácido aldárico, ácido aldónico, ácido 3-desoxi-D-mano-oct-2-ulosónico, ácido glucurónico, ácido glucosaminurónico, ácido glicérico, ácido N-glicolilneuramínico, ácido idurónico, ácido isosacarínico, ácido pangámico, ácido siálico, ácido treónico, ácido ulosónico, ácido urónico, ácido xilónico, ácido glucónico, ácido ascórbico, ácido cetodesoxioctulosónico, ácido galacturónico, ácido galactosaminurónico, ácido manurónico, ácido manosaminurónico, ácido tartárico, ácido múcico, ácido sacárico, ácido láctico, ácido oxálico, ácido succínico, ácido hexanoico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido butírico, ácido cítrico, ácido glucosamínico, ácido málico, ácido succinámico, ácido sebácico y ácido cáprico; vi) una o más subunidades de glicano seleccionadas de ácidos grasos de cadena corta seleccionados de ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico y ácido isovalérico; y vii) una o más subunidades de glicano seleccionadas de alcoholes de azúcar seleccionados de metanol, etilenglicol, glicerol, eritritol, treitol, arabitol, ribitol, xilitol, manitol, sorbitol, galactitol, iditol, volemitol, fucitol, inositol, maltotritol, maltotetraitol y poliglicitol.
Se describen glicanos a modo de ejemplo mediante un código de tres letras que representa el componente de azúcar monomérico seguido de un número entre cien que refleja el porcentaje del material que constituye el monómero. Por lo tanto, 'glu100' se atribuye a un glicano generado a partir de un aporte del 100 % de D-glucosa (unidad de glicano) y 'glu50gal50' se atribuye a un glicano generado a partir de un aporte del 50 % de D-glucosa y el 50%de D-galactosa (unidades de glicano) o, alternativamente, a partir de un aporte de dímero de lactosa (unidad de glicano). Tal como se usa en el presente documento: xilo = D-xilosa; ara = L-arabinosa; gal = D-galactosa; glu = D-glucosa; rha = L-ramnosa; fuc = L-fucosa; man = D-manosa; sor = D-sorbitol; gly = D-glicerol; neu = ácido NAc-neuramínico.
En algunas realizaciones, la preparación de polímeros de glicano comprende una unidad de glicano A seleccionada de i) a vii) anteriores, en donde la unidad de glicano A comprende el 100 % del aporte de unidades de glicano. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la preparación de polímero de glicano se selecciona de los homoglicanos xyl100, rha100, ara100, gal 100, glu100 y man100. En algunas realizaciones, la preparación de polímero de glicano se selecciona de los homoglicanos fuc100 y fru100.
En algunas realizaciones, la preparación de polímeros de glicano comprende una mezcla de dos unidades de glicano A y B seleccionadas independientemente de i) a vii) anteriores, en donde A y B pueden seleccionarse del mismo o diferente grupo i) a vii) y en donde A y B pueden seleccionarse en cualquier razón deseada (por ejemplo, entre el 1-99 % de A y entre el 99-1 % de B, sin exceder el 100 %).
Por ejemplo, en algunas realizaciones, la preparación de polímero de glicano se selecciona de los heteroglicanos ara50gal50, ara50gal50, xyl75gal25, ara80xyl20, ara60xyl40, ara50xyl50, glu80man20, glu60man40, man80glu20, man60glu40, xyl75ara25, gal75xyl25, Man80gal20, gal75xyl25, Man66gal33, Man75gal25, glu80gal20, glu60gal40, glu40gal60, glu20gal80, gal80man20, gal60man40, gal40man60, glu80xyl20, glu60xyl40, glu40xyl60, glu20xyl80, glu80ara20, glu60ara40, glu40ara60, glu20ara80, gal80xyl20, gal 60xyl40, gal40xyl60, gal20xyl80, gal80ara20, gal60ara40, gal40ara60, gal20ara80, man80xyl20, man60xyl40, man40xyl60, man20xyl80, man80ara20, man60ara40, man40ara60, man20ara80, xyl80ara20, xyl60ara40, glu50gal50 y man62glu38.
En algunas realizaciones, la preparación de polímeros de glicano comprende una mezcla de tres unidades de glicano A, B y C seleccionadas independientemente de i) a vii) anteriores, en donde A, B y C pueden seleccionarse del mismo o de un grupo diferente i) a vii) y en donde A, B y C pueden seleccionarse en cualquier razón deseada (por ejemplo, en cualquier lugar entre el 1-99 % de A, el 1-99 % de B, el 1-99 % de C, sin exceder el 100 %).
Por ejemplo, en algunas realizaciones, la preparación de polímero de glicano se selecciona de los heteroglicanos xyl75glu12gal12, xyl33glu33gal33, xyl75glu12gal12, glu33gal33fuc33, glu33gal33nman33, glu33gal33xyl33, glu33gal33ara33, gal33man33xyl33, gal33man33ara33, man52glu29gal19, Glu33Man33Xyl33, Glu33Man33Ara33, Glu33Xyl33Ara33, Gal33Man33Xyl33, Gal33Man33Ara33, Gal33Xyl33Ara33, Man33Xyl33Ara33, Glu90Gal5Man5, Glu80Gal10Man10, Glu60Gal20Man20, Glu40Gal30Man30, Glu20Gal40Man40, Glu10Gal45Man45, Glu5Gal90Man5, Glu10Gal80Man10, Glu20Gal60Man20, Glu30Gal40Man30, Glu40Gal 20Man40, Glu45Gal10Man45, Glu5Gal5Man90, Glu10Gal10Man80, Glu20Gal20Man60, Glu30Gal30Man40, Glu40Gal40Man20 y Glu45Gal45Man10.
En algunas realizaciones, la preparación de polímeros de glicano comprende una mezcla de cuatro unidades de glicano A, B, C y D seleccionadas independientemente de i) a vii) anteriores, en donde A, B, C y D pueden seleccionarse del mismo o de un grupo diferente i) a vii) y en donde A, B, C y D pueden seleccionarse en cualquier razón deseada (por ejemplo, en cualquier lugar entre el 1-99 % de A, el 1-99 % de B, el 1-99 % de C, el 1-99 % de D, sin exceder el 100%).
En algunas realizaciones, la preparación de polímeros de glicano comprende una mezcla de cinco unidades de glicano A, B, C, D y E seleccionadas independientemente de i) a vii) anteriores, en donde A, B, C, D y E pueden seleccionarse de entre mismo o un grupo diferente i) a vii) y en donde A, B, C, D y E pueden seleccionarse en cualquier razón deseada (por ejemplo, en cualquier lugar entre el 1-99 % de A, el 1-99 % de B, el 1-99 % de C, el 1-99% de D, el 1-99% de E, sin exceder el 100%).
En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de polímeros de glicano, en donde al menos una subunidad de glicano se selecciona del grupo que consiste en una glucosa, una galactosa, una arabinosa, una manosa, una fructosa, una xilosa, una fucosa y una ramnosa.
En algunas realizaciones, la preparación de polímeros de glicano comprende una mezcla deseada de dos subunidades de glicano de monosacárido diferentes, tal como una mezcla de, por ejemplo, glucosa y galactosa, glucosa y arabinosa, glucosa y manosa, glucosa y fructosa, glucosa y xilosa, glucosa y fucosa, glucosa y ramnosa, galactosa y arabinosa, galactosa y manosa, galactosa y fructosa, galactosa y xilosa, galactosa y fucosa, y galactosa y ramnosa, arabinosa y manosa, arabinosa y fructosa, arabinosa y xilosa, arabinosa y fucosa, y arabinosa y ramnosa, manosa y fructosa, manosa y xilosa, manosa y fucosa, y manosa y ramnosa, fructosa y xilosa, fructosa y fucosa, y fructosa y ramnosa, xilosa y fucosa, xilosa y ramnosa, y fucosa y ramnosa, por ejemplo en una razón de 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 o 1:5 o la razón inversa de las mismas, o en una razón de 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:14, 1:16, 1:18, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, o 1:100 o la razón inversa de las mismas.
En algunas realizaciones, la preparación de polímeros de glicano comprende una mezcla deseada de tres subunidades de glicano de monosacárido diferentes, tal como una mezcla de, por ejemplo para preparaciones de glicano que contienen glucosa, glucosa, galactosa y arabinosa; glucosa, galactosa y manosa; glucosa, galactosa y fructosa; glucosa, galactosa y xilosa; glucosa, galactosa y fucosa, glucosa, galactosa y ramnosa; glucosa, arabinosa y manosa; glucosa, arabinosa y fructosa; glucosa, arabinosa y xilosa; glucosa, arabinosa y fucosa; glucosa, arabinosa y ramnosa; glucosa, manosa y fructosa; glucosa, manosa y xilosa; glucosa, manosa y fucosa; glucosa, manosa y ramnosa; glucosa, fructosa y xilosa; glucosa, fructosa y fucosa; glucosa, fructosa y ramnosa; glucosa, fucosa y ramnosa, por ejemplo en una razón de 1:1:1, 1:2:1, 1:3:1, 1:4:1, 1:5:1, 1:1:2, 1:2:2, 1:3:2, 1:4:2, 1:1:3, 1:2:3, 1:3:3, 1:1:4, 1:2:4, 1:1:5, 1:2:5, , etc., o en una razón de 1:1:1, 1:2:1, 1:3:1, 1:4:1, 1:5:1, 1:6:1, 1:7:1, 1:8:1, 1:9:1, 1:10:1, 1:12:1, 1:14:1, 1:16:1, 1:18:1, 1:20:1, 1:1:2, 1:2:2, 1:3:2, 1:4:2, 1:5:2, 1:6:2, 1:7:2, 1:8:2, 1:9:2, 1:10:2, 1:1:3, 1:2:3, 1:3:3, 1:4:3, 1:5:3, 1:6:3, 1:7:3, 1:8:3, 1:9:3, 1:10:3, 1:1:4, 1:2:4, 1:3:4, 1:4:4, 1:5:4, 1:6:4, 1:7:4, 1:8:4, 1:9:4, 1:10:4, 1:1:5, 1:2:5, 1:3:5, 1:4:5, 1:5:5, 1:6:5, 1:7:5, 1:8:5, 1:9:5, 1:10:5, etc.
En algunas realizaciones, la preparación de polímeros de glicano no comprende N-acetilgalactosamina o N-acetilglucosamina. En algunas realizaciones, la preparación de glicanos no comprende ácido siálico. En algunas realizaciones, la preparación de polímeros de glicano no comprende un lípido ni ácido graso. En algunas realizaciones, la preparación de polímeros de glicano no comprende un aminoácido.
Furanosa.piranosa
En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de polímeros de glicano en donde al menos una subunidad de glicano es un azúcar de furanosa. En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de glicanos en donde al menos una subunidad de glicano es un azúcar de piranosa. En algunas realizaciones, los polímeros de glicano comprenden mezclas de azúcares de furanosa y piranosa. En algunas realizaciones, la razón de azúcar de furanosa:piranosa en una preparación es de aproximadamente 0,1:1, 0,2:1, 0,3:1, 0,4:1, 0,5:1, 0,6:1, 0,7:1, 0,8:1, 0,9:1, 1:1, 1,2:1, 1,5:1, 1,7:1, 2:1, 2,2:1, 2,5:1, 2,7:1, 3:1, 4:1, 5:1 o aproximadamente 6:1 o la razón de azúcar de furanosa:piranosa en una preparación es de aproximadamente 7:1, 8:1, 9:1 o aproximadamente 10:1.
En algunas realizaciones, la preparación de polímeros de glicano comprende sustancialmente todo azúcar de furanosa o piranosa, comprendiendo opcionalmente el 1 %, 2 %, 3 %, 4 % 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % o 20 % del otro azúcar respectivo.
En algunas realizaciones, la preparación de polímeros de glicano comprende sustancialmente todo azúcar de piranosa y no más de aproximadamente el 0,1 %, 02 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 % o no más del 5 % de unidades de glicano en la preparación en forma de furanosa. En algunas realizaciones, no más del 3 %, 2 % o no más del 1 % de unidades de glicano monoméricas en la preparación están en forma de furanosa.
Sales
En algunas realizaciones, la preparación de polímeros de glicano comprende una subunidad de glicano o pluralidad de subunidades de glicano presentes en una forma de sal (por ejemplo, una forma de sal farmacéuticamente aceptable), tal como, por ejemplo, una sal de clorhidrato, yodhidrato, bromhidrato, fosfato, sulfato, metanosulfato, acetato, formiato, tartrato, malato, citrato, succinato, lactato, gluconato, piruvato, fumarato, propionato, aspartato, glutamato, benzoato, ascorbato.
Derivatización
Si se desea, las subunidades de glicano de monosacárido u oligosacárido de los glicanos se sustituyen o derivatizan adicionalmente, por ejemplo, los grupos hidroxilo pueden eterificarse o esterificarse. Por ejemplo, los glicanos (por ejemplo oligo- o polisacárido) pueden contener unidades de sacárido modificadas, tales como 2'-desoxirribosa en donde se elimina un grupo hidroxilo, 2'-fluororribosa en donde se reemplaza un grupo hidroxilo c un flúor, o N-acetilglucosamina, una forma que contiene nitrógeno de glucosa (por ejemplo, 2'-fluororribosa, desoxirribose y hexosa). El grado de sustitución (DS, número promedio de grupos hidroxilo por unidad de glicosilo) puede ser de 1, 2 o 3, u otro DS adecuado. En algunas realizaciones, el 1 %, 2 %, 3 %, 4 % 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de las subunidades de glicano están sustituidas o derivatizadas. En algunas realizaciones, el grado de sustitución varía entre las subunidades, por ejemplo, un determinado porcentaje no se derivatiza, presenta un DS de 1, presenta un DS de 2 o presenta un DS de 3. Puede generarse cualquier mezcla deseada, por ejemplo el 0-99 % de las subunidades no están derivatizadas, el 0-99 % de las subunidades presentan un DS de 1, el 0-99 % de las subunidades presentan un DS de 2 y el 0-99 % de las subunidades presentan un DS de 3, constituyendo el total el 100 %. El grado de sustitución puede controlarse ajustando el número promedio de moles de sustituyente añadido a un resto glicosilo (sustitución molar (MS)). La distribución de sustituyentes a lo largo de la longitud de la cadena de oligo- o polisacárido de glicano puede controlarse ajustando las condiciones de reacción, el tipo de reactivo y la magnitud de la sustitución. En algunas realizaciones, las subunidades monoméricas se sustituyen con uno o más de un éster de acetato, semiéster de sulfato, éster de fosfao o un grupo acetal cíclico de piruvilo.Solubilidad
En algunas realizaciones, los polímeros de glicano en una preparación son altamente solubles. En algunas realizaciones, las preparaciones de polímeros de glicano pueden concentrarse hasta al menos 55 Brix, 65 Brix, 60 Brix, 65 Brix, 70 Brix, 75 Brix, 80 Brix o al menos 85 Brix sin solidificación o cristalización obvia a 23 °C (límite de solubilidad final). En algunas realizaciones, las preparaciones de polímeros de glicano se concentran hasta al menos aproximadamente 0,5 g/ml, 1 g/ml, 1,5 g/ml, 2 g/ml, 2,5 g/ml, 3 g/ml, 3,5 g/ml o al menos 4 g/ml sin solidificación o cristalización obvia a 23 °C (límite de solubilidad final).
En algunas realizaciones, las preparaciones de polímeros de glicano (por ejemplo oligosacáridos) están ramificadas, por ejemplo, tienen un DB promedio de al menos 0,01, 0,05 o 0,1 y tienen un límite de solubilidad final en agua de al menos aproximadamente 70 Brix, 75 Brix, 80 Brix o al menos aproximadamente 85 Brix a 23 °C o es de al menos aproximadamente 1 g/ml, 2 g/ml o al menos aproximadamente 3 g/ml.
En algunas realizaciones, la preparación de polímeros de glicano tiene un límite de solubilidad final de al menos 0,001 g/l, 0,005 g/l, 0,01 g/l, 0,05 g/l, 0,1 g/l, 0,2 g/l, 0,3 g/l, 0,4 g/l, 0,5 g/l, 0,6 g/l, 0,7 g/l, 0,8 g/l, 0,9 g/l, 1 g/l, 5 g/l, 10 g/l, 20 g/l, 30 g/l, 40 g/l, 50 g/l, 100 g/l, 200 g/l, 300 g/l, 400 g/l, 500 g/l, 600 g/l, 700 g/l, 800 g/l, 900 g/l, 1000 g/l en agua desionizada, o en un tampón adecuado tal como, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4 o pH fisiológico similar) y a 20 °C. En algunas realizaciones, la preparación de polímeros de glicano es más del 50 %, más del 60 %, más del 70 %, más del 80 %, más del 90 %, más del 95 %, más del 96 %, más del 97 %, más del 98 %, más del 99 % o más del 99,5 % soluble sin precipitación observada a una concentración de más de 0,001 g/l, 0,005 g/l, 0,01 g/l, 0,05 g/l, 0,1 g/l, 0,2 g/l, 0,3 g/l, 0,4 g/l, 0,5 g/l, 0,6 g/l, 0,7 g/l, 0,8 g/l, 0,9 g/l, 1 g/l, 5 g/l, 10 g/l, 20 g/l, 30 g/l, 40 g/l, 50 g/l, 100 g/l, 200 g/l, 300 g/l, 400 g/l, 500 g/l, 600 g/l, 700 g/l, 800 g/l, 900 g/l, 1000 g/l en agua desionizada, o en un tampón adecuado tal como, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4 o pH fisiológico similar) y a 20 °C.
Dulzor
En algunas realizaciones, la preparación de polímeros de glicano tiene un grado de dulzor deseado. Por ejemplo, la sacarosa (azúcar de mesa) es el prototipo de sustancia dulce. La sacarosa en disolución tiene una clasificación de percepción de dulzor de 1, y otras sustancias se clasifican en relación a esto (por ejemplo, la fructosa se clasifica en 1,7 veces el dulzor de la sacarosa). En algunas realizaciones, el dulzor de la preparación de polímeros de glicano oscila entre 0,1 y 500.000 en relación con la sacarosa. En algunas realizaciones, el dulzor relativo es de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 25000, 50000, 75000, 100000, 150000, 200000, 250000, 300000, 350000, 40000, 450000, 500000 o más de 500.000 en relación con la sacarosa (puntuada la sacarosa como uno). En algunas realizaciones, la preparación de polímeros de glicano es ligeramente dulce, o tanto dulce como amarga.
En algunas realizaciones, la preparación de polímeros de glicano, por ejemplo una preparación que es sustancialmente DP2+ o DP3+ (por ejemplo, al menos el 80 %, el 90 % o al menos el 95 %, o una preparación fraccionada de DP2+ o DP3+), es sustancialmente imperceptible como dulce y el dulzor relativo es de aproximadamente 0, 0,0001, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 o aproximadamente 0,8 en relación con la sacarosa (puntuada la sacarosa como uno).
Fermentabilidad
En algunas realizaciones, las preparaciones de polímeros de glicano dadas a conocer en el presente documento se examinan para evaluar su fermentabilidad. La fermentabilidad de un polímero de glicano es función del número o representación de enlaces glicosídicos hidrolizables en las especies de glicano de la preparación. En algunas realizaciones, la fermentabilidad se somete a prueba usando una enzima glicosidasa o una molécula de enzima glicosidasa descrita en el presente documento. Se cree que un polímero de glicano producido mediante los métodos descritos en el presente documento, por ejemplo, utilizando una molécula de enzima glicosidasa, es un sustrato para una enzima glicosidasa (por ejemplo, la de un microbio intestinal humano) que está estrechamente relacionada con la molécula de enzima glicosidasa (por ejemplo, comparten un alto grado de homología de secuencia relevante, la molécula de la enzima glicosidasa es un derivado de la enzima glicosidasa, comparten el mismo origen (por ejemplo, origen microbiano, comparten la misma funcionalidad glicosídica, son miembros de la familia CAZy de glicósido hidrolasa o glicósido transferasa, etc.).
En algunas realizaciones, el grado de fermentabilidad de la preparación de polímero de glicano es de 30 minutos o menos, 20 minutos o menos, 15 minutos o menos, 10 minutos o menos, 5 minutos o menos, 4 minutos o menos, 3 minutos o menos, 2 minutos o menos o 1 minuto o menos. En algunas realizaciones, la digestibilidad de la preparación de polímero de glicano es de 30 minutos o más, 45 minutos o más, 1 hora o más, 2 horas o más, 3 horas o más, 4 horas o más, 5 horas o más, o 10 horas o más, en el que el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % de los glicanos de la preparación se han fermentado, por ejemplo, descompuesto, de modo que los polímeros de glicano de la preparación presentan una reducción en el DP promedio (por ejemplo, DP = 5 a DP = 4) y/o una ganancia (o pérdida) de fracciones de peso molecular pequeño (por ejemplo, monómeros, dímeros, trímeros) mediante metodología convencional (por ejemplo, cromatografía de exclusión molecular). En algunas realizaciones, los polímeros de glicano de la preparación de polímero de glicano comprenden menos del 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 12 %, 14 %, 16 %, 18 %, 20 %, 30 %, 40 % o menos del 50 % de enlaces que son hidrolizables por una enzima de mamífero (por ejemplo, amilasa).
Pueden usarse ensayos adecuados para evaluar la fermentabilidad comparativa (por ejemplo, frente a un glicano de referencia) o para evaluar la digestibilidad absoluta.
Identificación y análisis de polímeros de glicano
Los siguientes aspectos y realizaciones para identificar y analizar polímeros de glicano tienen fines ilustrativos.
Si se desea, pueden caracterizarse las preparaciones de polímeros de glicano. Por ejemplo, los bloques de construcción monoméricos (por ejemplo, la composición de subunidades de monosacárido o glicano), la configuración anomérica de las cadenas laterales, la presencia y ubicación de grupos sustituyentes, el grado de polimerización/peso molecular y el patrón de unión pueden identificarse mediante métodos convencionales conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, análisis de metilación, escisión reductora, hidrólisis, GC-MS (cromatografía de gases-espectrometría de masas), MALDI-MS (desorción/ionización por láser asistida por matriz-espectrometría de masas), ESI-MS (ionización por electropulverización-espectrometría de masas), HPLC (cromatografía de líquidos de alto rendimiento con detección ultravioleta o de índice de refracción), HPAEC-PAD (cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento con detección amperométrica pulsada), CE (electroforesis capilar), espectroscopia IR (infrarroja)/Raman y técnicas de espectroscopía de RMN (resonancia magnética nuclear). Para polímeros de consistencia cristalina, la estructura cristalina puede resolver usando, por ejemplo, RMN de estado sólido, FT-IR (espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier) y WAXS (dispersión de rayos X de gran ángulo). El DP, la distribución de DP y la polidispersidad pueden determinarse, por ejemplo, mediante viscosimetría y SEC (SEC-HPLC, cromatografía de exclusión molecular de alto rendimiento). Pueden identificarse grupos extraños, grupos terminales y sustituyentes, por ejemplo, usando SEC con marcaje, análisis acuoso, MALDI-MS, FT-IR y RMN. Para identificar los componentes monoméricos de los glicanos, pueden usarse métodos tales como, por ejemplo, hidrólisis catalizada por ácido, HPLC (cromatografía de líquidos de alto rendimiento) o GLC (cromatografía de gas-líquido) (después de la conversión en acetatos de alditol). Para determinar las uniones presentes en los glicanos, en un ejemplo, el polisacárido se metila con yoduro de metilo y una base fuerte en DMSO, se realiza hidrólisis, se logra una reducción a alditoles parcialmente metilados, se realiza una acetilación a acetatos de alditol metilados y el análisis se lleva a cabo mediante GLC/MS (cromatografía de gas-líquido acoplada a espectrometría de masas). En algunas realizaciones, para determinar la secuencia de polisacáridos se lleva a cabo una despolimerización parcial usando un ácido o enzimas para determinar las estructuras. Se comparan las posibles estructuras del polisacárido con las de los oligómeros hidrolíticos y se determina cuál de las posibles estructuras podría producir los oligómeros. Para identificar la configuración anomérica, en un ejemplo, el polisacárido intacto o una preparación de oligosacáridos se someten a análisis enzimático, por ejemplo, se ponen en contacto con una enzima que es específica para un tipo particular de unión, por ejemplo, p-galactosidasa o a-glucosidasa, etc., y puede usarse RMN para analizar los productos.
Por ejemplo, la distribución del grado de polimerización (DP) (o promedio) de una preparación de polímero de glicano puede medirse inyectando una muestra con una concentración de, por ejemplo, 10-100 mg/ml en un instrumento HPLC Agilent 1260 BioPure (o similar) equipado con una columna BioRad Aminex HPX-42A de 7,8x300 mm (o similar) y un detector de RI tal como se describe, por ejemplo, en Gómezet al.(Purification, Characterization, and Prebiotic Properties of Pectic Oligosaccharides from Orange Peel Wastes, J Agric Food Chem, 2014, 62:9769). Alternativamente, puede inyectarse una muestra con una concentración en un instrumento HPLC Dionex ICS5000 (o similar) equipado con una columna Dionex CarboPac PA1 de 4x250 mm (o similar) y un detector de PAD tal como se describe, por ejemplo, en Holcket al.,(Feruloylated and nonferuloylated arabino-oligosaccharides from sugar beet pectin selectively stimulate the growth of bifidobacterium spp. in human fecal in vitro fermentations, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(12), 6511-6519). La integración del espectro resultante en comparación con una disolución parón de oligómeros permite la determinación del DP promedio.
La distribución de pesos moleculares puede medirse, por ejemplo, mediante espectrometría de masas MALDI. La concentración de oligosacáridos puede medirse con un refractómetro de azúcar Mettler-Toledo (o similar) con el valor final ajustado frente a una curva estandarizada para tener en cuenta las diferencias de refracción entre monómeros y oligómeros.
La distribución de la regioquímica de glicósidos puede caracterizarse, por ejemplo, mediante una variedad de técnicas de RMN 2D que incluyen análisis COSY, HMBC, HSQC, DEPT y TOCsY usando secuencias de pulsos convencionales y un espectrómetro Bruker de 500 MHz. Los picos pueden asignarse mediante correlación con los espectros de polisacáridos que se producen de manera natural con regioquímica conocida.
Las composiciones monoméricas de oligómeros pueden medirse, por ejemplo, mediante el método de hidrólisis completa en el que se disuelve una cantidad conocida de oligómero en un ácido fuerte a temperatura elevada y se deja tiempo suficiente para que se produzca la hidrólisis total. Luego, la concentración de monómeros individuales puede medirse mediante los métodos de HPLC o GC descritos en el presente documento y conocidos en la técnica para lograr mediciones de abundancia relativa como en Holcket al.Pueden medirse cantidades absolutas añadiendo a la muestra de HPLC una cantidad conocida de patrón activo del detector seleccionado para evitar la superposición con cualquiera de las señales críticas.
El grado de ramificación en cualquier población dada puede medirse mediante el método de análisis de metilación establecido, por ejemplo, por Hakomori (J. Biochem. (Tokio), 1964, 55, 205). Con estos datos, puede establecerse la identificación de posibles unidades de repetición combinando datos de la hidrólisis total, el DP promedio y el análisis de metilación y comparándolos con el espectro de RMN DEPT. La correlación del número de señales de carbono anomérico con estos datos indica si se requiere una unidad de repetición regular para satisfacer los datos recogidos tal como se demuestra, por ejemplo, en Harding,et al.(Carbohydr. Res. 2005, 340, 1107).
El porcentaje molar de especies con un grado de polimerización (DP) de n (indicado en este caso como DP(n)) en una población se determina mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC), por ejemplo, en un instrumento de la serie Agilent 1260 BioInert equipado con un detector de índice de refracción (RI) y una variedad de columnas familiares para los expertos en la técnica usando agua como fase móvil. Las columnas se seleccionan de químicas que incluyen, pero no se limitan a, HILIC, coordinación de metales y cromatografía acuosa de exclusión por tamaño que aíslan mejor las especies de interés. El % molar de DP(n) está determinado por la fórmula:
% DP(n) = 100 * AUC [DP(n)] / AUC [DP(total)],
donde AUC se define como el área bajo la curva de la especie de interés tal como se determina por calibración con patrones conocidos. El porcentaje molar de isómeros de enlaces glicosídicos (% alfa y % beta) se determinan mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) usando una variedad de técnicas 2D familiares para los expertos en la técnica. Los isómeros alfa y beta pueden distinguirse, por ejemplo, por su distinto desplazamiento en el espectro de RMN y el porcentaje molar se determina mediante la fórmula:
% (isómero glicosídico n) de enlaces glicosídicos = 100* AUC [desplazamiento (isómero n)] / AUC [desplazamiento (isómero alfa isómero beta)],
donde AUC se define como el área bajo la curva en un valor de desplazamiento específico que se sabe que representa el isómero deseado n. El porcentaje molar de isómeros regioquímicos se determina de forma análoga usando la fórmula:
% (regioisómero n) de regioisómeros = 100* AUC [desplazamiento (regioisómero n)] / AUC [desplazamiento (todos los regioisómeros)].
El porcentaje relativo de azúcares monoméricos que constituyen la población oligomérica se determina, por ejemplo, mediante digestión ácida total de la muestra oligomérica seguido por conversión al acetato de alditol seguido por análisis de cromatografía de gases (GC) de las disoluciones monoméricas resultantes en comparación con GC de patrones conocidos. El porcentaje molar de monómero(n), donde n puede ser cualquier azúcar, se determina mediante la fórmula:
% (azúcar n) = 100* AUC [azúcar n] / AUC [total de todos los azúcares monoméricos].
En algunas realizaciones, la solubilidad de la preparación de polímeros de glicano puede controlarse, por ejemplo, seleccionando la carga, estructura (por ejemplo, DP, grado de ramificación) y/o derivatización de las unidades de glicano.
Las preparaciones de polímeros de glicano que consisten en un tipo de unidad de azúcar unida uniformemente en cadenas lineales son habitualmente insolubles en agua a 23 °C incluso cuando los glicanos tienen un peso molecular bajo con grados de polimerización (DP) de entre 20 y 30. El grado de solubilidad de los polímeros de glicano pueden ajustarse, por ejemplo, mediante la introducción de uniones (1->6) y enlaces glicosídicos alternos en los glicanos. Los grados de libertad adicionales proporcionados por la rotación alrededor de los enlaces C-5 a C-6 proporcionan valores de entropía en disolución más altos. Los homoglicanos con dos tipos de uniones de azúcar o heteroglicanos compuestos por dos tipos de azúcares son generalmente más solubles que los polímeros homogéneos. La ionización de homoglicanos lineales puede añadir solubilidad, por ejemplo, a la de los geles. La viscosidad de las disoluciones depende a menudo de las estructuras terciarias de los glicanos.
Formulaciones y dosificaciones de polímeros de glicano
Los siguientes aspectos y realizaciones para preparar polímeros de glicano con formulaciones específicas tienen fines ilustrativos.
En el presente documento también se proporcionan métodos para producir composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) que comprenden una preparación de polímero de glicano que cumple con una o más, dos o más, tres o más o cuatro o más de las características de las preparaciones descritas en el presente documento (incluidos los criterios (i)-(v) anteriores). En particular, los métodos incluyen proporcionar una preparación de polímero de glicano y adquirir el/los valor(es) para una o más, dos o más, o tres o más características de la preparación, incluido, por ejemplo, i) el grado de polimerización (DP), ii) el grado de ramificación promedio (DB, puntos de ramificación por residuo), iii) la razón de enlaces alfa-glicosídicos con respecto a beta-glicosídicos, iv) la identidad de las subunidades de glicano y v) la razón de subunidades de glicano, y producir un composición farmacéutica que comprende una preparación de polímero de glicano si los criterios deseados o predeterminados de la preparación se cumplen dentro de un intervalo de desviación deseado.
En la técnica se conocen métodos para formular la preparación de polímero de glicano en una composición farmacéutica, alimento médico o suplemento dietético y pueden incluir uno o más, dos o más, tres o más, o cuatro o más de las siguientes etapas: (i) formular la preparación para dar un producto farmacéutico, (ii) envasar la preparación, (iii) etiquetar la preparación envasada y (iv) vender u ofrecer para la venta la preparación envasada y etiquetada. La formulación de la preparación de polímero de glicano para dar un producto farmacéutico se conoce en la técnica y puede incluir uno o más, dos o más, tres o más, o cuatro o más de las siguientes etapas: (i) eliminar constituyentes no deseados de la preparación, (ii) reducir el volumen de la preparación, (iii) esterilizar la preparación, (iv) mezclar la preparación con un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable, (v) mezclar la preparación con un segundo fármaco o agente farmacéutico, (vi) formular la preparación en una consistencia adecuada, tal como, por ejemplo, una disolución acuosa diluida, un jarabe o un sólido, (vii) formular la preparación en una forma de dosificación adecuada, por ejemplo, en un comprimido, pastilla o cápsula.
En algunas realizaciones, la preparación de polímero de glicano se somete a un procesamiento adicional para producir o bien jarabe o bien polvo de polímero de glicano. Por ejemplo, en una variación, la preparación de polímero de glicano se concentra para formar un jarabe. Puede usarse cualquier método adecuado conocido en la técnica para concentrar una disolución, tal como el uso de un evaporador a vacío. En otra variación, la preparación de polímero de glicano se seca por pulverización para formar un polvo. Puede usarse cualquier método adecuado conocido en la técnica para secar por pulverización una disolución para formar un polvo. En el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticas, alimentos médicos y suplementos dietéticos que comprenden preparaciones de polímeros de glicano. Opcionalmente, las composiciones farmacéuticas, alimentos médicos y suplementos dietéticos que comprenden preparaciones de polímeros de glicano comprenden además un segundo agente, por ejemplo, una sustancia prebiótica y/o una bacteria probiótica. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y alimentos médicos y suplementos dietéticos que comprenden preparaciones de polímeros de glicano comprenden además un micronutriente. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y alimentos médicos y suplementos dietéticos que comprenden preparaciones de polímeros de glicano no contienen una sustancia prebiótica. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y alimentos médicos y suplementos dietéticos que comprenden preparaciones de polímeros de glicano no contienen una bacteria probiótica. Además, opcionalmente, las composiciones farmacéuticas y alimentos médicos y suplementos dietéticos que comprenden preparaciones de polímeros de glicano comprenden uno o más excipientes o portadores, incluidos diluyentes, aglutinantes, disgregantes, dispersantes, lubricantes, deslizantes, estabilizadores, tensioactivos, agentes aromatizantes y colorantes.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y alimentos médicos y suplementos dietéticos que comprenden preparaciones de polímeros de glicano (y kits que comprenden los mismos) comprenden uno o más micronutrientes. En algunas realizaciones, el micronutriente se selecciona del grupo que consiste en un oligoelemento, colina, una vitamina y un polifenol. En algunas realizaciones, el micronutriente es un oligoelemento. Los oligoelementos adecuados como micronutrientes incluyen, pero no se limitan a, boro, cobalto, cromo, calcio, cobre, flúor, yodo, hierro, magnesio, manganeso, molibdeno, selenio y zinc. En algunas realizaciones, el micronutriente es una vitamina. En algunas realizaciones, el micronutriente es un polifenol. Además, si se desea, las composiciones farmacéuticas y alimentos médicos y suplementos dietéticos que comprenden preparaciones de polímeros de glicano pueden comprender agentes terapéuticamente activos, sustancias prebióticas y/o bacterias probióticas. Alternativamente o además, los agentes terapéuticamente activos, sustancias prebióticas y/o bacterias probióticas pueden administrarse por separado (por ejemplo, antes, simultáneamente con o después de la administración de los polímeros de glicano) y no como parte de la composición farmacéutica o alimento médico o suplemento dietético (por ejemplo, como una coformulación) de polímeros de glicano. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas o alimentos médicos o suplementos dietéticos que comprenden preparaciones de polímeros de glicano se administran en combinación con una dieta recomendada o prescrita, por ejemplo, una dieta rica en alimentos que contienen probióticos y/o prebióticos, tal como lo determine un médico u otro profesional de la salud. Pueden administrarse agentes terapéuticamente activos, sustancias prebióticas y/o bacterias probióticas para modular el microbioma intestinal del sujeto. En algunas realizaciones, el efecto combinado (por ejemplo, sobre el número o la intensidad de los cambios microbianos, genómicos o funcionales) es aditivo. En otras realizaciones, el efecto combinado (por ejemplo, sobre el número o la intensidad de los cambios microbianos, genómicos o funcionales) es sinérgico.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y alimentos médicos y suplementos dietéticos que comprenden preparaciones de polímeros de glicano descritos en el presente documento comprenden además una sustancia prebiótica o una preparación de la misma.
En algunas realizaciones, pueden administrarse prebióticos a un sujeto que recibe las composiciones farmacéuticas o alimentos médicos o suplementos dietéticos que comprenden preparaciones de polímeros de glicano descritos en el presente documento. Los prebióticos son sustancias no digeribles que, cuando se consumen, pueden proporcionar un efecto fisiológico beneficioso en el huésped al estimular selectivamente el crecimiento o la actividad favorable de un número limitado de bacterias autóctonas en el intestino (Gibson G R, Roberfroid M B. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics. J Nutr. Junio de 1995; 125(6): 1401-12 ). Un prebiótico tal como una fibra dietética o un oligosacárido prebiótico (por ejemplo, celulosa cristalina, salvado de trigo, salvado de avena, fibra de maíz, fibra de soja, fibra de remolacha y similares) puede estimular adicionalmente el crecimiento de bacterias probióticas y/o comensales en el intestino proporcionando una dosis fermentable de hidratos de carbono a las bacterias y aumentar los niveles de esas poblaciones microbianas (por ejemplo, lactobacilos y bifidobacterias) en el tracto gastrointestinal. Los prebióticos incluyen, pero no se limitan a, diversos galactanos y gomas a base de hidratos de carbono, como psyllium, guar, carragenina, gellan, lactulosa y konjac. En algunas realizaciones, el prebiótico es uno o más de galactooligosacáridos (GOS), lactulosa, rafinosa, estaquiosa, lactosacarosa, fructooligosacáridos (FOS, por ejemplo, oligofructosa u oligofructano), inulina, isomaltooligosacárido, xilooligosacáridos (XOS), oligosacárido de paratinosa, oligosacáridos de isomaltosa (IMOS), oligosacáridos transgalactosilados (por ejemplo, transgalactooligosacáridos), disacáridos de transgalactosilato, oligosacáridos de soja (por ejemplo, sojaoligosacáridos), oligosacáridos de quitosano (quiosas), gentiooligosacáridos, oligosacáridos de soja y pectina, glucooligosacáridos, pecticooligosacáridos, policondensados de palatinosa, anhídrido de fructosa III, sorbitol, maltitol, lactitol, polioles, polidextrosa, dextranos lineales y ramificados, pululano, hemicelulosas, paratinosa reducida, celulosa, betaglucosa, betagalactosa, betafructosa, verbascosa, galactinol, xilano, inulina, quitosano, betaglucano, goma guar, goma arábiga, pectina, alginato con alto contenido de sodio y lambda carragenina, o mezclas de los mismos. Los ejemplos de probióticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, organismos clasificados como génerosBacteroides, Blautia, Clostridium, Fusobacterium, Eubacterium, Ruminococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Akkermansia, Faecalibacterium, Roseburia, Prevotella, Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacillus, Enterococcus, Escherichia, Streptococcus, Saccharomyces, Streptomycesy familia Christensenellaceae. Los ejemplos no exclusivos de bacterias probióticas que pueden usarse en los métodos y composiciones descritos en el presente documento incluyenL. acidophilus,especies deLactobacillus,tales comoL. crispatus, L. casei, L. rhamnosus, L. reuteri, L. fermentum, L. plantarum, L. sporogenesyL. bulgaricus,así como especies deBifidobacterum,tales comoB. lactis, B. animalis, B. bifidum, B. longum, B. adolescenteisyB. infantis.Como probióticos para la administración al intestino, también son adecuadas levaduras tales comoSaccharomyces boulardii,por ejemplo, por medio de formas de dosificación orales o alimentos. En algunas realizaciones, el taxón de bacterias probióticas no esBifidobacterium.En algunas realizaciones, el taxón de bacterias probióticas no esLactobacillus.Las bacterias beneficiosas para la modulación de la microbiota gastrointestinal pueden incluir bacterias que producen ácidos orgánicos (ácidos láctico y acético) o que producen agentes citotóxicos o citostáticos (para inhibir el crecimiento patógeno), tales como, por ejemplo, peróxido de hidrógeno (H2O2) y bacteriocinas. Las bacteriocinas son pequeños péptidos antimicrobianos que pueden destruir bacterias estrechamente relacionadas o presentar un espectro de actividad más amplio (por ejemplo, nisina).
Las bacterias beneficiosas pueden incluir una o más del géneroAkkermansia, Anaerofilum, Bacteroides, Blautia, Bifidobacterium, Butyrivibrio, Clostridium, Coprococcus, Dialister, Dorea, Fusobacterium, Eubacterium, Faecalibacterium,Lachnospira,Lactobacillus,Phascolarctobacterium,Peptococcus,Peptostreptococcus,Prevotella,Roseburia,RuminococcusyStreptococcus, y/o una o más de las especiesAkkermansia municiphilia,minuta, Clostridium coccoides, Clostridium leptum, Clostridium scindens, Dialister invisus, Eubacterium rectal, Eubacterium eligens, Faecalibacterium prausnitzii, Streptococcus salivariusyStreptococcus thermophilus.En algunas realizaciones, las bacterias probióticas o comensales incluyen una o más de las bacterias enumeradas en la tabla 2.
Las sustancias prebióticas y las cepas probióticas que pueden combinarse con los polímeros de glicano descritos en el presente documento para producir una composición o kit pueden aislarse con cualquier nivel de pureza mediante métodos convencionales y la purificación puede lograrse mediante medios convencionales conocidos por los expertos en la técnica, tales como destilación, recristalización y cromatografía. Las bacterias cultivadas que van a usarse en la composición se separan del caldo de cultivo con cualquier método incluido, sin limitaciones, centrifugación, filtración o decantación. Las células separadas del caldo de fermentación se lavan opcionalmente con agua, solución salina (NaCl al 0,9%) o con cualquier tampón adecuado. La masa celular húmeda obtenida puede secarse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, mediante liofilización. En algunas realizaciones, las bacterias probióticas son células vegetativas liofilizadas. En algunas realizaciones, se usan las preparaciones de esporas de bacterias probióticas esporulantes.
En una realización, una preparación de polímero de glicano comprende además un prebiótico y un probiótico. En una realización, la composición farmacéutica comprende probióticos cuya viabilidad se ha atenuado parcialmente (por ejemplo, una mezcla que comprende el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % o más de bacterias no viables), o probióticos que consisten únicamente en microbios no viables. Las composiciones pueden comprender además membranas microbianas y/o paredes celulares que se han aislado y purificado a partir de microbios muertos. Si se desea, el organismo probiótico puede incorporarse a la preparación de polímero de glicano como un cultivo en agua u otro medio líquido o semisólido en el que el probiótico sigue siendo viable. En otra técnica, puede incorporarse un polvo liofilizado que contiene el organismo probiótico en un material particulado o material líquido o semisólido mezclándolo o combinándolo.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y alimentos médicos y suplementos dietéticos que comprenden preparaciones de polímeros de glicano comprenden además un segundo agente terapéutico o una preparación del mismo. En algunas realizaciones, el agente terapéutico es un antibiótico, un agente antifúngico, un agente antiviral o un agente antiinflamatorio (por ejemplo, una citocina, una hormona, etc.).
Las preparaciones de polímeros de glicano descritas en el presente documento, otros agentes terapéuticamente activos, sustancias prebióticas, micronutrientes y probióticos pueden combinarse o mezclarse en una única composición farmacéutica o alimento médico o suplemento dietético. En otras realizaciones, pueden estar contenidos en recipientes separados (y/o en diversas formas de dosificación unitaria adecuadas) pero envasados juntos en uno o más kits. En algunas realizaciones, las preparaciones o composiciones no se envasan ni se colocan juntas. Luego, un médico puede administrar las preparaciones o composiciones juntas, por ejemplo antes, concomitantemente o una después de la otra. En algunas realizaciones, las preparaciones o composiciones actúan sinérgicamente en la modulación de la microbiota en un sujeto, por ejemplo, en el tracto GI.
En algunas realizaciones, una composición de polímero de glicano comprende entre el 0,1 % y el 100 % de preparación de polímero de glicano en p/p, p/v, v/v o % molar. En otra realización, una composición de polímero de glicano comprende aproximadamente el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 % 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % de la preparación de polímero de glicano en p/p, p/v, v/v o % molar. En una realización, una composición de polímero de glicano comprende aproximadamente el 1-90 %, aproximadamente el 10-90 %, aproximadamente el 20-90 %, aproximadamente el 30-90 %, aproximadamente el 40-90 %, aproximadamente el 40-80 %, aproximadamente el 40-70 %, aproximadamente el 40-60 %, aproximadamente el 40-50 %, aproximadamente el 50-90 %, aproximadamente el 50-80 %, aproximadamente el 50-70 %, aproximadamente el 50-60 %, aproximadamente el 60-90 %, aproximadamente el 60-80 %, aproximadamente el 60-70 %, aproximadamente el 70-90 %, aproximadamente el 70-80 %, aproximadamente el 70-90 %, aproximadamente el 70-80 %, aproximadamente el 80-90 %, aproximadamente el 90-96 %, aproximadamente el 93-96 %, aproximadamente el 93-95 %, aproximadamente el 94-98 %, aproximadamente el 93-99 % o aproximadamente el 90-100 % de la preparación de polímero de glicano en p/p, p/v, v/v o % molar. Una composición que comprende una preparación de polímero de glicano puede comprender opcionalmente uno o más excipientes o portadores. La composición de polímero de glicano puede comprender de desde aproximadamente el 1 % hasta aproximadamente el 90 % de uno o más excipientes o portadores en % p/p, p/v, v/v o % molar. Por ejemplo, la composición de polímero de glicano puede comprender aproximadamente el 1 90 %, 1-75 %, 1-60 %, 1-55 %, 1-50 %, 1-45 %, 1-40 %, 1-25 %, 1-15%, 1-10 %, 10-90 %, 10-75 %, 10-60 %, 10 55 %, 10-50 %, 10-45 %, 10-40 %, 10-25 %, 10-15 %, 15-90 %, 15-75 %, 15-60 %, 15-55 %, 15-50 %, 15-45 %, 15-40 %, 15-25 %, 25-90 %, 25-75 %, 25-60 %, 25-55 %, 25-50 %, 25-45 %, 25-40 %, 40-90 %, 40-75 %, 40-60 %, 40-55 %, 40-50 %, 40-45 %, 45-90 %, 45-75 %, 45-60 %, 45-55 %, 45-50 %, 50-90 %, 50-75 %, 50-60 %, 50 55 %, 55-90 %, 55-75 %, 55-60 %, 60-90 %, 60-75 %, 75-90 % de uno o más excipientes o portadores en p/p, p/v, v/v o % molar.
Alimentos médicos
También se proporcionan en el presente documento preparaciones de polímeros de glicano formulados como alimento médico. Cualquier preparación de polímero de glicano descrita en el presente documento puede formularse como alimento médico, así como composiciones farmacéuticas que comprenden preparaciones de polímero de glicano.
Un alimento médico se define en la sección 5(b)(3) de la Ley de Medicamentos Huérfanos (21 U.S.C.
360ee(b)(3)). Los alimentos médicos se formulan para consumirse (ingesta oral) o administrarse por vía enteral (por ejemplo, alimentación/sonda nasogástrica) bajo supervisión médica, por ejemplo por un médico. Está destinado al tratamiento dietético específico de una enfermedad o afección, como, por ejemplo, disbiosis o una enfermedad del GI. Los alimentos médicos tal como se usan en el presente documento no incluyen alimentos que simplemente recomienda un médico como parte de una dieta general para gestionar los síntomas o reducir el riesgo de una enfermedad o afección. Los alimentos médicos que comprenden una preparación de polímeros de glicano son alimentos que son productos alimenticios sintéticos (por ejemplo, productos formulados y/o procesados, tales como formulados para la alimentación parcial o exclusiva de un paciente mediante ingesta oral o alimentación enteral por sonda) y que no se producen de manera natural usados en un estado natural.
En algunas realizaciones, el sujeto tiene una capacidad limitada o alterada para ingerir, digerir, absorber o metabolizar productos alimenticios comunes o ciertos nutrientes. En otras realizaciones, el sujeto tiene otros requerimientos nutricionales especiales determinados médicamente, cuya gestión dietética no puede lograrse mediante la modificación de la dieta normal únicamente. Los alimentos médicos que comprenden una preparación de polímeros de glicano se administran a un sujeto que lo necesita bajo supervisión médica (que puede ser activa y continua) y, habitualmente, el sujeto recibe instrucciones sobre el uso del alimento médico. Los alimentos médicos pueden comprender uno o más aditivos alimentarios, aditivos colorantes, excipientes GRAS y otros agentes o sustancias adecuados para alimentos médicos. Las preparaciones alimenticias médicas pueden ser fórmulas nutricionalmente completas o incompletas.
Suplementos dietéticos
Cualquier preparación de polímero de glicano descrita en el presente documento puede formularse como un suplemento dietético, por ejemplo, para su uso en un método descrito en el presente documento. Los suplementos dietéticos están regulados por la Ley de Educación y Salud sobre Suplementos Dietéticos (DSHEA) de 1994. Un suplemento dietético es un producto que se toma por vía oral y que contiene un “ingrediente dietético” destinado a complementar la dieta. Los “ingredientes dietéticos” en estos productos pueden incluir, además de una preparación de polímero de glicano descrita en el presente documento, uno o más de: vitaminas, minerales, hierbas u otros botánicos, aminoácidos y sustancias tales como enzimas, tejidos de órganos, glandulares y metabolitos. Los suplementos dietéticos también pueden ser extractos o concentrados y pueden encontrarse en muchas formas, tales como comprimidos, cápsulas, cápsulas blandas, cápsulas de gel, líquidos o polvos. También pueden presentarse en otras formas, tales como una barra, pero si lo son, la información en su etiqueta no debe representar el producto como un alimento convencional o un único elemento de una comida o dieta. DSHEA requiere que cada suplemento esté etiquetado como suplemento dietético y no como alimento general.
Ingrediente alimentario
Cualquier preparación de polímero de glicano descrita en el presente documento puede formularse como ingrediente alimentario o aditivo alimentario, por ejemplo, para su uso en un método descrito en el presente documento. Los ingredientes alimentarios pueden reconocerse generalmente como seguros (GRAS) o pueden requerir autorización de la FDA. Pueden añadirse preparaciones de polímeros de glicano a cualquier alimento deseado, por ejemplo, bebidas (incluidos, por ejemplo, zumos de frutas), productos lácteos (por ejemplo, leche, yogur, queso), cereales (cualquier producto de cereales), pan, productos para untar, etc.
Las preparaciones de polímeros de glicano descritas en el presente documento pueden formularse en cualquier forma de dosificación adecuada, por ejemplo, para administración nasal, oral, rectal o gástrica. En algunas realizaciones, las preparaciones de polímeros de glicano descritas en el presente documento pueden formularse para administración enteral. En algunas realizaciones, las preparaciones de polímeros de glicano descritas en el presente documento pueden formularse para alimentación por sonda (por ejemplo, alimentación nasogástrica, oral-gástrica o gástrica). Las formas de dosificación descritas en el presente documento pueden fabricarse usando procesos que conocen los expertos en la técnica.
La forma de dosificación puede ser un paquete, tal como cualquier recipiente individual que contenga una preparación de polímero de glicano en forma de, por ejemplo, un líquido (lavado/enjuague), un gel, una crema, un ungüento, un polvo, un comprimido, una pastilla, una cápsula, un depósito, un aplicador de un solo uso o un dispositivo médico (por ejemplo, una jeringa). Por ejemplo, también se proporciona un artículo de fabricación, tal como un recipiente que comprende una forma farmacéutica unitaria de la preparación de polímero de glicano, y una etiqueta que contiene instrucciones para el uso de tal polímero de glicano.
Las formas de las composiciones que pueden usarse por vía oral incluyen comprimidos, cápsulas de ajuste a presión hechas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Pueden prepararse comprimidos mediante compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Pueden prepararse comprimidos fabricados por compresión comprimiendo en una máquina adecuada el principio activo en una forma de flujo libre, tal como polvo o gránulos, opcionalmente mezclados con aglutinantes (por ejemplo, povidona, gelatina, hidroxipropilmetilcelulosa), diluyentes inertes, conservantes, antioxidantes, disgregantes (por ejemplo, glicolato sódico de almidón, povidona reticulada, carboximetilcelulosa sódica reticulada) o agentes lubricantes, tensioactivos o dispersantes. Pueden prepararse comprimidos moldeados moldeando en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Opcionalmente, los comprimidos pueden estar recubiertos o ranurados y pueden formularse de manera que proporcionen una liberación lenta o controlada del principio activo que contienen. Opcionalmente, los comprimidos pueden estar provistos de un recubrimiento entérico, para proporcionar liberación en partes del intestino (por ejemplo, colon, intestino inferior) distintas del estómago. Todas las formulaciones para administración oral pueden estar en dosificaciones adecuadas para tal administración. Las cápsulas de ajuste a presión pueden contener los principios activos en mezcla con cargas tales como lactosa, aglutinantes tales como almidones y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En cápsulas blandas, los compuestos activos y/u otros agentes (por ejemplo, prebióticos o probióticos) pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, pueden añadirse estabilizadores. Se proporcionan núcleos de comprimidos recubiertos de azúcar con recubrimientos adecuados. Para este fin, pueden usarse disoluciones de azúcar concentradas, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol o dióxido de titanio, disoluciones de laca y disolventes orgánicos o mezclas de disolventes adecuados. A los comprimidos o comprimidos recubiertos de azúcar pueden añadírseles colorantes o pigmentos para su identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuestos activos. Las formulaciones para uso oral también pueden presentarse como cápsulas de gelatina dura en las que el principio activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín, o como cápsulas de gelatina blanda en las que el principio activo se mezcla con un portador soluble en agua, tal como polietilenglicol o un medio oleoso, por ejemplo aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.
En una realización, una preparación de polímero de glicano proporcionada incluye una formulación de cápsula blanda. Una cápsula blanda puede contener una cubierta a base de gelatina que rodea un relleno líquido. La cubierta puede estar hecha de gelatina, plastificante (por ejemplo, glicerina y/o sorbitol), modificador, agua, color, antioxidante o saborizante. La cubierta puede estar hecha de almidón o carragenina. La capa exterior puede tener un recubrimiento entérico. En una realización, una formulación de cápsula blanda puede incluir una disolución de relleno soluble en agua o aceite, o una suspensión de una composición cubierta por una capa de gelatina.
Las formulaciones sólidas para uso oral pueden comprender un recubrimiento entérico, que puede controlar la ubicación en la que se absorbe una preparación de polímero de glicano en el sistema digestivo. Por ejemplo, puede diseñarse un recubrimiento entérico de manera que una preparación de polímero de glicano no se disuelva en el estómago sino que se desplace hasta el intestino delgado, donde se disuelve. Un recubrimiento entérico puede ser estable a un pH bajo (tal como en el estómago) y puede disolverse a un pH más alto (por ejemplo, en el intestino delgado). El material que puede usarse en recubrimientos entéricos incluye, por ejemplo, ácido algínico, acetato ftalato de celulosa, plásticos, ceras, goma laca y ácidos grasos (por ejemplo, ácido esteárico, ácido palmítico).
Las formulaciones para uso oral también podrán presentarse en forma de dosificación líquida. Las preparaciones líquidas pueden estar en forma de, por ejemplo, suspensiones, soluciones, emulsiones, jarabes o elixires acuosos u oleosos, o pueden presentarse como un producto seco para su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Tales preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales, tales como agentes de suspensión, por ejemplo sorbitol, metilcelulosa, jarabe de glucosa, gelatina, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, gel de estearato de aluminio o grasas comestibles hidrogenadas, agentes emulsionantes, por ejemplo lecitina, monooleato de sorbitán, goma arábiga; vehículos no acuosos (que pueden incluir aceites comestibles), por ejemplo aceite de almendras, ésteres oleosos tales como glicerina, propilenglicol o alcohol etílico; conservantes, por ejemplo p-hidroxibenzoato de metilo o propilo o ácido sórbico y, si se desea, agentes aromatizantes o colorantes convencionales. En algunas realizaciones, las formulaciones líquidas pueden comprender, por ejemplo, un agente en forma de agua en disolución y/o suspensión; y un vehículo que comprende aceite de ricino polietoxilado, alcohol y/o un monooleato de sorbitán polioxietilado con o sin aromatizante. Cada forma de dosificación puede comprender una cantidad eficaz de un polímero de glicano y opcionalmente puede comprender agentes farmacéuticamente inertes, tales como excipientes, vehículos, cargas, aglutinantes, disgregantes, sustancias de ajuste del pH, tampones, disolventes, agentes solubilizantes, edulcorantes, agentes colorantes convencionales y cualquier otro agente inactivo que pueda incluirse en formas de dosificación farmacéuticas para su administración. Pueden encontrarse ejemplos de tales vehículos y aditivos en Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a edición (1985).
Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento pueden estar en formas de dosificación unitaria o en formas de dosificación múltiple. Una forma de dosificación unitaria, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una unidad físicamente diferenciada adecuada para su administración a un ser humano que lo necesita. En una realización, la forma de dosificación unitaria se proporciona en un paquete. Cada dosis unitaria puede contener una cantidad predeterminada de principio(s) activo(s) suficiente para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con otros portadores o excipientes farmacéuticos. Los ejemplos de formas de dosificación unitaria incluyen, pero no se limitan a, ampollas, jeringas y comprimidos y cápsulas envasados individualmente. Las formas de dosificación unitarias pueden administrarse en fracciones o múltiplos de las mismas. Una forma de dosificación múltiple es una pluralidad de formas de dosificación unitarias idénticas envasadas en un único recipiente, que pueden administrarse en forma de dosificación unitaria segregada. Los ejemplos de formas de dosificación múltiple incluyen, pero no se limitan a, viales, frascos de comprimidos o cápsulas, o frascos de pintas o galones. En otra realización, las formas de dosificación múltiple comprenden diferentes agentes farmacéuticamente activos. Por ejemplo, puede proporcionarse una forma de dosificación múltiple que comprende un primer elemento de dosificación que comprende una composición que comprende un polímero de glicano y un segundo elemento de dosificación que comprende un prebiótico, un agente terapéutico y/o un probiótico, que puede estar en una forma de liberación modificada. En este ejemplo, un par de elementos de dosificación pueden formar una única dosificación unitaria. En una realización, se proporciona un kit que comprende múltiples dosificaciones unitarias, en donde cada unidad comprende un primer elemento de dosificación que comprende una composición que comprende una preparación de polímero de glicano y un segundo elemento de dosificación que comprende un probiótico, un agente farmacéutico, un prebiótico o una combinación de los mismos, que puede estar en una forma de liberación modificada. En otra realización, el kit comprende además un conjunto de instrucciones.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación unitaria comprende entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 100 g de la preparación de polímero de glicano (por ejemplo, un polímero de glicano dado a conocer en el presente documento). Por ejemplo, la forma de dosificación unitaria puede comprender desde aproximadamente 50 mg hasta aproximadamente 50 g, de aproximadamente 500 mg a aproximadamente 50 g, de aproximadamente 5 g a aproximadamente 50 g, de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 100 g, de aproximadamente 1 g a aproximadamente 100 g, de aproximadamente 10 g a aproximadamente 100 g, de aproximadamente 1 g a aproximadamente 10 g, de aproximadamente 1 g a aproximadamente 20 g, de aproximadamente 1 g a aproximadamente 30 g, de aproximadamente 1 g a aproximadamente 40 g, de aproximadamente 1 g a aproximadamente 50 g, de aproximadamente 1 g a aproximadamente 60 g, de aproximadamente 1 g a aproximadamente 70 g, de aproximadamente 1 g a aproximadamente 80 g, de aproximadamente 1 g a aproximadamente 90 g, de aproximadamente 1 g a aproximadamente 100 g, de aproximadamente 1 g a aproximadamente 150 g, de aproximadamente 1 g a aproximadamente 200 g del polímero de glicano.
En otras realizaciones, la forma de dosificación unitaria comprende entre aproximadamente 0,001 ml y aproximadamente 1000 ml del polímero de glicano (por ejemplo, un polímero de glicano dado a conocer en el presente documento). Por ejemplo, la forma de dosificación unitaria puede comprender de aproximadamente 0,001 ml a aproximadamente 950 ml, de aproximadamente 0,005 ml a aproximadamente 900 ml, de aproximadamente 0,01 ml a aproximadamente 850 ml, de aproximadamente 0,05 ml a aproximadamente 800 ml, de aproximadamente 0,075 ml a aproximadamente 750 ml, de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 700 ml, de aproximadamente 0,25 ml a aproximadamente 650 ml, de aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 600 ml, de aproximadamente 0,75 ml a aproximadamente 550 ml, de aproximadamente 1 ml a aproximadamente 500 ml, de aproximadamente 2,5 ml a aproximadamente 450 ml, de aproximadamente 5 ml a aproximadamente 400 ml, de aproximadamente 7,5 ml a aproximadamente 350 ml, de aproximadamente 10 ml a aproximadamente 300 ml, de aproximadamente 12,5 ml a aproximadamente 250 ml, de aproximadamente 15 ml a aproximadamente 200 ml, de aproximadamente 17,5 ml a aproximadamente 150 ml, de aproximadamente 20 ml a aproximadamente 100 ml o de aproximadamente 25 ml a aproximadamente 75 ml del polímero de glicano.
En ciertas realizaciones, la forma de dosificación unitaria comprende de aproximadamente 0,001 ml a aproximadamente 10 ml, de aproximadamente 0,005 ml a aproximadamente 7,5 ml, de aproximadamente 0,01 ml a aproximadamente 5 ml, de aproximadamente 0,05 ml a aproximadamente 2,5 ml, de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 1 ml, de aproximadamente 0,25 ml a aproximadamente 1 ml o de aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 1 ml del polímero de glicano. En otras realizaciones, la forma de dosificación unitaria comprende de aproximadamente 0,01 ml a aproximadamente 10 ml, de aproximadamente 0,025 ml a aproximadamente 7,5 ml, de aproximadamente 0,05 ml a aproximadamente 5 ml o de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 2,5 ml del polímero de glicano. En otras realizaciones, la forma de dosificación unitaria comprende de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 10 ml, de aproximadamente 0,25 ml a aproximadamente 7,5 ml, de aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 5 ml, de aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 2,5 ml o de aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 1 ml del polímero de glicano.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación unitaria, por ejemplo, un comprimido, cápsula (por ejemplo, una cápsula dura, una cápsula de ajuste a presión o una cápsula blanda), o cápsula de blando, tiene una longitud corporal de entre aproximadamente 0,1 pulgadas y aproximadamente 1,5 pulgadas (por ejemplo, entre aproximadamente 0,5 pulgadas y aproximadamente 1 pulgada) o entre aproximadamente 5 mm y aproximadamente 50 mm (por ejemplo, entre aproximadamente 10 mm y aproximadamente 25 mm). En algunas realizaciones, la forma de dosificación unitaria, por ejemplo, un comprimido, cápsula (por ejemplo, una cápsula dura, cápsula de ajuste a presión o cápsula blanda), o cápsula de gel blando, tiene un diámetro externo de aproximadamente 0,05 pulgadas a aproximadamente 1 pulgada (por ejemplo, de aproximadamente 0,1 pulgadas a aproximadamente 0,5 pulgadas) o de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 25 mm (por ejemplo, de aproximadamente 5 mm a aproximadamente 10 mm).
Cada forma de dosificación unitaria del polímero de glicano puede tener un valor calórico de entre aproximadamente 0,01 kcal y aproximadamente 1000 kcal. Por ejemplo, la forma de dosificación unitaria puede tener un valor calórico de aproximadamente 0,01 kcal a aproximadamente 100 kcal, de aproximadamente 0,05 kcal a aproximadamente 50 kcal, de aproximadamente 0,1 kcal a aproximadamente 10 kcal, de aproximadamente 0,25 kcal a aproximadamente 2,5 kcal, de aproximadamente 0,5 kcal a aproximadamente 5 kcal, de aproximadamente 0,75 kcal a aproximadamente 7,5 kcal, de aproximadamente 1 kcal a aproximadamente 10 kcal, de aproximadamente 5 kcal a aproximadamente 50 kcal o de aproximadamente 10 kcal a aproximadamente 100 kcal. En ciertas realizaciones, la forma de dosificación unitaria del polímero de glicano tiene un valor calórico de entre 10 kcal y aproximadamente 500 kcal. En ciertas realizaciones, la forma de dosificación unitaria del polímero de glicano tiene un valor calórico de entre 1 kcal y aproximadamente 100 kcal. En determinadas realizaciones, la forma de dosificación unitaria del polímero de glicano tiene un valor calórico de entre 0,1 kcal y aproximadamente 10 kcal. En todavía otras realizaciones, la forma de dosificación unitaria puede tener un valor calórico de aproximadamente 0,001 kcal a aproximadamente 10 kcal, de aproximadamente 0,005 kcal a aproximadamente 10 kcal, de aproximadamente 0,01 kcal a aproximadamente 10 kcal, de aproximadamente 0,025 kcal a aproximadamente 25 kcal, de aproximadamente 0,05 kcal a aproximadamente 50 kcal, de aproximadamente 0,075 kcal a aproximadamente 75 kcal, de aproximadamente 0,1 kcal a aproximadamente 100 kcal, de aproximadamente 0,25 kcal a aproximadamente 10 kcal, de aproximadamente 0,5 kcal a aproximadamente 5 kcal, de aproximadamente 0,25 kcal a aproximadamente 25 kcal o de aproximadamente 0,1 kcal a aproximadamente 50 kcal aproximadamente 1 kcal.
La forma de dosificación unitaria del polímero de glicano puede formularse para disolverse en una disolución acuosa (por ejemplo, agua, leche, zumo y similares) y se administra por vía oral como una bebida, jarabe, disolución o suspensión. Por ejemplo, la dosificación en forma unitaria del polímero de glicano puede comprender un cubo, paquete, pastilla para chupar, píldora, comprimido, cápsula, caramelo, polvo, elixir o jarabe concentrado formulado para disolverse en una disolución acuosa antes de la administración oral. En otras realizaciones, la forma de dosificación unitaria del polímero de glicano puede comprender un cubo, paquete, pastilla para chupar, píldora, comprimido, cápsula, caramelo, polvo, elixir o jarabe concentrado formulado para disolversein vivo,por ejemplo, en la boca, el estómago, intestino o colon del sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) tras la administración oral.
En algunas realizaciones, la preparación de polímero de glicano se administra por vía entérica. Esto incluye preferentemente la administración oral o mediante una sonda oral o nasal (incluida nasogástrica, nasoyeyunal, oral gástrica u oral yeyunal). En otras realizaciones, la administración incluye administración rectal (incluido enema, supositorio o colonoscopia).
Las formas de dosificación descritas en el presente documento pueden fabricarse usando procesos que conocen los expertos en la técnica. Por ejemplo, para la fabricación de comprimidos, puede dispersarse uniformemente una cantidad eficaz de un prebiótico en uno o más excipientes o aditivos, por ejemplo, usando granulación de alta cizalladura, granulación de baja cizalladura, granulación en lecho fluido o mezclando para compresión directa. Los excipientes y aditivos incluyen diluyentes, aglutinantes, disgregantes, dispersantes, lubricantes, deslizantes, estabilizadores, tensioactivos, antiadherentes, sorbentes, edulcorantes y colorantes, o una combinación de los mismos. Pueden usarse diluyentes, también denominados cargas, para aumentar el volumen de un comprimido de modo que se proporcione un tamaño práctico para la compresión. Los ejemplos no limitativos de diluyentes incluyen lactosa, celulosa, celulosa microcristalina, manitol, almidón seco, almidones hidrolizados, azúcar en polvo, talco, cloruro de sodio, dióxido de silicio, óxido de titanio, fosfato de dicalcio dihidratado, sulfato de calcio, carbonato de calcio, alúmina y caolín. Los aglutinantes pueden conferir cualidades cohesivas a una formulación de comprimido y pueden usarse para ayudar a que un comprimido permanezca intacto después de la compresión. Los ejemplos no limitativos de aglutinantes adecuados incluyen almidón (incluido almidón de maíz y almidón pregelatinizado), gelatina, azúcares (por ejemplo, glucosa, dextrosa, sacarosa, lactosa y sorbitol), celulosas, polietilenglicol, ácido algínico, dextrina, caseína, metilcelulosa, ceras, gomas naturales y sintéticas, por ejemplo, arábiga, tragacanto, alginato de sodio, goma arábiga, goma xantana y polímeros sintéticos tales como polimetacrilatos, poli(alcoholes vinílicos), hidroxipropilcelulosa y polivinilpirrolidona. Los lubricantes también pueden facilitar la fabricación de comprimidos; los ejemplos no limitativos de los mismos incluyen estearato de magnesio, estearato de calcio, ácido esteárico, behenato de glicerilo y polietilenglicol. Los disgregantes pueden facilitar la disgregación del comprimido después de la administración, y los ejemplos no limitativos de los mismos incluyen almidones, ácido algínico, polímeros reticulados tales como, por ejemplo, polivinilpirrolidona reticulada, croscarmelosa sódica, glicolato sódico o potásico de almidón, arcillas, celulosas (por ejemplo, carboximetilcelulosas (por ejemplo, carboximetilcelulosa).
(CMC), CMC-Na, CMC-Ca)), almidones, gomas y similares. Los ejemplos no limitativos de deslizantes adecuados incluyen dióxido de silicio, talco y similares. Los estabilizadores pueden inhibir o retardar reacciones de descomposición de fármacos, incluidas reacciones oxidativas. Los tensioactivos también pueden incluir y pueden ser aniónicos, catiónicos, anfóteros o no iónicos. Los edulcorantes a modo de ejemplo pueden incluir extracto de stevia, aspartamo, sacarosa, alitamo, sacarina, y similares. Si se desea, los comprimidos también pueden comprender sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes tamponantes del pH, conservantes, por ejemplo, antioxidantes, agentes humectantes o emulsionantes, agentes solubilizantes, agentes de recubrimiento, agentes aromatizantes (por ejemplo, menta, cereza, anís, melocotón, albaricoque, regaliz, frambuesa, vainilla) y similares. Los excipientes y aditivos adicionales pueden incluir acetato de aluminio, alcohol bencílico, butilparabeno, hidroxitolueno butilado, EDTA cálcico disódico, hidrogenofosfato de calcio dihidratado, fosfato de calcio dibásico, fosfato de calcio tribásico, cera de candelilla, cera de carnauba, aceite de ricino hidrogenado, cloruro de cetilpiridina, ácido cítrico, dióxido de silicona coloidal, copolividona, almidón de maíz, cisteína HCl, dimeticona, hidrogenofosfato de disodio, eritrosina sódica, etilcelulosa, gelatina, glicerina, monooleato de glicerilo, monoestearato de glicerilo, glicina, ftalato de HPMC, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hipromelosa, óxido de hierro rojo u óxido férrico, óxido de hierro amarillo, óxido de hierro u óxido férrico, carbonato de magnesio, óxido de magnesio, estearato de magnesio, metionina, copolímero de ácido metacrílico, metilparabeno, celulosa microcristalina silicificada, aceite mineral, ácido fosfórico, fosfato de calcio simple, fosfato de calcio anhidro, polaxámero 407, polaxámero 188, polaxámero simple, óxido de polietileno, estearato de polioxi 140, polisorbato 80, bicarbonato de potasio, sorbato de potasio, almidón de patata, povidona, propilenglicol, propilenparabeno, propilparabeno, palmitato de retinilo, sacarina sódica, selenio, sílice, gel de sílice, sílice pirógena, benzoato de sodio, carbonato de sodio, citrato de sodio dihidratado, crossmelosa de sodio, laurilsulfato de sodio, metabisulfito de sodio, propionato de sodio, almidón de sodio, glicolato sódico de almidón, estearilfumarato de sodio, ácido sórbico, sorbitol, monooleato de sorbitán, almidón pregelatinizado, ácido succínico, triacetina, citrato de trietilo, estearina vegetal, vitamina A, vitamina E, vitamina C o una combinación de los mismos. Las cantidades de estos excipientes y aditivos pueden seleccionarse apropiadamente basándose en su relación con otros componentes y propiedades del método de preparación y producción.
Las formulaciones de liberación inmediata de una cantidad eficaz de una preparación de polímero de glicano pueden comprender una o más combinaciones de excipientes que permiten una liberación rápida de un agente farmacéuticamente activo (tal como desde 1 minuto hasta 1 hora después de la administración). Las formulaciones de liberación controlada (también conocidas como de liberación sostenida (SR), liberación prolongada (ER, XR o XL), liberación en el tiempo o liberación programada, liberación controlada (CR) o liberación continua) se refieren a la liberación de una preparación de polímero de glicano a partir de una forma de dosificación en un momento particular deseado después de que la forma de dosificación se administre a un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano).
En una realización, una forma farmacéutica de liberación controlada comienza su liberación y continúa esa liberación durante un período de tiempo prolongado. La liberación puede producirse casi inmediatamente o puede ser sostenida. La liberación puede ser constante, puede aumentar o disminuir con el tiempo, puede ser pulsada, puede ser continua o intermitente, y similares. En una realización, una dosificación de liberación controlada se refiere a la liberación de un agente de una composición o forma de dosificación en la que el agente se libera según un perfil deseado durante un período de tiempo prolongado. En un aspecto, liberación controlada se refiere a la liberación retardada de un agente de una composición o forma de dosificación en la que el agente se libera según un perfil deseado en el que la liberación se produce después de un período de tiempo. Los portadores o vehículos farmacéuticos adecuados para la administración de los compuestos proporcionados en el presente documento incluyen todos los portadores que los expertos en la técnica saben que son adecuados para el modo de administración particular. Además, las composiciones pueden tener uno o más componentes que no alteran la acción deseada, o con componentes que complementan la acción deseada, o que tienen otra acción.
En un aspecto adicional, la forma de dosificación puede ser una forma de dosificación efervescente. Efervescente significa que la forma de dosificación, cuando se mezcla con líquido, incluida agua y saliva, desprende un gas. Algunos agentes efervescentes (o pareja efervescente) desprenden gas por medio de una reacción química que tiene lugar tras la exposición del agente de disgregación efervescente al agua o a la saliva en la boca. Esta reacción puede ser el resultado de la reacción de una fuente de ácido soluble y una fuente de monocarbonato o carbonato alcalino. La reacción de estos dos compuestos generales produce gas dióxido de carbono al entrar en contacto con el agua o la saliva. Una pareja efervescente (o el ácido y la base individuales por separado) pueden recubrirse con un recubrimiento entérico o protector de disolvente para evitar una reacción prematura. Una pareja de este tipo también puede mezclarse con partículas previamente liofilizadas (tales como un polímero de glicano). Las fuentes de ácido pueden ser cualquiera que sea segura para el consumo humano y generalmente pueden incluir ácidos alimentarios, antiácidos de ácidos e hidritas tales como, por ejemplo: cítrico, tartárico, amálico, fumérico, adípico y succínico. Las fuentes de carbonato incluyen sales de carbonato y bicarbonato sólidas secas tales como bicarbonato de sodio, carbonato de sodio, bicarbonato de potasio y carbonato de potasio, carbonato de magnesio y similares. También se incluyen reactivos que desprenden oxígeno u otros gases y que son seguros para el consumo humano. En una realización, se usan ácido cítrico y bicarbonato de sodio.
En otro aspecto, la forma de dosificación puede estar en forma de caramelo (por ejemplo, matriz), tal como una piruleta o una pastilla para chupar. En una realización, se dispersa una cantidad eficaz de un polímero de glicano dentro de una matriz de caramelo. En una realización, la matriz de caramelo comprende uno o más azúcares (tales como dextrosa o sacarosa). En otra realización, la matriz de caramelo es una matriz sin azúcar. La elección de una matriz de caramelo particular está sujeta a una amplia variación. Pueden emplearse edulcorantes convencionales (por ejemplo, sacarosa), alcoholes de azúcar adecuados para su uso con pacientes diabéticos (por ejemplo, sorbitol o manitol) u otros edulcorantes (por ejemplo, los edulcorantes descritos en el presente documento). La base de caramelo puede ser muy blanda y de rápida disolución, o puede ser dura y de disolución más lenta. Diversas formas tendrán ventajas en diferentes situaciones.
Una composición de masa de caramelo que comprende una cantidad eficaz del polímero de glicano puede administrarse por vía oral a un sujeto que lo necesita de modo que se libere una cantidad eficaz del polímero de glicano en la boca del sujeto a medida que la masa de caramelo se disuelve y se ingiere. Un sujeto que lo necesita incluye un adulto o un niño humano.
Las formas de dosificación descritas en el presente documento también pueden adoptar la forma de partículas farmacéuticas fabricadas mediante una variedad de métodos, que incluyen, pero no se limitan a, homogeneización a alta presión, molienda con bolas en húmero o en seco o precipitación de partículas pequeñas (por ejemplo, NanoSpray de nGimat). Otros métodos útiles para preparar una formulación en polvo adecuada son la preparación de una disolución de principios activos y excipientes, seguido por precipitación, filtración y pulverización, o seguido por eliminación del disolvente mediante secado por congelación, seguido por pulverización del polvo hasta el tamaño de partícula deseado. En una realización, las partículas farmacéuticas tienen un tamaño final de 3-1000 micrómetros, tal como como máximo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80. , 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 micrómetros. En otra realización, las partículas farmacéuticas tienen un tamaño final de 10-500 micrómetros. En otra realización, las partículas farmacéuticas tienen un tamaño final de 50-600 micrómetros. En otra realización, las partículas farmacéuticas tienen un tamaño final de 100-800 micrómetros.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un método de preparación de una forma de dosificación unitaria descrita en el presente documento, que comprende proporcionar un polímero de glicano (por ejemplo, un polímero de glicano descrito en el presente documento); formular el polímero de glicano en una forma de dosificación unitaria (por ejemplo, una forma de dosificación unitaria descrita en el presente documento), envasar la forma de dosificación unitaria, etiquetar la forma de dosificación unitaria envasada y/o vender u ofrecer a la venta la forma de dosificación unitaria envasada y etiquetada.
Las formas de dosificación unitarias descritas en el presente documento también pueden procesarse. En una realización, el procesamiento comprende uno o más de: procesar la forma de dosificación en una composición farmacéutica, por ejemplo, formular, combinar con un segundo componente, por ejemplo, un excipiente o tampón; dividir en alícuotas más pequeñas o más grandes; disponer en un recipiente, por ejemplo, un recipiente hermético a gases o líquidos; envasar; asociar con una etiqueta; enviar o mover a una ubicación diferente. En una realización, el procesamiento comprende uno o más de: clasificar, seleccionar, aceptar o descartar, liberar o retener, procesar en una composición farmacéutica, enviar, mover a una ubicación diferente, formular, etiquetar, envasar, lanzar al comercio o vender u ofrecer para la venta, dependiendo de si se alcanza el umbral predeterminado. En algunas realizaciones, las formas de dosificación procesadas comprenden un polímero de glicano descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones, el procesamiento comprende uno o más de: procesar la forma de dosificación en una composición farmacéutica, por ejemplo, formular, combinar con un segundo componente, por ejemplo, un excipiente o tampón; dividir en alícuotas más pequeñas o más grandes; disponer en un recipiente, por ejemplo, un recipiente hermético a gases o líquidos; envasar; asociar con una etiqueta; enviar o mover a una ubicación diferente. En una realización, el procesamiento comprende uno o más de: clasificar, seleccionar, aceptar o descartar, liberar o retener, procesar en una composición farmacéutica, enviar, mover a una ubicación diferente, formular, etiquetar, envasar, lanzar al comercio o vender u ofrecer para la venta, dependiendo de la determinación.
En otra realización, se proporciona una forma de dosificación oral que comprende una preparación de polímero de glicano, en donde la forma de dosificación oral es un jarabe. El jarabe puede comprender aproximadamente el 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % u 85 % de sólido. El jarabe puede comprender aproximadamente el 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 % o 50 % de líquido, por ejemplo, agua. El sólido puede comprender una preparación de polímero de glicano. El sólido puede ser, por ejemplo, aproximadamente el 1-96 %, 10-96 %, 20-96 %, 30-96 %, 40-96 %, 50-96 %, 60-96 %, 70-96 %, 80-96% o 90-96% de preparación de polímero de glicano. En otra realización, se formula una preparación de polímero de glicano como un fluido viscoso.
En una realización, la composición comprende un componente espumante, un componente neutralizante o una fibra dietética insoluble en agua. Un componente espumante puede ser al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en hidrogenocarbonato de sodio, carbonato de sodio y carbonato de calcio. En una realización, un componente neutralizante puede ser al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en ácido cítrico, ácido L-tartárico, ácido fumárico, ácido L-ascórbico, ácido DL-málico, ácido acético, ácido láctico y ácido cítrico anhidro. En una realización, una fibra dietética insoluble en agua puede ser al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en celulosa cristalina, salvado de trigo, salvado de avena, fibra de maíz, fibra de soja y fibra de remolacha. La formulación puede contener un éster de ácido graso de sacarosa, azúcar en polvo, zumo de fruta en polvo y/o material aromatizante.
En algunas realizaciones, las formas de dosificación se formulan para liberar las composiciones farmacéuticas que comprenden preparaciones de polímeros de glicano en región/regiones específica(s) del tracto gastrointestinal, tal como el intestino delgado o el intestino grueso. En algunas realizaciones, las formas de dosificación se formulan para liberar las composiciones farmacéuticas que comprenden preparaciones de polímeros de glicano en región/regiones específica(s) del tracto gastrointestinal, tal como el ciego, el colon ascendente, el colon transverso, el colon descendente, el colon sigmoide y/o recto.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las preparaciones de polímeros de glicano descritas en el presente documento es un sistema de administración sensible a enzimas. Por ejemplo, pueden prepararse polímeros sensibles a tripsina usando hidrogeles que están reticulados por péptidos que se degradan por la tripsina. La tripsina es activa en el intestino delgado. Pueden usarse sistemas de administración sensibles a tripsina para dirigir la administración de las preparaciones de polímeros de glicano al intestino delgado. En otro ejemplo, los hidrogeles digeribles por enzimas que consisten en poli(vinilpirrolidona) reticulada con albúmina se degradan en presencia de pepsina.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las preparaciones de polímeros de glicano descritas en el presente documento es un dispositivo de administración que permite una retención prolongada en un sitio específico del tracto gastrointestinal. Por ejemplo, un sistema de administración gastrorretentiva permite la liberación prolongada de las preparaciones de polímeros de glicano al estómago. La administración gastrorretentiva puede usarse para las preparaciones de polímeros de glicano que modulan las bacterias en el estómago o en la parte superior del intestino delgado.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las preparaciones de polímeros de glicano descritas en el presente documento es un sistema de administración mucoadhesivo que se adhiere a las superficies mucosas del estómago. Normalmente, se componen de polímeros con numerosos grupos de unión de hidrógeno, por ejemplo, poli(ácidos acrílicos) reticulados, carboximetilcelulosa de sodio, alginato de sodio, carragenina, Carbopol 934P o policarbófilo tiolado.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las preparaciones de polímeros de glicano descritas en el presente documento es un sistema de administración de expansión que aumenta rápidamente de tamaño en el estómago, lo que ralentiza su paso a través del píloro. Tales sistemas incluyen sistemas que se despliegan en el estómago. Por ejemplo, pueden envasarse formas geométricas tales como tetraedros, anillos, discos, etc. en una cápsula de gelatina. Cuando la cápsula se disuelve, la forma se despliega. Los sistemas pueden estar compuestos por uno o más polímeros erosionables (por ejemplo, hidroxipropilcelulosa), uno o más polímeros no erosionables (por ejemplo, poliolefinas, poliamidas, poliuretanos). Luego, el polímero de glicano puede dispersarse dentro de la matriz polimérica. Los tiempos de retención pueden ajustarse finamente mediante la mezcla de polímeros. Alternativamente, pueden usarse dispositivos hechos de polímeros elásticos que son estables en el pH ácido del estómago pero que se disuelven en condiciones neutras/alcalinas a lo largo del tracto GI. Tales formulaciones de polímero pueden prevenir la obstrucción intestinal cuando el dispositivo sale del estómago. También pueden usarse geles poliméricos supramoleculares reticulados por enlaces de hidrógeno entre grupos carboxilo, por ejemplo, compuestos por poli(ácido acriloil-6-aminocaproico) (PA6ACA) y poli(ácido metacrílico-co-acrilato de etilo) (EUDRAGIT L 100-55). Otros sistemas incluyen excipientes hinchables, tales como esponjas de colágeno. Por ejemplo, una matriz de hidrogel (por ejemplo, un núcleo hinchable: polivinilpirrolidona XL, Carbopol 934P, carbonato de calcio) se hincha 2-50 veces en el estómago. Los materiales compuestos de hidrogel superporosos se hinchan hasta cientos de veces su volumen original en unos pocos minutos. Algunos sistemas aprovechan la generación de gas para lograr la expansión, por ejemplo, sistemas expandibles que generan dióxido de carbono y que están rodeados por una membrana hidrófila.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las preparaciones de polímeros de glicano descritas en el presente documento es un sistema de administración de densidad controlada. Estos sistemas están diseñados para o bien flotar o bien hundirse en los fluidos gástricos, lo que retrasa su vaciado del estómago. Por ejemplo, los sistemas de alta densidad permiten que el dispositivo se sedimente en el fondo del estómago, debajo del píloro, y así evitan el vaciado del estómago. Otros sistemas son sistemas flotantes/de baja densidad. Tales dispositivos, por ejemplo, pueden comprender aire atrapado en cámaras huecas o pueden incorporar materiales de baja densidad tales como grasas, aceites o espuma en polvo. Puede conseguirse una baja densidad a través de hinchamiento, por ejemplo, las cápsulas que contienen hidrocoloides se disuelven al entrar en contacto con el fluido gástrico y los hidrocoloides se hinchan para formar un cuerpo mucoso. Los polímeros alternativos incluyen: quitosanos, alginato de sodio y matriz de monooleato de glicerol. Puede lograrse una baja densidad a través de la generación de gas. Por ejemplo, comprimidos cargados con carbonato y opcionalmente ácido cítrico generan dióxido de carbono después del contacto con medios acuosos ácidos. El dióxido de carbono generado queda atrapado dentro del hidrocoloide gelificante provocando que el sistema flote. Los hidrocoloides incluyen hidroxipropilmetilcelulosa y Carbopol 934P.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las preparaciones de polímeros de glicano descritas en el presente documento emplea un diseño para retener un dispositivo en el intestino delgado o grueso. La naturaleza específica de ubicación del dispositivo se proporciona por un método de activación específico, por ejemplo, pH, enzimas, etc. Estos incluyen sistemas diseñados para mucoadhesión y también píldoras de microagujas. Las píldoras de microagujas comprenden un depósito de fármaco enriquecido con microagujas que está encapsulado en un recubrimiento sensible al pH. Cuando la píldora llega a la ubicación deseada en el tracto GI y el recubrimiento se disuelve, las microagujas permiten que la píldora se adhiera al revestimiento del tracto GI. En otras realizaciones, las píldoras con microagujas comprenden una cápsula que consiste en dos compartimentos químicos llenos de ácido cítrico y bicarbonato de sodio, respectivamente. A medida que la píldora se disuelve en el sistema digestivo, las barreras entre las dos sustancias se erosionan, lo que les permite mezclarse y crear una reacción química que empuja las microagujas de sacáridos a través de la capa externa de la cápsula al interior del revestimiento del intestino delgado. Las agujas de sacárido pueden estar llenas de fármacos que se administran a los vasos sanguíneos cercanos a medida que se absorbe el sacárido.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las preparaciones de polímeros de glicano descritas en el presente documento emplea un recubrimiento de polímero sensible al pH. Por ejemplo, los polímeros dependientes del pH (bifásicos o trifásicos) pueden ser insolubles a niveles de pH bajo (por ejemplo, resistencia a los ácidos en el estómago, pH 1-2) y volverse cada vez más solubles a medida que se eleva el pH, por ejemplo, hasta aproximadamente 5,5 - 6,2 en el duodeno, hasta aproximadamente pH 5,7 en el colon ascendente, hasta aproximadamente pH 6,4 en el ciego, hasta aproximadamente pH 6,6 en el colon transverso, hasta aproximadamente pH 7,0 en el colon descendente, hasta aproximadamente 7,2 - 7,5 en el íleon o hasta aproximadamente pH 7,5 en el intestino delgado distal. En un ejemplo, puede usarse la tecnología TARGIT™ para la administración específica de sitio de las preparaciones de polímeros de glicano en el tracto gastrointestinal (GI). El sistema emplea recubrimientos sensibles al pH sobre cápsulas de almidón moldeadas por inyección para dirigirse al íleon terminal y al colon. En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las preparaciones de polímeros de glicano descritas en el presente documento es un sistema de liberación retardada o un sistema de liberación controlada en el tiempo. Tales sistemas emplean habitualmente recubrimientos entéricos que pueden combinarse con funciones sensibles al pH y de liberación prolongada. Por ejemplo, pueden usarse comprimidos ETP (recubierto a presión de liberación en el tiempo con recubrimiento entérico) que se componente de tres componentes: un comprimido central que contiene polímero de glicano (función de liberación rápida), una capa de polímero hidrofóbico hinchable y recubierta a presión (por ejemplo, capa de hidroxipropilcelulosa (HPC)), y una función de liberación en el tiempo. La duración de la fase de retraso puede controlarse o bien por el peso o bien por la composición de la capa de polímero y una capa de recubrimiento entérico (función de resistencia a ácidos).
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las preparaciones de polímeros de glicano descritas en el presente documento emplea recubrimientos entéricos Eudragit® de comprimidos y cápsulas. Otros polímeros sintéticos adecuados incluyen: recubrimientos de goma laca, etilcelulosa, acetato ftalato de celulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, poli(acetato ftalato de vinilo) y poli(ácido glutámico), tal como ácido poli-y-glutámico (y-PGA). Estos recubrimientos combinan estrategias de liberación tanto mucoadhesiva como dependiente del pH. Para mejorar la administración dirigida al colon, Eudragits® son copolímeros metacrílicos con composiciones de grupos laterales variables que alteran el pH al que son solubles. Por ejemplo, para sistemas recubiertos con Eudragit®, no se produce una liberación significativa de fármaco en el estómago (por ejemplo, a pH 1,4) ni en el intestino delgado (por ejemplo, a pH 6,3), mientras que puede observarse una liberación significativa de fármaco a pH 7,8 en la región ileocecal.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las preparaciones de polímeros de glicano descritas en el presente documento es un sistema activado por microbios, tal como un sistema de administración basado en polisacáridos. Los sistemas de administración basados en polisacáridos contienen recubrimientos de polímeros biodegradables y mucoadhesivos, incluidos recubrimientos de quitosano y pectina. Otros polímeros naturales adecuados incluyen, por ejemplo, goma guar, inulina, ciclodextrina, dextrano, amilasa, sulfato de condrotina y goma de algarroba. Estos sistemas de administración pueden usarse para dirigir el polímero de glicano al intestino delgado. Los recubrimientos con polisacáridos que se producen de manera natural tales como goma guar, goma xantana, quitosano, alginatos, etc. se degradan por la microbiota intestinal del colon, por ejemplo, enzimas tales como xilosidasa, arabinosidasa, galactosidasa, etc. Por ejemplo, puede usare la tecnología CODES™ para administrar las preparaciones de polímeros de glicano. Este sistema combina el recubrimiento de polisacárido con un recubrimiento sensible al pH. En algunas realizaciones, el sistema consiste en un comprimido central recubierto con tres capas de recubrimientos poliméricos: el recubrimiento exterior se compone de Eudragit L. Este recubrimiento se disuelve en el duodeno y expone el siguiente recubrimiento. El siguiente recubrimiento se compone de Eudragit E. Esta capa permite la liberación de la lactulosa presente en el núcleo interno. La lactulosa se metaboliza en ácidos grasos de cadena corta que reducen el pH circundante donde se disuelve la capa de Eudragit E. La disolución de Eudragit E da como resultado la exposición del polímero de glicano. Las bacterias presentes en el colon son responsables de la degradación de los polisacáridos que se liberan del núcleo del comprimido. La degradación de los polisacáridos puede dar como resultado la formación de ácidos orgánicos que reducen el pH del contenido que rodea el comprimido.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las preparaciones de polímeros de glicano descritas en el presente documento es un sistema de administración controlado por presión. El sistema aprovecha el hecho de que en el colon se encuentran presiones más altas que en el intestino delgado. Por ejemplo, para los sistemas de etilcelulosa que son insolubles en agua, la liberación de polímeros de glicano se produce después de la disgregación de una cápsula de polímero insoluble en agua como resultado de la presión en la luz del colon. El perfil de liberación puede ajustarse variando el grosor de la etilcelulosa, el tamaño de la cápsula y/o la densidad de la cápsula.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las preparaciones de polímeros de glicano descritas en el presente documento es un sistema de administración pulsátil dirigido al colon. Por ejemplo, el sistema puede ser un sistema de cápsula pulsante. La cápsula que se emplea comprende un tapón que se coloca en la cápsula y que controla la liberación del polímero de glicano. Un hidrogel hinchable (por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), poli(metacrilato de metilo) o poli(acetato de vinilo)) sella el contenido del fármaco. Cuando la cápsula entra en contacto con un fluido, el tapón se desprende de la cápsula y se libera el polímero de glicano. El perfil de liberación puede controlarse variando la longitud y/o el punto de intersección del tapón con el cuerpo de la cápsula. Otro sistema es un sistema de puerto. El cuerpo de la cápsula está encerrado en una membrana semipermeable. El tapón insoluble consiste en un agente osmóticamente activo y el polímero de glicano. Cuando la cápsula entra en contacto con un fluido, la membrana semipermeable permite el flujo de entrada del fluido, lo que aumenta la presión en el cuerpo de la cápsula. Esto conduce a la expulsión del tapón y a la liberación del polímero de glicano.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las preparaciones de polímeros de glicano descritas en el presente documento es un sistema de administración dirigido al colon controlado osmóticamente. Un sistema a modo de ejemplo, OROS-CT, consiste en unidades osmóticas (hasta 5 o 6 unidades empuje-tracción) encapsuladas en una cápsula de gelatina dura. Las unidades empuje-tracción tienen dos capas con una membrana entérica impermeable exterior y una membrana semipermeable interior. La parte central interna del empuje-tracción consiste en la capa de fármaco y la capa de empuje. El polímero de glicano se libera a través de la membrana semipermeable. El cuerpo de la cápsula que encierra las unidades empuje-tracción se disuelve inmediatamente después de la administración. En el tracto GI, la membrana entérica impermeable impide la absorción de agua. El recubrimiento entérico se disuelve en el intestino delgado (pH más alto, >7), entra agua en la unidad a través de la membrana semipermeable, lo que hace que la capa de empuje se hinche y expulse el polímero de glicano.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las preparaciones de polímeros de glicano descritas en el presente documento es una “píldora inteligente” que puede usarse para liberar el polímero de glicano justo antes de llegar a la válvula ileocecal.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las preparaciones de polímeros de glicano descritas en el presente documento es una formulación administrada por vía rectal. Por ejemplo, los enemas introducen en el recto una preparación de polímero de glicano en formulación líquida. El volumen administrado es normalmente de menos de 10 ml. Los supositorios introducen una preparación de polímero de glicano en el recto. Los supositorios son formas de dosificación sólidas que se derriten o se disuelven cuando se insertan en el recto, liberando los polímeros de glicano. Los excipientes típicos para formulaciones de supositorios incluyen manteca de cacao, polietilenglicoles y agar.
Kits
Los siguientes kits tienen fines ilustrativos.
También se contemplan kits. Por ejemplo, un kit puede comprender formas de dosificación unitaria de la preparación de polímero de glicano y un prospecto que contiene instrucciones para el uso del polímero de glicano en el tratamiento de un trastorno o afección gastrointestinal. Los kits incluyen una preparación de polímero de glicano en un envase adecuado para su uso por un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) que lo necesita. Cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento puede envasarse en forma de un kit. Un kit puede contener una cantidad de una preparación de polímero de glicano (que opcionalmente comprende además una sustancia prebiótica, una bacteria probiótica y/o un segundo agente terapéutico) suficiente para un ciclo completo de tratamiento, o para una parte de un ciclo de tratamiento. Las dosis de una preparación de polímero de glicano pueden envasarse individualmente, o la preparación de polímero de glicano puede proporcionarse a granel, o combinaciones de los mismos. Por tanto, en una realización, un kit proporciona, en un envase adecuado, dosis individuales de una preparación de polímero de glicano que corresponden a puntos de dosificación en un régimen de tratamiento, en donde las dosis se envasan en uno o más envases.
En una realización, la preparación de polímero de glicano puede proporcionarse a granel en un solo recipiente, o en dos, tres, cuatro, cinco o más de cinco recipientes. Por ejemplo, cada recipiente puede contener suficiente preparación de polímero de glicano para una semana particular de un programa de tratamiento que dura un mes. Si se proporciona más de un recipiente a granel, los recipientes a granel pueden envasarse adecuadamente juntos para proporcionar suficiente preparación de polímero de glicano para todo o una parte de un período de tratamiento. El recipiente o recipientes pueden etiquetarse con una etiqueta que indique información útil para el sujeto que la necesita o para el médico que realiza el protocolo de tratamiento, tal como, por ejemplo, programas de dosificación.
La preparación de polímero de glicano puede envasarse con otras sustancias adecuadas, tales como bacterias probióticas, sustancias prebióticas u otras sustancias, tal como se describe en el presente documento. La otra sustancia o sustancias pueden envasarse por separado de la preparación de polímero de glicano, o mezclarse con la preparación de polímero de glicano, o combinaciones de los mismos. Por tanto, en una realización, los kits incluyen una forma de dosificación que contiene todos los componentes destinados a usarse en un curso de tratamiento o una parte de un curso de tratamiento, por ejemplo, una preparación de polímero de glicano y opcionalmente tampones, excipientes, etc., un probiótico, prebiótico o un agente de polímero. En una realización, una preparación de polímero de glicano se envasa en un envase o conjunto de envases, y se envasan componentes adicionales, tales como bacterias probióticas, prebióticos y agentes terapéuticos, por separado de la preparación de polímero de glicano.
Los kits pueden incluir además materiales escritos, tales como instrucciones, resultados esperados, testimonios, explicaciones, advertencias, datos clínicos, información para profesionales de la salud y similares. En una realización, los kits contienen una etiqueta u otra información que indica que el kit es para uso únicamente bajo la dirección de un profesional sanitario. El recipiente puede incluir además cucharas, jeringas, botellas, vasos, aplicadores u otros dispositivos de medición o servicio.
Identificación de constituyentes bacterianos
Los siguientes aspectos y realizaciones para identificar constituyentes bacterianos tienen fines ilustrativos.
En algunas realizaciones, las preparaciones de polímeros de glicano descritas en el presente documento se administran a un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) para aumentar el crecimiento de bacterias beneficiosas, disminuir el crecimiento de patógenos y/o modular un metabolito (microbiano) (tal como, por ejemplo, SCFA, amoníaco, TMA/TMAO, ácidos biliares, LPS) en el tracto GI. En algunas realizaciones, el polímero de glicano desplaza la comunidad microbiana hacia un estado saludable. Los cambios microbianos que se producen en el tracto GI pueden analizarse usando cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. Como método cuantitativo para determinar si una preparación de polímero de glicano da como resultado un cambio en la población de bacterias en el tracto GI, puede realizarse PCR cuantitativa (qPCR). Puede extraerse ADN genómico de muestras usando kits disponibles comercialmente, tales como el kit de aislamiento de ADN Mo Bio Powersoil®-htp 96 Well Soil (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA), el kit de aislamiento de ADN Mo Bio Powersoil® (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA), o el kit QIAamp DNA Stool Mini (QIAGEN, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante, o mediante otros métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica.
En algunas realizaciones, la qPCR puede realizarse usando HotMasterMix (5PRIME, Gaithersburg, MD) y cebadores específicos para ciertas bacterias (por ejemplo, beneficiosas o deseadas) y puede realizarse en una placa de reacción de 96 pocillos MicroAmp® Fast Optical código de barras (0,1 ml) (Life Technologies, Grand Island, NY) y realizarse en un termociclador BioRad C1000™ equipado con un sistema en tiempo real CFX96™ (BioRad, Hercules, CA), con lecturas fluorescentes de los canales FAM y ROX. El valor de Cq para cada pocillo en el canal FAM lo determina el software CFX Manager™ versión 2.1. El logio(ufc/ml) de cada muestra experimental se calcula introduciendo el valor de Cq de una muestra dada en un modelo de regresión lineal generado a partir de la curva patrón comparando los valores de Cq de los pocillos de la curva patrón con el log10(ufc/ml) conocido de esas muestras. El experto en la técnica puede emplear modos de qPCR alternativos. En algunas realizaciones, los constituyentes microbianos se identifican caracterizando la secuencia de ADN del gen de ARN ribosómico de subunidad pequeña 16S microbiano (gen de ARNr 16S). El gen ARNr 16S tiene aproximadamente 1.500 nucleótidos de longitud y, en general, está altamente conservado en todos los organismos, pero contiene regiones variables e hipervariables específicas (V1-V9) que albergan suficiente diversidad de nucleótidos para diferenciar taxones a nivel de especie y cepa de la mayoría de los organismos. Estas regiones en bacterias están definidas por los nucleótidos 69-99, 137-242, 433-497, 576-682, 822-879, 986 1043, 1117-1173, 1243-1294 y 1435-1465 respectivamente usando una numeración basada en el sistema de nomenclatura deE. coli.(véase, por ejemplo, Brosiuset al.,Complete nucleotide sequence of a 16S ribosomal RNA gene from Escherichia coli, PNAS 75(10):4801-4805 (1978).)).
La composición de una comunidad microbiana puede deducirse secuenciando el gen de ARNr 16S completo, o al menos una de las regiones V1, V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8 y V9 de este gen o mediante la secuenciación de cualquier combinación de regiones variables de este gen (por ejemplo, V1-3 o V3-5). En una realización, se usan las regiones V1, V2 y V3 para caracterizar una microbiota. En otra realización, se usan las regiones V3, V4 y V5 para caracterizar una microbiota. En otra realización, se usa la región V4 para caracterizar una microbiota.
Las secuencias que son al menos el 97 % idénticas entre sí se agrupan en Unidades Taxonómicas Operativas (OTU). Las OTU que contienen secuencias con un 97 % de similitud corresponden aproximadamente a taxones a nivel de especie. Se elige al menos una secuencia representativa de cada OTU y se usa para obtener una asignación taxonómica para una OTU mediante comparación con una base de datos de referencia de secuencias del gen de ARNr 16S altamente curadas (tales como las bases de datos Greengenes o SILVA). La relación entre las OTU en una comunidad microbiana podría deducirse mediante la construcción de un árbol filogenético a partir de secuencias representativas de cada OTU.
Usando técnicas conocidas, con el fin de determinar la secuencia de 16S completa o la secuencia de cualquier región variable de la secuencia de 16S, se extrae el ADN genómico de una muestra bacteriana, se amplifica el ARNr 16S (región completa o regiones variables específicas) usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se limpian los productos de la PCR y se delinean las secuencias de nucleótidos para determinar la composición genética del gen de ARNr 16S o una región variable del gen. Si se realiza una secuenciación de 16S completa, el método de secuenciación usado puede ser, pero no se limita a, secuenciación de Sanger. Si se usa una o más regiones variables, tales como la región V4, la secuenciación puede realizarse, pero sin limitarse a, usando el método de Sanger o usando un método de secuenciación de última generación, tal como un método Illumina. Los cebadores diseñados para hibridarse con regiones conservadas de genes de ARNr 16S (por ejemplo, los cebadores 515F y 805R para la amplificación de la región V4) podrían contener secuencias de códigos de barras únicas para permitir la caracterización de múltiples comunidades microbianas simultáneamente.
Como otro método para identificar la composición microbiana, está la caracterización de genes o marcadores de nucleótidos, en particular genes altamente conservados (por ejemplo, genes “de mantenimiento”), o una combinación de los mismos, o una secuencia indiscriminada del genoma completo (WGS). Usando métodos definidos, el ADN extraído de una muestra bacteriana tendrá regiones genómicas específicas amplificadas usando PCR y se secuenciará para determinar la secuencia de nucleótidos de los productos amplificados. En el método WGS, el ADN extraído se fragmentará en trozos de diversas longitudes (de 300 a aproximadamente 40.000 nucleótidos) y se secuenciará directamente sin amplificación. Pueden generarse datos de secuencia usando cualquier tecnología de secuenciación incluida, pero sin limitarse a, Sanger, Illumina, 454 Life Sciences, Ion Torrent, ABI, Pacific Biosciences y/u Oxford Nanopore.
Además del gen de ARNr 16S, se analiza un conjunto seleccionado de genes que se sabe que son genes marcadores para una especie o grupo taxonómico determinado para evaluar la composición de una comunidad microbiana. Alternativamente, estos genes se analizan usando una estrategia de detección basada en PCR. Por ejemplo, diversas cepas deEscherichia colipatogénica se distinguen utilizando genes que codifican para toxinas termolábiles (LTI, LTha y LTIIb) y termoestables (STI y STII), verotoxina tipos 1, 2 y 2e (VT1, VT2 y VT2e, respectivamente), factores necrotizantes citotóxicos (CNF1 y CNF2), mecanismos de fijación y borrado (eaeA), mecanismos enteroagregativos (Eagg) y mecanismos enteroinvasivos (Einv). Los genes óptimos que van a utilizarse para determinar la composición taxonómica de una comunidad microbiana mediante el uso de genes marcadores son familiares para un experto habitual en la técnica de la identificación taxonómica basada en secuencias.
Pueden prepararse bibliotecas de secuenciación para la secuenciación del genoma completo (WGS) microbiano a partir de ADN genómico bacteriano. Para el ADN genómico que se ha aislado de una muestra humana o de un animal de laboratorio, el ADN puede enriquecerse opcionalmente con ADN bacteriano usando kits disponibles comercialmente, por ejemplo, el kit de enriquecimiento de ADN de microbioma NEBNext (New England Biolabs, Ipswich, MA) u otro kit de enriquecimiento. También pueden prepararse bibliotecas de secuenciación a partir del ADN genómico usando kits disponibles comercialmente, tales como el kit de preparación de muestras Nextera Mate-Pair, TruSeq DNA PCR-Free o TruSeq Nano DNA, o el kit de preparación de muestras Nextera XT (Illumina, San Diego, Estados Unidos, CA) según las instrucciones del fabricante. Alternativamente, pueden prepararse bibliotecas usando otros kits compatibles con la plataforma de secuenciación Illumina, tales como el kit de construcción de bibliotecas de ADN NEBNext (New England Biolabs, Ipswich, MA). Luego, las bibliotecas pueden secuenciarse usando tecnología de secuenciación convencional que incluye, pero no se limita a, un secuenciador MiSeq, HiSeq o NextSeq (Illumina, San Diego, CA).
Alternativamente, puede prepararse una biblioteca de fragmentos indiscriminados de genoma completo usando métodos convencionales en la técnica. Por ejemplo, la biblioteca de fragmentos indiscriminados podría construirse usando el kit de preparación rápida de bibliotecas GS FLX Titanium (454 Life Sciences, Branford, CT), amplificarse usando un kit GS FLX Titanium emPCR (454 Life Sciences, Branford, CT) y secuenciarse siguiendo protocolos de pirosecuenciación 454 convencionales en un secuenciador 454 (454 Life Sciences, Branford, CT).
Puede aislarse ARN bacteriano aislar de cultivos microbianos o muestras que contienen bacterias mediante kits disponibles comercialmente, tales como el kit de purificación de ARN bacteriano RiboPure (Life Technologies, Carlsbad, CA). Otro método para el aislamiento de ARN bacteriano puede implicar el enriquecimiento de ARNm en muestras purificadas de ARN bacteriano a través de la eliminación de ARNt. Alternativamente, el ARN puede convertirse en ADNc, que se usa para generar bibliotecas de secuenciación usando métodos convencionales como el kit de preparación de muestras Nextera XT (Illumina, San Diego, CA).
Las secuencias de ácidos nucleicos se analizan para definir asignaciones taxonómicas usando métodos de similitud de secuencia y colocación filogenética o una combinación de las dos estrategias. Se usa un enfoque similar para anotar nombres de proteínas, funciones de proteínas, nombres de factores de transcripción y cualquier otro esquema de clasificación para secuencias de ácidos nucleicos. Los métodos basados en similitud de secuencia incluyen BLAST, BLASTx, tBLASTn, tBLASTx, RDP-classifier, DNAclust, RapSearch2, DIAMOND, USEARCH y diversas implementaciones de estos algoritmos tales como QIIME o Mothur. Estos métodos mapean una lectura de secuencia en una base de datos de referencia y seleccionan la mejor coincidencia. Las bases de datos comunes incluyen KEGG, MetaCyc, base de datos no redundante NCBI, Greengenes, RDP y Silva para asignaciones taxonómicas. Para asignaciones funcionales, se mapean lecturas en diversas bases de datos funcionales, tales como COG, KEGG, BioCyc, MetaCyc y la base de datos de enzimas activas en hidratos de carbono (CAZy). Los clados microbianos se asignan usando software incluido MetaPhlAn.
Análisis proteómico de poblaciones microbianas.
Pueden seleccionarse preparaciones de polímeros de glicano basándose en su capacidad para aumentar la expresión de proteínas microbianas asociadas con estados saludables o para disminuir la expresión de proteínas microbianas asociadas con estados patológicos. El análisis proteómico de poblaciones microbianas puede realizarse siguiendo protocolos conocidos por un experto en la técnica (por ejemplo, Cordwell, Exploring and exploiting bacterial proteomes, Methods in Molecular Biology, 2004, 266:115). Para identificar proteínas expresadas diferencialmente (por ejemplo, para identificar cambios en la expresión de proteínas tras el tratamiento de poblaciones microbianas con polímeros de glicano), puede realizarse un análisis proteómico tal como se describe, por ejemplo, en Justeet al.(Bacterial protein signals are associated with Crohn's disease, Gut, 2014, 63:1566). Por ejemplo, la proteína se aísla de los lisados microbianos de dos muestras (por ejemplo, una población microbiana no tratada y una población que se ha tratado con polímeros de glicano). Cada muestra de proteína se etiqueta (por ejemplo, con un tinte fluorescente, por ejemplo, Cy3 o colorante mínimo Cy5 CyDye DIGE Fluor, GE Healthcare) y se analiza mediante electroforesis en gel diferencial bidimensional (2D-DIGE). Los geles se tiñen y las manchas de proteínas identificadas como significativamente diferentes entre las dos muestras se cortan, se digieren y se analizan mediante cromatografía de líquidos-espectrometría de masas en tándem (CL-EM/EM). Puede usarse X!TandemPipeline (http://pappso.inra.fr/bioinfo/xtandempipeline/) para identificar proteínas expresadas diferencialmente.
También pueden seleccionarse preparaciones de polímeros de glicano para su administración a un sujeto humano basándose en su efecto sobre la presencia de productos microbianos. Por ejemplo, pueden seleccionarse preparaciones de polímeros de glicano por su capacidad para inducir o promover el crecimiento de bacterias que producen ácidos grasos de cadena corta tales como propionato (ácido propiónico), acetato y/o butirato (ácido butírico). De manera similar, pueden seleccionarse preparaciones de polímeros de glicano por su capacidad para inducir o promover el crecimiento de bacterias que producen ácido láctico, que pueden modular el crecimiento de otras bacterias produciendo un entorno ácido y también se utilizan por taxones productores de butirato. Tal análisis también puede usarse para emparejar bacterias probióticas con polímeros de glicano de modo que el polímero de glicano sea un sustrato para la producción de los productos de fermentación deseados. En algunas realizaciones, también pueden seleccionarse polímeros de glicano para su administración a un sujeto humano basándose en su efecto sobre taxones bacterianos que no producen un metabolito no deseado, tal como, por ejemplo, amoníaco, un soluto urémico, TMA y similares. En algunas realizaciones, los polímeros de glicano aumentan el crecimiento de taxones bacterianos que no producen un metabolito no deseado, compitiendo exitosamente de ese modo con taxones bacterianos que producen el metabolito no deseado (por ejemplo, por espacio y nutrientes). Al desplazar el equilibrio de no productores a productores en favor de los no productores, puede reducirse el nivel global del metabolito no deseado. En algunas realizaciones, el equilibrio entre los taxones productores de SCFA y los no productores se desplaza hacia los productores de SCFA para aumentar el nivel de producción de SCFA (por ejemplo, butirato, acetato, propionato). En algunas realizaciones, el equilibrio entre taxones productores de amoníaco y taxones no productores se desplaza hacia los no productores (por ejemplo, taxones bacterianos negativos a ureasa) para disminuir el nivel de producción de amoníaco. En algunas realizaciones, el equilibrio de los productores de TMA a taxones no productores se desplaza hacia los no productores para disminuir el nivel de producción de TMA. Los metabolitos que están presentes en medios de cultivo nuevos o usados o en muestras biológicas recogidas de seres humanos pueden determinarse usando métodos descritos en el presente documento. Métodos no sesgados que pueden usarse para determinar la concentración relativa de metabolitos en una muestra y que conoce un experto en la técnica, tales como cromatografía de gases o líquidos combinada con espectrometría de masas o 1H-RMN. Estas mediciones pueden validarse ejecutando patrones de metabolitos a través de los mismos sistemas analíticos.
En el caso del análisis de cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-EM) o de cromatografía de líquidos-espectrometría de masas (CL-EM), podrían extraerse metabolitos polares y ácidos grasos usando sistemas monofásicos o bifásicos de disolventes orgánicos y una muestra acuosa y derivatizarse (Fendtet al.,Reductive glutamine metabolism is a function of the a-ketoglutarate to citrate ratio in cells, Nat Commun, 2013, 4:2236; Fendtet al.,Metformin decreases glucose oxidation and increases the dependency of prostate cancer cells on reductive glutamine metabolism, Cancer Res, 2013, 73:4429; Metalloet al.,Reductive glutamine metabolism by IDH1 mediates lipogenesis under hypoxia, Nature, 2011, 481:380). Un protocolo a modo de ejemplo para la derivatización de metabolitos polares implica la formación de derivados de metoxima-tBDMS a través de la incubación de los metabolitos con clorhidrato de metoxilamina al 2 % en piridina, seguido por la adición de N-terc-butildimetilsilil-N-metiltrifluoroacetamida (MTBSTFA) con terc-butildimetilclorosilano al 1% (t-BDMCS). Las fracciones no polares, incluidos triacilglicéridos y fosfolípidos, pueden saponificarse para dar ácidos grasos libres y esterificarse para formar ésteres metílicos de ácidos grasos, por ejemplo, o bien mediante incubación con H2SO4 al 2% en metanol o bien usando reactivo de metil-8 (Thermo Scientific). Luego, las muestras derivatizadas pueden analizarse mediante GC-EM utilizando métodos de CL-EM convencionales, por ejemplo, una columna DB-35MS (30 m x 0,25 mm de d.i. x 0,25 |im, Agilent J&W Scientific) instalada en un cromatógrafo de gases (GC) interconectado con un espectrómetro de masas (EM). Las distribuciones de isotopómeros de masa pueden determinarse integrando fragmentos iónicos de metabolitos y corregirse según la abundancia natural usando algoritmos convencionales, tales como los adaptados de Fernándezet al.(Fernández et al., Correction of 13C mass isotopomer distributions for natural stable isotope abundance, J Mass Spectrom, 1996, 31:255). En el caso de la cromatografía de líquidos-espectrometría de masas (CL-EM), los metabolitos polares pueden analizarse utilizando una CL-EM/EM de sobremesa convencional equipada con una columna, tal como una columna polimérica SeQuant ZIC-pHILIC (2,1 * 150 mm; EMD Millipore). Las fases móviles a modo de ejemplo usadas para la separación podrían incluir tampones y disolventes orgánicos ajustados a un valor de pH específico.
En combinación o como alternativa, las muestras extraídas pueden analizarse mediante Resonancia magnética nuclear de 1H (1H-RMN). Las muestras pueden combinarse con disolventes enriquecidos isotópicamente tales como D2O, opcionalmente en presencia de una disolución tamponada (por ejemplo, Na2HPO4, NaH2PO4 en D2O, pH 7,4). Las muestras también pueden complementarse con un patrón de referencia para la calibración y determinación del desplazamiento químico (por ejemplo, sal sódica de 2,2-dimetil-2-silapentano-5-sulfonato 5 mM (DSS-d6, Isotec, EE. UU.)). Antes del análisis, la disolución puede filtrarse o centrifugarse para eliminar cualquier sedimento o precipitado y luego transferirse a un tubo o recipiente de RMN adecuado para su análisis (por ejemplo, un tubo de r Mn de 5 mm). Los espectros de 1H-RMN pueden adquirirse en un espectrómetro de RMN convencional, tal como un espectrómetro Avance II 500 Bruker (500 MHz) (Bruker, DE), equipado con un cabezal de sonda QXI-Z C/N/P de 5 mm) y analizarse con software de integración de espectros (tal como Chenomx NMR Suite 7.1; Chenomx Inc., Edmonton, AB). (Duarteet al.,1H-NMR protocol for exometabolome analysis of cultured mammalian cells, Methods Mol Biol, 2014:237-47). Alternativamente, puede realizarse 1H-RMN siguiendo otros protocolos publicados conocidos en la técnica (Chassainget al.,Lack of soluble fiber drives diet-induced adiposity in mice, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2015; Baiet al.,Comparison of Storage Conditions for Human Vaginal Microbiome Studies, PLoS ONE, 2012:e36934).
Administración
En algunas realizaciones, se administra un polímero de glicano a un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) que lo necesita mediante administración enteral. En algunas realizaciones, se administra un polímero de glicano a un sujeto que lo necesita mediante administración oral, nasal, gástrica o rectal. En algunas realizaciones, se administra un polímero de glicano a un sujeto que lo necesita mediante alimentación por sonda.
En algunas realizaciones, se administra un polímero de glicano a un sujeto que lo necesita inmediatamente después de que uno o más tratamientos farmacológicos hayan finalizado (por ejemplo, 1 hora, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas después de finalizar el tratamiento con antibiótico). Durante un curso de tratamiento farmacológico, la preparación de polímero de glicano puede proporcionarse antes del inicio del tratamiento farmacológico (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 días antes); el día del inicio del tratamiento farmacológico; o poco después del tratamiento con antibiótico, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más días después del tratamiento, y opcionalmente puede proporcionarse sólo inicialmente (por ejemplo, durante un período corto) o durante toda la duración del tratamiento farmacológico, e incluso puede continuarse durante un período deseado después de que haya finalizado el período de tratamiento farmacológico (por ejemplo, durante de 1 a 7 días, 1 a 14 días o 1 a 21 días después). En algunas realizaciones, la administración de la preparación de polímero de glicano se inicia o continúa cuando se producen y/o se diagnostican uno o más efectos adversos (por ejemplo, anomalías digestivas o crecimiento de patógenos) junto con el tratamiento farmacológico. En algunas realizaciones, el agente de tratamiento que provoca una disbiosis no es un fármaco sino un tratamiento de radiación o cirugía y la preparación de polímero de glicano también puede administrarse tal como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, el número total y la duración de los períodos de tratamiento se basan en la respuesta de un sujeto al tratamiento. Por ejemplo, un individuo puede experimentar una reducción de los síntomas después de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 días de tratamiento con una preparación de polímero de glicano. En otro ejemplo, un individuo puede experimentar una reducción de los síntomas después de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses de tratamiento con una preparación de polímero de glicano. Por tanto, la duración del tratamiento está determinada por la respuesta de un sujeto individual a una preparación de polímero de glicano y la aparición del alivio de uno o más síntomas. Por tanto, un sujeto puede experimentar síntomas con una dosis determinada de una preparación de polímero de glicano y puede requerir que el sujeto permanezca en esa dosis, o en una dosis más baja, hasta que los síntomas desaparezcan. Por tanto, en una realización, la duración del tratamiento no se determina desde el principio, sino que continúa hasta que se alcanza la dosis máxima de una preparación de polímero de glicano por día, o hasta que se logra el nivel deseado de reducción de los síntomas. En una realización, el tratamiento es continuo.
En una realización, a un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) puede administrársele una dosis para el primer período de tratamiento durante un régimen de tratamiento y una segunda dosis durante un segundo período de tratamiento. Por ejemplo, a un sujeto puede administrársele una dosis de preparación de polímero de glicano durante un período de una semana y una segunda dosis durante un período posterior de una semana.
Un sujeto puede autoadministrarse una preparación de polímero de glicano y la preparación de polímero de glicano la suministra o recomienda (o receta) un profesional sanitario, por ejemplo, un médico u otro profesional sanitario calificado y, opcionalmente, se monitorizan los resultados de prueba (por ejemplo, obtenidos para biomarcadores de muestras tomadas del sujeto) y/o cambios de salud y criterios de valoración del tratamiento por un profesional sanitario. En algunas realizaciones, la preparación de polímero de glicano la administra un profesional sanitario.
En una realización, un sujeto que lo necesite puede someterse a cursos repetidos de tratamiento con una preparación de polímero de glicano. El curso del tratamiento puede repetirse cuando los síntomas reaparecen o aumentan hasta un nivel no deseado. Alternativamente, el curso de tratamiento puede repetirse a intervalos regulares o predeterminados. Así, el tratamiento puede repetirse después de aproximadamente un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, seis meses, ocho meses, diez meses, un año, 18 meses, dos años, tres años, cuatro años, cinco años o más de cinco años, o cualquier combinación de los mismos (por ejemplo, el tratamiento puede repetirse después de un año y luego cada de dos a cinco años). El tratamiento puede repetirse de la misma forma (por ejemplo, duración, dosificación, momento de la dosificación, sustancias adicionales, etc.) que se usó en el primer tratamiento o puede modificarse. Por ejemplo, la duración del tratamiento puede acortarse o alargarse, la dosis puede aumentarse o disminuirse.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra una, dos o tres veces al día. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra dos veces al día. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra cada día durante un número predeterminado de días (el período de tratamiento). En algunas realizaciones, el período de tratamiento es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 100, 200, 300 o 365 días. En algunas realizaciones, el período de tratamiento es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses. En algunas realizaciones, el período de tratamiento es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 años o de por vida.
En una realización, la duración total de los períodos de tratamiento para una enfermedad, trastorno o afección gastrointestinal puede ser de aproximadamente un día a 10 años, de un día a 1 año, de 1 día a 6 meses, de 1 día a 3 meses, de 1 día a 1 mes, de un día a una semana, de un día a cinco días, de un día a 10 días, de una semana a aproximadamente 12 semanas, o de aproximadamente cuatro semanas a aproximadamente diez semanas, o de aproximadamente cuatro semanas a aproximadamente ocho semanas, o de aproximadamente seis semanas. El sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) puede someterse a un número adecuado de períodos de tratamiento, tales como, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de 10 períodos de tratamiento. Durante un período de tratamiento, el sujeto toma una preparación de polímero de glicano descrita en el presente documento, opcionalmente junto con la ingestión de productos alimenticios que contienen prebióticos y/o probióticos. En una realización, también puede administrarse una preparación de polímero de glicano en combinación con otra sustancia (tal como un probiótico o una bacteria beneficiosa comensal, una sustancia prebiótica o un agente terapéutico), tal como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, la preparación de polímero de glicano también puede combinarse con un antibiótico que altera el crecimiento normal de la microbiota gastrointestinal. Normalmente, la duración de los tratamientos con antibióticos es de 1-14 días, o 2-10 días o 5-7 días. En algunas realizaciones, se administra un polímero de glicano a un sujeto que lo necesita inmediatamente después de que uno o más tratamientos con antibióticos hayan finalizado (por ejemplo, 1 hora, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas después de finalizar el tratamiento con antibiótico). Durante un curso de tratamiento con antibiótico, la preparación de polímero de glicano puede proporcionarse al inicio del tratamiento con antibiótico; poco después del tratamiento con antibiótico, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más días después del tratamiento; o puede administrarse tras el diagnóstico de crecimiento de patógenos no deseados.
Métodos de tratamiento
En el presente documento se proporcionan métodos para tratar a un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) que tiene una enfermedad o trastorno. En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno está asociado con un nivel no deseado de un metabolito, en donde el metabolito es trimetilamina (TMA) o N-óxido de trimetilamina (TMAO). Los métodos, en algunas realizaciones, incluyen administrar al sujeto humano una preparación de polímero de glicano en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad o trastorno, en donde la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste en aterosclerosis, enfermedad cardiovascular, riesgo cardiovascular en VIH, aterosclerosis de la carótida, cardiopatía crónica, insuficiencia cardíaca crónica, enfermedad renal crónica, enfermedad vascular crónica, cáncer colorrectal, cardiopatía coronaria, arteriopatía coronaria (CAD), diabetes (tipo II), enfermedad renal en estadio terminal, VIH, enfermedad inflamatoria del intestino, ataque isquémico, síndrome metabólico, enfermedad de hígado graso no alcohólica (NAFLD), obesidad, síntomas intestinales agudos inducidos por radiación (RIAIS) y accidente cerebrovascular. El método para tratar al sujeto comprende: seleccionar una preparación de polímero de glicano basándose en el conocimiento de que modula la producción o el nivel del metabolito, y administrar una cantidad de la preparación de polímero de glicano eficaz para dar como resultado una modulación del nivel del metabolito, tratando de ese modo la enfermedad o el trastorno, en donde la preparación de polímero de glicano comprende glucosa y al menos un enlace alfa-glicosídico, opcionalmente, en donde el enlace alfa-glicosídico es un enlace alfa-1,3 glicosídico, un enlace alfa-1,4 glicosídico, o una combinación de los mismos, y en donde el grado de polimerización (DP) medio de la preparación está entre DP3-15. En algunas realizaciones, la preparación de polímero de glicano (por ejemplo, descrita en el presente documento) es beneficiosa en el tratamiento de diversas enfermedades, trastornos o afecciones. Tales enfermedades, trastornos o afecciones pueden estar asociados con una disbiosis de la microbiota. Las alteraciones en la microbiota beneficiosa pueden producirse debido a una variedad de factores (por ejemplo, genéticos o ambientales), incluidos, pero sin limitarse a, el uso de antibióticos, productos quimioterápicos y otros fármacos o tratamientos que inducen disbiosis (por ejemplo, radioterapia), infección por patógenos, actividad de patobiontes, ingesta calórica mal calibrada (por ejemplo, alta en grasas, alta en azúcar), ingesta de fibra mal calibrada (no digerible) (por ejemplo, fibra baja o nula), factores del huésped (por ejemplo, alteraciones genéticas del huésped) y similares. En algunas realizaciones, la enfermedad, trastorno o afección está asociada con una disbiosis de la microbiota gastrointestinal. En algunas realizaciones, mediante el tratamiento de la disbiosis, se trata la enfermedad, trastorno o afección. Los síntomas que pueden estar asociados con una disbiosis de la microbiota gastrointestinal y/o con una enfermedad, trastorno o afección gastrointestinal incluyen, pero no se limitan a, gases, acidez estomacal, malestar estomacal, hinchazón, flatulencia, diarrea, dolor abdominal, calambres, náuseas, y vómitos. Los problemas digestivos menores relacionados con el GI también incluyen hinchazón ocasional, diarrea, estreñimiento, gases o malestar estomacal.
Indicaciones asociadas con metabolitos
La enfermedad o trastorno está asociado con un nivel no deseado de un metabolito, en donde el metabolito es trimetilamina (TMA) o N-óxido de trimetilamina (TMAO). Los metabolitos, tales como un ácido graso de cadena corta (SCFA), un soluto urémico, un lipopolisacárido o un ácido biliar, y las bacterias que los producen, se han asociado con una gama de enfermedades y se incluyen con fines ilustrativos. Por ejemplo, se han notificado niveles reducidos de bacterias productoras de butirato en la enfermedad de Crohn (Takahashiet al.,(2016)), y se notifica que los niveles de butirato y propionato se reducen y el acetato aumenta en muestras fecales de pacientes con enfermedad de Crohn (Galeckaet al.,(2013)). Se ha notificado que el butirato disminuye la expresión de citocinas proinflamatorias, que pueden desempeñar un papel importante en la enfermedad inflamatoria intestinal, incluida la enfermedad de Crohn (Ruso I.et al.PLoS One 2012). Otras enfermedades asociadas con niveles disminuidos de butirato en relación con poblaciones de pacientes sanos incluyen colitis ulcerosa (Kumariet al.,2013), diabetes tipo 2 (Qinet al.,2012), dermatitis atópica (Songet al.,2016), cáncer colorrectal (Wanget al.,2012) y enfermedad de Parkinson (Keshavarzianet al.,2015). La administración de glicanos que apoyan el crecimiento de la microbiota asociada positivamente con la producción de butirato, directa o indirectamente, a individuos puede aumentar los niveles de butiratoin vivoy mejorar o prevenir los síntomas de la enfermedad de Crohn.
En algunas realizaciones, también puede ser beneficioso administrar glicanos que reducen la producción de uno o más ácidos grasos de cadena corta para tratar algunas enfermedades. Se notifica que las bacterias productoras de butirato están aumentadas en pacientes obesos en comparación con individuos sanos (Rosset al.,2015), y se ha descubierto que el butirato y el propionato aumentan en las heces de pacientes obesos en relación con pacientes sanos (Payneet al.,2011); asimismo, niveles elevados de acetato se han asociado con la obesidad (Gaoet al.,2014). La administración de glicanos que disminuyen selectivamente la microbiota asociada directa o indirectamente con un aumento de butirato, propionato y/o acetato puede ser útil, por tanto, para tratar o prevenir la obesidad. Otras enfermedades asociadas con niveles relativamente altos de acetato incluyen síndrome de malabsorción (Balaet al.,2006), cáncer colorrectal (Weiret al.,(2013) y enfermedad de Crohn (Galeckaet al.,2013). La administración de glicanos a individuos para disminuir selectivamente la microbiota asociada directa o indirectamente con un aumento de acetato puede ser útil en el tratamiento o la prevención de enfermedades asociadas con niveles elevados de acetato, tales como obesidad, síndrome de malabsorción, cáncer colorrectal y enfermedad de Crohn.
En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno está asociado con un nivel (por ejemplo, un nivel no deseado) de un ácido graso de cadena corta, por ejemplo, y se selecciona de reservoritis aguda, enfermedades alérgicas, SIDA, aterosclerosis, asma, dermatitis atópica, trastorno del espectro autista, estreñimiento funcional crónico, enfermedad celíaca, gastritis atrófica crónica, reservoritis crónica, enfermedad asociada aClostridium difficile(CDAD), enfermedad celíaca, adenoma colorrectal, cáncer colorrectal, enfermedad de Crohn, fibrosis quística, depresión, diabetes (tipo I), diabetes (tipo II), diarrea, eccema, enterostomía, fiebre mediterránea familiar, hipersensibilidad alimentaria, enfermedad de injerto contra huésped (GvHD), encefalopatía hepática, hipertensión, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad del intestino irritable, enfermedad del intestino irritable-estreñimiento (IBS-C), cáncer de pulmón, colitis microscópica, esclerosis múltiple, enfermedad de hígado graso no alcohólica (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), asma relacionada con obesidad, enfermedad de Parkinson (EP), síntomas intestinales agudos inducidos por radiación, shigelosis, síndrome de intestino corto, disfunción intestinal asociada a lesión de la médula espinal, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, lupus eritematoso sistémico y colitis ulcerosa. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos de tratamiento que incluyen modular los niveles de SCFA para tratar la enfermedad o trastorno.
En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno está asociado con un nivel (por ejemplo, un nivel no deseado) de un ácido graso de cadena corta, por ejemplo, butirato, es diarrea. En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno está asociado con un nivel (por ejemplo, un nivel no deseado) de un ácido graso de cadena corta, por ejemplo, butirato, es toxicidad, por ejemplo, toxicidad de fármaco. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos de tratamiento que incluyen modular los niveles de SCFA, por ejemplo, butirato para tratar la enfermedad o trastorno, tal como síntomas asociados a diarrea, tales como, por ejemplo, diarrea provocada por toxicidad farmacológica.
En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno está asociado con un nivel (por ejemplo, un nivel no deseado) de trimetilamina o N-óxido de trimetilamina, por ejemplo, y se selecciona de aterosclerosis, enfermedad cardiovascular, riesgo cardiovascular en VIH, aterosclerosis de la carótida, cardiopatía crónica, insuficiencia cardíaca crónica, enfermedad renal crónica (ERC), enfermedad vascular crónica, cáncer colorrectal, cardiopatía coronaria, arteriopatía coronaria (CAD), diabetes (tipo II), enfermedad renal en estadio terminal, VIH, enfermedad inflamatoria del intestino, ataque isquémico, síndrome metabólico, enfermedad de hígado graso no alcohólica (NAFLD), obesidad, síntomas intestinales agudos inducidos por radiación (RIAIS) y accidente cerebrovascular. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos de tratamiento que incluyen modular los niveles de TMA o TMAO para tratar la enfermedad o trastorno.
En algunas realizaciones, la enfermedad o el trastorno está asociado con un nivel (por ejemplo, un nivel no deseado) de amoníaco, por ejemplo, y se selecciona entre enfermedad renal crónica, infección porHelicobacter pylori,encefalopatía hepática y cirrosis hepática con encefalopatía hepática mínima (MHE). En una realización, la enfermedad o el trastorno que está asociado con un nivel (por ejemplo, un nivel no deseado) de amoníaco es encefalopatía hepática (HE). En algunas realizaciones, se proporcionan métodos de tratamiento que incluyen modular los niveles de amonía
En algunas realizaciones, la enfermedad o el trastorno está asociado con un nivel (por ejemplo, un nivel no deseado) de un ácido biliar, por ejemplo, y se selecciona de cirrosis hepática alcohólica, aterosclerosis, reservoritis crónica, cirrosis, adenoma colorrectal, cáncer colorrectal, cáncer colorrectal (pacientes poscolecistectónicos), arteriopatía coronaria, enfermedad de Crohn, fibrosis quística, enfermedad inflamatoria del intestino, diabetes (tipo II), enfermedad hepática asociada a insuficiencia intestinal, enfermedad del intestino irritable, enfermedad del intestino irritable-estreñimiento (IBS-C), síndrome de malabsorción, enfermedad de hígado graso no alcohólica (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), obesidad, asma relacionada con la obesidad, poscolecistectomía, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria (PSC), colestasis intrahepática familiar progresiva, esofagitis por reflujo, síndrome del intestino corto, síndrome de Steven Johnson, colitis ulcerosa y enfermedad diverticular no complicada. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos de tratamiento que incluyen modular los niveles de un ácido biliar para tratar la enfermedad o el trastorno.
En algunas realizaciones, la enfermedad o el trastorno está asociado con un nivel (por ejemplo, un nivel no deseado) de lipopolisacárido, por ejemplo, y se selecciona de enfermedades alérgicas, aterosclerosis, trastorno del espectro autista, hepatitis autoinmunitaria, síndromes de fatiga crónica (CFS), enfermedad renal crónica. enfermedades vasculares crónicas, inmunodeficiencia común variable (CVID), enfermedad de Crohn, depresión, diabetes (tipo II), encefalopatía hepática, hepatitis B, hepatitis C, VIH, controladores de élite del VIH, enfermedades hepáticas asociadas a insuficiencia intestinal, enfermedad del intestino irritable, síndrome metabólico, enterocolitis necrotizante neonatal (ECN), obesidad, enfermedad de Parkinson (EP) y colitis ulcerosa. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos de tratamiento que incluyen modular los niveles de LPS para tratar la enfermedad o el trastorno.
Toxicidad farmacológica/anomalías digestivas (incluida diarrea)
En el presente documento se proporcionan métodos para reducir los síntomas inducidos por fármacos o tratamientos en un sujeto humano mediante la administración de una preparación de polímero de glicano (por ejemplo, tal como se describe en el presente documento). En una realización, los métodos incluyen modular los niveles de SCFA, incluido butirato. Los síntomas inducidos por fármacos o tratamientos incluyen cualquier anomalía digestiva. Las anomalías digestivas a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, aumento de peso, estreñimiento, acidez de estómago, malestar estomacal, gases, hinchazón, flatulencia, diarrea, dolor abdominal, calambres, náuseas y vómitos. En algunas realizaciones, la anomalía digestiva es diarrea. El método incluye administrar al sujeto humano una composición farmacéutica que comprende una preparación de polímero de glicano en una cantidad eficaz para reducir uno o más síntomas inducidos por un fármaco o tratamiento. En una realización, el tratamiento es tratamiento con radiación. En una realización, el tratamiento es un tratamiento quimioterápico.
En una realización, el sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) que se identifica como adecuado para el tratamiento con una preparación de polímero de glicano tiene o se sospecha que tiene diarrea inducida por fármacos, estreñimiento inducido por fármacos, toxicidad inducida por fármacos, intolerancia inducida por fármacos (por ejemplo, a metformina, a quimioterapias, tales como, por ejemplo, irinotecán (camptosar) y/o 5-fluorouracilo), daño al microbioma inducido por fármacos, enfermedad del microbioma inducida por fármacos, enfermedad gastrointestinal inducida por fármacos, enteritis o colitis inducida por fármacos o trastorno o afección inducid por fármacos similar.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica que comprende una preparación de polímero de glicano se administra antes, concomitantemente con o después de la administración del fármaco (o tratamiento de radiación), cuya administración induce los síntomas.
Los fármacos a modo de ejemplo que a menudo están asociados con síntomas inducidos por fármacos o tratamientos incluyen, pero no se limitan a, un fármaco contra el cáncer, un antidiabético, un fármaco inmunosupresor, un fármaco antimicrobiano, un quimioterápico, un antipsicótico, un inhibidor de la bomba de protones, inhibidores de tirosina cinasa (TKI, por ejemplo, dasatinib (Sprycel), erlotinib (Tarceva), gefitinib (Iressa), imatinib (Gleevec), lapatinib (Tykerb), nilotinib (Tasigna), sorafenib (Nexavar), sunitinib (Sutent), afatinib (Gilotrif), alectinib (Alecensa), axitinib (Inlyta), bortezomib (Velcade), bosutinib (Bosulif), cabozantinib (Cometriq, Cabometyx), carfilzomib (Kyprolis), ceritinib (Zykadia), cobimetinib (Cotellic), crizotinib (Xalkori), dabrafenib (Tafinlar), dasatinib (Sprycel), erlotinib (Tarceva), gefitinib (Iressa), ibrutinib (Imbruvica), idelalisib (Zydelig), imatinib (Gleevec), ixazomib (Ninlaro), lapatinib (Tykerb), lenvatinib (Lenvima), nilotinib (Tasigna), niraparib (Zejula), olaparib (Lynparza), osimertinib (Tagrisso), palbociclib (Ibrance), pazopanib (Votrient), pegaptanib (Macugen), ponatinib (Iclusig), regorafenib (Stivarga), ribociclib (Kisqali), rucaparib (Rubraca), ruxolitinib (Jakafi), sonidegib (Odomzo), sorafenib (Nexavar), sunitinib (Sutent), tofacitinib (Xeljanz), trametinib (Mekinist), vandetanib (Caprelsa), vemurafenib (Zelboraf), vismodegib (Erivedge) y un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE). La administración de estos fármacos generalmente está asociada con disbiosis que puede producirse, por ejemplo, durante el régimen de tratamiento. En algunas realizaciones, la disbiosis provoca o amplifica los síntomas inducidos por el fármaco o el tratamiento, tales como anomalías digestivas, tales como diarrea. En algunas realizaciones, la administración de la preparación de polímero de glicano modula el microbioma de manera que se reducen los síntomas inducidos por el fármaco o el tratamiento (por ejemplo, modulando los niveles de SCFA, tales como butirato). En algunas realizaciones, la preparación de polímero de glicano promueve el crecimiento de bacterias comensales y/o apoya el crecimiento de comunidades microbianas beneficiosas que se verían afectadas negativamente o se perderían en respuesta al tratamiento farmacológico o que pueden complementar las bacterias comensales que se han visto afectadas negativamente o se han perdido en respuesta al tratamiento farmacológico. En algunas realizaciones, la preparación de polímero de glicano promueve el crecimiento de taxones bacterianos productores de SCFA, tales como, por ejemplo, taxones productores de acetato, propionato o butirato.
Los ejemplos específicos de fármacos asociados con anomalías digestivas cuyos síntomas pueden reducirse mediante la administración de la preparación de polímero de glicano incluyen, pero no se limitan a, ciprofloxacino, clindamicina, amoxicilina-clavulanato, cefixima, cefalosporinas, fluoroquinolonas, azitromicina, claritromicina, eritromicina, tetraciclina, azitromicina, irinotecán (camptosar), 5-fluorouracilo, leucovorina, oxaliplatino, bortezomib, imatinib, lenalidomida, imbruvica, ipilimumab, pertuzumab, capecitabina, docetaxel, lapatinib, erlotinib, carmustina, etopósido, aracitina, melfalán, citarabina, daunorubicina, amsacrina, mitoxantrona, olanzapina, ranitidina, famotidina, cimetidina, omeprazol, sucralfato, esomeprazol, naproxeno, diclofenaco, indometacina, ibuprofeno, ketoprofeno, piroxicam, celecoxib, nimesulida, aspirina, metformina, paroxetina, ácido valproico o clozapina.
En algunas realizaciones, las anomalías digestivas están asociadas con el tratamiento del sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) con un agente quimioterápico. En una realización, la anomalía digestiva es diarrea. En realizaciones específicas, el agente quimioterápico es irinotecán, 5-fluorouracilo, leucovorina o combinaciones de los mismos. En realizaciones específicas, el agente quimioterápico es oxaliplatino, leucovorina, 5-fluorouracilo o combinaciones de los mismos (por ejemplo, régimen de FOLFIRI). En realizaciones específicas, el agente quimioterápico es bortezomib, imatinib, lenalidomida, imbruvica, ipilimumab, pertuzumab, capecitabina, docetaxel, lapatinib, erlotinib o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el agente quimioterápico es carmustina, etopósido, aracitina, melfalán o combinaciones de los mismos. En realizaciones específicas, el agente quimioterápico es citarabina, daunorubicina, etopósido o combinaciones de los mismos. En realizaciones específicas, el agente quimioterápico es amsacrina, citarabina, etopósido o combinaciones de los mismos. En realizaciones específicas, el agente quimioterápico es mitoxantrona, citarabina o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, las anomalías digestivas están asociadas con el tratamiento del sujeto con un antibiótico. En una realización, la anomalía digestiva es diarrea. En realizaciones específicas, el antibiótico es ciprofloxacino, clindamicina, amoxicilina-clavulanato, cefixima, cefalosporinas, fluoroquinolonas, azitromicina, claritromicina, eritromicina, tetraciclina o azitromicina.
En algunas realizaciones, las anomalías digestivas están asociadas con el tratamiento del sujeto con un fármaco antipsicótico. En una realización, la anomalía digestiva es aumento de peso. En una realización, el fármaco es olanzapina.
En algunas realizaciones, las anomalías digestivas están asociadas con el tratamiento del sujeto con un fármaco inhibidor de la bomba de protones. En una realización, la anomalía digestiva es diarrea. En realizaciones específicas, el fármaco es ranitidina, famotidina, cimetidina, omeprazol, sucralfato o esomeprazol.
En algunas realizaciones, las anomalías digestivas están asociadas con el tratamiento del sujeto con un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE). En una realización, la anomalía digestiva es diarrea. En realizaciones específicas, el fármaco es naproxeno, diclofenaco, indometacina, ibuprofeno, ketoprofeno, piroxicam, celecoxib, nimesulida o aspirina.
En algunas realizaciones, las anomalías digestivas están asociadas con el tratamiento del sujeto con metformina, paroxetina, ácido valproico o clozapina.
En una realización, la reducción de uno o más síntomas aumenta el cumplimiento por parte del sujeto del régimen de tratamiento. En una realización, reducir uno o más síntomas permite al médico prescribir una dosis más alta del fármaco que va a administrarse. En tales realizaciones, el tratamiento de la enfermedad subyacente es más eficaz (por ejemplo, una mayor reducción de los síntomas, un período más corto para alcanzar un estado libre de síntomas o enfermedad, o un mantenimiento más prolongado de un estado libre de síntomas o enfermedad, etc.).
Enfermedad renal crónica (CKD)
En algunas realizaciones, los sujetos con enfermedad renal crónica (CKD) pueden tratarse según los métodos proporcionados en el presente documento. Los sujetos con CKD pueden presentar fatiga, dificultad para concentrarse, falta de apetito, dificultad para dormir, calambres musculares nocturnos, pies y tobillos hinchados, erupción cutánea/picazón, náuseas, vómitos, sabor metálico en la boca, dificultad para respirar y/o aumento de la micción. El diagnóstico de la enfermedad renal, incluida la CKD, se realiza mediante pruebas de la tasa de filtración glomerular (GFR), niveles sanguíneos de urea y creatinina, niveles de albúmina en orina, biopsia renal, ecografía y/o tomografía computarizada. Las poblaciones de pacientes incluyen sujetos con CKD provocada por nefropatía diabética; sujetos con CKD provocada por tensión arterial alta; sujetos con enfermedad renal poliquística, pielonefritis o glomerulonefritis; sujetos con daño renal debido al uso prolongado de medicamentos que dañan los riñones; y sujetos con riesgo de desarrollar CKD debido a la presencia de factores de riesgo tales como diabetes, hipertensión arterial o antecedentes familiares de enfermedad renal.
Encefalopatía hepática (HE)
En algunas realizaciones, los sujetos con encefalopatía hepática (HE) pueden tratarse según los métodos proporcionados en el presente documento. La encefalopatía hepática incluye múltiples síntomas neurológicos adversos que se producen cuando el hígado no puede eliminar sustancias tóxicas tales como amoníaco de la sangre. Los sujetos con HE pueden presentar confusión, olvidos, ansiedad o excitación, cambios repentinos en la personalidad o el comportamiento, cambios en los patrones de sueño, desorientación, aliento con olor dulce o a humedad, dificultad para hablar y/o dificultad para controlar las funciones motoras. El diagnóstico de HE se realiza mediante pruebas de función hepática, niveles séricos de amoníaco, EEG y otras pruebas sanguíneas y neurológicas. Las poblaciones de pacientes incluyen sujetos con HE leve, HE grave, HE manifiesta, sujetos que han experimentado previamente uno o más episodios de HE y pacientes que están en riesgo de padecer HE debido a la presencia de factores de riesgo tales como daño hepático.
Enfermedad inflamatoria del intestino (IBP) /enfermedad de Crohn (CD)/colitis ulcerosa (UC)
Los sujetos con enfermedad inflamatoria del intestino (EII) pueden presentar calambres y dolor abdominal, diarrea que puede ser sanguinolenta, urgencia de defecar, estreñimiento, náuseas, vómitos, fiebre, pérdida de peso, pérdida de apetito y/o anemia por deficiencia de hierro debido a pérdida de sangre. Los síntomas de la IBD pueden producirse en brotes, con períodos alternos de enfermedad sintomática y asintomática. La IBD puede diagnosticarse mediante una combinación de pruebas, incluidos exámenes de heces (para eliminar la posibilidad de causas infecciosas de la diarrea, detectar cantidades traza de sangre en las heces y cuantificar biomarcadores asociados con la IBD, tales como calprotectina fecal), un hemograma completo para evaluar los niveles de inflamación, análisis de sangre para evaluar biomarcadores que incluyen proteína C reactiva (CRP) y el anticuerpo citoplasmático anti-neutrófilo perinuclear (pANCA), rayos X de bario, sigmoidoscopia, colonoscopia y endoscopia. Las poblaciones de pacientes incluyen sujetos con colitis ulcerosa (UC; limitada al colon o intestino grueso), sujetos con enfermedad de Crohn (CD; que afecta a cualquier segmento del tracto gastrointestinal) y sujetos con diferentes gravedades de la enfermedad (leve, moderada, grave).
Diabetes tipo 2/NASH/NAFLD
En algunas realizaciones, los sujetos con diabetes tipo 2 pueden tratarse según los métodos proporcionados en el presente documento. Los sujetos con diabetes tipo 2 pueden presentar visión borrosa, neuropatía periférica, aumento de la micción, aumento de la sed, fatiga, aumento del hambre, pérdida de peso o infecciones por levaduras, vejiga, riñones, piel u otras. La diabetes tipo 2 se diagnostica según los criterios descritos por la American Diabetes Association (ADA), incluidos los siguientes: glucosa plasmática en ayunas (GPA) de 126 mg/dl (7 mM) o más, o un nivel de glucosa plasmática a las 2 horas de 200 mg/dl (11,1 mM) o más durante una prueba de tolerancia a la glucosa oral (OGTT) de 75 g, o una glucosa plasmática aleatoria de 200 mg/dl (11,1 mM) o más en un paciente con síntomas clásicos de hiperglucemia o crisis hiperglucémica, o un nivel de hemoglobina A1c (HbA1c) del 6,5 % o más. Las poblaciones de pacientes incluyen adultos y niños con diabetes tipo 2, sujetos con riesgo de desarrollar diabetes tipo 2 (por ejemplo, sujetos con prediabetes o sujetos con sobrepeso) y sujetos con diabetes tipo 2 junto con afecciones de síndrome metabólico que incluyen obesidad, tensión arterial alta, triglicéridos séricos elevados y niveles bajos de lipoproteínas de alta densidad (HDL).
En algunas realizaciones, los sujetos que presentan enfermedad de hígado graso no alcohólica (NAFLD) y/o esteatohepatitis no alcohólica (NASH) pueden tratarse según los métodos proporcionados en el presente documento.
La enfermedad de hígado graso no alcohólica (NAFLD) se caracteriza por una acumulación anormal de grasa en el hígado. La NAFLD puede progresar a esteatohepatitis no alcohólica (NASH), que se caracteriza por inflamación del hígado, fibrosis y cirrosis. Los sujetos con NAFLD pueden ser asintomáticos. Los sujetos con NAFLD o NASH pueden presentar aumento del tamaño del hígado (observado durante el examen físico), fatiga, pérdida de peso, debilidad general y/o dolor en la parte superior derecha del abdomen. El diagnóstico de NAFLD/NASH incluye niveles sanguíneos elevados de alanina aminotransferasa (ALT) o aspartato aminotransferasa (AST), agrandamiento del hígado y marcadores histopatológicos específicos (por ejemplo, mediante biopsia hepática, ecografía abdominal, tomografía computarizada o resonancia magnética). Las poblaciones de pacientes incluyen sujetos con NAFLD, sujetos con NASH, sujetos con riesgo de desarrollar NAFLD/NASH (por ejemplo, sujetos con sobrepeso o niveles elevados de colesterol) y sujetos con NAFLD/NASH junto con afecciones de síndrome metabólico que incluyen obesidad, glucosa plasmática en ayunas elevada, tensión arterial elevada, triglicéridos séricos elevados y niveles bajos de lipoproteínas de alta densidad (HDL).Obesidad
En algunas realizaciones, los sujetos obesos pueden tratarse según los métodos proporcionados en el presente documento. La obesidad es un problema de salud importante y puede tener un efecto negativo sobre la salud. Por ejemplo, la obesidad puede reducir la esperanza de vida y/o aumentar los problemas de salud, tales como diabetes, tensión arterial alta, cariopatías, accidentes cerebrovasculares, colesterol alto, apnea del sueño y artritis. Los sujetos obesos presentan un índice de masa corporal (IMC) superior a 30 kg/m2. Alternativamente, los sujetos obesos pueden clasificarse basándose en el porcentaje de grasa corporal (más del 25 % para los hombres o más del 33 % para las mujeres). El diagnóstico también puede incluir una evaluación de los niveles de lípidos en ayunas (colesterol, triglicéridos), la función hepática, los niveles de glucosa, los niveles de insulina, la hemoglobina glicosilada (HbA1c) y/o la tolerancia a la glucosa. Las poblaciones de pacientes incluyen sujetos con obesidad infantil, obesidad moderada, obesidad mórbida/grave, causas genéticas de obesidad (incluidos síndrome de Prader-Willi, síndrome de Bardet-Biedl, síndrome de Cohen y síndrome MOMO) y obesidad junto con otras afecciones del síndrome metabólico (tensión arterial elevada, glucosa plasmática en ayunas elevada, triglicéridos séricos elevados y niveles bajos de lipoproteínas de alta densidad (HDL)).
Colitis inducida por infección por Clostridium difficile (CDI)
En algunas realizaciones, los sujetos con colitis inducida por infección porClostridium difficile(CDI) pueden tratarse según los métodos proporcionados en el presente documento. Los sujetos con colitis inducida por CDI pueden presentar diarrea acuosa, calambres, dolor abdominal, anorexia, malestar general, fiebre, deshidratación, sensibilidad en la parte inferior del abdomen y/o sensibilidad de rebote. La presencia deC. difficileen las heces de los pacientes puede someterse a prueba mediante cultivo de heces, inmunoensayo enzimático de glutamato deshidrogenasa, ensayo de PCR para detectar genes de las toxinas deC. difficile,ensayo de citotoxinas en heces o inmunoensayo enzimático para las toxinas A y B deC. difficile.Las poblaciones de pacientes incluyen sujetos con CDI primaria, sujetos con CDI recurrente, sujetos con diferente gravedad de diarrea asociada a CDI (leve, moderada, grave) y sujetos en riesgo de CDI debido a la presencia de factores de riesgo tales como tratamiento con antibióticos, tratamiento con antibióticos de espectro amplio, residencia en un hospital o centro de atención a largo plazo, cirugía del tracto gastrointestinal, enfermedades del colon, sistema inmunitario debilitado, quimioterapia, edad avanzada, enfermedad renal o uso de inhibidores de la bomba de protones. Los tratamientos de atención convencionales para la CDI incluyen antibióticos tales como metronidazol, fidaxomicina o vancomicina. Los tratamientos también pueden incluir probióticos, trasplante fecal y líquidos para prevenir la deshidratación. La resolución de la enfermedad se mide mediante la disminución de la diarrea (por ejemplo, la ausencia de un período de 24 horas con más de tres deposiciones no formadas) y la resolución de otros síntomas descritos anteriormente. La eliminación de la infección puede verificarse mediante la ausencia de una prueba de heces positiva paraC. difficile.
En una realización, se proporcionan métodos para prevenir, tratar, mejorar los síntomas y/o prevenir la colonización inicial o la recaída de la colonización por patógenos. En algunas realizaciones, la recaída se produce durante o después del régimen de tratamiento de primera línea o de atención convencional. En algunos casos, la carga de patógenos puede disminuir inicialmente con el tratamiento convencional, pero luego comienza a aumentar nuevamente, lo que potencialmente desencadena una recaída de la enfermedad. En algunas realizaciones, pueden administrarse preparaciones de polímeros de glicano (por ejemplo, al principio, durante o después del régimen de tratamiento inicial) para prevenir la recaída o tratar uno o más síntomas de recaída. En algunas realizaciones, las bacterias, patobiontes o patógenos asociados a enfermedades se seleccionan del grupo que consiste en las especiesBilophila wadsworthia, Campylobacter jejuni, Citrobacter farmer, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Collinsella aerofaciens, Enterobacter hormaechei, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Fusobacterium varium, Fusobacterium nucleatum, Haemophilus parainfluenzae, Klebsiella pneumonia, Peptostreptococcus stomatis, Porphyromonas asaccharolytica, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella bongori, Salmonella enteric, Shigella boydii, Shigella Dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Streptococcus infantarius, Vibrio cholera y Yersinia enterocolitica.
En algunas realizaciones, las bacterias, patobiontes o patógenos asociados a enfermedades incluyen los génerosBilophila, Campylobacter, Candidatus, Citrobacter, Clostridium, Collinsella, Desulfovibrio, Enterobacter, Enterococcus, Escherichia, Fusobacterium, Haemophilus, Klebsiella, Lachnospiraceae, Peptostreptococcus, Porphyromonas, Portiera, Providencia, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, VibrioyYersinia.
Colonización por enterococos resistentes a vancomicina (VRE)
En algunas realizaciones, los sujetos que presentan colonización e infección por enterococos resistentes a vancomicina (VRE) pueden tratarse según los métodos proporcionados en el presente documento. Las bacterias del géneroEnterococcusson miembros comunes de la microbiota intestinal. Los miembros de este género resistentes a vancomicina, comúnmenteE. faecalisyE. faecium,pueden provocar colonización e infección por enterococos resistentes a vancomicina (VRE). Los sujetos colonizados por VRE pueden presentar una muestra de heces, un hisopo rectal, un hisopo perirrectal o una muestra de otro sitio del cuerpo positiva para VRE. La resistencia a la vancomicina puede someterse a ensayo mediante cultivo bacteriano o mediante ensayos basados en PCR que detectan los operones del gen de resistencia a vancomicina (Van). Aunque los sujetos colonizados pueden ser asintomáticos, esta población tiene un mayor riesgo de infección por VRE. Los sujetos con infección por VRE pueden presentar diarrea, fiebre, escalofríos, infección del tracto urinario (UTI), bacteriemia, endocarditis, infección intraabdominal y pélvica, infección respiratoria o infección en otra parte del cuerpo. Las poblaciones de pacientes incluyen sujetos que están colonizados por VRE, sujetos que padecen una infección por VRE y sujetos que están en riesgo de colonización o infección por VRE debido a la presencia de factores de riesgo tales como hospitalización, residencia en un centro de atención a largo plazo, uso prolongado de antibióticos, inmunosupresión, cirugía, heridas abiertas, dispositivos permanentes (por ejemplo, vías intravenosas o catéteres urinarios) o empleo como trabajador de la salud.
Dermatitis atópica (AD)
En algunas realizaciones, los sujetos con dermatitis atópica (AD) pueden tratarse según los métodos proporcionados en el presente documento. Los sujetos con dermatitis atópica (AD) pueden presentar piel seca, con picazón y/o inflamada. El diagnóstico y la gravedad de la AD pueden determinarse mediante el índice SCORAD (Oranje, AP,et al.British Journal of Dermatology 157.4 (2007): 645-648) o la puntuación de Eczema Area and Severity Index (EASI) (Hanifinet al.,Experimental Dermatology, 2001, 10:11). La AD puede producirse en brotes, con períodos alternos de enfermedad sintomática y asintomática.Staphylococcus aureusestá comúnmente presente en sitios de la piel con AD, y biomarcadores que incluyen IgE y citocinas y quimiocinas inflamatorias o Th2 también pueden estar elevados en la piel enferma o de manera sistémica. Las poblaciones de pacientes incluyen lactantes con AD de aparición temprana, niños con AD pediátrica, adultos con AD de aparición tardía, mujeres embarazadas con riesgo de padecer brotes de AD (“erupción atópica del embarazo”), sujetos con brotes de AD leves, moderados o graves, o sujetos que tienen riesgo de desarrollar AD.
Asma
En algunas realizaciones, los sujetos con asma pueden tratarse según los métodos proporcionados en el presente documento. Los sujetos con asma pueden presentar sibilancias, tos, dificultad para respirar y/u opresión o dolor en el pecho. Estos síntomas son comúnmente episódicos y pueden desencadenarse por factores tales como el ejercicio o la exposición a alérgenos. Además, los niños con asma pueden presentar antecedentes de bronquitis recurrente, bronquiolitis o neumonía o tos persistente con resfriados. El diagnóstico de asma se establece mediante pruebas de función pulmonar con espirometría en presencia y ausencia de tratamiento con un broncodilatador. Las poblaciones de pacientes incluyen bebés con asma; sujetos con asma infantil; asma de inicio en la edad adulta; asma intermitente, persistente leve, persistente moderada o persistente grave; asma inducida por el ejercicio; asma alérgica; asma variante con tos; asma ocupacional; asma nocturna; y sujetos que tienen riesgo de desarrollar asma, por ejemplo, debido a antecedentes familiares de atopia.
Enfermedades inflamatorias
En algunas realizaciones, la administración de la preparación de polímero de glicano reduce la inflamación. En algunas realizaciones, se identifica que un sujeto es adecuado para el tratamiento si el sujeto tiene o se sospecha que tiene una enfermedad, trastorno o afección que incluye: enfermedades inflamatorias gastrointestinales que incluyen enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), colitis ulcerosa (UC), enfermedad de Crohn (CD), inflamación idiopática del intestino delgado, colitis indeterminada, reservoritis; síndrome del intestino irritable (IBS), cánceres de colon y de hígado, enterocolitis necrotizante (NEC), inflamación intestinal, estreñimiento, colitis microscópica, diarrea; enfermedad de injerto contra huésped (GVHD); alergias (alimentarias); colitis pseudomembranosa; indigestión o dispepsia no ulcerosa; diverticulosis o diverticulitis, colitis isquémica; colitis por radiación o enteritis; colitis colagenosa; gastroenteritis; y pólipos.
En una realización, el sujeto que se identifica como adecuado para el tratamiento con una preparación de polímero de glicano tiene o se sospecha que tiene enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), colitis ulcerosa (UC), enfermedad de Crohn (CD), inflamación intestinal, colitis microscópica o enfermedad, trastorno o afección similar que se asocia con la inflamación del intestino.
En una realización, el sujeto que se identifica como adecuado para el tratamiento con una preparación de polímero de glicano tiene o se sospecha que tiene inflamación idiopática del intestino delgado, colitis indeterminada, reservoritis, colitis pseudomembranosa, colitis isquémica, colitis por radiación (enteritis), colitis colagenosa o enfermedad, trastorno o afección similar que se asocia con la inflamación del intestino.
En una realización, el sujeto que se identifica como adecuado para el tratamiento con una preparación de polímero de glicano tiene o se sospecha que tiene gastroenteritis; enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) o una alergia (alimentaria).
En una realización, el sujeto que se identifica como adecuado para el tratamiento con una preparación de polímero de glicano tiene o se sospecha que tiene síndrome del intestino irritable (IBS), estreñimiento, diarrea, indigestión, dispepsia no ulcerosa o enfermedad, trastorno o afección similar que se asocia con un tránsito intestinal alterado.
En una realización, el sujeto que se identifica como adecuado para el tratamiento con una preparación de polímero de glicano tiene o se sospecha que tiene cáncer de colon, cánceres de hígado, enterocolitis necrotizante (NEC); diverticulosis o diverticulitis; pólipos o enfermedad, trastorno o afección similar que se asocia con alteración estructural del intestino.
Enfermedades metabólicas
En algunas realizaciones, se identifica que un sujeto es adecuado para el tratamiento si el sujeto tiene o se sospecha que tiene una enfermedad, trastorno o afección que incluye: obesidad, prediabetes, diabetes tipo II, colesterol alto en sangre, LDL alto, tensión arterial alta, niveles altos de azúcar en sangre en ayunas, niveles altos de triglicéridos, enfermedad de hígado graso no alcohólica con HDL bajo (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH); síndrome metabólico; hiperamonemia, deficiencia de nutrientes esenciales, hemocromatosis, intolerancia a la lactosa, intolerancia al gluten; y acrodermatitis enteropática.
En una realización, el sujeto que se identifica como adecuado para el tratamiento con una preparación de polímero de glicano tiene o se sospecha que tiene obesidad, prediabetes (resistencia a la insulina), diabetes tipo I<i>, niveles altos de azúcar en sangre en ayunas (hiperglucemia), síndrome metabólico o enfermedad, trastorno o afección similar que se asocia con síntomas de enfermedades metabólicas.
En una realización, el sujeto que se identifica como adecuado para el tratamiento con una preparación de polímero de glicano tiene o se sospecha que tiene colesterol alto en sangre, LDL alto, tensión arterial alta (hipertensión), niveles altos de triglicéridos, HDL bajo o un factor de riesgo cardiovascular similar.
En una realización, el sujeto que se identifica como adecuado para el tratamiento con una preparación de polímero de glicano tiene o se sospecha que tiene enfermedad de hígado graso no alcohólica (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), hiperamonemia o enfermedad, trastorno o afección similar del hígado. En una realización, el sujeto que se identifica como adecuado para el tratamiento con una preparación de polímero de glicano tiene o se sospecha que tiene intolerancia a la lactosa, intolerancia al gluten o enfermedad, trastorno o afección similar que se asocia con intolerancia alimentaria.
En una realización, el sujeto que se identifica como adecuado para el tratamiento con una preparación de polímero de glicano tiene o se sospecha que tiene deficiencia de nutrientes esenciales, hemocromatosis, acrodermatitis enteropática o enfermedad, trastorno o afección similar que se asocia con una mala gestión de nutrientes.
En una realización, se proporciona un método para tratar un trastorno metabólico en un ser humano que lo necesita, mediante: administración al ser humano una composición de preparación de polímero de glicano para tratar el trastorno metabólico. En una realización, el trastorno metabólico se selecciona de obesidad, adiposidad, resistencia a la insulina, diabetes y síndrome de hígado graso.
Los trastornos metabólicos pueden incluir trastornos, enfermedades y afecciones provocados o caracterizados por un aumento de peso anómalo; uso o consumo de energía; respuestas alteradas a nutrientes, fuentes de energía, hormonas u otras moléculas de señalización; o metabolismo alterado de hidratos de carbono, lípidos, proteínas o ácidos nucleicos, o una combinación de los mismos. Los ejemplos de trastornos metabólicos incluyen resistencia a la insulina, sensibilidad a la insulina, síndrome de hígado graso, obesidad, adiposidad y diabetes (por ejemplo, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2). En una variación, los métodos proporcionados en el presente documento tratan la obesidad. En el presente documento se proporcionan métodos para tratar la obesidad en un sujeto que lo necesita usando una composición de preparación de polímero de glicano que puede alterar la microbiota intestinal del sujeto de una manera que da como resultado pérdida de peso y/o disminución de la grasa corporal en el sujeto.
En una realización, se proporciona un método para reducir la adiposidad en un sujeto que lo necesita, mediante: administración al ser humano una composición de preparación de polímero de glicano en una cantidad eficaz para reducir la adiposidad. La adiposidad puede determinarse usando cualquier método apropiado conocido en la técnica, incluido, por ejemplo, circunferencia de la cintura, relación cintura-cadera, grosor de los pliegues cutáneos, impedancia bioeléctrica, pesaje bajo el agua, pletismografía por desplazamiento de aire o hidrometría. En una realización, se proporciona un método para mejorar el metabolismo de la glucosa en un sujeto que lo necesita, mediante: administrar al sujeto una composición de preparación de polímero de glicano en una cantidad eficaz para mejorar el metabolismo de la glucosa. El metabolismo de la glucosa puede determinarse mediante cualquier método apropiado conocido en la técnica, incluido, por ejemplo, nivel de azúcar en sangre en ayunas, nivel de insulina en ayunas, prueba de azúcar en sangre posprandial, prueba de insulina posprandial, prueba de tolerancia a la glucosa oral, prueba de tolerancia a la glucosa intravenosa, nivel de hemoglobina glucosilada o prueba aleatoria de azúcar en sangre.
En una realización, se proporciona un método para aumentar la sensibilidad a la insulina en un ser humano, mediante: administrar al sujeto una composición de preparación de polímero de glicano en una cantidad eficaz para aumentar la sensibilidad a la insulina, en donde el ser humano tiene una sensibilidad a la insulina antes de la administración de la preparación de polímero de glicano y una sensibilidad a la insulina después de la administración de la preparación de polímero de glicano, y la sensibilidad a la insulina del ser humano después de la administración de la preparación de polímero de glicano es mayor que la sensibilidad a la insulina del ser humano antes de la administración de la preparación de polímero de glicano. La sensibilidad a la insulina puede determinarse mediante cualquier método apropiado conocido en la técnica, incluido, por ejemplo, nivel de azúcar en sangre en ayunas, nivel de insulina en ayunas, prueba de azúcar en sangre posprandial, prueba de insulina posprandial, prueba de tolerancia a la glucosa oral, prueba de tolerancia a la glucosa intravenosa, nivel de hemoglobina glucosilada o prueba aleatoria de azúcar en sangre.
Enfermedades infecciosas
En algunas realizaciones, la administración de la preparación de polímero de glicano reduce la infección. En algunas realizaciones, se identifica que un sujeto es adecuado para el tratamiento si el sujeto tiene o se sospecha que tiene una enfermedad, trastorno o afección que incluye: enfermedades infecciosas gastrointestinales que incluyen infección porClostridium difficile(CDI); infección por enterococos resistentes a vancomicina (VRE), colitis infecciosa y colitis porC. difficile;micosis, tales como, por ejemplo, infección porCandida albicans,infección porCampylobacter jejuni,infección porHelicobacter pylori;diarrea, tal como por ejemplo diarrea asociada aClostridium difficile(CDAD), diarrea asociada a antibióticos (AAD), diarrea inducida por antibióticos, diarrea del viajero (TD), diarrea pediátrica, diarrea infecciosa (aguda), cáncer de colon y de hígado, ameboma; enterocolitis necrotizante (NEC) y sobrecrecimiento bacteriano del intestino delgado (SIBO); indigestión o dispepsia no ulcerosa; fisuras anales, absceso perianal y fístula anal; diverticulosis o diverticulitis; úlceras pépticas; y gastroenteritis.
En una realización, el sujeto que se identifica como adecuado para el tratamiento con una preparación de polímero de glicano tiene o se sospecha que tiene una infección porClostridium difficile(CDI); una infección por enterococos resistentes a vancomicina (VRE), colitis infecciosa o colitis porC. difficile.
En una realización, el sujeto que se identifica como adecuado para el tratamiento con una preparación de polímero de glicano tiene o se sospecha que tiene micosis, tales como, por ejemplo, infección porCandida albicans,infección porCampylobacter jejunio infección porHelicobacter pylori.
En algunas realizaciones, la infección del tracto GI es una infección bacteriana o viral, tal como una infección con, por ejemplo, VRE,C. difficile, Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Campylobacter, Vibrio cholera, Clostridium perfringes, Bacillus cereus, Vibrio parahemolyticus, Yersinia enterocolitica, Helicobacter pylori,rotavirus o norovirus.
En algunas realizaciones, la infección del tracto GI es una infección por hongos, tal como una infección con, por ejemplo,Candida, Aspergillus, Mucor, Cryptococcus, HistoplasmaoCoccidioides.
En algunas realizaciones, la infección del tracto gastrointestinal es una infección por protozoos, tal como una infección con, por ejemplo,Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum.
En una realización, el sujeto que se identifica como adecuado para el tratamiento con una preparación de polímero de glicano tiene o se sospecha que tiene diarrea, tal como, por ejemplo, diarrea asociada aClostridium difficile(CDAD), diarrea asociada a antibióticos (AAD), diarrea inducida por antibióticos, diarrea del viajero (TD), diarrea pediátrica o diarrea infecciosa (aguda).
En una realización, el sujeto que se identifica como adecuado para el tratamiento con una preparación de polímero de glicano tiene o se sospecha que tiene enterocolitis necrotizante (NEC); gastroenteritis; sobrecrecimiento bacteriano del intestino delgado (SIBO) o enfermedad, trastorno o afección similar que se asocia con una infección del tracto GI.
En una realización, el sujeto que se identifica como adecuado para el tratamiento con una preparación de polímero de glicano tiene o se sospecha que tiene cáncer de colon, cáncer de hígado, ameboma; indigestión o dispepsia no ulcerosa; fisuras anales, absceso perianal y fístula anal; diverticulosis o diverticulitis; úlcera péptica o enfermedad, trastorno o afección similar que se asocia con alteraciones estructurales del tracto GI.
Otras enfermedades
En algunas realizaciones, se identifica que un sujeto es adecuado para el tratamiento si el sujeto tiene o se sospecha que tiene una enfermedad, trastorno o afección que incluye: artritis autoinmunitaria, diabetes tipo I, dermatitis atópica, autismo, asma, enfermedad cardiovascular, enfermedad renal crónica, esclerosis múltiple, cariopatías, psoriasis, hiperamonemia, encefalopatía hepática, caquexia, gota, intolerancia a fármacos (por ejemplo, a metformina), baja biodisponibilidad oral de fármacos, incontinencia fecal, enfermedad de Hirschsprung, anismo, cólico, íleo, hemorroides e invaginación intestinal.
En una realización, el sujeto que se identifica como adecuado para el tratamiento con una preparación de polímero de glicano tiene o se sospecha que tiene artritis autoinmunitaria, diabetes tipo I, esclerosis múltiple, psoriasis o enfermedad, trastorno o afección autoinmunitaria similar.
En una realización, el sujeto que se identifica como adecuado para el tratamiento con una preparación de polímero de glicano o se sospecha que tiene asma, dermatitis atópica o alergia similar impulsada por el medio ambiente.
En una realización, el sujeto que se identifica como adecuado para el tratamiento con una preparación de polímero de glicano tiene o se sospecha que tiene enfermedad renal crónica, cardiopatía, enfermedad cardiovascular o enfermedad, trastorno o afección similar se asocia con insuficiencia orgánica.
En una realización, el sujeto que se identifica como adecuado para el tratamiento con una preparación de polímero de glicano tiene o se sospecha que tiene autismo, hiperamonemia, encefalopatía hepática o enfermedad, trastorno o afección similar que se asocia con síntomas neurológicos.
En una realización, el sujeto que se identifica como adecuado para el tratamiento con una preparación de polímero de glicano tiene o se sospecha que tiene caquexia, gota o un trastorno nutricional similar.
En una realización, el sujeto que se identifica como adecuado para el tratamiento con una preparación de polímero de glicano tiene o se sospecha que tiene enfermedad de Hirschsprung, íleo, anismo, invaginación intestinal, incontinencia fecal, hemorroides o trastorno gastrointestinal similar.
Efectos del tratamiento
En algunas realizaciones, el sujeto experimenta una reducción en al menos un síntoma de una enfermedad o trastorno después del tratamiento. En algunas realizaciones, puede determinarse una reducción en la gravedad de un síntoma después del tratamiento (por ejemplo, midiendo un biomarcador conocido) y es del orden de aproximadamente el 3 %, 5 %, 7 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o aproximadamente el 100 %. En algunas realizaciones, los síntomas, medidos tal como se describe en el presente documento, disminuyen en un promedio de aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o aproximadamente el 100 % en comparación con los síntomas antes de la administración de una preparación de polímero de glicano. En algunas realizaciones, la reducción en la gravedad del síntoma persiste durante al menos aproximadamente un día, dos días, tres días, cuatro días, cinco días, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, 3 meses, 6 meses, 9 meses, un año, dos años, cinco años, diez años después del tratamiento o la reducción es permanente.
En una realización, la gravedad de un síntoma de una enfermedad, trastorno o afección descrito en el presente documento permanece parcial, sustancial o completamente eliminado o disminuido en un sujeto durante al menos aproximadamente 1 día, 1 semana, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 9 meses, un año, 18 meses, dos años, tres años, cuatro años, cinco años, diez años o más de diez años después de la terminación del tratamiento. En otra realización, un síntoma de una enfermedad, la gravedad de un trastorno o afección descrito en el presente documento se elimina o se disminuye permanentemente en un sujeto después de la terminación del tratamiento.
En algunas realizaciones, la administración de las preparaciones de polímeros de glicano mejora la salud global del huésped y/o la salud de un nicho específico, tal como el tracto GI, por ejemplo, modulando (por ejemplo, aumentando o disminuyendo) el crecimiento o la abundancia de uno o más miembros de la comunidad microbiana en el nicho (tales como bacterias comensales residentes y/o patógenos o patobiontes adquiridos). Las preparaciones de polímeros de glicano, cuando se administran a un sujeto en una cantidad eficaz, pueden modular una o más rutas del huésped. El tratamiento con la preparación del polímero de glicano puede dar como resultado aumentos o disminuciones de uno o más biomarcadores que pueden determinarse mediante métodos conocidos en la técnica. Un investigador puede determinar fácilmente en qué punto o puntos durante el tratamiento debe(n) medirse el/los biomarcador(es), por ejemplo, antes del tratamiento, en diversos intervalos durante el tratamiento y/o después del tratamiento. Puede extraerse del sujeto cualquier muestra adecuada, por ejemplo una muestra gastrointestinal específica tal como, por ejemplo, una muestra de tejido o una biopsia, un hisopo, una secreción gastrointestinal (tal como heces/una muestra de heces), etc. y puede analizarse la muestra. En algunas realizaciones, puede detectarse un aumento o disminución sustancial en un biomarcador. En algunas realizaciones, la preparación de polímero de glicano se digiere por la microbiota intestinal (por ejemplo, clostridios), lo que da como resultado, por ejemplo, la liberación de ácidos grasos de cadena corta tales como butirato, acetato y propionato, que pueden actuar con una capacidad inmunomoduladora (por ejemplo, antiinflamatoria) y otros metabolitos (por ejemplo, ácidos biliares y lactato) que pueden conferir efectos beneficiosos para la salud del huésped.
Para evaluar el efecto de las composiciones de preparación de polímeros de glicano administradas sobre la producción de SCFA en el intestino, pueden recogerse muestras fecales. Pueden cuantificarse los niveles de SCFA, particularmente acetato, propionato y butirato. Los SCFA, creatinas e hidroxi-SCFA pueden cuantificarse alcalinizando muestras de heces, obteniendo huellas dactilares de la composición metabólica de la muestra usando, por ejemplo, un espectrómetro de RMN de 1H 1D y analizando con métodos estadísticos multivariados supervisados. La inulina puede servir como control positivo.
En algunas realizaciones, se usan perfiles de metabolitos microbianos de muestras de pacientes o cultivos de microbios de muestras de sujetos para identificar factores de riesgo para desarrollar una enfermedad, trastorno o afección infecciosa y/o inflamatoria gastrointestinal. Los metabolitos a modo de ejemplo con fines de diagnóstico, evaluación del riesgo de pronóstico o evaluación del tratamiento incluyen los enumerados en la tabla 5. En algunas realizaciones, se toman perfiles de metabolitos microbianos en diferentes puntos de tiempo durante la enfermedad y el tratamiento de un sujeto con el fin de evaluar mejor el estado patológico del sujeto incluidos eventos de recuperación o recaída. Tal monitorización también es importante para reducir el riesgo de que un sujeto desarrolle una nueva enfermedad, trastorno o afección gastrointestinal. En algunas realizaciones, los perfiles de metabolitos informan del tratamiento posterior.
Además, si un médico encargado u otro proveedor de atención médica determina que son útiles, las composiciones de preparación de polímeros de glicano descritas en el presente documento pueden administrarse en combinación con otras diversas terapias de atención convencionales. En algunas realizaciones, la combinación de administración de la preparación de polímero de glicano y el agente de terapia convencioinal tiene efectos de tratamiento aditivos o sinérgicos. Las preparaciones de polímeros de glicano pueden administrarse antes, simultáneamente o después del tratamiento con terapias de atención convencionales. En algunos casos, las terapias alteran la composición y la salud de la microbiota normal del tracto GI (por ejemplo, el uso de agentes antibacterianos, antivirales o antifúngicos), lo que puede conducir a la proliferación no deseada de bacterias o patógenos dañinos, que pueden provocar uno o más de los síntomas descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, la administración de las preparaciones de polímeros de glicano descritas en el presente documento es útil para aliviar esos síntomas y mejorar la composición de la comunidad microbiana gastrointestinal.
Combinaciones
Se pueden administrar sustancias adicionales junto con una preparación de polímero de glicano. En algunas realizaciones, la preparación de polímero de glicano también puede combinarse con otro agente (por ejemplo, un agente terapéutico, micronutriente, prebiótico, probiótico o simbiótico).
Estas sustancias pueden potenciar la acción de las dosis de polímero de glicano, por ejemplo, fomentando el crecimiento de bacterias, por ejemplo, en el intestino que alivian los síntomas de una enfermedad, trastorno (por ejemplo, descrito en el presente documento), aumentando la adhesión de bacterias comensales probióticas o beneficiosas en el nicho o en el intestino. Estas sustancias pueden administrarse antes del tratamiento con una preparación de polímero de glicano, durante el tratamiento con una preparación de polímero de glicano, después del tratamiento con una preparación de polímero de glicano o cualquier combinación de los mismos. Si se administran durante el tratamiento con la preparación de polímero de glicano, pueden administrarse con la dosis de preparación de polímero de glicano que está administrándose, o antes o después de la dosis de preparación de polímero de glicano, o cualquier combinación de los mismos. En una realización, las sustancias de uso junto con una preparación de polímero de glicano incluyen microbio(s) probiótico(s), prebióticos, agentes terapéuticos o tampones/portadores/excipientes. Una o más de estas sustancias pueden usarse en combinación con la preparación de polímero de glicano en cualquier momento adecuado antes, durante, después del tratamiento o alguna combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el agente adicional es un agente terapéutico, por ejemplo, un fármaco que provoca disbiosis, por ejemplo, un fármaco que altera el crecimiento normal de la microbiota gastrointestinal, por ejemplo, un fármaco quimioterápico, un fármaco antidiabético, un fármaco inmunosupresor, un fármaco antimicrobiano, un fármaco antipsicótico, un fármaco inhibidor de la bomba de protones o un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE). La preparación de polímero de glicano, en algunas realizaciones, reduce los síntomas inducidos por el fármaco o el tratamiento en un sujeto humano. Los síntomas incluyen anomalías digestivas, tales como, por ejemplo, aumento de peso, estreñimiento, acidez de estómago, malestar estomacal, gases, hinchazón, flatulencia, diarrea, dolor abdominal, calambres, náuseas y vómitos.
En algunas realizaciones, el agente adicional es un micronutriente. En algunas realizaciones, el micronutriente se selecciona del grupo que consiste en un oligoelemento, colina, una vitamina y un polifenol. En algunas realizaciones, el micronutriente es un oligoelemento. Los oligoelementos adecuados como micronutrientes incluyen, pero no se limitan a, boro, cobalto, cromo, calcio, cobre, flúor, yodo, hierro, magnesio, manganeso, molibdeno, selenio y zinc. En algunas realizaciones, el micronutriente es una vitamina. Las vitaminas adecuadas como micronutrientes incluyen, pero no se limitan a, complejo de vitamina B, vitamina B1 (tiamina), vitamina B2 (riboflavina), vitamina B3 (niacina), vitamina B5 (ácido pantoténico), vitamina B6 (piridoxina, piridoxal, piridoxamina), vitamina B7 (biotina), vitamina B8 (ácido ergadenílico), vitamina B9 (ácido fólico), vitamina B12 (cianocobalamina), colina, vitamina A (retinol), vitamina C (ácido ascórbico), vitamina D, vitamina E (tocoferol), vitamina K, carotenoides (alfa caroteno, beta caroteno, criptoxantina, luteína, licopeno) y zeaxantina.
En algunas realizaciones, el micronutriente es un polifenol. Los polifenoles son compuestos químicos o moléculas que se caracterizan por tener al menos un anillo aromático con uno o más grupos hidroxilo. En algunas realizaciones, el polifenol es un polifenol sintético o un polifenol que se produce de manera natural. En algunas realizaciones, el polifenol es un polifenol que se produce de manera natural y se deriva de material de origen vegetal. En algunas realizaciones, el polifenol es un flavonoide o una catequina. En algunas realizaciones, el flavonoide o catequina se selecciona de antocianinas, chalconas, dihidrocalconas, dihidroflavonoles, flavanoles, flavanonas, flavonas, flavonoles e isoflavonoides. En algunas realizaciones, el polifenol es un lignano. En algunas realizaciones, el polifenol se selecciona de alquilmetoxifenoles, alquilfenoles, curcuminoides, furanocumarinas, hidroxibenzaldehídos, hidroxibenzocetonas, hidroxicinamaldehídos, hidroxicumarinas, hidroxifenilpropenos, metoxifenoles, naftoquinonas, terpenos fenólicos y tirosoles. En algunas realizaciones, el polifenol es un tanino o ácido tánico. En algunas realizaciones, el polifenol se selecciona de ácidos hidroxibenzoicos, ácidos hidroxicinámicos, ácidos hidroxifenilacéticos, ácidos hidroxifenilpropanoicos y ácidos hidroxifenilpentanoicos. En algunas realizaciones, el polifenol es un estilbeno.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y alimentos médicos y suplementos dietéticos que comprenden preparaciones de polímeros de glicano descritos en el presente documento comprenden además una sustancia prebiótica o una preparación de la misma.
En algunas realizaciones, pueden administrarse prebióticos a un sujeto que recibe las composiciones farmacéuticas o alimentos médicos o suplementos dietéticos que comprenden preparaciones de polímeros de glicano descritas en el presente documento. Los prebióticos son sustancias no digeribles que, cuando se consumen, pueden proporcionar un efecto fisiológico beneficioso en el huésped al estimular selectivamente el crecimiento o la actividad favorable de un número limitado de bacterias autóctonas en el intestino (Gibson G R, Roberfroid M B. J Nutr. Junio de 1995; 125(6): 1401-12.). Un prebiótico tal como una fibra dietética o un oligosacárido prebiótico (por ejemplo, celulosa cristalina, salvado de trigo, salvado de avena, fibra de maíz, fibra de soja, fibra de remolacha y similares) puede estimular adicionalmente el crecimiento de bacterias probióticas y/o comensales en el intestino proporcionando una dosis fermentable de hidratos de carbono a las bacterias y aumenta los niveles de esas poblaciones microbianas (por ejemplo, lactobacilos y bifidobacterias) en el tracto gastrointestinal.
Los prebióticos incluyen, pero no se limitan a, diversos galactanos y gomas a base de hidratos de carbono, tales como psyllium, guar, carragenina, gellan, lactulosa y konjac. En algunas realizaciones, el prebiótico es uno o más de galactooligosacáridos (GOS), lactulosa, rafinosa, estaquiosa, lactosacarosa, fructooligosacáridos (FOS, por ejemplo, oligofructosa u oligofructano), inulina, isomaltooligosacárido, xilo-oligosacáridos (XOS), oligosacárido de paratinosa, oligosacáridos de isomaltosa (IMOS), oligosacáridos transgalactosilados (por ejemplo, transgalactooligosacáridos), disacáridos transgalactosilados, oligosacáridos de soja (por ejemplo, sojaoligosacáridos), oligosacáridos de quitosano (quiosas), gentiooligosacáridos, oligosacáridos de soja y pectina, glucooligosacáridos, pecticooligosacáridos, policondensados de palatinosa, anhídrido de fructosa III , sorbitol, maltitol, lactitol, polioles, polidextrosa, dextranos lineales y ramificados, pulalano, hemicelulosas, paratinosa reducida, celulosa, betaglucosa, betagalactosa, betafructosa, verbascosa, galactinol, xilano, inulina, quitosano, betaglucano, goma guar, goma arábiga, pectina, alginato con alto contenido de sodio y lambda carragenina, o mezclas de los mismos.
Pueden encontrarse prebióticos en ciertos alimentos, por ejemplo, raíz de achicoria, alcachofa de Jerusalén, hojas de diente de león, ajo, puerro, cebolla, espárragos, salvado de trigo, harina de trigo, plátano, leche, yogur, sorgo, bardana, brócoli, coles de Bruselas, repollo, coliflor, berza, col rizada, rábano y colinabo y miso. En algunas realizaciones, los polímeros de glicano descritos en el presente documento se administran a un sujeto junto con una dieta que incluye alimentos ricos en prebióticos. Están disponibles comercialmente fuentes adecuadas de fibras solubles e insolubles.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y alimentos médicos y suplementos dietéticos que comprenden preparaciones de polímeros de glicano comprenden además una bacteria probiótica o preparación de la misma, por ejemplo, derivada de cultivos bacterianos que generalmente se reconocen como seguros (GRAS) o microbios comensales o probióticos conocidos. En algunas realizaciones, para maximizar el efecto beneficioso de los microbios comensales endógenos o de los microorganismos probióticos administrados exógenamente, las composiciones farmacéuticas y los alimentos médicos y suplementos dietéticos que comprenden preparaciones de polímeros de glicano se administran para estimular el crecimiento y/o la actividad de bacterias ventajosas en el tracto GI.
Los ejemplos de probióticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, organismos clasificados como génerosBacteroides, Blautia, Clostridium, Fusobacterium, Eubacterium, Ruminococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Akkermansia, Faecalibacterium, Roseburia, Prevotella, Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacillus, Enterococcus, Escherichia, Streptococcus, Saccharomyces, Streptomycesy familia Christensenellaceae. Los ejemplos no exclusivos de bacterias probióticas que pueden usarse en los métodos y composiciones descritos en el presente documento incluyenL. acidophilus,especies deLactobacillus,tales comoL. crispatus, L. casei, L. rhamnosus, L. reuteri, L. fermentum, L. plantarum, L. sporogenesyL. bulgaricus,así como especies deBifidobacterum,tales comoB. lactis, B. animalis, B. bifidum, B. longum, B. adolescenteisyB. infantis.Como probióticos para la administración intestinal también son adecuadas levaduras tales comoSaccharomyces boulardii,por ejemplo por medio de formas de dosificación orales o alimentos. Por ejemplo, el yogur es un producto que ya contiene especies de bacterias, tales comoLactobacillus bulgaricusyStreptococcus thermophilus.
Las bacterias beneficiosas para la modulación de la microbiota gastrointestinal pueden incluir bacterias que producen ácidos orgánicos (ácidos láctico y acético) o que producen agentes citotóxicos o citostáticos (para inhibir el crecimiento patógeno), tales como, por ejemplo, peróxido de hidrógeno (H2O2) y bacteriocinas. Las bacteriocinas son pequeños péptidos antimicrobianos que pueden destruir bacterias estrechamente relacionadas o presentar un espectro de actividad más amplio (por ejemplo, nisina).
Las bacterias beneficiosas pueden incluir una o más del géneroAkkermansia, Anaerofilum, Bacteroides, Blautia, Bifidobacterium, Butyrivibrio, Clostridium, Coprococcus, Dialister, Dorea, Fusobacterium, Eubacterium, Faecalibacterium, Lachnospira, Lactobacillus, Phascolarctobacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus, Prevotella, Roseburia, RuminococcusyStreptococcus,y/o una o más de las especiesAkkermansia municiphilia, minuta, Clostridium coccoides, Clostridium leptum, Clostridium scindens, Dialister invisus, Eubacterium rectal, Eubacterium eligens, Faecalibacterium prausnitzii, Streptococcus salivariusyStreptococcus thermophilus.
En algunas realizaciones, se proporcionan combinaciones que comprenden un taxón bacteriano seleccionado de la columna 1 de las tablas 19, 20 o 21 y una preparación de glicano descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la preparación de combinación comprende una preparación microbiana de un microbio seleccionado de la columna 1 de las tablas 19, 20 o 21 y una preparación de glicano seleccionada de las columnas 3-10 (tabla 19) o columnas 2-9 (tablas 20 y 21). En algunas realizaciones, se proporcionan combinaciones simbióticas adecuadas para la administración a un sujeto humano que las necesita (por ejemplo, administración oral o rectal). En algunas realizaciones, los taxones bacterianos seleccionados para la combinación son taxones bacterianos formadores de esporas. En algunas realizaciones, la preparación de glicano seleccionada para la combinación es un sustrato (fermentable) (por ejemplo, para una enzima glicosidasa) de los taxones bacterianos formadores de esporas.
Además, si se desea, las composiciones farmacéuticas y alimentos médicos y suplementos dietéticos que comprenden preparaciones de polímeros de glicano pueden comprender agentes terapéuticamente activos, sustancias prebióticas y/o bacterias probióticas. Alternativamente o además, los agentes terapéuticamente activos, sustancias prebióticas y/o bacterias probióticas pueden administrarse por separado (por ejemplo, antes, simultáneamente con o después de la administración de los polímeros de glicano) y no como parte de la composición farmacéutica o alimento médico o suplemento dietético (por ejemplo, como una coformulación) de polímeros de glicano. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas o alimentos médicos o suplementos dietéticos que comprenden preparaciones de polímeros de glicano se administran en combinación con una dieta recomendada o prescrita, por ejemplo, una dieta rica en alimentos que contienen probióticos y/o prebióticos, tal como lo determine un médico u otro profesional de la salud. Pueden administrarse agentes terapéuticamente activos, sustancias prebióticas y/o bacterias probióticas para modular el microbioma intestinal del sujeto. En algunas realizaciones, el efecto combinado (por ejemplo, sobre el número o la intensidad de los cambios microbianos, genómicos o funcionales) es aditivo. En otras realizaciones, el efecto combinado (por ejemplo, sobre el número o la intensidad de los cambios microbianos, genómicos o funcionales) es sinérgico.
Administración de preparaciones de polímeros de glicano
Para cualquier composición de preparación de polímero de glicano usada en un método descrito en el presente documento (por ejemplo, un método de tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección enumerados en la tabla 5), puede estimarse inicialmente una dosis terapéuticamente eficaz a partir de modelos animales de laboratorio conocidos por los expertos en la técnica. Tal información puede usarse para determinar con mayor precisión las dosis útiles en seres humanos. Las dosificaciones iniciales también pueden estimarse a partir de datosin vitrooin vivo.Las dosificaciones iniciales también pueden formularse comparando la eficacia de los compuestos usados en los métodos descritos en el presente documento en ensayos modelo con la eficacia de compuestos conocidos. Por ejemplo, pueden formularse dosificaciones iniciales comparando la eficacia de las preparaciones de polímeros de glicano en ensayos modelo con la eficacia de otros compuestos que han demostrado eficacia en el tratamiento de las presentes afecciones. En este método, puede obtenerse una dosificación inicial multiplicando la razón de concentraciones efectivas obtenidas en el ensayo modelo para las preparaciones de polímero de glicano usadas en los métodos descritos en el presente documento y el compuesto de control entre la dosis eficaz del compuesto de control. Por ejemplo, si una preparación útil en el presente método es dos veces más eficaz en un ensayo modelo que un compuesto conocido (por ejemplo, la concentración eficaz (CE50) de la preparación de polímero de glicano es igual a la mitad de la CE50 del compuesto conocido en el mismo ensayo), una dosificación eficaz inicial de la preparación de polímero de glicano sería la mitad de la dosificación conocida para el compuesto conocido. Usando estas directrices iniciales, un experto habitual en la técnica puede determinar una dosificación eficaz en sujetos, tales como seres humanos. La cantidad y el intervalo de dosificación pueden ajustarse individualmente para proporcionar niveles de la preparación de polímero de glicano que sean suficientes para mantener el efecto terapéutico. Un experto en la técnica podrá optimizar dosificaciones locales terapéuticamente eficaces sin experimentación indebida.
Dependiendo del trastorno y del sujeto que va a tratarse y de la vía de administración, las composiciones pueden administrarse en dosis variables. En una realización, se usa la cantidad o dosis eficaz más pequeña de preparación de polímero de glicano. En algunas realizaciones, la preparación de polímero de glicano se administra en una dosis de desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 10.000 mg/kg, desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 1.000 mg/kg, desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg, desde 0,05 mg/kg hasta aproximadamente 5.000 mg/kg, desde aproximadamente 0,5 mg/kg hasta aproximadamente 5.000 mg/kg, desde aproximadamente 5 mg/kg hasta aproximadamente 500 mg/kg. Esta dosis puede administrarse como mg/kg/día y puede administrarse como dosis inicial o puede aumentarse o disminuirse con el tiempo (por ejemplo, días o semanas) para alcanzar una dosis final.
En algunas realizaciones, la preparación de polímero de glicano se administra en una dosis diaria total por sujeto de desde aproximadamente 1 mg al día hasta aproximadamente 100 gramos al día; desde aproximadamente 10 mg al día hasta aproximadamente 10 gramos al día; desde aproximadamente 100 mg al día hasta aproximadamente 10 gramos al día; desde aproximadamente 1 gramo al día hasta aproximadamente 10 gramos al día, desde aproximadamente 2 gramos al día hasta aproximadamente 20 gramos al día; desde aproximadamente 5 gramos al día hasta aproximadamente 50 gramos al día, desde aproximadamente 10 gramos al día hasta aproximadamente 100 gramos al día, desde aproximadamente 10 gramos al día hasta aproximadamente 50 gramos al día, desde aproximadamente 10 gramos al día hasta aproximadamente 75 gramos al día, desde aproximadamente 20 gramos al día hasta aproximadamente 100 gramos al día, desde aproximadamente 20 gramos al día hasta aproximadamente 50 gramos al día, desde aproximadamente 20 gramos al día hasta aproximadamente 75 gramos al día, desde aproximadamente 20 gramos al día hasta aproximadamente 100 gramos al día, desde aproximadamente 50 gramos al día hasta aproximadamente 150 gramos al día o desde aproximadamente 50 gramos al día hasta aproximadamente 200 gramos al día.
En algunas realizaciones, un síntoma de una enfermedad, trastorno o afección gastrointestinal en un sujeto que presenta los síntomas se disminuye o se elimina administrando al sujeto cantidades (o dosis) crecientes, decrecientes o constantes de una composición de preparación de polímero de glicano durante un período de tiempo. (por ejemplo, un período de tratamiento).
En una realización, la composición contiene cepas bacterianas beneficiosas, comensales y/o probióticas en una cantidad comprendida entre 1 x 107 y 1*1013 UFC/dosis y cepa bacteriana, o entre 1*109 y 1x1011 UFC/dosis y cepa bacteriana.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra una, dos o tres veces al día. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra dos veces al día. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra cada día durante un número predeterminado de días (el período de tratamiento). En algunas realizaciones, el período de tratamiento es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 100, 200, 300 o 365 días. En algunas realizaciones, el período de tratamiento es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses. En algunas realizaciones, el período de tratamiento es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 años o de por vida.
En una realización, la duración total de los períodos de tratamiento para una enfermedad, trastorno o afección gastrointestinal puede ser de aproximadamente un día a 10 años, de un día a 1 año, de 1 día a 6 meses, de 1 día a 3 meses, de 1 día a 1 mes, de un día a una semana, de un día a cinco días, de un día a 10 días, de una semana a aproximadamente 12 semanas, o de aproximadamente cuatro semanas a aproximadamente diez semanas, o de aproximadamente cuatro semanas a aproximadamente ocho semanas, o de aproximadamente seis semanas. El sujeto puede someterse a un número adecuado de períodos de tratamiento, tales como, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de 10 períodos de tratamiento. Durante un período de tratamiento, el sujeto toma una composición de preparación de polímero de glicano descrita en el presente documento, opcionalmente junto con la ingestión de productos alimenticios que contienen prebióticos y/o probióticos. En una realización, una composición de preparación de polímero de glicano también puede administrarse en combinación con otra sustancia (tal como un probiótico o una bacteria beneficiosa comensal, una sustancia prebiótica o un agente terapéutico), tal como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, la composición de preparación de polímero de glicano también puede combinarse con un antibiótico que altera el crecimiento normal de la microbiota gastrointestinal. Normalmente, la duración de los tratamientos con antibióticos es de 1-14 días, de 2-10 días o de 5-7 días. En algunas realizaciones, se administra una preparación de polímero de glicano a un sujeto que lo necesita inmediatamente después de que uno o más tratamientos con antibióticos hayan finalizado (por ejemplo, 1 hora, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas después de que haya finalizado el tratamiento con antibióticos). Durante un curso de tratamiento con antibióticos, la composición de preparación de polímero de glicano puede proporcionarse al inicio del tratamiento con antibióticos; poco después del tratamiento con antibióticos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más días después del tratamiento; o puede administrarse tras el diagnóstico de crecimiento de patógenos no deseados.
En algunas realizaciones, la composición de preparación de polímero de glicano también puede combinarse con un fármaco que provoca disbiosis, por ejemplo, un fármaco que altera el crecimiento normal de la microbiota gastrointestinal, por ejemplo, un fármaco quimioterápico, un fármaco antidiabético, un fármaco inmunosupresor, un fármaco antimicrobiano, un fármaco antipsicótico, un fármaco inhibidor de la bomba de protones o un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE). La composición de preparación de polímero de glicano, en algunas realizaciones, reduce los síntomas inducidos por el fármaco o el tratamiento en un sujeto humano. Los síntomas incluyen anomalías digestivas, tales como, por ejemplo, aumento de peso, estreñimiento, acidez de estómago, malestar estomacal, gases, hinchazón, flatulencia, diarrea, dolor abdominal, calambres, náuseas y vómitos. En algunas realizaciones, se administra una preparación de polímero de glicano a un sujeto que lo necesita inmediatamente después de que uno o más tratamientos farmacológicos hayan finalizado (por ejemplo, 1 hora, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas después de que haya finalizado el tratamiento con antibióticos). Durante un curso de tratamiento farmacológico, la composición de preparación de polímero de glicano puede proporcionarse antes del inicio del tratamiento farmacológico (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 días antes); el día del inicio del tratamiento farmacológico; o poco después del tratamiento con antibióticos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más días después del tratamiento, y opcionalmente puede proporcionarse sólo inicialmente (por ejemplo, durante un período corto) o durante toda la duración del tratamiento farmacológico, e incluso puede continuarse durante un período deseado después de que haya finalizado el período de tratamiento farmacológico (por ejemplo, durante 1-7 días, 1-14 días o 1-21 días después). En algunas realizaciones, la administración de la composición de preparación de polímero de glicano se inicia o continúa cuando se producen y/o se diagnostican uno o más efectos adversos (por ejemplo, anomalías digestivas o crecimiento de patógenos) junto con el tratamiento farmacológico. En algunas realizaciones, el agente de tratamiento que provoca una disbiosis no es un fármaco sino un tratamiento de radiación o cirugía y la composición de preparación de polímero de glicano también puede administrarse como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, el número total y la duración de los períodos de tratamiento se basan en la respuesta de un sujeto al tratamiento. Por ejemplo, un individuo puede experimentar una reducción de los síntomas después de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 días de tratamiento con una composición de preparación de polímero de glicano. En otro ejemplo, un individuo puede experimentar una reducción de los síntomas después de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses de tratamiento con una composición de preparación de polímero de glicano. Por tanto, la duración del tratamiento está determinada por la respuesta de un sujeto individual a una composición de preparación de polímero de glicano y la aparición de alivio de uno o más síntomas. Por tanto, un sujeto puede experimentar síntomas a una dosis dada de una composición de preparación de polímero de glicano y puede requerir que el sujeto permanezca en esa dosis, o en una dosis más baja, hasta que los síntomas desaparezcan. Por tanto, en una realización, la duración del tratamiento no se determina desde el principio, sino que continúa hasta que se alcanza la dosis máxima de una composición de preparación de polímero de glicano al día, o hasta que se logra el nivel deseado de reducción de los síntomas. En una realización, el tratamiento es continuo.
En una realización, a un sujeto puede administrársele una dosis para el primer período de tratamiento durante un régimen de tratamiento y una segunda dosis durante un segundo período de tratamiento. Por ejemplo, a un sujeto puede administrársele una dosis de composición de preparación de polímero de glicano durante un período de una semana y una segunda dosis durante un período posterior de una semana.
Un sujeto puede autoadministrarse una composición de preparación de polímero de glicano y la composición de preparación de polímero de glicano la suministra o recomienda (o prescribe) un profesional de la salud, por ejemplo, un médico u otro profesional de la salud calificado y, opcionalmente, un profesional de la salud monitoriza los resultados de prueba (por ejemplo, obtenidos para biomarcadores de muestras tomado del sujeto) y/o los cambios de salud y los criterios de valoración del tratamiento. En algunas realizaciones, la composición de preparación de polímero de glicano la administra un profesional de la salud.
En una realización, un sujeto que lo necesita puede someterse a cursos repetidos de tratamiento con una composición de preparación de polímero de glicano. El curso del tratamiento puede repetirse cuando los síntomas reaparecen o aumentan hasta un nivel no deseado. Alternativamente, el curso del tratamiento puede repetirse a intervalos regulares o predeterminados. Así, el tratamiento puede repetirse después de aproximadamente un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, seis meses, ocho meses, diez meses, un año, 18 meses, dos años, tres años, cuatro años, cinco años o más de cinco años, o cualquier combinación de los mismos (por ejemplo, el tratamiento puede repetirse después de un año y luego cada de dos a cinco años después). El tratamiento puede repetirse de la misma forma (por ejemplo, duración, dosificación, momento de la dosificación, sustancias adicionales, etc.) que se usó en el primer tratamiento o puede modificarse. Por ejemplo, la duración del tratamiento puede acortarse o alargarse, la dosificación puede aumentarse o disminuirse. Opcionalmente, el tratamiento con la preparación de polímero de glicano puede producirse en combinación con un número o composiciones diferentes de agentes, por ejemplo, que contienen más o menos otras sustancias, o menos o más sustancias (tales como, por ejemplo, una sustancia prebiótica, una bacteria probiótica o un agente terapéutico) además de la preparación de polímero de glicano.
Pueden administrarse sustancias adicionales junto con una composición de preparación de polímero de glicano. Estas sustancias pueden potenciar la acción de las dosis de preparación de polímero de glicano, por ejemplo, fomentando el crecimiento de bacterias en el tracto GI que alivian los síntomas de la enfermedad, trastorno o afección gastrointestinal, aumentando la adhesión de bacterias comensales probióticas o beneficiosas en el nicho o en el intestino. Estas sustancias pueden administrarse antes del tratamiento con una preparación de polímero de glicano, durante el tratamiento con una preparación de polímero de glicano, después del tratamiento con una preparación de polímero de glicano o cualquier combinación de los mismos. Si se administran durante el tratamiento con la preparación de polímero de glicano, pueden administrarse con la dosis de preparación de polímero de glicano que está administrándose, o antes o después de la dosis de preparación de polímero de glicano, o cualquier combinación de los mismos. En una realización, las sustancias de uso junto con una composición de preparación de polímero de glicano incluyen microbio(s) probiótico(s), prebióticos, agentes terapéuticos o tampones/portadores/excipientes. Una o más de estas sustancias pueden usarse en combinación con una composición de preparación de polímero de glicano en cualquier momento adecuado antes, durante, después del tratamiento o alguna combinación de los mismos.
Tabla 1: Características de polímeros de glicano a modo de ejemplo.
Tabla 2: Constituyentes microbianos a nivel de género del tracto GI.
Tabla 3: Filos y cepas asociados con metabolitos a modo de ejemplo
Tabla 4: Predicción de la actividad de la familia de glucósido hidrolasa (GH) y glicosiltransferasa (GT) de CAZy.
__________________________________
Tabla 5: Metabolitos e indicaciones asociadas
Tabla 19.
Tabla 19 (continuación)
Tabla 20.
Tabla 20 (continuación)
Tabla 21.
______
Blautia________ una preparación de una preparación de una preparación de una preparación de Clostridiales glicano (tal como se glicano (tal como se glicano (tal como se glicano (tal como se Clostridium_____ describe en el presente describe en el describe en el describe en el Eubacterium documento, por ejemplo, presente presente presente Lachnospiraceae que tiene cualquier DP, documento, por documento, por documento, por Roseburia_____ Db , razón de enlace ejemplo, que tiene ejemplo, que tiene ejemplo, que tiene Ruminococcus glicosídico alfa/beta, cualquier DP, DB, cualquier DP, DB, cualquier DP, DB, número de enlaces razón de enlace razón de enlace razón de enlace glicosídicos, regioquímica glicosídico alfa/beta, glicosídico alfa/beta, glicosídico alfa/beta, de enlace y número de enlaces número de enlaces número de enlaces estereoquímica de enlace, glicosídicos, glicosídicos, glicosídicos, y otras características (por regioquímica de regioquímica de regioquímica de ejemplo, solubilidad, enlace y enlace y enlace y fermentabilidad, estereoquímica de estereoquímica de estereoquímica de viscosidad, dulzor, etc.) enlace, y otras enlace, y otras enlace, y otras descritas en el presente características (por características (por características (por documento) que ejemplo, solubilidad, ejemplo, solubilidad, ejemplo, solubilidad, comprende glicanos que fermentabilidad, fermentabilidad, fermentabilidad, comprenden a unidad de viscosidad, dulzor, viscosidad, dulzor, viscosidad, dulzor, glicano de manosa, etc.) descritas en el etc.) descritas en el etc.) descritas en el opcionalmente en donde presente presente presente la preparación de glicano documento) que documento) que documento) que comprende cualquier comprende glicanos comprende glicanos comprende glicanos cantidad de manosa de que comprenden a que comprenden que comprenden entre el 1 % y el 100 %, unidad de glicano una unidad de una unidad de opcionalmente además en de ramnosa, glicano de fructosa, glicano de fucosa, donde la preparación de opcionalmente en opcionalmente en opcionalmente en glicano comprende una donde la donde la donde la
EJEMPLOS
La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos. Los ejemplos se proporcionan para fines ilustrativos solo, y no deben interpretarse como limitativos del alcance o contenido de la invención de ningún modo. La práctica de la presente invención empleará, a menos que se índique lo contrario, métodos convencionales de química de proteínas, bioquímica, técnicas de ARN recombinante y farmacología, dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); Green & Sambrooket al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4a edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012); Colowick & Kaplan, Methods In Enzymology (Academic Press); Remington: The Science and Practice de Pharmacy, 22a edición (Pharmaceutical Press, 2012); Sundberg & Carey, Advanced Organic Chemistry: Parts A and B, 5a edición (Springer, 2007).
Ejemplo 1. Método para producir polímeros de glicano usando una enzima glicosidasa purificadaPueden generarse glicanos mediante hidrólisis inversa de enlaces glicosídicos catalizada por una o más enzimas hidrolasa o transferasa parcial o totalmente purificadas, descritas en el presente documento, por ejemplo, tablas 4, 22, 23 y 24 y, por ejemplo, codificadas por las SEQ ID Nos 1-124. La(s) enzima(s) seleccionada(s) puede(n) ser cualquier enzima que se conoce que hidroliza enlaces glicosídicos, incluidas glicosilhidrolasas, glicosiltransferasas y polisacárido liasas, incluidas aquellas que usan donadores de azúcar no activados o donadores de azúcar activados, incluidos, entre otros, nucleótidos de azúcar y azúcares fosforilo. Idealmente, la enzima seleccionada se aísla de o está relacionada con una glicosil hidrolasa de los glicotaxones (por ejemplo, clase 1, clase 2, clase 3, clase 4, clase 5, clase 6 o clase 7) con un efecto positivo sobre la estructura o salud del microbioma del huésped (por ejemplo, la modulación de un metabolito, por ejemplo, SCFA (por ejemplo, butirato, propionato), TMA/t Ma O, amoníaco, soluto urémico (por ejemplo, indol, p-cresol), LPS o un ácido biliar (por ejemplo, un ácido biliar secundario).
El donador de glicosilo puede consistir en un glucósido monomérico inactivado (por ejemplo, glucosa, galactosa, ácido glucurónico, etc.), un glucósido monomérico activado (por ejemplo, fosfoglucosa, lactosa, maltobiosa, UDP-glucosa, 1-fluoroglucosa, glucosa tricloroacetimidada, para-nitrofenilglucosa, ácido hexeneurónico), o glucósidos oligoméricos o poliméricos (por ejemplo, maltosa, galactooligosacáridos).
El aceptor de glicosilo puede consistir en cualquier sustrato compatible con glicosilhidrolasas o transferasas, incluidos azúcares monoméricos (por ejemplo, glucosa, galactosa, ácido glucurónico), oligómeros (por ejemplo, lactosa, maltobiosa, galactooligosacáridos) o sustratos distintos de azúcar que se notifica que son compatibles con otros glucósidos (por ejemplo, sorbitol, glicerol). En algunas realizaciones, el aceptor de glicosilo y el donador de glicosilo pueden ser el mismo material, por ejemplo, maltobiosa puede ser tanto donador como aceptor.
La enzima de interés puede disolverse o suspenderse hasta una concentración de 1-50 U/ml en un disolvente biocompatible que incluye agua; mezclas de agua y un disolvente miscible tal como acetona, etanol, isopropanol, polietilenglicol, t-butanol u otros disolventes notificados; o un disolvente orgánico puro. Se añaden donador y aceptor de glicosilo al medio en una concentración de entre el 5 % y el 50 % en peso. El pH del medio se ajusta a un intervalo de entre 2,5 y 8,0 usando un tampón biocompatible, por ejemplo, tampón acetato de sodio, tampón ácido cítrico/hidrogenofosfato de disodio, tampón fosfato, etc. Luego se permite que la reacción se agite suavemente durante 2-48 horas a una temperatura compatible con la molécula de enzima glicosidasa seleccionada, normalmente de 35 °C a 90 °C.
Las condiciones para la síntesis usando una molécula de enzima glicosidasa que se aísla con cambios estructurales mínimos de su huésped o se expresa a partir de un sistema recombinante pueden reflejar más estrechamente la fisiología nativa, es decir, un pH de entre 5 y 7,5 y una temperatura de entre 35 y 60 °C. Idealmente, las condiciones para la síntesis usando una molécula de enzima glicosidasa que se ha modificado para mejorar su estabilidad pueden desviarse además de las condiciones fisiológicas, por ejemplo, un pH de entre 3,5 y 8 y una temperatura de entre 35 y 70 °C. Pueden usarse cambios en la estabilidad de las proteínas para aumentar las propiedades deseables, incluido el rendimiento de síntesis, la tasa de conversión, la reciclabilidad o el rendimiento de producción de proteínas.
Idealmente, las condiciones para la síntesis usando una molécula de enzima glicosidasa que se ha modificado sumamente o aislado de bacterias extremófilas evolucionadas para soportar condiciones extremas de temperatura o pH pueden desviarse ampliamente de las condiciones fisiológicas, por ejemplo, un pH de entre 2,0 y 8 y una temperatura de hasta 90 °C.
En una realización, el sustrato seleccionado (tabla 23, columna E) se colocó en un vial de centelleo de 20 ml. Se añadió al vial tampón Mcllvaine de pH especificado (tabla 23, columna J) y se disolvió el polvo mediante un breve calentamiento con una pistola de calor. Después de que la disolución de sustrato tamponada se enfriara hasta temperatura ambiente, se añadió la enzima seleccionada (tabla 23, columna H), se agitó la disolución suavemente para mezclar y se colocó el vial tapado un baño de agua a la temperatura especificada (tabla 23, columna K), sin agitar. Una vez transcurrido el tiempo especificado (tabla 23, columna L), se calentó el vial en un baño de agua en ebullición durante 20 min para inactivar la enzima. Luego, las muestras se transfirieron a tubos de centrífuga cónicos de 50 ml y se diluyeron hasta -200 mg/ml. Los productos diluidos se purificaron entonces mediante los métodos descritos en el ejemplo 18. Los materiales aislados se caracterizaron como se describe en los ejemplos 11-15 y los datos se presentan en la tabla 23 (SEC) y la tabla 24 (HSQC-NMR).
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Ejemplo 2. Generación de beta-galactooligosacáridos por medio de beta-galactosidasa y lactosa
A un tampón acetato de sodio 0,05 M, pH 5 a 60 °C se le añadió lactosa hasta una concentración de 400 mg/ml. Se agitó la reacción suavemente hasta que se disolvieron los sustratos. Luego se añadió a la reacción una disolución madre de beta-galactosidasa (Megazyme, n.° de catálogo E-BGLAN) hasta una concentración final de 10 U/ml. Se mantuvo la reacción a 60 °C durante 26 h en un baño de agua cubierto. Cuando la reacción se consideró completa, se calentó hasta 100 °C durante 10 minutos para inactivar la enzima, luego se diluyó con agua hasta una concentración total de hidratos de carbono del 2 % (tabla 23, línea 31). Entonces, se caracterizaron los productos, se aislaron y se purificaron tal como se describe en los ejemplos 11-18 y se muestra en la figura 5. El oligosacárido aislado tiene un peso molecular >20 % DP>3, una estereoquímica glicosídica >50 % de betaglucósidos, una regioquímica >10 % de enlaces 1,4-glucosídicos y una constitución >50 % de D-galactosa.
Ejemplo 3. Generación de alfa-galactooligosacáridos por medio alfa-galactosidasa y melibiosa
A un tampón acetato de sodio 0,05 M, pH 5 a 60 °C se le añadió melibiosa hasta una concentración de 1000 mg/ml. Se agitó la reacción suavemente hasta que se disolvieron los sustratos. Luego se añadió a la reacción una disolución madre de alfa-galactosidasa (Megazyme, n.° de catálogo E-AGLAN) hasta una concentración final de 10 U/ml. Se mantuvo la reacción a 60 °C durante 22 h en un baño de agua cubierto. Cuando la reacción se consideró completa, se calentó hasta 100 °C durante 10 minutos para inactivar la enzima, luego se diluyó con agua hasta una concentración total de hidratos de carbono del 2 % (tabla 23, línea 29). Entonces, se caracterizaron los productos, se aislaron y se purificaron tal como se describe en los ejemplos 11 18 (figura 8). El oligosacárido aislado tiene un peso molecular >20 % DP>3, una estereoquímica glicosídica >50 % de alfa-glucósidos, una regioquímica >10 % de enlaces 1,4-glucosídicos y una constitución >50 % de D-galactosa.
Ejemplo 4. Generación de beta-gluccooligosacáridos por medio de beta-glucosidasa y celobiosa
A un tampón acetato de sodio 0,05 M, pH 5 a 60 °C se le añadió celobiosa hasta una concentración de 200 mg/ml. Se agitó la reacción suavemente hasta que se disolvieron los sustratos. Luego se añadió a la reacción una disolución madre de beta-glucosidasa (Megazyme, n.° de catálogo E-BGOSPC) hasta una concentración final de 10 U/ml. Se mantuvo la reacción a 60 °C durante 26 h en un baño de agua cubierto. Cuando la reacción se consideró completa, se calentó hasta 100 °C durante 10 minutos para inactivar la enzima y luego se diluyó con agua hasta una concentración total de hidratos de carbono del 2 % (tabla 23, línea 10). Entonces, se caracterizaron los productos, se aislaron y se purificaron tal como se describe en los ejemplos 11 18 (figura 6). El oligosacárido aislado tiene un peso molecular >10 % DP>3, una estereoquímica glicosídica >50 % de beta-glucósidos, una regioquímica >10 % de enlaces 1,4-glucosídicos y una constitución >90 % de D-glucosa (tabla 24, línea 10).
Ejemplo 5. Generación de alfa-gluccooligosacáridos por medio de alfa-glucosidasa y maltosa
A un tampón maleato de sodio 0,05 M, pH 6,5 a 55 °C se le añadió maltosa hasta una concentración de 1000 mg/ml. Se agitó la reacción suavemente hasta que se disolvieron los sustratos. Luego se añadió a la reacción una disolución madre de alfa-glucosidasa (Megazyme, n.° de catálogo E-TSAGL) hasta una concentración final de 10 U/ml. Se mantuvo la reacción a 55 °C durante 24 h en un baño de agua cubierto. Cuando la reacción se consideró completa, se calentó hasta 100 °C durante 10 minutos para inactivar la enzima, luego se diluyó con agua hasta una concentración total de hidratos de carbono del 2 % (tabla 23, línea 27). Entonces, se caracterizaron los productos, se aislaron y se purificaron tal como se describe en los ejemplos 11 18 (figura 7A, B). El oligosacárido aislado tiene un peso molecular >15 % DP>3, una estereoquímica glicosídica >50 % de alfa-glucósidos, una regioquímica >10 % de enlaces 1,4-glucosídicos y una constitución >90 % de D-glucosa (tabla 24, línea 11).
Ejemplo 6. Generación selectiva de oligosacáridos mediante tratamiento de mezclas de sustratos con una glicosidasa selectiva
Se generan oligosacáridos con composiciones mixtas (incluidas mezclas de estereoquímicas, regioquímicas y composición monomérica) tratando una mezcla de sustratos con una glicosidasa que es selectiva para uno o más de los sustratos en las condiciones descritas en el ejemplo 1. En este ejemplo, los sustratos susceptibles a la glicosidasa sirven como donadores de enlaces glicosídicos y los sustratos que no son susceptibles a la glicosidasa solo sirven como aceptores de enlaces glicosídicos. Mezclando diferentes combinaciones de sustratos con glicosidasas diferentemente selectivas, pueden generarse combinaciones distintas de oligosacáridos (figura 12).
En una realización, a un tampón acetato de sodio 0,05 M, pH 5 a 60 °C se le añadió una mezcla 1:2 p/p de celobiosa y lactosa hasta una concentración final de 600 mg/ml. Se agitó la reacción suavemente hasta que se disolvieron los sustratos. Luego se añadió a la reacción una disolución madre de beta-glucosidasa (Megazyme, n.° de catálogo E-BGOSPC) hasta una concentración final de 10 U/ml. Se mantuvo la reacción a 60 °C durante 26 h en un baño de agua cubierto. Cuando la reacción se consideró completa, se calentó hasta 100 °C durante 10 minutos para inactivar la enzima y luego se diluyó con agua hasta una concentración total de hidratos de carbono del 2 %. Entonces, se caracterizaron los productos, se aislaron y se purificaron tal como se describe en los ejemplos 11-18 (figura 14). El oligosacárido aislado tiene un peso molecular >10 % DP>3, una estereoquímica glicosídica >50 % de beta-glucósidos, una regioquímica >10 % de enlaces 1,4-glicosídicos y una constitución >50 % de D-glucosa y <50 % de D-galactosa.
En una segunda realización, a un tampón acetato de sodio 0,05 M, pH 5 a 60 °C se le añadió una mezcla 1:2 p/p de celobiosa y lactosa hasta una concentración final de 600 mg/ml. Se agitó la reacción suavemente hasta que se disolvieron los sustratos. Luego se añadió a la reacción una disolución madre de beta-galactosidasa (Megazyme, n.° de catálogo E-BGLAN) hasta una concentración final de 10 U/ml. Se mantuvo la reacción a 60 °C durante 26 h en un baño de agua cubierto. Cuando la reacción se consideró completa, se calentó hasta 100 °C durante 10 minutos para inactivar la enzima y luego se diluyó con agua hasta una concentración total de hidratos de carbono del 2 %. Entonces, se caracterizaron los productos, se aislaron y se purificaron tal como se describe en los ejemplos 11-18 (figura 13). El oligosacárido aislado tiene un peso molecular >20 % DP>3, una estereoquímica glicosídica >50 % de beta-glucósidos, una regioquímica >10 % de enlaces 1,4-glicosídicos y una constitución <50 % de D-glucosa y >50 % de D-galactosa.
En otras realizaciones, la mezcla de sustratos seleccionada puede diferir por el monómero constituyente (por ejemplo, maltosa y melibiosa o L-arabinobiosa y D-arabinobiosa), por la estereoquímica glicosídica (por ejemplo, maltosa y celobiosa), por la regioquímica (por ejemplo, lactosa y alolactosa), por estrategia de activación (por ejemplo, 1-(para-nitrofenil)-D-glucosa y lactosa), o por cualquier combinación de estos u otros factores que diferencian los sustratos de enzimas glicosídicas. Las glicosidasas seleccionadas pueden diferir según la selectividad por el sustrato (por ejemplo, glucosidasa frente a galactosidasa), estereoquímica glicosídica (por ejemplo, alfa-glucosidasa frente a beta-glucosidasa), regioquímica (por ejemplo, 1,6-glucosidasa frente a 1,3-glucosidasa), posición de la cadena (por ejemplo, endoglicosidasa frente a exoglicosidasa; extremo reductor selectivo frente a extremo no reductor selectivo), o cualquier combinación de estos u otros factores que diferencian las enzimas glicosídicas.
Ejemplo 7. Generación de oligosacáridos a partir de azúcares monoméricos usando un sistema de disolventes orgánicos/acuosos mixto
Los glicanos descritos en el ejemplo 1 pueden generarse a partir de azúcares monoméricos mediante un evento de hidrólisis inversa termodinámica. Las azúcar hidrolasas establecen un equilibrio termodinámico en el que los azúcares monoméricos están en constante intercambio con oligosacáridos de orden superior con la dirección dominante de la reacción dictada por la actividad del agua del entorno. La alta concentración de agua en relación con el sustrato que se encuentra en condiciones fisiológicas hace que estas enzimas tengan una acción principalmente hidrolítica. En determinadas condiciones de laboratorio, la dirección dominante de la reacción puede alterarse para favorecer la formación de enlaces glicosídicos que permitan la formación de oligosacáridos a partir de constituyentes monoméricos. La glucosa se disolvió en tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 5,2, a una concentración del 10 % (p/p). Después de que se disolvieron los sustratos, se añadieron cuatro volúmenes de uno de los siguientes disolventes orgánicos a la porción acuosa: terc-butanol, dimetil éter de dietilenglicol (DEGD), dimetil éter de tetraetilenglicol (TEGD) o trimetilfosfato (TMP). Se añadió disolución madre de betaglucosidasa a la reacción hasta una concentración de 10 U/ml. La reacción se calentó hasta 50 °C en un baño de agua cubierto y se controló durante un período de 10 días. Una vez que se consideró completa la reacción, la reacción se calentó a 100 °C durante 10 minutos para inactivar las enzimas. Entonces se centrifugó la reacción en una centrífuga de sobremesa para recoger los glicanos precipitados y se eliminó el sobrenadante mediante decantación. Entonces, se caracterizaron los productos y purificaron tal como se describe en los ejemplos 11-18. En la figura 9 se muestra un experimento de electroforesis de hidratos de carbono asistida por fluoróforo que demuestra la presencia de glicanos DP>1.
Ejemplo 8. Cambio de las distribuciones de productos mediante la adición de modificadores de la reacción
Pueden añadirse otros modificadores a la reacción para controlar la velocidad de reacción, el rendimiento total de material, la eficiencia de conversión o la distribución estructural del glicano resultante. En una realización, se añadió D-galactosa monomérica a la reacción descrita en el ejemplo 12. La comparación del perfil de producto durante 24 horas mostró que la galactosa tanto ralentizó la velocidad de formación de oligosacáridos como desplazó la distribución de producto hacia una mayor proporción de oligosacáridos (figura 10).
A un tampón acetato de sodio 0,05 M, pH 5 a 60 °C se le añadió lactosa hasta una concentración de 400 mg/ml. La lactosa se agitó suavemente hasta que se disolvió. Luego se añadió D-galactosa a la reacción hasta una concentración final de 115 mg/ml y se agitó suavemente hasta que se disolvió. Luego se añadió a la reacción una disolución madre de beta-galactosidasa (Megazyme, n.° de catálogo E-BGLAN) hasta una concentración final de 10 U/ml. Se mantuvo la reacción a 60 °C durante 24 h en un baño de agua cubierto. Cuando la reacción se consideró completa, se calentó hasta 100 °C durante 10 minutos para inactivar la enzima y luego se diluyó con agua hasta una concentración total de hidratos de carbono del 2 %. Entonces, se caracterizaron los productos, se aislaron y se purificaron tal como se describe en los ejemplos 6-8.
Ejemplo 9. Método para producir glicanos por medio de hidrólisis inversa mediante aislado de cultivo bacteriano
Los glicanos descritos, por ejemplo, en el ejemplo 1, pueden generarse mediante hidrólisis inversa de enlaces glicosídicos catalizada por una preparación bacteriana aislada que incluye una o más de las categorías de células completas viables, células completas no viables, células parciales o componentes celulares, sobrenadantes de cultivo celular u otras porciones de medios bacterianos que contienen glucósido hidrolasas. En este experimento, en primer lugar se cultiva una cepa bacteriana, una combinación de cepas o una comunidad bacteriana completa en medios adecuados y en condiciones adecuadas. Luego, el cultivo se recoge usando técnicas convencionales y luego el cultivo aislado se somete a las condiciones de hidrólisis inversa descritas en el ejemplo 1 para generar un glicano que está adaptado a esa cepa, combinación o comunidad.
La cepa, combinación o comunidad de cepas puede cultivarse usando cualquiera de los medios bien conocidos descritos, por ejemplo, en Martens, EC;et al.Cell Host & Microbe, 2008, 4, 447.; Romano, KA;et al.mBio, 2015, 6, e02481-14.; Atlas, R. M., Handbook of Microbiological Media, 4a ed., 2010.; u otra bibliografía publicada que seleccione condiciones de cultivo optimizadas para la cepa o cepas de interés. Una vez que el cultivo ha alcanzado una densidad adecuada, el cultivo se recoge del medio mediante cualquier método adecuado que incluye filtración, centrifugación o liofilización.
Si se desea, las células aisladas se lisan después de su recogida mediante batido con perlas, liofilización u otra técnica para producir una mezcla de materia celular no viable que contiene glicosil hidrolasas endocelulares o unidas a membrana expresadas de manera nativa.
Si se desea, el sobrenadante del cultivo se aísla y se liofiliza independientemente de la materia celular para producir una mezcla de glicosil hidrolasas exocelulares expresadas de manera nativa.
Si se desea, las células combinadas y el sobrenadante del cultivo se lisan y se liofilizan juntos para producir una mezcla de todas las glicosil hidrolasas expresadas.
Las glicosil hidrolasas aisladas descritas se usan luego para generar glicanos, por ejemplo, tal como se describe en el ejemplo 1 usando las glicosil hidrolasas aisladas en lugar de las enzimas purificadas. Las condiciones descritas en el ejemplo 1 pueden modificarse adicionalmente mediante la adición de agentes permeabilizantes celulares, incluidos DMSO o tolueno, para aumentar la accesibilidad de las enzimas expresadas. La actividad de los sólidos aislados puede medirse usando cualquier técnica adecuada, por ejemplo, descrita en Goulas,et al.International Dairy Journal 17 (2007) 648-656. Cuando se aplican a glicanos generados usando este método, las purificaciones descritas en los ejemplos 16-18 pueden alterarse para eliminar el material celular residual mediante cualquier método bien conocido que incluye centrifugación, filtración estéril y cromatografía de filtración en gel. Los glicanos pueden usarse entonces para aumentar el crecimiento de cepas, combinaciones o comunidades de cepas particulares, por ejemplo, en el intestino, por ejemplo, tras la administración de una cantidad eficaz a un sujeto humano.
En una realización adicional, un sedimento de biomasa que contenía -400 mg deBifidobacterium longum(BLO.16) cultivado en un medio que contenía glucosa como única fuente de hidratos de carbono se lavó con 1 ml de 0,01 XPBS seis veces para eliminar cualquier residuo del medio de cultivo. Para cada lavado, el sedimento se resuspendió mediante vórtex y luego se recogió mediante centrifugación a 10.000 g durante 3 minutos. Una vez completado el lavado, se resuspendió la biomasa en agua a -100 mg/ml y se diluyó con 16 ml de 0,01 XPBS y 40 |il de tolueno durante 1 h a temperatura ambiente para aumentar la permeabilidad de la membrana celular. El sedimento celular se recogió mediante centrifugación a 10.000 g durante 10 minutos y se descartó el sobrenadante. Luego se lavó el sedimento cuatro veces con 20 ml de 0,01 XPBS de la misma manera. Después de eso, se resuspendió la biomasa en 4 ml de agua y se liofilizó para fines de síntesis enzimática.
Después de la preparación de la biomasa, se pesaron 250 mg de maltosa en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y se disolvieron en 250 |il de tampón acetato 0,05 M, pH 5, con breve calentamiento en un baño de agua a 40 °C. La biomasa liofilizada se añadió a la disolución de maltosa. Las reacciones se mantuvieron a 40 °C durante 3 días y se monitorizó la producción de oligómeros. En cada intervalo de tiempo, se calentó una porción de 20 |il de una muestra en un baño de agua en ebullición durante 10 minutos para inactivar la enzima. Luego, se diluyó esta porción hasta -20 mg/ml con agua y se filtró por 0,2 |im para comprobar el progreso de la reacción mediante SEC o TLC.
Ejemplo 10. Método para inducir la expresión de hidrolassa mediante pretratamiento del cultivo bacteriano con glicano definido
El método para producir glicanos mediante una preparación bacteriana aislada descrita en el ejemplo 3 puede modificarse adicionalmente induciendo la expresión de glicosil hidrolasas específicas en la etapa de crecimiento del cultivo con el fin de cambiar los niveles de expresión de la enzima. En este ejemplo, las condiciones de cultivo bacteriano descritas en el ejemplo 8 pueden modificarse mediante la adición de un glicano (por ejemplo, de una síntesis previa), glucósido (por ejemplo, alfa-1,6-manobiosa), oligosacárido (por ejemplo, lactosa, GOS) o fibra (por ejemplo, celulosa, inulina, pectina) en lugar de otras fuentes de carbono con el fin de inducir que el cultivo exprese glicosil hidrolasas específicas para el metabolismo de ese glicano, glucósido, oligosacárido o fibra como sustrato. De esta manera, la actividad enzimática de la preparación bacteriana aislada puede ajustarse y potenciarse para mejorar la producción del glicano deseado. Por ejemplo, se genera un aislado celular que favorece la producción de enlaces alfa-1,6-glucosa cultivando la cepa deseada en oligosacáridos que contienen predominantemente enlaces alfa-1,6-glucosa tales como isomaltosa. El cultivo se establece con isomaltosa como única fuente de carbono hasta que la cepa alcanza una tasa de crecimiento que sugiere una regulación por incremento de las enzimas capaces de digerir la isomaltosa. Los aislados de este cultivo están enriquecidos en glicosidasas selectivas para la hidrólisis de alfa-1,6-glucosa. Este aislado enriquecido se usa entonces para producir glicanos mediante hidrólisis inversa. El glicano puede administrarse a un sujeto, por ejemplo, al intestino, para estimular selectivamente el crecimiento de un taxón bacteriano rico en alfa-1,6-glucosidasa.
En una segunda realización, la biomasa descrita en el ejemplo 9 se cultivó en un medio que contenía melibiosa (galactosa-alfa-1,6-glucosa) como única fuente de hidratos de carbono en lugar de glucosa, dando como resultado una biomasa con glucosil hidrolasas reguladas por disminución y galactosilhidrolasas reguladas por incremento. Luego se modificó el procedimiento descrito en el ejemplo 9 reemplazando la maltosa con 100 mg de melibiosa disueltos en 250 |il de tampón cítrico/fosfato pH 5,5. Luego se siguió el procedimiento de manera idéntica para crear oligómeros de alfa-galactosa en lugar de alfa-glucosa como se describe en el ejemplo 9.Ejemplo 11. Preparaciones de glicanos
A un matraz de fondo redondo equipado con un agitador superior y un condensador de recorrido corto con camisa se le añadió uno o más mono o disacáridos junto con el 3-20 % en peso seco de uno o más de los catalizadores, por ejemplo, catalizadores que contienen ácidos, iónicos, iónicos/ácidos tales como, por ejemplo, los descritos en las patentes estadounidense n.° 9.079.171 y el documento WO 2016/007778. Se añadió agua u otro disolvente compatible (de cero a 10 equivalentes) a la mezcla seca y la suspensión se combinó a aproximadamente 100 rpm usando una paleta dimensionada para coincidir lo más posible con los contornos del matraz de fondo redondo seleccionado. Entonces se calentó la mezcla hasta 80-185 °C. Una vez que los sólidos alcanzaron un estado fundido, el recipiente se colocó bajo una presión de vacío de 10-1000 mbar. Se agitó la reacción durante 30 minutos a 8 horas, eliminando constantemente el agua de la reacción. El progreso de la reacción se monitorizó mediante HPLC. Cuando se hubo producido suficiente oligomerización, se apagó el agitador, se enfrió la reacción hasta temperatura ambiente y se ventiló a presión atmosférica, y el producto, o bien como un sólido o bien como jarabe, se disolvió en un volumen de agua suficiente para crear una disolución de aproximadamente 50 Brix (gramos de azúcar por 100 g de disolución). Una vez completada la disolución, se eliminó el catalizador sólido mediante filtración y la disolución de oligómero se concentró hasta aproximadamente 50-75 Brix mediante evaporación rotatoria. En casos en los que se ha usado un disolvente orgánico, los disolventes inmiscibles en agua pueden eliminarse mediante extracción bifásica y los disolventes miscibles en agua pueden eliminarse mediante evaporación rotatoria concomitante con la etapa de concentración.
Entre otros, los siguientes glicanos se prepararon en múltiples lotes y se sometieron a prueba en diversos ensayos descritos en el presente documento:
Unidad de glicano única (homoglicanos): ara100, fru100, gal100, galA100, glcNac100, glu100, gluA100, Lglu100, man100, rha100, xyl10.
Dos unidades de glicano (heteroglicanos): Ara60Xyl40, Ara80Xyl20, Gal20Ara80, Gal20Xyl80, Gal40Ara60, Gal40Man60, Gal40Xyl60, Gal57Glu43, Gal60Ara40, Gal60Man40, Gal60Xyl40, Gal80Ara20, Gal80Man20, Gal80Xyl20, Glu20Ara80, Glu20Xyl80, Glu40Ara60, Glu40Gal60, Glu40Xyl60, Glu50Gal50, Glu50Lglu50, Glu60Ara40, Glu60Gal20Man20, Glu60Gal40, Glu60Man40, Glu60Xyl40, Glu66Fru33, Glu75Gala25, Glu75GluA25, Glu75GluN25, Glu80Ara20, Glu80Gal20, Glu80Lglu20, Glu80Man20, Glu80Xyl20, Glu90LGlu10, Man20Ara80, Man20Xyl80, Man40Ara60, Man40Xyl60, Man60Ara40, Man60Glu40, Man60Xyl40, Man75Gal25, Man80Ara20, Man80Gal20, Man80Glu21, Man80Xyl20, Xyl60Ara40, Xyl75Ara25, Xyl80Ara20, y los glicanos híbridos glu90sor10 y glu90gly10.
Tres unidades de glicano (heteroglicanos): Gal5Xyl5Ara90, Gal5Xyl90Ara5, Gal10Xyl10Ara80, Gal10Xyl45Ara45, Gal10Xy180Ara10, Gal20Xyl20Ara60, Gal20Xyl40Ara40, Gal20Xyl60Ara20, Gal30Xyl30Ara40, Gal30Xyl40Ara30, Gal33Man33Ara33, Gal33Man33Xyl33, Gal33Xyl33Ara33, Gal45Xyl10Ara45, Gal45Xyl45Ara10, Gal50Glu25Fru25, Gal40Xyl20Ara40, Gal40Xyl30Ara30, Gal40Xyl40Ara20, Gal60Xyl20Ara20, Gal80Xyl10Ara10, Gal90Xyl5Ara5, Glu5Gal5Man90, Glu5Gal90Man5, Glu5Xyl5Ara90, Glu5Xyl90Ara5, Glu10Gal10Man80, Glu10Gal45Man45, Glu10Gal80Man10, Glu10Xyl10Ara80, Glu10Xyl45Ara45, Glu10Xyl80Ara10, Glu20Gal20Man60, Glu20Gal40Man40, Glu20Gal60Man20, Glu20Gal80, Glu20Xyl20Ara60 Glu20Xyl40Ara40, Glu20Xyl60Ara20, Glu30Gal30Man40, Glu30Gal40Man30, Glu30Xyl30Ara40, Glu30Xyl40Ara30, Glu33Gal33Ara33, Glu33Gal33Fuc33, Glu33Gal33Man33, Glu33Gal33Xyl33, Glu33Man33Ara33 Glu33Man33Xyl33, Glu33Xyl33Ara33, Glu40Gal20Man40, Glu40Gal30Man30, Glu40Gal40Man20 Glu40Xyl20Ara40, Glu40Xyl30Ara30, Glu40Xyl40Ara20, Glu45Gal10Man45, Glu45Gal45Man10 Glu45Xyl10Ara45, Glu45Xyl45Ara10, Glu60Xyl20Ara20, Glu75GluNAc25, Glu80Gal10Man10 Glu80Xyl10Ara10, Glu90Gal5Man5, Glu90Xyl5Ara5, Man33Xyl33Ara33, Man52Glu29Gal19. Cuatro unidades de glicano (heteroglicanos): Gal25Man25Xyl25Ara25, Glu25Gal25Man25Ara25, Glu25Gal25Man25Xyl25, Glu25Gal25Xyl25Ara25, Glu25Man25Xyl25Ara25.
Cinco unidades de glicano (heteroglicanos): Glu20Gal20Man20Xyl20Ara20.
Los glicanos se describen mediante un código de tres a seis letras que representa el componente de azúcar monomérico seguido por un número entre cien que refleja el porcentaje del material que constituye el monómero. Por tanto, 'glu100' se atribuye a un glicano generado a partir de un aporte del 100 % de D-glucosa (unidad de glicano) y 'glu50gal50' se atribuye a un glicano generado a partir de un aporte del 50 % de D-glucosa y el 50 % de D-galactosa (unidades de glicano) o, alternativamente a partir de un aporte de dímero de lactosa (unidad de glicano). Tal como se usa en el presente documento: xyl = D-xilosa; ara = L-arabinosa; gal = D-galactosa; glu = D-glucosa; rha = L-ramnosa; fuc = L-fucosa; man = D-manosa; sor = D-sorbitol; gly = D-glicerol; neu = ácido NAcneuramínico; Lglu = L-glucosa; gluA = ácido D-glucurónico; gluN = D-glucosamina; gluNAc = N-acetil-D-glucosamina; galA = ácido D-galacturónico. 3-Bn = bencilo; 3-Obn = 3-benciloxi; 6-TBDPS = 6-tercbutildifenilsililo; galnac = N-acetil galactosamina; rib = D-ribosa; Sor = sorbitol.
Ejemplo 12. Purificación
Se disolvieron oligo y polisacáridos en agua desionizada hasta una concentración final de 25-50 Brix. Luego, el material se expuso a al menos 2 equivalentes de masa de resina de intercambio iónico Dowex Monosphere 88. La exposición puede producirse agitando un matraz a 120-170 rpm o mediante filtración a través de una columna empaquetada en suspensión húmeda siempre que el tiempo de residencia sea suficiente para que la disolución alcance un pH final de entre 3 y 5. La disolución de oligómero se aisló mediante filtración (como en el caso de reacciones agitadas) o elución (como en el caso de filtración en columna) y el proceso se repitió con resina de intercambio iónico Dowex Monosphere 77 de manera análoga hasta que el pH de la disolución estuvo por encima de 5,5. Finalmente, se expuso la disolución a la resina decolorante adsorbente Dowex Optipore s D-2 hasta que la disolución estuvo suficientemente clarificada y se filtró a través de un filtro de 0,2 micrómetros para eliminar la resina residual y los finos de resina. Entonces, se concentró la disolución final hasta 50-85 Brix mediante evaporación rotatoria o hasta un sólido mediante liofilización.
Ejemplo 13. Preparación de alto rendimiento a pequeña escala
Los oligómeros y polímeros se sintetizaron de forma paralela en placas de 24, 48 o 96 pocillos o en matrices de tamaño similar de viales de 1 dram alojados en bloques calefactores de aluminio. En este ejemplo, todas las transferencias de líquido se manejaron mediante robot programable o manualmente usando pipetas calibradas. A cada vial o pocillo se añadió el 20-100 % en peso seco de uno o más catalizadores, por ejemplo, catalizadores que contienen ácidos, catalizadores iónicos, catalizadores iónicos/catalizadores que contienen ácidos tales como, por ejemplo, los descritos en la patente estadounidense n.° 9.079.171 y el documento WO 2016/007778. La placa o bloque calefactor se colocó sin cubrir en un horno de vacío calentado a de 50 a 150 °C bajo un vacío de 10-800 mbar. La bomba de vacío del horno estaba protegida por un condensador de dos etapas que consistía en una trampa enfriadora de recirculación seguida de una trampa de hielo seco/acetona. Las placas o bloques se calientan durante de 30 minutos a 6 horas a temperatura elevada y presión reducida sin agitación. Después de un período de tiempo preestablecido, el horno se ventiló a presión atmosférica, las placas o bloques se enfriaron hasta temperatura ambiente y cada pocillo o vial se diluyó hasta aproximadamente 50 Brix con agua desionizada. Las etapas de extracción en fase sólida descritas en el ejemplo 12 se realizaron mediante elución a través de columnas secuenciales empaquetadas en húmedo en las que el eluyente de cada columna fluye inmediatamente hacia la parte superior de la siguiente columna a una velocidad de entre 2 y 6 volúmenes de lecho/hora usando una bomba peristáltica u otra bomba pequeña adecuada. Luego se enjuagó la pila de columnas con agua desionizada y los efluentes combinados se concentraron mediante liofilización para aislar polvos sólidos con un contenido de agua residual del 1-10 % en masa.
Ejemplo 14. Eliminación de especies de bajo peso molecular
Se modificaron oligómeros o polímeros para eliminar especies de bajo peso molecular.
En una realización, la separación se logró mediante separación osmótica. Se colocaron aproximadamente 45 cm de tubo de diálisis Biotech CE de MWCO de 1,0 kD (31 mm de ancho plano) de Spectrum Labs en agua desionizada y se remojó durante 10 minutos, luego se selló un extremo con una pinza de tubo de diálisis. Se esterilizó por filtración una disolución de 25 Brix de 8 gramos de oligosacárido seco y se selló en el tubo con una segunda pinza junto con unos pocos ml de aire para permitir que el tubo flotara. Luego se colocó el tubo lleno en un tanque de 3 galones de agua desionizada que se agitó con fuerza suficiente para inducir un remolino lento de los tubos sellados. Después de 8 horas, se reemplazó el agua del tanque y se dejó agitar el tubo durante 16 horas más. Una vez que se completó la diálisis y el material tenía un rendimiento de DP2+ superior al 95 % y un rendimiento de DP3+ superior al 90 %, la disolución diluida se esterilizó por filtración y se concentró a vacío hasta una concentración final de aproximadamente 65 Brix o se liofilizó hasta obtener un sólido con una humedad residual de entre el 1 y el 10%.
En una segunda realización, la separación se logró mediante filtración de flujo tangencial (TFF). En este caso, se colocaron 100 ml de una muestra de glicano de 25 Brix disuelta en agua desionizada y esterilizada por filtración en la botella de alimentación de un sistema TFF KrosFlo Research IIi de Spectrum Labs que se preparó de acuerdo con la recomendación del fabricante. Entonces, la muestra se sometió a diafiltración a través de un filtro de fibra hueca mPES MidiKros de 1 kD a una presión transmembrana de 25 psig. Se usaron muestras de HPLC de la materia prima tomadas cada 0,5 volúmenes de diafiltración para determinar cuándo el material tenía un rendimiento de DP2+ superior al 95 % y un rendimiento de DP3+ superior al 90 %, momento en el que la disolución se esterilizó por filtración y se concentró a vacío hasta un jarabe de 65 Brix o se liofilizó hasta un sólido con un contenido de agua residual del 1-10% en masa.
En una tercera realización, la separación se logró mediante precipitación con etanol. En este caso, se vertieron 100 ml de una muestra de glicano de 25 Brix en un vaso de precipitados agitado vigorosamente que contenía 900 ml de etanol puro de calidad USP a una velocidad no superior a 10 ml/minuto. Una vez completada la adición, los sólidos precipitados se sometieron a agitación durante 15 minutos adicionales a temperatura ambiente o ligeramente por debajo. Los sólidos precipitados se aislaron mediante filtración a través de un embudo de vidrio sinterizado de frita fina bajo una atmósfera de nitrógeno para evitar la hidratación y el engomado. Los sólidos se enjuagaron una vez con etanol, luego se disolvieron en agua hasta una concentración final de 25 Brix y se reconcentraron hasta >65 Brix. A continuación, este jarabe se diluyó nuevamente hasta 25 Brix y se concentró una vez más para garantizar la eliminación del etanol residual.
Ejemplo 15. Métodos para analizar preparaciones.
Medición de la concentración por refractometría de líquidos
Este experimento se diseñó para cuantificar la cantidad de glicano en cualquier disolución acuosa dada. Se calibró un refractómetro de azúcar portátil Mettler-Toledo Refracto 30GS usando agua desionizada de ósmosis inversa de alta pureza. Se filtraron varias gotas de la disolución de glicano a través de un filtro de jeringa de 0,2 micrómetros directamente sobre la lente del refractómetro. La medición se tomó a temperatura ambiente y se notificó como Brix. Los glicanos se concentraron rutinariamente hasta 50, 60, 70 o 75 Brix sin solidificación ni cristalización obvia a 23 °C. Luego, los grados Brix pueden convertirse en solubilidad suponiendo una densidad específica del agua igual a 1,0 g/ml. Por tanto, 75 Brix (100 gramos de disolución que consiste en 75 gramos de glicano y 25 gramos de agua) equivalen a una solubilidad acuosa de 3,0 g/ml. A modo de comparación, Sigma-Aldrich notifica que la solubilidad acuosa de la D-glucosa es de 0,909 g/ml (48 Brix) a 25 °C.
Composición monomérica por hidrólisis y GC-EM.
Este experimento se diseñó para cuantificar la razón de contenido de monómero dentro de un oligosacárido dado. El análisis de la composición de glicosilo se realizó mediante cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC/EM) combinada de los derivados de per-O-trimetilsililo (TMS) de los metilglicósidos de monosacáridos producidos a partir de la muestra mediante metanólisis ácida tal como describieron anteriormente Santanderet al.(2013) Microbiology 159:1471. Se liofilizaron entre 100 y 200 |ig de muestra en un tubo de ensayo adecuado. Se añadió inositol (20 |ig) a la muestra como patrón interno y luego la muestra se calentó hasta 80 °C en HCl 1 M/metanol durante 18 horas. Entonces, los monosacáridos resultantes volvieron a acetilarse usando piridina y anhídrido acético en MeOH, y se per-O-trimetilsililaron con Tri-Sil (Pierce) a 80 °C durante 30 minutos. El análisis GC/EM de los metilglicósidos de TMS se realizó en un instrumento de GC Agilent 7890A interconectado a un instrumento MSD 5975C, usando una columna capilar de sílice fundida Supelco Equity-1 (30 mx 0,25 mm de DI). Cada pico se asignó a un componente de azúcar basándose en la comparación con patrones conocidos y la integración de los picos respectivos permitió un cálculo limpio del porcentaje relativo de monómeros dentro de un glicano ejemplificado. En todos los glicanos enumerados, pueden identificarse de forma rutinaria condiciones en las que la composición de monómeros de un oligosacárido determinado coincidió con la razón de entrada dentro del error experimental y la composición de salida coincidió con la composición de entrada dentro de la precisión de la medición.
Distribución de peso molecular mediante cromatografía de exclusión molecular (SEC)
Este experimento se diseñó para cuantificar la distribución de pesos moleculares dentro de un oligosacárido determinado. La medición se realizó mediante HPLC usando el método descrito en Monografía de la Farmacopea de los Estados Unidos, 38(6) Revisión en proceso: Heparina Sódica (USP37-NF32). Las separaciones se lograron en un sistema HPLC Agilent 1200 por medio de una columna GE superpuesta 12 usando acetato de amonio 50 mM como eluyente a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min y un detector ELSD. La temperatura de la columna se ajustó a 30 °C y se usó dextrano (1 kD, 5 kD, 10 kD de peso) para dibujar una curva patrón. Se preparó una disolución de 2 mg/ml de las muestras y se hizo pasar a través de un filtro giratorio de 0,45 |im, seguido de inyecciones de 40 |il en la HPLC. Se construyó una curva polinómica de tercer orden basándose en los pesos moleculares logarítmicos y los volúmenes de elución de los patrones enumerados. Se calcularon el peso molecular promedio en peso (Mw), el peso molecular promedio en número (Mn) y el índice de polidispersidad (PDI) para la muestra mediante comparación con la curva patrón. La figura 1 muestra la curva generada durante la evaluación por SEC de una muestra de glu100 en la que se determinó que el peso molecular promedio era de 1212 g/mol o aproximadamente DP7. Se determinó que el extremo superior del peso molecular del material definido por el punto de la curva al 10 % de la absorción máxima que encabeza la curva era de 4559 g/mol o aproximadamente DP28. Se determinó que el extremo inferior del peso molecular del material definido por el 10% de la absorción máxima detrás de la curva era de 200 g/mol o aproximadamente DP1. Un análisis similar de una muestra de glu50gal50 mostró un PM, una masa alta y una masa baja de 1195 g/mol (~DP7), 4331 g/mol (-DP27) y 221 g/mol (~DP1) respectivamente.
Distribución de peso molecular mediante cromatografía de afinidad iónica (IAC)
La proporción de glicano con DP mayor o igual a 2 (DP2+) y 3 (DP3+) puede medirse mediante cromatografía de afinidad iónica. Se diluyó una muestra de glicano hasta 50-100 mg/ml y se inyectaron 10 |il de esta disolución en un instrumento de HPLC Agilent 1260 BioPure equipado con una columna BioRad Aminex HPX-42A de 7,8 x 300 mm y un detector de RI. Usando agua pura de calidad para HPLC como eluyente, se eluyó la muestra a 0,6 ml/min a través de una columna de 80 °C y un detector de RI mantenido a 50 °C. Los picos que representan DP1-6 se asignan mediante comparación con patrones de referencia y se integran usando el software Agilent ChemStation. Los picos normalmente se integran como DP1, DP2, DP3, DP4-7 y DP8+. El DP que puede lograrse mediante la reacción descrita en el Ejemplo 11 varía de un monómero a otro, aunque es constante entre lotes si se sigue el procedimiento. Por ejemplo, en 17 lotes de glu100, los valores de DP2+ oscilaron entre el 77 93 % y los valores de DP3+ oscilaron entre el 80-90 %. Por el contrario, en 6 lotes de ara100, los valores de DP2+ oscilaron entre el 63-78 % y los valores de DP3+ oscilaron entre el 48 -71 %. Las mezclas de monómeros se comportaron como promedios de los componentes individuales.
Distribución alfa/beta por RMN 2D
Este experimento se diseñó para cuantificar la razón de enlaces glicosídicos alfa y beta dentro de una muestra dada mediante RMN bidimensional. Se secaron aproximadamente 150 mg de disolución de oligosacárido de 65 Brix hasta obtener una masa estable en una estufa de vacío a 45-95 °C bajo una presión de 400 mbar. La muestra se sometió a dos ciclos de disolución en D2O y secado para eliminar el H2O residual. Una vez seca, la muestra se disolvió en 750 |il de D2O con acetona al 0,1%, se colocó en un tubo de RMN de 3 mm y se analizó en un instrumento Bruker Avance-III que funciona a 500,13 MHz 1H (125,77 MHz 13 C) equipado con una sonda Bruker BBFO que funciona a 21,1 °C. La muestra se analizó usando una secuencia de pulsos de coherencia cuántica única heteroatómica (HSQC) usando la secuencia de pulsos estándar de Bruker. Los protones anoméricos entre 4-6 ppm (1H) y 80-120 ppm (13C) se asignaron por analogía a la glucosa tal como se notifica en Roslundet al.(2008) Carbohydrate Res. 343:101-112. Los espectros se referenciaron a la señal interna de acetona: 1H - 2,22 ppm; 13°C - 30,8 ppm. Los isómeros se cuantificaron mediante la integración de sus respectivos picos usando el paquete de software MNova de Mestrelab Research (Santiago de Compostela, España). La figura 2 muestra la región anomérica de un espectro representativo. Se han analizado más de 300 muestras de esta manera y la tabla 29 enumera la distribución en una muestra de combinaciones de monómeros que muestran que la razón alfa/beta es tan alta como 4:1 como en el caso de rha100 y tan baja como 1:1 como en el caso de glu50gal50.
Tabla 29: Distribución de enlaces alfa y beta a través de lotes y tipos de glicanos
Este experimento fue diseñado para identificar la composición de un glicano mediante la identificación por RMN 2D de los monómeros constituyentes. Se secaron aproximadamente 150 mg de disolución de oligosacárido de 65 Brix hasta obtener una masa estable en una estufa de vacío a 45-95 °C bajo una presión de 400 mbar. La muestra se sometió a dos ciclos de disolución en D2O y secado para eliminar el H2O residual. Una vez seca, la muestra se disolvió en 750 |il de D2O con acetona al 0,1%, se colocó en un tubo de RMN de 3 mm y se analizó en un instrumento Bruker Avance-III que funciona a 500,13 MHz 1H (125,77 MHz 13 C) equipado con una sonda Bruker BBFO que funciona a 70 °C. La muestra se analizó usando una secuencia de pulsos de coherencia cuántica única heteroatómica (HSQC) usando la secuencia de pulsos estándar de Bruker. Luego se examinó la región anomérica de cada espectro de glicano derivado de un único monómero de azúcar en busca de picos que representaran enlaces glicosídicos específicos característicos de ese monómero. Para cualquier glicano determinado, los espectros HSQC permiten la identificación de picos que son únicos de la disposición regio y estereoquímica de los enlaces. Por ejemplo, la figura 5 muestra una asignación parcial de los espectros de una preparación de glu100 que demuestra cómo estos picos pueden usarse para identificar regio y estereoquímicas glicosídicas específicas. Debido a la naturaleza de espín aislado de los anillos de hidratos de carbono individuales dentro de los polisacáridos, se predice que los espectros HSQC de un glicano con más de un monómero estarán representados por la suma de los picos HSQC de cada uno de sus azúcares constituyentes. Por tanto, cada monómero constituyente tiene picos de HSQC únicos que aparecerán en cualquier glicano que contenga ese monómero independientemente de otros monómeros constituyentes y, además, los monómeros usados para sintetizar un glicano pueden determinaser identificando los picos de huellas dactilares únicos para cada monómero constituyente. Por ejemplo, la figura 3B muestra que el espectro HSQC de glu50gal50 es un híbrido de los espectros de glu100 (figura 3A) y gal100 (figura 3C). La tabla 30 enumera los picos de huellas dactilares para unidades de glicano seleccionadas.
Tabla 30: Picos de HSQC de diagnóstico para cada azúcar componente.
Aparecieron al menos 5 picos para cada unidad de glicano usada como material de partida en la síntesis de glicanos que contienen 3 o menos unidades de glicano distintas. Los espectros HSQC de glicanos que contienen 4 o más unidades de glicano distintas tienen al menos 4 picos para cada unidad de glicano constituyente.
Las figuras 6A y 6B muestran los espectros de HSQC para man 100 y xyl 100, respectivamente.
Análisis de uniones glicosídicas
Este experimento se diseñó para cuantificar la distribución de regioisómeros glicosídicos (ramificación) dentro de un oligosacárido dado. Para el análisis de la unión glicosilo, las muestras se permetilaron, se despolimerizaron, se redujeron y se acetilaron; y los acetatos de alditol parcialmente metilados (PMAA) resultantes se analizaron mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-EM) tal como describen Heisset al(2009) Carbohydr. Res. 344:915. Las muestras se suspendieron en 200 |il de dimetilsulfóxido y se dejaron agitar durante 1 día. La permetilación se vio afectada por dos rondas de tratamiento con hidróxido de sodio (15 min) y yoduro de metilo (45 min). La disolución acuosa se hidrolizó mediante la adición de ácido trifluoroacético 2 M y calentando hasta 121 °C durante 2 horas. Los sólidos se asilaron a vacío y se acetilaron en ácido acético/ácido trifluoroacético. Los PMAA resultantes se analizaron en un instrumento de GC Agilent 7890A conectado a un instrumento MSD 5975C (detector selectivo de masa, modo de ionización por impacto de electrones); la separación se realizó en una columna capilar de sílice fundida de fase unida Supelco SP-2331 de 30 m. La figura 4 muestra tres espectros de GC representativos de este análisis. Estos análisis muestran que los glicanos tenían al menos el 0,1 %, 0,2 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 5 %, 10 % o más del tipo de enlace 1,2-glicósido, por ejemplo, ara100 = 3,8%, gal 100 = 7,2%; al menos el 0,1 %, 0,2 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 5 %, 10 % o más del tipo de enlace 1,3-glicósido, por ejemplo, 3-bn-glu100 = 1,7 %, glu50gal50 = 10,4 %; al menos el 0,1 %, 0,2 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 5 %, 10 % o más del tipo de enlace 1,4-glicósido, por ejemplo, glu50gal50 = 5,9 %, gal33man33ara33 = 10,1%; y al menos el 0,1 %, 0,2 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 % o más del tipo de enlace 1,6-glicosídico, por ejemplo, gal33man33ara33 = 13,4 %, glu100 = 25,4 %. Los materiales también contenían al menos el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 % o más de los tipos de enlaces ramificados (incluidos, pero sin limitarse a, 1,3,6-; 1,4,6-; o 1,2,4-glicósidos, por ejemplo, tabla 31), un grado de ramificación (DB) de al menos 0,05. El grado de ramificación se define como el número promedio de monómeros ramificados en relación con el número total de unidades de monómero. Por ejemplo, un polímero de glicano glu100 en el que el 20 % de las unidades de monómero de glucosa contienen uniones glicosídicas a tres o más monómeros de glucosa tendría un DB de 0,20. Los glicanos también tienen aproximadamente un 3-12 % de las unidades monoméricas en forma de furanosa. Un glicano que se origina de un único monómero consistía en al menos 12 patrones de sustitución no terminales distintos. Un glicano que se origina de dos monómeros consistía en al menos 18 patrones de sustitución no terminales distintos, por ejemplo, glu-1,2-glu; glu-1,2-gal; gal-1,2-glu; gal-1,2-gal; glu-1,2(glu),6-glu; glu-1,3-glu; glu-1,3-gal; etc. Un glicano que se origina de tres o más monómeros consistía en al menos 24 patrones de sustitución no terminales distintos.
preparaciones di erentes caracterizadas tal como se describe en el presente documento.
Electroforesis de hidratos de carbono asistida por fluorescencia (FACE)
Este experimento se diseñó para cuantificar el peso molecular de los glicanos dentro de un oligosacárido dado en los casos en que la señal de fondo (por ejemplo, material de un cultivo bacteriano, enzimas residuales, tampones, etc.) interfiere con las técnicas de<s>E<c>tradicionales. El glicano seleccionado se marcó con un tinte polianiónico tal como ácido 8-aminopiren-1,3,6-trisulfónico (APTS) o ácido 8-aminonaftaleno-1,3,6-trisulfónico (ANTS) y se separó mediante electroforesis en gel. Los glicanos seleccionados se diluyeron hasta 100 mg/ml en agua y se diluyeron 5 |il de esta disolución hasta 1,00 ml para obtener una concentración de disolución final de 0,5 |ig/|il. A 10 nmol de glicano secado a vacío durante 3 h se le añadieron 2 |il de APTS o ANTS 0,1 M, 2 |il de NaCNBH31 M en THF y 2 |il de ácido cítrico 1,7 M y la mezcla se mantuvo a 70 °C durante 2 h. Las disoluciones marcadas se diluyeron con 94 |il de agua y posteriormente se mezclaron 4 |il de esta disolución de glicano marcada con 1 |il de glicerol al 40 % en agua y se cargaron sobre un gel prefabricado de poliacrilamida al 20 % (Life-Technologies). La electroforesis se realizó durante 5 min a 100 V y luego a 400 V durante 40 min a 4 °C. Se trataron maltodextrina y pululano 12.000 de la misma manera y se usados como patrones en cada gel. Los geles se visualizaron con un instrumento Bio-Rad Gel Doc EZ Imager usando el paquete de software Bio-Rad Image Lab 3.0. Las imágenes capturadas con el software de Bio-Rad se procesaron usando el software GE ImageQuant TL 8.1.
Las condiciones de reacción pueden ajustarse como se describe en el presente documento para lograr un grado de polimerización medio, grado de ramificación y distribución de enlaces glicosídicos deseados para generar preparaciones de glicano que sean eficaces para modular la producción o el nivel de un metabolito cuando se administra, por ejemplo, al intestino de un sujeto, y son sustratos de una enzima glicosídica (por ejemplo, una enzima glicosidasa que está presente en un microbio intestinal humano) y, si así se desea, el microbio intestinal humano es uno de los glicotaxones seleccionados de clase 1, clase 2, clase 3, clase 4, clase 5, clase 6 o clase 7, tal como se describe en el presente documento.
Ejemplo 16. Purificación de preparaciones de polímeros de glicano mediante cromatografía de intercambio iónico
Si así se desea, cualquier glicano generado tal como se describe en el presente documento se purifica mediante cromatografía de intercambio iónico. Se sintetizaron oligo y polisacáridos y se disolvieron en agua desionizada hasta una concentración final de 25-50 Brix. Entonces, el material se expuso a al menos 2 equivalentes de masa de resina de intercambio iónico Dowex Monosphere 88. La exposición puede producirse agitando un matraz a 120-170 rpm o mediante filtración a través de una columna empaquetada en suspensión húmeda con suficiente tiempo de residencia para que la disolución alcance un pH final de entre 3 y 5. La disolución de oligómero se aisló mediante filtración (como en el caso de reacciones agitadas) o elución (como en el caso de filtración en columna) y el proceso se repitió con resina de intercambio iónico Dowex Monosphere 77 de manera análoga hasta que el pH de la disolución estuvo por encima de 5,5. Finalmente, la disolución se expuso a la resina decolorante Adsorbente Dowex Optipore SD-2 hasta que la solución estuvo suficientemente clarificada y se filtró a través de un filtro estéril de 0,2 micrómetros para eliminar los sólidos residuales y los posibles contaminantes microbiológicos. Los glicanos aislados de reacciones de materia celular pueden purificarse adicionalmente mediante centrifugación, cromatografía en gel, ultrafiltración o diálisis, precipitación u otros métodos bien conocidos para eliminar la materia celular residual.
Ejemplo 17. Fraccionamiento de preparaciones de polímeros de glicano mediante cromatografía de carbón activado
Si así se desea, cualquier glicano generado tal como se describe en el presente documento se fracciona mediante cromatografía de carbón activado. Se sintetizaron oligo y polisacáridos y se fraccionaron en grupos de peso molecular diferencial mediante cromatografía sobre carbón activado. Se agitaron 500 mg de una disolución acuosa de glicano de 40-60 Brix y 6 g de carbón activado (glicano:carbón = 1:12, p/p) en 100 ml de una disolución de etanol/agua al 1 % v/v. La mezcla se agitó a 300 rpm en un vaso de precipitados de 250 ml a temperatura ambiente durante 3 h y se filtró a vacío a través de una frita de vidrio gruesa precargada con 6 g de celite 545 (Acros Organics). El carbón y la celite se mezclaron finamente y se cargaron en un cartucho Biotage Samplet vacío de 20 ml. La salida del cartucho se conectó a la entrada de un segundo cartucho Biotage Samplet de 20 ml precargado con 8 g de mezcla de carbón/celite (1:1, p/p). Entonces, se hicieron pasar 100 ml de concentraciones crecientes de eluyentes de etanol/agua (el 0 %, 1 %, 3 %, 5 %, 7 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 % , 50 %, v/v) a través de la columna de cartucho a una velocidad de flujo de 3,7 ml/min usando una bomba peristáltica Masterflex para desorber las fracciones de glicano. Se recogieron 100 ml de eluato para cada fracción y se secaron a vacío.
En una realización, se usó este proceso para eliminar sólo azúcares monoméricos del glicano. En esta realización, el carbón se lavó con etanol acuoso al 1 % hasta que el monómero ya no eluyó de la columna. Luego se lavó el carbón con etanol acuoso al 50 % para eliminar todo el glicano residual tal como se muestra en la figura 11.
En una segunda realización, se usó este proceso para dividir el glicano en múltiples grupos de peso molecular promedio creciente. En esta realización, el carbón se lavó secuencialmente con eluyentes de proporción creciente de etanol (por ejemplo, el 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 20 %, 50 %). Se recogieron fracciones de peso molecular creciente a medida que aumentaba la fracción de etanol en el eluyente.
Ejemplo 18. Eliminación de materiales monoméricos y diméricos mediante fermentación de levaduraSi así se desea, de cualquier glicano generado tal como se describe en el presente documento se eliminan sus materiales monoméricos y diméricos mediante fermentación de levadura. Se sintetizaron oligo y polisacáridos y se purificaron para eliminar especies monoméricas y algunas especies diméricas mediante fermentación con un cultivo de levadura. Este procedimiento está destinado principalmente a eliminar materiales que pueden ser digeribles por el metabolismo del huésped para enriquecer la abundancia de glicanos que están disponibles exclusivamente para la fermentación bacteriana. Se hinchó levadura de pan (2 g, levadura de Fleischmann, Fenton, MO) en 10 ml de agua desionizada durante 1-16 h a 4 °C. Se disolvió alginato de sodio (2,5 g) en 100 ml de agua desionizada caliente agitando a -300 rpm durante 1 h en una placa de agitación caliente mantenida a -80 °C. El volumen final de disolución de alginato de sodio se ajustó a 100 ml con agua desionizada. Después de que la temperatura de la disolución de alginato se enfriara hasta -30 °C, la suspensión de levadura se mezcló con la disolución de alginato a -100 rpm durante 10 minutos. La mezcla se transfirió a una jeringa de 15 ml equipada con una aguja de calibre 21 y se añadió lentamente gota a gota a una disolución de cloruro de calcio al 4 % (Sigma) sin agitar en un matraz Erlenmeyer de 200 ml para formar perlas de alginato con levadura inmovilizada. Entonces, las perlas se mantuvieron a 4 °C durante 1 h para que solidificaran y se lavaron al menos 5 veces con agua para eliminar el cloruro de calcio. Esta reserva de perlas de levadura se mantuvo a 4 °C en agua durante no más de 1 semana. Las perlas de levadura se añadieron a disoluciones de glicano de 20 Brix a 37 °C durante 24 h con una razón de -6 ml de perlas por 25 ml de disolución de glicano. Las perlas gastadas se reemplazaron por perlas nuevas y se incubaron durante otras 39 h. La progresión de la eliminación de monosacáridos se monitorizó mediante SEC-HPLC. Se aplicó una segunda reposición de perlas para las muestras que requerían una eliminación adicional de monosacáridos. Después del tratamiento con levadura, las disoluciones de glicano se filtraron a través de un filtro estéril de 0,2 |im y se hicieron pasar a través de columnas de intercambio iónico tal como se describe en el ejemplo 16. Los filtrados se recogieron y se concentraron a vacío. Toda la galactosa y glucosa monoméricas se eliminaron de los glicanos usando este método. Algunos materiales diméricos (por ejemplo, maltosa, lactosa) podrían eliminarse usando este método, aunque algunos dímeros eran resistentes a la fermentación (por ejemplo, melibiosa, alolactosa). Las figuras 7A-7B muestran un glicano derivado de maltosa antes y después de una fermentación de levadura.
Se seleccionó levadura de pan (levadura de Fleischmann, Fenton, MO) para purificar glicanos preparados a partir de maltosa, sacarosa, palatinosa, celobiosa, melecitosa y melibiosa. Se seleccionóKluyveromyces marxianus(ATCC 46537) para purificar glicanos preparados a partir de rafinosa, gentiobiosa, lactosa y lactulosa. Se prepararon perlas deKluyveromyces marxianusde manera análoga, excepto porque la suspensión de levadura se preparó mezclando 10 g de levadura recién cultivada con 2,5 ml de agua.
Ejemplo 19. Ensayos de crecimiento de cepa única para evaluar los efectos de glicanos con bajo DPSe realizó un ensayoin vitropara evaluar la capacidad de diversas cepas bacterianas, incluidos comensales y patógenos del tracto gastrointestinal, para utilizar glicanos sintetizados enzimáticamente (es decir, polímeros de glicanos) y los azúcares de los que se derivaron como sustratos de crecimiento. El ensayo se diseñó para determinar si los glicanos sintetizados enzimáticamente difieren de los azúcares de los que se derivan en cómo de bien apoyan el crecimiento de miembros bacterianos potencialmente beneficiosos o dañinos del microbioma humano. Las cepas bacterianas se manipularon en todas las etapas en una cámara anaerobia (AS-580, Anaerobe Systems) con un catalizador de paladio. Inicialmente, la cámara se hizo anaerobia purgándola con una mezcla de gases anaerobia del 5 % de hidrógeno, el 5 % de dióxido de carbono y el 90 % de nitrógeno y posteriormente se mantuvo en un estado anaerobio usando esta misma mezcla de gases anaerobia. La anaerobicidad de la cámara se confirmó diariamente usando tiras indicadoras anaerobias Oxoid que cambian de color en presencia de oxígeno. Todos los medios de cultivo, placas de ensayo, otros reactivos y consumibles de plástico se redujeron previamente en la cámara anaerobia durante al menos 24-48 horas antes del contacto con las bacterias. Se esterilizaron por filtración los glicanos lacto-oligo, melib-oligo, malto-oligo, sucro-oligo, raffinooligo y lactulo-oligo sintetizados enzimáticamente y los azúcares de los que se derivaron, lactosa, melibiosa, maltosa, sacarosa, rafinosa y lactulosa, se prepararon al 5 % p/v en agua estéril y se añadieron a placas de ensayo Costar 3370 para una concentración final del 0,5 % p/v en el ensayo, con cada glicano analizado en tres pocillos no adyacentes y dextrosa y agua suministradas como controles positivo y negativo.
Se obtuvieron aislados bacterianos de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) y del Instituto Leibniz DSMZ-Instituto Alemán de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ). Se cultivaron cultivos de los BacteroidetesBacteroides thetaiotaomicronATCC 29741 “BTH.8” yParabacteroides distasonisATCC 8503 “PDI.6”; los clostridialesClostridium scindensATCC 35704 “CSC.32”,Dorea formicigeneransATCC 27755 “DFO.36”,dorea longicatenaDSM 13814 “DLO.76” yBlautia hanseniiATCC 27752 “BHA.20” de manera anaerobia en caldo de glucosa de carne picada (CMG, Anaerobe Systems), un medio enriquecido previamente reducido que incluye carne picada magra, digesto enzimático de caseína, extracto de levadura, fosfato de potasio, dextrosa, cisteína, hemina y vitamina K1, durante 18-48 horas a 37 °C. Se prepararon inóculos determinando la densidad óptica de cada cultivo a 600 nM (DO600) en una placa de ensayo de fondo plano de 96 pocillos de poliestireno Costar 3370 usando un lector de placas Biotek Synergy 2 con el software lector de microplacas todo en uno Gen52.0 según el protocolo del fabricante y diluyendo las células hasta DO6000,01 final en medios definidos y semidefinidos que se prepararon sin azúcares. Se sometieron a prueba aislados deD. formicigenerans, P. distasonis, B. hanseniiyD. longicatenaen cloruro de sodio 900 ml/l, cloruro de calcio dihidratado 26 ml/l, cloruro de magnesio hexahidratado 20 ml/l, cloruro de manganeso tetrahidratado 10 ml/l, sulfato de amonio 40 ml/l, sulfato de hierro heptahidratado 4 ml/l, cloruro de cobalto hexahidratado 1 ml/l, fosfato de potasio dibásico 300 ml/l, fosfato de sodio dibásico 1,5 g/l, bicarbonato de sodio 5 g/l, biotina 0,125 ml/l, piridoxina 1 ml/l, pantotenato 1 m/l, histidina 75 ml/l, glicina 75 ml/l, triptófano 75 ml/l, arginina 150 ml/l, metionina 150 ml/l, treonina 150 ml/l, valina 225 ml/l, isoleucina 225 ml/l, leucina 300 mg/l, cisteína 400 ml/l y prolina 450 ml/l (Theriot CMet al.Nat Commun. 2014; 5:3114), complementado con el 0-10% (v/v) de CMG. Se sometió a pruebaB. thetaiotaomicronen tampón fosfato de potasio 100 mM (pH 7,2), cloruro de sodio 15 mM, sulfato de amonio 8,5 mM, L-cisteína 4 mM, hematina 1,9 |iM, L-histidina 200 |iM, cloruro de magnesio 100 |iM, sulfato de hierro heptahidratado 1,4 |iM, cloruro de calcio 50 |iM, vitamina K31 |ig/mk y vitamina B125 ng/ml (Martens ECet al.Cell Host & Microbe 2008; 4, 447-457). Se sometió a pruebaC. scindensen triptona peptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, clorhidrato de L-cisteína 0,5 g/l, tampón fosfato de potasio 0,1 M, pH 7,2, vitamina K3 1 |ig/ml, cloruro de calcio al 0,08 % p/v, sulfato de hierro heptahidratado 0,4 |ig/ml, resazurina 1 |ig/ml, hematina 1,2 |ig/ml, histidina 0,2 mM, Tween 80 al 0,05 %, extracto de carne al 0,5 % (Sigma), suplemento de oligoelementos al 1 % (ATCC), suplemento vitamínico al 1 % (ATCC), ácido acético al 0,017 % v/v, ácido isovalérico al 0,001 % v/v, ácido propiónico al 0,2 % v/v y ácido N-butírico al 0,2 % v/v (Romano KAet al.mBio 2015; 6(2): e02481-14). Las bacterias se expusieron a los glicanos lacto-oligo, melib-oligo, malto-oligo, sucrooligo, raffino-oligo y lactulo-oligo sintetizados enzimáticamente y a los azúcares lactosa, melibiosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, lactulosa y dextrosa a una concentración final del 0,5% p/v en microplacas de 96 pocillos, 200 |il de volumen final por pocillo, a 37 °C durante 18-48 horas, de manera anaerobia. Se obtuvieron mediciones de DO600 para cada aislado al final del período de incubación usando un lector Biotek Synergy2 con el software Gen52.0 según las especificaciones del fabricante. Las mediciones para cada cepa se blanquearon restando el valor promedio de DO600 de la cepa en ausencia de glicano o azúcar. La tabla 8 y los tres párrafos siguientes resumen los resultados obtenidos.
Tabla 8. Crecimiento de comensales intestinales sobre azúcares y glicanos sintetizados enzimáticamente
Algunos glicanos sintetizados enzimáticamente soportan diferentes niveles de crecimiento de bacterias comensales intestinales en el ensayo que los azúcares de los que se derivan. Como se observa en la tabla 8, raffino-oligo apoyó un mayor crecimiento que la rafinosa de los FirmicutesD. formicigenerans, C. scindens, D. longicatenatB. hanseniiy el BacteroideteB. thetaiotaomicronen el ensayo. Lactulo-oligo apoyó un mayor crecimiento que la lactulosa deD. formicigenerans, C. scindens, P. distasonis, B. thetaiotaomicronyD. longicatenaen el ensayo, mientras queB. hanseniicreció menos bien sobre lactulo-oligo que sobre lactulosa en el ensayo. En el ensayo, sucro-oligo apoyó un mayor crecimiento de D.formicigenerans, P. distasonisyB. hanseniique la sacarosa y un menor crecimiento deB. thetaiotaomicronyD. longicatenaque la sacarosa. Los glicanos sintetizados enzimáticamente también difieren en la cantidad de crecimiento que apoyan entre las cepas bacterianas del ensayo. En el ensayo, raffino-oligo apoyó altos niveles de crecimiento deP. distasonis, B. thetaiotaomicron y B. hanseniicon valores de DO600 superiores a 0,7, niveles moderados de crecimiento deD. formicigeneranscon valores de DO600 de entre 0,3 y 0,7, y un menor nivel de crecimiento de C.scindensyD. longicatenacon valores de DO600 de entre 0,1 y 0,3.
En el ensayo, algunos glicanos sintetizados enzimáticamente también soportan niveles diferentes de crecimiento de patógenos entéricos que los azúcares de los que se derivan. Sucro-oligo apoyó menos de la mitad del crecimiento de S.enterica, E. faeciumyC. difficileque la sacarosa en el ensayo, mientras que rafino-oligo apoyó un mayor crecimiento de estos patógenos que la rafinosa. Lactulo-oligo y lactulosa apoyaron niveles de crecimiento similares de estos patógenos en el ensayo.
Algunos glicanos sintetizados enzimáticamente soportan niveles de crecimiento bacteriano en el ensayo similares a los azúcares de los que se derivan. En el ensayo, los comensales bacterianosD. formicigenerans, D.
longicatena, B. hansenii, C. scindens, P. distasonisyB. thetaiotaomicroncrecieron a niveles similares, con densidades ópticas que difieren en un 20 % o menos, en lacto-oligo y lactosa, melib-oligo y melibiosa, y maltooligo y maltosa. Los patógenos entéricos S.entérica, E. faeciumyC. difficiletambién crecieron a niveles aproximadamente similares en el ensayo de melib-oligo y melibiosa, malto-oligo y maltosa, y lacto-oligo y lactosa, con la excepción de C.difícilsobre lacto-oligo y lactosa, para los cuales hubo una diferencia de crecimiento del 30 %.
Las diferencias observadas en el ensayo entre la actividad de los glicanos sintetizados enzimáticamente y los azúcares de los que se derivan con respecto a las cepas bacterianas que soportan y el nivel de crecimiento que soportan para diversas cepas bacterianas sugieren que un glicano sintetizado enzimáticamente puede administrarse para apoyar diferencialmente uno o más microbios beneficiososin vivopara beneficio terapéutico. Por ejemplo,C. scindensse ha asociado con la protección contra la diarrea asociada aC. difficile(Buffieet al,Nature 2015). La administración de un glicano sintetizado enzimáticamente que promueve selectivamente el crecimiento de C.scindenspuede estimular el crecimiento deC. scindens in vivoy, por tanto, ser beneficioso en la profilaxis o el tratamiento de la diarrea asociada aC. difficile.
Ejemplo 20. Perfiles de glicosidasa y utilización de azúcar de productores de metabolitos seleccionados
Vincular las funciones metabólicas codificadas por bacterias intestinales con genes de utilización de hidratos de carbono tiene el potencial de examenin silicode preparaciones de polímeros de glicano para detectar enfermedades humanas vinculadas a metabolitos específicos. Sin embargo, se ha demostrado que muchas funciones metabólicas son polifiléticas y, por tanto, la secuenciación del gen de ARNr 16S no es un método de análisis adecuado (Vitalet al.,2014, Martinez del Campoet al.,2015). Con el fin de superar este desafío, pueden utilizarse análisis genómicos y metagenómicos para analizar directamente los genes implicados en la síntesis de metabolitos y vincular estos genes a la utilización de hidratos de carbono a través de genomas secuenciados.
La base de datos Carbohydrate-Active enZYmes (CAZy; http://www.cazy.org/) describe familias de enzimas con módulos catalíticos o de unión a hidratos de carbono para enzimas que degradan, modifican o crean enlaces glicosídicos. Las glucósido hidrolasas (GH) y glicosiltransferasas (GT) son enzimas importantes para la utilización de hidratos de carbono en el microbioma intestinal. Las familias CAZy están ampliamente distribuidas filogenéticamente (Kaoutariet al.,2013).
En este análisis, se utilizaron un total de 439 genomas secuenciados aislados del tracto gastrointestinal como parte del Proyecto Microbioma Humano (http://hmpdacc.org/reference_genomes/reference_genomes.php). Todos los genomas se anotaron usando la base de datos Carbohydrate-Active enZYmes (CAZy; http://www.cazy.org/) usando USEARCH v8 y la opción -usearch_global, lo que requiere un 90 % de identidad global con la proteína objetivo. Además, todos los genomas se anotaron por su implicación prevista en 1) la producción de butirato, 2) la conversión de colina en TMA a través de TMA-liasa y 3) la conversión de urea en amoníaco. Para la producción de butirato, la anotación se centró en la ruta de acetil-CoA, la ruta más abundante codificada en el microbioma intestinal (Vitalet al.,2014). Con el fin de predecir la producción de butirato, se usaron los genes terminales en la ruta(butybuk),lo que requiere una identidad global del 90 % con una proteína objetivo identificada en el análisis del genoma de Vitalet al. Con el fin de predecir el potencial de TMA-liasa, se realizó BLASTP en el gencutCgen descrito en Martínez del Campoet al.,los que requiere >60 % de identidad en más del 40 % de las proteínas objetivo y de consulta. Después de la anotación tanto de la producción de metabolitos como del contenido de CAZy, se realizó el enriquecimiento de los genes de utilización de hidratos de carbono en productores de metabolitos (butirato) o no productores de metabolitos (TMA) usando la prueba de Wilcox con corrección por FDR. Para la conversión de ureasa, indol, p-cresol, propionato y ácidos biliares secundarios, todos los genomas de HMP se anotaron usando la base de datos KEGG, con más del 70 % de identidad global usando la opción -usearch_global. Para la producción de ureasa, se usó el número EC 3.5.1.5 como marcador de la enzima ureasa para identificar genomas positivos para ureasa. Para la producción de indol. se usó el número CE 4.1.99.1 como marcador de la enzima triptofanasa para identificar genomas positivos para indol. Para la producción de p-cresol, se usaron los números CE 4.1.1.83, 2.6.1.-, 4.1.1.-, 1.2.7.5 para identificar la ruta de tirosina a p-cresol a través de 4-fenilhidroxiacetato. Para el propionato, se usaron los números CE 6.4.1.3, 2.1.3.1, 4.1.1.41, 1.2.1.27, 2.3.3.5, 1.2.1.87, 1.3.1.95, 1.3.8.7, 2.3.1.54, 2.3.1.168, 2.3.1.8, 2.3.1.222 para identificar todas las rutas de producción de propionato. Para la conversión de ácidos biliares secundarios, se usaron los siguientes números CE para identificar los convertidores de ácidos biliares: 1.1.1.159, 1.1.1.176, 1.1.1.201, .1.1.238, 1.1.1.391, 1.1.392, 1.1.393, 1.1. 395, 1.1.1.52, 2.8.3.25, 4.2.1.106, 6.2.1.7.
Se predijo que un total de 439 genomas secuenciados en una variedad de especies bacterianas comensales aisladas de microbiomas intestinales humanos sanos como parte del Proyecto Microbioma Humano tenían la capacidad de producir butirato, convertir urea en amoníaco a través de ureasa y convertir colina en TMA (figura 15). Cada una de estas tres importantes funciones bacterianas está distribuida de manera amplia pero discontinua en la filogenia, lo que demuestra la importancia de un enfoque funcional para caracterizar el potencial metabólico de un microbioma. Por ejemplo, aunque se predice que la producción de butirato sea universal en especies deFaecalibacteriumyRoseburia,especies deEubacteriayLacnospiraceaeparecen ser más variables en su capacidad para producir butirato. Además, la producción de estas tres funciones metabólicas parece no superponerse en general entre especies, lo que presenta el potencial para la producción selectiva de supresión beneficiosa y simultánea de metabolitos tóxicos.
Se identificó que un total de siete familias y subfamilias CAZy eran diferencialmente abundantes entre productores y no productores predichos de butirato (figuras 16A-16B; P<0,001, suma de rangos de Wilcox con corrección por FDR). De estas familias, dos están casi completamente ausentes de los no productores butiratos (GH13.36 y GH113), que se sabe que se dirigen a glicanos que contienen glucosa y manosa, respectivamente (figuras 16A-16B; tabla 9 a continuación). En general, las enzimas que se enriquecen en productores de butirato se dirigen a glicanos que componen la glucosa, manosa y galactosa, siendo la glucosa la composición objetivo más común (tabla 9). Este hallazgo está respaldado experimentalmente, usando tanto una comunidad fecalex vivocomo una comunidadin vitrodefinida cultivada en diversas composiciones de glicanos y analizada para la producción de SCFA. Para identificar las composiciones e interacciones de monómeros que más contribuyen al aumento de la producción de SCFA, incluido el butirato, se usó un modelo de regresión lineal LASSO (glmnet en R con lambda mínima de validación cruzada para comunidades definidas y lambda máxima dentro de un error estándar de lambda mínima paraex-vivo)con el porcentaje de composición de monómeros como entrada, permitiendo todos los términos de interacción de segundo orden. Todos los coeficientes positivos del modelo se muestran en las figuras 22A-22B. En este caso, la glucosa es un predictor importante para la producción de todos los SCFA, incluido el butirato, para comunidades definidas (figura 22B), y la combinación de glucosa, galactosa y manosa aumenta la producción de butirato en comunidades fecalesex-vivo,mientras que se predice que la glucosa sola aumentará la producción de acetato (figura 22A). Además de respaldar el uso de una composición objetivo de monómeros como predictor del potencial metabólico, usando un modelo de regresión lineal LASSO con el porcentaje de composición de monómeros como entrada para predecir el crecimiento de cepas bacterianas individuales, se muestra que la composición de monómeros es altamente predictiva del crecimiento bacteriano. Aunque estos hallazgos respaldan los genes diana de glicanos que son más diferenciales entre los productores y no productores de butirato, estos no son exhaustivos de las glicosil hidrolasas más abundantes codificadas en los productores de butirato (figura 17).
Tabla 9. Composición objetivo de glicanos para familias CAZy enriquecidas en productores de butirato con respecto a no productores de butirato.
Este método puede aplicarse además para dirigirse a glicanos para metabolitos que son dañinos y deseables de disminuir, incluidos TMA y amoníaco. Por ejemplo, se identificaron 11 familias y subfamilias CAZy que son exclusivas y están sobrerrepresentadas en taxones que no codifican para el gencutc(figuras 18A-18B; P<0,05, suma de rangos de Wilcox, corregida por FDR), que se ha demostrado que es responsable de convertir colina en TMA en el intestino (Martínez del Campo,et al).Además, al menos una de estas familias está codificada en casi el 50 % de las especies bacterianas que no codifican tampoco para el gencutc.Estas familias se dirigen a una gama más amplia de composiciones de glicanos (figuras 18A-18B, tabla 10), sin embargo, la galactosa y la glucosa son las composiciones de monómeros objetivo más abundantes. Estas familias y subfamilias CAZy son las más diferencialmente abundantes entre genomas positivos y negativos paracutC,sin embargo, puede encontrarse que otro conjunto de genes es el más abundante en genomas negativos paracutCy también son objetivos deseables para la reducción de TMA (figura 19).
Tabla 10. Composición objetivo de glicanos para familias CAZy en genomas que carecen de la enzima TMA-liasa.
Extendiendo esta aplicación a la producción de escisión de amoníaco de urea por la enzima ureasa, se identificaron 7 familias y subfamilias CAZy que están codificadas diferencialmente entre genomas positivos y negativos para ureasa (figuras 20A-20B; P<0,05, suma de rangos de Wilcox, corregida por FDR).
Además, estas enzimas son exclusivas de los genomas negativos para ureasa y son objetivos exclusivos de glicanos que contienen glucosa y galactosa (figuras 20A-20B, tabla 11). Estas familias y subfamilias CAZy son las más diferencialmente abundantes entre los genomas positivos y negativos para ureasa; sin embargo, puede encontrarse que otro conjunto de genes es el más abundante en los genomas negativos para ureasa y, por tanto, también son objetivos deseables para la reducción de amoníaco (figura 21).
Tabla 11. Composición objetivo de glicanos para familias CAZy en genomas que carecen de la enzima ureasa.
Extendiendo esta aplicación a la producción de propionato, se identificaron 7 familias y subfamilias CAZy que están codificadas diferencialmente entre productores de propionato y no productores de propionato (figuras 30G, P<0,01, suma de rangos de Wilcox, corregida por FDR). Estas enzimas están enriquecidas en no productores de propionato y son objetivos de N-acetilglucosamina, xilosa, arabinosa, glucosa, galactosa y fucosa (figura 30G, tabla 25). Estas familias y subfamilias CAZy son las más diferencialmente abundantes entre los productores y no productores de propionato; sin embargo, puede encontrarse que otro conjunto de genes es el más abundante en los no productores de propionato y, por tanto, también son objetivos deseables para la reducción de propionato (figura 30H).
Tabla 25. Composición objetivo de glicanos para familias CAZy en genomas que carecen de rutas de producción de propionato.
Extendiendo esta aplicación a la conversión de ácidos biliares, se identificaron 6 familias y subfamilias CAZy que están codificadas diferencialmente entre convertidores de ácidos biliares secundarios y no convertidores de ácidos biliares secundarios (figura 30A, P<0,05, suma de rangos de Wilcox, corregida por FDR). Estas enzimas están enriquecidas en convertidores de ácidos biliares secundarios y son objetivos exclusivos de trehalosa, ácido siálico y glucosa (figura 30A, tabla 26). Estas familias y subfamilias CAZy son las más diferencialmente abundantes entre los convertidores de ácidos biliares secundarios y no convertidores de ácidos biliares secundarios; sin embargo, puede encontrarse que otro conjunto de genes es el más abundante en no productores de propionato y, por tanto, también son objetivos deseables para la conversión de ácidos biliares secundarios (figura 30B).
Tabla 26. Composición objetivo de glicanos para familias CAZy en genomas con rutas de síntesis de ácidos biliares secundarios.
Extendiendo esta aplicación a la producción de indol, se identificaron 7 familias y subfamilias CAZy que están codificadas exclusivamente en bacterias no productoras de indol (figura 30C). Estas enzimas están codificadas exclusivamente en bacterias no productoras de indol y están enriquecidas para objetivos de glucosa, xilosa, arabinosa y manosa (figura 30C, tabla 27). Estas familias y subfamilias CAZy están codificadas exclusivamente en bacterias no productoras de indol; sin embargo, puede encontrarse que otro conjunto de genes es el más abundante en bacterias no productoras de indol y, por tanto, también son objetivos deseables para la reducción de indol (figura 30D).
Tabla 27. Composición objetivo de glicanos para familiar CAZy en genomas que carecen de una triptofanasa codificada para la producción de indol.
Extendiendo esta aplicación a la producción de p-cresol, se identificaron 7 familias y subfamilias CAZy que están codificadas diferencialmente entre productores de p-cresol y no productores de p-cresol (figura 30<e>, P<0,01, suma de rangos de Wilcox, corregida por FDR). Estas enzimas están enriquecidas en bacterias no productoras de p-cresol y enriquecidas para objetivos de xilosa, arabinosa, galactosa y glucosa (figura 30E, tabla 28). Estas familias y subfamilias CAZy están codificadas exclusivamente en bacterias no productoras de indol; sin embargo, puede encontrarse que otro conjunto de genes es el más abundante en bacterias no productoras de p-cresol y, por tanto, también son objetivos deseables para la reducción de p-cresol (figura 30F).
Tabla 28. Composición objetivo de glicanos para familias CAZy en genomas que carecen de una ruta codificada para la producción de p-cresol.
Para todas las cepas que crecen bien sobre glicanos sintetizados, la composición de monómeros es fuertemente predictiva del crecimiento de las cepas sobre un glicano particular tal como se describe en la tabla 12.
Tabla 12. R2 calculado usando un modelo de regresión lineal LASSO sobre la composición de monómeros.
Ejemplo 21. Enriquecimiento dirigido de un microorganismo usando una preparación de polímero de glicano a modo de ejemplo
Si una especie microbiana de interés está presente en una comunidad microbiana, puede observar una mayor representación de esa especie al poner en contacto la comunidad microbiana con ciertas preparaciones de polímeros de glicano. Por ejemplo, se sabe que especies del géneroBacteroidesposeen la mayor cantidad de enzimas activas sobre hidratos de carbono (CAZymes). Entre esas especies, la secuencia del genoma deBacteroides cellulolyticuscomprende el mayor número de genes que codifican para enzimas dedicadas a la degradación de hidratos de carbono de todos los genomas secuenciados conocidos del género: 503 CAZyme en total que incluyen 373 GH, 28 esterasas de hidratos de carbono y 84 glicosiltransferasas (McNultyet al,PLOS Biology, doi:10.1371/joumal.pbio. 1001637). Para mostrar que la representación deBacteroides cellulolyticuspodría aumentarse selectivamente en respuesta a la administración de una preparación de polímero de glicano a modo de ejemplo, se reunió y se sometió a prueba una comunidad bacteriana compleja que comprendía 15 cepas bacterianas.
La composición de esta comunidad definida fue: 1) Filo Actinobacteria: 2 cepas deBifidobacterium longum;2) Filo Firmicutes:Blautia hansenii, Clostridium nexile, Clostridium scindens, Dorea formicigenerans, Dorea longicatena, Ruminococcus obeum; 3)Filo Bacteroidetes:Bacteroides caccae, Bacteroides cellulolyticus, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides vulgatus, Prevotella copri, Para bacteroides distasonis;4) Filo Verrucomicrobia:Akkermansia muciniphila.
Cada cepa se cultivó por separado en medio convencional de glucosa de carne picada durante 18 horas. Cada cultivo se diluyó hasta una densidad óptica final (DO600) de 0,01 y se combinó en la comunidad mixta final. Esta comunidad se cultivó durante 48 horas en un medio al que se suministraron los siguientes hidratos de carbono como única fuente de carbono: glucosa, FOS, Glu100 (también denominado “Glu”), Glu50Gal50 (también denominado “GluGal”), Gal100 (también denominado “Gal”) y Man52Glu29Gal19 (también denominado “ManGluGal”). Se añadió agua a un medio sin ninguna fuente de carbono añadida como control.
La comunidad resultante, así como las cepas individuales, se añadió a una placa de 96 pocillos (Costar de fondo plano, 300 ul) que contenía medio de crecimiento sin glicano, o con cada uno de los glicanos enumerados anteriormente. La concentración final de cada glicano en el ensayo fue del 5 %. Cada glicano estaba representado 3 veces dentro de cada placa de crecimiento y era la única fuente de carbono para las bacterias. Las placas se incubaron a 37 °C en una cámara anaerobia AS-580 durante un total de 48 horas.
A las 18 y 48 horas, se determinó la densidad óptica para cada comunidad incubada con un glicano, y se dividieron en alícuotas de 150 ul de cultivo y se congelaron inmediatamente a -80 °C para la secuenciación del gen de ARNr 16S para determinar los cambios en la composición de la comunidad en función del tiempo y el glicano.
Para determinar la representación de cada cepa en esta comunidad definida, se extrajo ADN genómico de cada comunidad y se amplificó y secuenció el gen de ARNr 16S. Como se muestra en las figuras 23A-23B, la abundancia relativa deBacteroides cellulolyticusaumentó de un promedio del 4 % al 30 % cuando una comunidad definida compuesta por 15 cepas se cultivó sobre glicano Glu100, pero no sobre otras fuentes de carbono.
Además, cuando una comunidad ha crecido en presencia de una fuente de carbono, distinta de Glu100, tal como se muestra en la figura 23A, y luego se añadió Glu100 a una comunidad establecida, la abundancia relativa deBacteroides cellulolyticusaumentó de un promedio del 4 % al 14 %, tal como se muestra en la figura 23B (Gal100, Glu50Gal50, Man52Glu29Gal19). De manera importante, cuando se añadióB. cellulolyticusa una comunidad durante una fase estacionaria, tales como comunidades cultivadas en presencia de glucosa o FOS, no se observaron cambios enB. cellulolyticus, lo que implica que probablemente se han consumido otros nutrientes que limitan el crecimiento, tales como fuentes de nitrógeno o fósforo (figuras 23A-23B). Los datos sugieren la viabilidad de un enriquecimiento dirigido de taxones específicos en una comunidad bacteriana usando los polímeros de glicano descritos en el presente documento.
Ejemplo 22. Demostración de una administración simbiótica a una comunidad definida in vitro establecida
En determinadas enfermedades, la microbiota nativa puede verse alterada por la ingesta de antibióticos u otros agentes perjudiciales para la microbiota. La administración de especies probióticas es un intento común de restaurar la microbiota nativa. Sin embargo, la mayoría de los probióticos aprobados por la FDA son bacterias del ácido láctico que están presentes en muy baja abundancia en la microbiota intestinal de los adultos. Además, la administración de estas especies no da como resultado la restauración de la microbiota comensal, tales como miembros del géneroBacteroides.Además, el injerto de una especie probiótica en una comunidad compleja establecida a menudo es difícil. Por tanto, puede ser necesaria la administración simultánea de un probiótico junto con una fuente de carbono que consume selectivamente esa especie probiótica para garantizar un injerto exitoso de esta especie en una comunidad residente. En el presente documento, se demuestra el injerto exitoso deBacteroides cellulolyticusen una comunidad establecida, en donde la comunidad mejoró significativamente mediante la administración simultánea de una preparación de polímero de glicano a modo de ejemplo (glicano Glu100).
Se cultivó una comunidad definida compuesta por 14 cepas (las 15 cepas enumeradas en el ejemplo 21 exceptoBacteroides cellulolyticus),en presencia de 6 glicanos o agua como única fuente de carbono durante 18 horas. A la 18a hora, se añadió un cultivo deBacteroides cellulolyticusa una DO=0,1 a cada comunidad. Para someter a prueba si el injerto deBacteroides cellulolyticusdependía de su fuente de carbono preferida (Glu100), se añadieron 20 ul de Glu100 al 5% oBacteroides cellulolyticusy 20 uL de Glu100 al 5% a cada comunidad establecida, tal como se muestra en la tabla 13.
��� A las 48 horas, se determinó la densidad óptica para cada comunidad, se dividieron en alícuotas de 150 ul de cultivo y se congelaron inmediatamente a -80 °C para la secuenciación del gen de ARNr 16S para determinar los cambios en la composición de la comunidad en función del tiempo y el glicano.
Para determinar la representación de cada cepa en esta comunidad definida, se extrajo ADN genómico de 150 ul de cultivos usando el kit de extracción de<a>D<n>/ARN MoBio Microbiome (número de catálogo 27500-4-EP). Se amplificó región V4 del gen de ARNr 16S usando los cebadores directo 515 e inverso 806 como se describe en Caporaso JGet al,ISME J. Se secuenciaron amplicones usando el instrumento Illumina MiSeq con lecturas de 250 pb de largo usando química de extremos emparejados. Se recogieron Unidades Taxonómicas Operativas (OTU) usando una identidad de secuencia del 97 %. Se obtuvieron quince OTU que coincidían con 16 cepas. Dos cepas deBifidobacterium longumno pudieron resolverse mediante el gen de ARNr 16S, por lo que 1 OTU representaba ambas cepas.
Tal como se muestra en la figura 24A, la abundancia relativa deBacteroides cellulolyticusfue del 8 % en una comunidad cultivada con Glu100 o agua y solo del 2 % para comunidades cultivadas con otros glicanos.
Sin embargo, cuando se administró Glu100 simultáneamente conBacteroides cellulolyticus,la abundancia relativa de esta cepa aumentó del 2 % al 10 % en promedio si una comunidad había estado creciendo en presencia de una preparación de polímero de glicano, o del 25 % si una comunidad había estado creciendo en ausencia de una preparación de polímero de glicano (figura 24B). De manera importante, si se añadíaB. cellulolyticusa una comunidad durante una fase estacionaria, tales como comunidades cultivadas en presencia de glucosa o FOS, no se observó ningún cambio enB. cellulolyticus,lo que implica que probablemente se hayan consumido otros nutrientes que limitan el crecimiento, tales como fuentes de nitrógeno o fósforo (figuras 24A-24B).
Ejemplo 23: Ensayo ex vivo para evaluar la capacidad de preparaciones de polímeros de glicano para modular el crecimiento bacteriano y la producción de metabolitos
Se realizó un ensayoex vivopara evaluar la capacidad de una comunidad fecal humana, en un entornoin vitro,para utilizar diferentes glicanos. El ensayoex vivose diseñó para determinar si pueden usarse glicanos para modular diferencialmente una comunidad bacteriana compleja y ácidos grasos de cadena corta, incluidos los asociados con efectos protectores. Las muestras fecales y suspensiones se manipularon en una cámara anaerobia (AS-580, Anaerobe Systems) con un catalizador de paladio. Se prepararon los glicanos glu33gal33man33, gal33man33ara33, glu50gal50, glu33gal33ara33, gal100, glu40man60, gal33man33xyl33, glu40gal60, glu20gal80, glu60gal40, glu80ara20, gal40man60, man80xy120, gal60ara40, glu100, gal80man20, gal40ara60, gal80ara20, gal60man40, glu80gal20, xyl60ara40, glu80xyl20, glu60man40, glu20xyl80, glu20man80, man60ara40, glu80man20, glu60xyl40, gal20man80, gal60xyl40, gal80xyl20, glu40ara60, glu60ara40, xyl20ara80, man52glu29gal19, gal40xyl60, glu40xyl60, man60xyl40, xyl100, glu20ara80, gal20ara80, gal20xy180, man20ara80, man100, xyl40ara60, ara100, xyl80ara20 y un control disponible comercialmente, FOS (Nutraflora FOS; NOW Foods, Bloomingdale IL) al 5% p/v en agua, se esterilizaron por filtración y se añadieron a placas de ensayo de microplacas de 96 pocillos profundos para una concentración final del 0,5% p/v en el ensayo, con agua suministrada como controles positivo y negativo.
Se almacenó una donación de muestra fecal humana a -80 °C. Para preparar las reservas de trabajo, se transfirió la muestra fecal a la cámara anaerobia y se dejó descongelar. La muestra fecal se preparó al 20 % p/v en solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4 (P0261, Teknova Inc., Hollister, CA), glicerol al 15 % y se almacenó a -80 °C. La suspensión fecal al 20 % p/v glicerol al 15 % se centrifugó a 2.000 xg, se eliminó el sobrenadante y el sedimento se suspendió en cloruro de sodio 900 mg/l, cloruro de calcio dihidratado 26 mg/l, cloruro de magnesio hexahidratado 20 mg/l, cloruro de manganeso tetrahidratado 10 ml/l, sulfato de amonio 40 ml/l, sulfato de hierro heptahidratado 4 ml/l, cloruro de cobalto hexahidratado 1 ml/l, fosfato de potasio dibásico 300 ml/l, fosfato de sodio dibásico 1,5 g/l, bicarbonato de sodio 5 g/l, biotina 0,125 ml/l, piridoxina 1 ml/l, pantotenato 1 m/l, histidina 75 ml/l, glicina 75 ml/l, triptófano 75 ml/l, arginina 150 ml/l, metionina 150 mg/l, treonina 150 ml/l, valina 225 ml/l, isoleucina 225 ml/l, leucina 300 ml/l, cisteína 400 ml/l y prolina 450 ml/l (Theriot CMet al.Nat Commun. 2014; 5:3114) hasta una suspensión fecal al 1 % p/v. La suspensión fecal al 1 % p/v preparada se expuso a los glicanos glu33gal33man33, gal33man33ara33, glu50gal50, glu33gal33ara33, gal100, glu40man60, gal33man33xyl33, glu40gal60, glu20gal80, glu60gal40, glu80ara20, gal40man60, man80xyl20, gal60ara40, glu100, gal80man20, gal40ara60, gal80ara20, gal60man40, glu80gal20, xyl60ara40, glu80xyl20, glu60man40, glu20xyl80, glu20man80, man60ara40, glu80man20, glu60xyl40, gal20man80, gal60xyl40, gal80xyl20, glu40ara60, glu60ara40, xyl20ara80, man52glu29gal19, gal40xyl60, glu40xyl60, man60xyl40, xyl 100, glu20ara80, gal20ara80, gal20xy180, man20ara80, man100, xyl40ara60, ara100, xyl80ara20 y FOS comercial a una concentración final del 0,5 % p/v en microplacas de 96 pocillos profundos, 500 |il de volumen final por pocillo, a 37 °C durante 45 horas, de manera anaerobia. Después de la incubación, las muestras de ensayo se dividieron, una parte se usó para la extracción y secuenciación del ADN y la otra para el análisis de ácidos grasos de cadena corta.
Se extrajo ADN genómico de las suspensiones fecales tratadas con glicanos y controles, y se amplificó y secuenció la región variable 4 del gen de ARNr 16S (protocolo del Proyecto Microbioma Terrestre www.earthmicrobiome.org/emp-standard-protocols/16s/ y Caporaso JGet al.Al. 2012. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J.). Se generaron Unidades Taxonómicas Operativas (OTU) alineando secuencias de ARNr 16S con una identidad del 97 %.
Las suspensiones fecales tratadas con glicanos y controles se centrifugaron a 4000 xg durante 10 minutos a 4 °C y los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos. Las muestras se mantuvieron congeladas a -80 °C hasta su análisis. Se sacaron las muestras del congelador y se descongelaron. Se transfirió 1 ml del sobrenadante de cultivo a un vial de vidrio. El pH de la suspensión se ajustó a 2-3 añadiendo 100 ul de ácido sulfúrico al 50 %. Las muestras acidificadas se mantuvieron a temperatura ambiente y se agitaron durante 10 minutos. Para la extracción de compuestos volátiles, se añadieron 50 ul del patrón interno (disolución de ácido 2-metilpentanoico al 1 %) y 1000 ul de etil éter anhidro. Los tubos se mezclaron de extremo a extremo durante 10 minutos y luego se centrifugaron a 2000 g durante 2 minutos. Se inyectó 1 ul de la capa de éter superior en el cromatograma para su análisis.
El análisis cromatográfico de la concentración de SCFA se llevó a cabo usando un sistema Agilent 7890B con un detector de ionización de llama (FID) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Se usó una columna capilar de cromatografía de gases de alta resolución de 30 m x 0,25 mm recubierta con un grosor de película de 0,25 |im (DB-FFAP) para los ácidos volátiles (Agilent Technologies). Se usó nitrógeno como gas portador. La temperatura del horno fue de 145 °C y el FID y el puerto de inyección se ajustaron a 225 °C. El volumen de muestra inyectada fue de 1 ul y el tiempo de ejecución para cada análisis fue de 12 minutos. Los cromatogramas y la integración de datos se llevaron a cabo usando el software OpenLab ChemStation (Agilent Technologies). Los resultados se resumen en las tablas 14 y 15.
Las abundancias relativas de OTU de muestras de suspensión fecal tratadas con glicanos se compararon con el grupo sin glicanos añadidos usando la prueba no paramétrica de suma de rangos de Wilcoxon para determinar diferencias en las composiciones del microbioma a nivel de especie. Con el fin de explorar las asociaciones entre la composición de especies y los niveles de butirato, acetato y propionato en diferentes glicanos, en primer lugar se normalizó la proporción de especies presentes en el grupo tratado con glicanos con respecto a las obtenidas del grupo (de control) sin carbono añadido. Los valores de cambio en veces, así obtenidos para cada tratamiento con glicano, se correlacionaron entonces con los niveles de butirato obtenidos de los glicanos usando el método de correlación de rangos de Spearman [Myles Hollander y Douglas A. Wolfe (1973), Nonparametric Statistical Methods. Nueva York: John Wiley & Sons. Páginas 185-194 (Pruebas de Kendall y Spearman)]. Se identificaron asociaciones entre especies y niveles de butirato con significación estadística (valor de p corregido por Benjamini Hochberg < 0,05) [Benjamini, Y. y Hochberg, Y. (1995) Journal of the Royal Statistical Society Series B 57, 289 300], y en las figuras 25A-25D, 26A-26F y 27A-27D se muestran gráficos que representan las asociaciones más fuertes.
Tabla 14. Los glicanos modulan diferencialmente la producción de ácidos grasos de cadena corta lineales en el ensayo ex vivo en relación con el control sin glicano promedio
Como se muestra en la tabla 14, 48 glicanos sintéticos modulan diferencialmente la producción de los ácidos grasos de cadena corta no ramificada butirato, acetato y propionato en relación con el control sin glicano añadido promedio en el ensayo. En el ensayo, los mayores aumentos en veces se observaron con butirato y propionato, ya que 1 glicano aumentó el butirato al menos 10 veces, 4 glicanos aumentaron el propionato al menos 10 veces y ninguno de los glicanos aumentó el acetato al menos 10 veces. En el ensayo, se observaron cambios de 3-10 veces en relación con el control sin glicano en butirato con 38 glicanos, en acetato con 28 glicanos y en propionato con 27 glicanos. En el ensayo, se observaron cambios de menos de 3 veces en relación con el control sin glicano en butirato con 9 glicanos, en acetato con 20 glicanos y en propionato con 17 glicanos.
El butirato se moduló en el ensayo en grados variables dependiendo de la composición de glicano. El butirato aumentó al menos 10 veces en el ensayo en relación con el control sin glicano añadido promedio con un trímero donde 3 de los aportes eran un tercio de cada una de manosa, galactosa y glucosa. El butirato aumentó al menos 5 veces en el ensayo con glicanos que contenían glucosa y galactosa, donde la glucosa constituía menos del 80 % del aporte de monómeros, y con glicanos compuestos por tres monómeros, donde dos de los aportes eran al menos un tercio de cada una de manosa y galactosa. El butirato aumentó menos de cinco veces en el ensayo con dos de cada cuatro glicanos compuestos por arabinosa y xilosa, y con cuatro de cinco glicanos donde el aporte era al menos un 80 % de arabinosa.
El acetato se moduló en el ensayo en grados variables dependiendo de la composición de glicano. Aparte de FOS, los glicanos que aumentaron el acetato al menos 5 veces en el ensayo incluyeron glucosa como aporte de monómero. Aparte de man100 y gal 100, los glicanos que aumentaron el acetato menos de 3 veces en el ensayo incluyeron arabinosa y/o xilosa como aporte de monómero. Por tanto, la composición de monómeros parece influir en la producción de acetato en el ensayo, favoreciendo el aporte de glucosa la producción de acetato, y tendiendo los aportes de arabinosa y xilosa a reducir relativamente el acetato.
El propionato se moduló en el ensayo en grados variables dependiendo de la composición de glicano. Tres de cada cuatro glicanos que aumentaron el propionato al menos 10 veces en el ensayo incluyeron tanto galactosa como manosa como aportes, y dos de cada cuatro incluyeron xilosa y manosa como aportes. El propionato aumentó al menos 5 veces en el ensayo con 14 de 16 glicanos que incluían manosa como aporte de monómero. En el ensayo, 16 de 18 glicanos con los que el propionato cambió menos de 3 veces incluían xilosa y/o arabinosa como aporte de monómero. Por tanto, la composición de monómeros parece influir en la producción de propionato en el ensayo, favoreciendo el aporte de manosa la producción de propionato, y tendiendo los aportes de arabinosa y xilosa a reducir relativamente el propionato.
a a . os g canos mo uan erencamen e a pro ucc n e c os grasos e ca ena cor a ramificados en el ensayo ex vivo en relación con el control sin glicano promedio
Como se observa en la tabla 15, los glicanos modulan diferencialmente los ácidos grasos de cadena corta ramificados isovalerato, isobutirato e isocaproato en el ensayo en relación con el control sin glicano añadido promedio. En el ensayo, se observaron aumentos de al menos 2 veces en isobutirato con 5 glicanos, en isovalerato con 1 glicano y en isocaproato con 3 glicanos. En el ensayo, se observaron cambios de menos de 2 veces en isobutirato con 36 glicanos, en isovalerato con 38 glicanos y en isocaproato con 25 glicanos. Se observaron disminuciones de al menos 2 veces en el ensayo en isobutirato con 6 glicanos, en isovalerato con 9 glicanos y en isocaproato con 4 glicanos. Consecuente con niveles por debajo del límite de detección, no se detectó isobutirato en el ensayo con 2 glicanos, no se detectó isovalerato con 1 glicano y no se detectó isocaproato con 16 glicanos.
En el ensayo, la modulación de los ácidos grasos ramificados de cadena corta parece depender de la composición de glicano. 4 de 5 glicanos con los que el isobutirato aumentó al menos 2 veces en el ensayo incluían manosa en combinación con glucosa y/o galactosa. Los 6 glicanos con los que el isobutirato disminuyó en el ensayo al menos 2 veces incluían galactosa. La capacidad de los glicanos para aumentar o disminuir selectivamente los ácidos grasos de cadena corta ramificados sugiere que pueden administrarse para modular selectivamente los ácidos grasos de cadena cortain vivopara beneficio terapéutico. La modulación por glicanos de ácidos grasos de cadena corta en el ensayo está asociada con cambios en varios taxones. Como se indica en las figuras 25A-25D, el análisis de secuenciación de ARNr 16S indica que las bacterias identificadas comoClostridiaceae, Turicibacter, RoseburiayBacteroides fragilisestaban correlacionadas positivamente con butirato en el ensayo. Muchos miembros de los taxones Clostridiaceae yRoseburiase han identificado como productores de butirato basándose en el análisis genómico notificado y un aumento en su abundancia relativa puede estar directamente relacionado con un aumento de butirato en el ensayo. La correlación deTuricibacteryB. fragiliscon la producción de butirato puede estar relacionada con efectos indirectos. Se ha notificado queTuricibacterproduce lactato (Bosshard p Pet al,DSEM 2002), y el lactato es un precursor para la síntesis de butirato (Bourriaud Cet al,JAM 2005; Belenguer Aet al,AEM 2007).B. fragilisproduce acetato (Macfarlane Set al,PNS 2003), que se ha demostrado que se utiliza para la producción de butirato por bacterias que incluyenRoseburia(Duncan SHet al,BJN 2004).TuricibacteryB. fragilispueden contribuir indirectamente a un aumento en la producción de butirato al proporcionar precursores que se transforman en butirato por bacterias tales como Clostridiaceae yRoseburia.
La modulación por glicano del acetato en el ensayo estaba correlacionada negativamente con algunos taxones bacterianos y positivamente con otros. Tal como se indica en las figuras 26A-26F, taxones que incluíanRuminococcaceae, RickenellaceaeyOscillospiraestaban fuertemente asociados negativamente con la producción de acetato en el ensayo. Los taxones que estaban asociados positivamente con el acetato en el ensayo incluyeronBacteroides uniformis,Clostridiaceae yBacteroides ovatus.Tal como se indica en las figuras 27A-27D,B. ovatusyB. uniformistambién estaban asociadas positivamente con el propionato en el ensayo, mientras que los taxones que estaban más fuertemente asociados negativamente con el propionato diferían de los más fuertemente asociados con el acetato e incluíanBifidobacterium, Ruminococcus bromiiyRoseburia faecis.Por tanto, la modulación diferencial de las abundancias relativas de taxones bacterianos por los glicanos en el ensayo parece estar asociada con la modulación diferencial de los ácidos grasos de cadena corta.
Ejemplo 24: Capacidad de las preparaciones de polímeros de glicano para modular el crecimiento bacteriano de taxones bacterianos formadores de esporas
Se realizó un ensayoin vitropara evaluar la capacidad de diversos comensales bacterianos formadores de esporas del tracto gastrointestinal para utilizar diferentes glicanos como sustratos de crecimiento. Este ensayo se diseñó para evaluar la capacidad de glicanos seleccionados para promover el crecimiento de comensales intestinales formadores de esporas, que se han asociado con una gama de efectos beneficiosos para la salud. Las cepas bacterianas se manipularon en todas las etapas en una cámara anaerobia (AS-580, Anaerobe Systems) con un catalizador de paladio. Inicialmente, la cámara se hizo anaerobia purgándola con una mezcla de gases anaeróbica del 5 % de hidrógeno, el 5 % de dióxido de carbono y el 90 % de nitrógeno y posteriormente se mantuvo en un estado anaerobio usando esta misma mezcla de gases anaeróbia. La anaerobicidad de la cámara se confirmó diariamente utilizando tiras indicadoras anaerobias Oxoid que cambian de color en presencia de oxígeno. Todos los medios de cultivo, placas de ensayo, otros reactivos y consumibles de plástico se redujeron previamente en la cámara anaerobia durante de 24 a 48 horas antes del contacto con las bacterias. Se prepararon los glicanos gal 100, glu20gal80, glu40gal60, glu50gal50, glu60gal40, glu80gal20, glu100, glu80man20, glu60man40, glu40man60, glu20man80, man100, xyl100, xyl80ara20, xyl60ara40, xyl40ara60, xyl20ara80, ara100, glu80ara20, glu60ara40, glu40ara60, glu20ara80, glu80xyl20, glu60xyl40, glu40xyl60, glu20xyl80, gal80man20, gal60man40, gal40man60, gal20man80, gal80xyl20, gal60xyl40, gal40xyl60, gal20xy180, gal80ara20, gal60ara40, gal40ara60, gal20ara80, man80xyl20, man60xyl40, man40xyl60, man20xyl80, man80ara20, man60ara40, man40ara60, man20ara80, glu33gal33ara33, man52glu29gal19, glu33gal33man33, glu33gal33xyl33, gal33man33xyl33, gal33man33ara33 y un control disponible comercialmente, FOS (Nutraflora FOS; NOW Foods, Bloomingdale IL) al 5% p/v en agua, se esterilizaron por filtración y se añadieron a placas de ensayo Costar 3370 para una concentración final del 0,5 % p/v en el ensayo, sometiéndose a ensayo cada glicano en dos pocillos no adyacentes y suministrando dextrosa y agua como controles positivo y negativo.
Se obtuvieron aislados bacterianos de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) y del Instituto Leibniz DSMZ-Instituto Alemán de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ). Se cultivaron cultivos deClostridium scindensATCC 35704 “CSC.32”,Clostridium nexileATCC 27757 “CNE.31”,Blautia productaATCC 27340 “BPR.22”,Dorea longicatenaDSM 13814 “DLO.76”,Ruminococcus obeumATCC 29714 “ROB.74” yBlautia hanseniiATCC 27752 “BHA.20” de manera anaerobia en caldo de glucosa de carne picada (CMG, Anaerobe Systems), un medio enriquecido previamente reducido que incluye carne picada magra, digesto enzimático de caseína, extracto de levadura, fosfato de potasio, dextrosa, cisteína, hemina y vitamina K1, durante 18-48 horas a 37 °C. Se prepararon inóculos determinando la densidad óptica de cada cultivo a 600 nM (DO600) en una placa de ensayo de fondo plano de 96 pocillos de poliestireno Costar 3370 usando un lector de placas Biotek Synergy 2 con el software lector de microplacas todo en uno Gen52.0 según el protocolo del fabricante y diluyendo las células hasta DO600 0,01 final en medios definidos y semidefinidos que se prepararon sin azúcares. Se sometieron a prueba aislados deB. hansenii, B. productayD. longicatenaen cloruro de sodio 900 ml/l, cloruro de calcio dihidratado 26 ml/l, cloruro de magnesio hexahidratado 20 ml/l, cloruro de manganeso tetrahidratado 10 ml/l, sulfato de amonio 40 ml/l, sulfato de hierro heptahidratado 4 ml/l, cloruro de cobalto hexahidratado 1 ml/l, fosfato de potasio dibásico 300 ml/l, fosfato de sodio dibásico 1,5 g/l, bicarbonato de sodio 5 g/l, biotina 0,125 ml/l, piridoxina 1 ml/l, pantotenato 1 m/l, histidina 75 ml/l, glicina 75 ml/l, triptófano 75 ml/l, arginina 150 ml/l, metionina 150 ml/l, treonina 150 ml/l, valina 225 ml/l, isoleucina 225 ml/l, leucina 300 mg/l, cisteína 400 ml/l y prolina 450 ml/l (Theriot CMet al.Nat Commun. 2014; 5:3114), complementado con el 0-10 % (v/v) de CMG. Se sometieron a prueba C.scindens, C. nexileyR. obeumen triptona peptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, clorhidrato de L-cisteína 0,5 g/l, tampón fosfato de potasio 0,1 M, pH 7,2, vitamina K31 |ig/ml, cloruro de calcio al 0,08 % p/v, sulfato de hierro heptahidratado 0,4 |ig/ml, resazurina 1 |ig/ml, hematina 1,2 |ig/ml, histidina 0,2 mM, Tween 80 al 0,05 %, extracto de carne al 0,5 % (Sigma), suplemento de oligoelementos al 1 % (ATCC), suplemento vitamínico al 1 % (ATCC), ácido acético al 0,017 % v/v, ácido isovalérico al 0,001 % v/v, ácido propiónico al 0,2 % v/v y ácido N-butírico al 0,2 % v/v (Romano KAet al.mBio 2015; 6(2): e02481-14). Las bacterias se expusieron a los glicanos gal100, glu20gal80, glu40gal60, glu50gal50, glu60gal40, glu80gal20, glu100, glu80man20, glu60man40, glu40man60, glu20man80, man100, xyl100, xyl80ara20, xyl60ara40, xyl40ara60, xyl20ara80, ara100, glu80ara20, glu60ara40, glu40ara60, glu20ara80, glu80xyl20, glu60xyl40, glu40xyl60, glu20xyl80, gal80man20, gal60man40, gal40man60, gal20man80, gal80xyl20, gal60xyl40, gal40xyl60, gal20xy180, gal80ara20, gal60ara40, gal40ara60, gal20ara80, man80xyl20, man60xyl40, man40xyl60, man20xyl80, man80ara20, man60ara40, man40ara60, man20ara80, glu33gal33ara33, man52glu29gal19, glu33gal33man33, glu33gal33xyl33, gal33man33xyl33, gal33man33ara33, FOS comercial y dextrosa a una concentración final del 0,5 % p/v en microplacas de 96 pocillos, 200 |il de volumen final por pocillo, a 37 °C durante 18-48 horas, de manera anaerobia. Se obtuvieron mediciones de DO600 para cada aislado al final del período de incubación usando un lector Biotek Synergy2 con el software Gen52.0 según las especificaciones del fabricante.
Tabla 16. Crecimiento soportado por glicanos de formadores de esporas comensales
Como se observa en la tabla 16, los glicanos soportan el crecimiento de 6 comensales intestinales formadores de esporas en el ensayo en diversos grados. En el ensayo, gal100, glu20gal80, xyl80ara20, xyl60ara40, glu20xyl80 soportan el crecimiento de las 6 cepas; glu40gal60, glu50gal50, glu60gal40, xyl40ara60, xyl20ara80, glu40xyl60 y glu33gal33ara33 soportan el crecimiento de 5 cepas; xyl100, gal60ara40, man52glu29gal19 y glu33gal33man33 soportan el crecimiento de 4 cepas; y glu20ara80, gal20ara80, man40xyl60, man20xyl80, glu33gal33xyl33 y gal33man33ara33 soportan el crecimiento de 3 cepas.
La modulación del crecimiento de comensales formadores de esporas en el ensayo varía con la composición de los glicanos. Los oligómeros con aportes de glucosa y galactosa soportan al menos la mitad de las 6 cepas en el ensayo, y la proporción de cepas para las que el crecimiento se soporta en el ensayo generalmente aumenta a medida que aumenta la proporción de galactosa. En el ensayo, glu80gal20 y glu100 soportan 3 cepas, glu50gal50 soportan 5 cepas y gal 100 y glu20gal80 soportan el crecimiento de 6 cepas. Entre los 4 oligómeros que incluyen glu, gal y otro monómero como aportes, 3 oligómeros (glu33gal33ara33, man52glu29gal19 y glu33gal33man33) soportan el crecimiento de 4 cepas en el ensayo, y 1 oligómero (glu33gal33xyl33) soporta el crecimiento de 3 cepas en el ensayo. El número de cepas soportadas en el ensayo por oligómeros con aportes de xilosa y arabinosa y por oligómeros con aportes de glucosa y xilosa aumenta a medida que aumenta la proporción de aporte de xilosa. En el ensayo, glu80xyl20 soporta 2 cepas, glu60xyl40 soporta 3 cepas, glu40xyl60 soporta 5 cepas y glu20xyl80 soporta 6 cepas. En el ensayo, los oligómeros que contienen aportes de xilosa y arabinosa soportan el crecimiento de 5 o 6 cepas, mientras que xyl100 soporta el crecimiento de 4 cepas y ara100 soporta 2 cepas.
El tracto gastrointestinal de seres humanos sanos contiene una comunidad microbiana diversa que puede incluir cientos de especies bacterianas diferentes. Tal como se describe en la solicitud estadounidense 2016/0158294, la microbiota intestinal desempeña un papel importante en la salud humana, con beneficios que incluyen la resistencia a la colonización contra patógenos, la regulación de las respuestas inmunitarias del huésped, la producción de nutrientes esenciales y la absorción de nutrientes, y el mantenimiento de la integridad epitelial intestinal. En condiciones disbióticas, la población del microbioma intestinal se altera y los efectos negativos en el huésped pueden incluir respuestas inmunitarias alteradas, aumento de la inflamación, respuestas metabólicas alteradas y aumento de la susceptibilidad a patógenos. Los probióticos representan sólo unas pocas de los cientos de especies bacterianas que están presentes en la microbiota humana normal y sano. Las bacterias comensales formadoras de esporas abundan en el microbioma humano e incluyen especies asociadas con diversos efectos beneficiosos, incluida la producción de butirato, que está asociada con la integridad de la barrera epitelial intestinal y la regulación de respuestas metabólicas e inmunitarias, y la protección contra la infección porClostridium difficilepor C.scindens.Pueden administrarse glicanos para promover el crecimiento de bacterias comensales formadoras de esporas para proporcionar una gama de beneficios para la salud y prevenir y tratar enfermedades relacionadas con la disbiosis microbiana.
Ejemplo 25: Perfiles de glicosidasas y utilización de azúcar de taxones bacterianos formadores de esporas
Se identificaron glucósido hidrolasas (GH) y glicosiltransferasas (GT) que están enriquecidas en taxones bacterianos formadores de esporas esencialmente tal como se describe en el ejemplo 20.
Se identificaron genes de 40 familias y subfamilias de glucósido hidrolasa y transferasa (CAZy) que están enriquecidas en genomas de bacterias formadoras de esporas en comparación con bacterias no formadoras de esporas (figura 28, P <0,05, suma de rangos de Wilcox, corregida por FDR). Los formadores de esporas se resumen en la tabla: 17.
��� Por ejemplo, GH43, GH13 y GH28 estaban mucho más sumamente representados en genomas de bacterias formadoras de esporas (figura 28). El enriquecimiento excesivo también correspondió en general a una mayor prevalencia de detección en todos los genomas de bacterias formadoras de esporas (figura 29A). En general, las familias CAZyme que se identificó que estaban enriquecidas en bacterias formadoras de esporas estaban presentes en una porción mayor de genomas bacterianos formadores de esporas en comparación con bacterias no formadoras de esporas (figura 29 B). Estos resultados muestran que enzimas activas sobre hidratos de carbono específicas están enriquecidas en bacterias formadoras de esporas. La tabla 18 muestra los monómeros de glicano que probablemente sean el objetivo de estas familias de enzimas.
Tabla 18. Composición objetivo de glicanos para familias CAZy enriquecidas en bacterias formadoras de esporas con respecto a bacterias no formadoras de esporas.
Muchos se dirigen a sustratos que contienen glucosa, xilosa, galactosa y arabinosa, lo que sugiere que los glicanos con estos constituyentes podrían usarse para promover el crecimiento de bacterias formadoras de esporas. Los glicanos que comprenden glucosa, xilosa, galactosa y/o arabinosa promovieron el crecimiento de bacterias formadoras de esporas en ensayos de crecimiento de una sola cepa (véase el ejemplo 24, tabla 16).
Ejemplo 27: Enriquecimiento de taxones específicos que codifican para glicosidasas en suspensiones fecales de seres humanos en presencia de oligosacáridos sintetizados usando glicosidasas objetivoSe sometió a prueba la capacidad de las preparaciones de glicano para modular los niveles de especies bacterianas objetivo que codifican para glicosidasas específicas en una suspensión fecal de un sujeto humano sanoin vitro(también conocido como ensayoex vivo).Las muestras y suspensiones fecales se manipularon en una cámara anaerobia (AS-580, Anaerobe Systems) con un catalizador de paladio. Se prepararon glicanos al 5 % p/v en agua, se esterilizaron por filtración y se añadieron a placas de ensayo de microplacas de pocillos profundos de 96 pocillos para una concentración final del 0,5 % p/v en el ensayo, suministrándose agua como controles positivo y negativo.
Se almacenó una donación de muestra fecal humana a -80 °C. Para preparar las reservas de trabajo, la muestra fecal se transfirió a la cámara anaerobia y se dejó descongelar. La muestra fecal se preparó al 20 % p/v en solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4 (P0261, Teknova Inc., Hollister, cA), glicerol al 15 % y se almacenó a -80 °C. La suspensión fecal al 20 % p/v glicerol al 15 % se centrifugó a 2.000 xg, se eliminó el sobrenadante y el sedimento se suspendió en cloruro de sodio 900 ml/l, cloruro de calcio dihidratado 26 ml/l, cloruro de magnesio hexahidratado 20 ml/l, cloruro de manganeso tetrahidratado 10 ml/l, sulfato de amonio 40 ml/l, sulfato de hierro heptahidratado 4 ml/l, cloruro de cobalto hexahidratado 1 ml/l, fosfato de potasio dibásico 300 ml/l, fosfato de sodio dibásico 1,5 g/l, bicarbonato de sodio 5 g/l, biotina 0,125 ml/l, piridoxina 1 ml/l, pantotenato 1 m/l, histidina 75 ml/l, glicina 75 ml/l, triptófano 75 ml/l, arginina 150 ml/l, metionina 150 ml/l, treonina 150 ml/l, valina 225 ml/l, isoleucina 225 ml/l, leucina 300 mg/l, cisteína 400 ml/l y prolina 450 ml/l (Theriot CMet al.Nat Commun. 2014; 5:3114) complementado con urea 750 uM y peptona al 0,1 % en suspensión fecal al 1 % p/v.
La suspensión fecal al 1% p/v preparada se expuso a melibiosa-1, melibiosa-enz19-1, melibiosa-enz20-1, melibiosa-enz16-1, melibiosa-enz17-1, rafinosa-1, rafinosa-enz19-1, rafinosa-enz16-1 a una concentración final del 0,5 % p/v en microplacas de pocillos profundos de 96 pocillos, 500 |il de volumen final por pocillo, a 37 °C durante 14 horas, de manera anaerobia. Melibiosa y rafinosa denotan el sustrato usado para generar oligosacáridos con enzimas específicas (enz19, enz20, etc.); y el número después del guión indica una preparación de glicano (por ejemplo, -1) que tiene características diferentes de otra preparación de glicano (por ejemplo, -3), que difieren entre sí dentro de los intervalos para las preparaciones de glicano descritas en el presente documento.
Después de la incubación, se extrajo ADN genómico de las suspensiones fecales tratadas con glicanos y controles, y se amplificó y secuenció la región variable 4 del gen de ARNr 16S (protocolo del Proyecto Microbioma Terrestre www.earthmicrobiome.org/emp-standard-protocols/16s/ y Caporaso JGet al.,2012. Ultrahigh-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J.). Las secuencias sin procesar se demultiplexaron y cada muestra se procesó por separado con UNOISE2 (Edgar 2016). Brevemente, se fusionaron lecturas finales emparejadas y se filtró por calidad. Luego se eliminó el ruido de lecturas únicas y las secuencias fusionadas sin filtrar se asignaron a las secuencias sin ruido. La taxonomía se asignó a las secuencias sin ruido usando el clasificador RDP (Wang 2007).
Tal como se demuestra en el presente documento, cuando las glicosidasas usadas para sintetizar enzimas están codificadas por especies microbianas intestinales, los oligosacáridos resultantes enriquecen esas especies específicas. Por ejemplo, cuando se usan glicosidasas codificadas por Lachnospiriaceae para generar oligosacáridos, los oligosacáridos resultantes enriquecen Lachnospiriceae más que o bien el sustrato original o bien los oligosacáridos generados por medio de enzimas codificadas por diferentes especies (figuras 31A-31B). Esto es válido independientemente del sustrato usado para generar el oligosacárido (figuras 31A-31B). Esto demuestra un mecanismo para dirigir oligosacáridos a glicosidasas en el microbioma intestinal para enriquecer específicamente taxones y funciones de interés.
Pueden dirigirse a grupos de taxones no relacionados mediante la identificación de glicosil hidrolasas compartidas. Tal como se demuestra en el presente documento, cuando se utilizan glicosil hidrolasas que son abundantes en tres géneros únicos,Bifidoabacteria, BacteroidesyRoseburia,los 3 taxones se enriquecen simultáneamente en la comunidadex vivo(figuras 32A-32D). Esto demuestra la capacidad de dirigirse a especies de distintos filos y a funciones objetivo adicionales, o glicotaxones. No se pretende que el alcance de las presentes realizaciones descritas en el presente documento se limite a la descripción, las figuras o los ejemplos anteriores, sino que más bien a lo establecido en las reivindicaciones adjuntas. Los expertos habituales en la técnica apreciarán que pueden realizarse diversos cambios y modificaciones en esta descripción sin apartarse del alcance de la presente invención, tal como se define en las siguientes reivindicaciones.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Preparación de polímero de glicano para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno asociado con un nivel no deseado de un metabolito, en donde el metabolito es trimetilamina (TMA) o N-óxido de trimetilamina (TMAO), y en donde la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste en aterosclerosis, enfermedad cardiovascular, riesgo cardiovascular en VIH, aterosclerosis de la carótida, cardiopatía crónica, insuficiencia cardíaca crónica, enfermedad renal crónica, enfermedad vascular crónica, cáncer colorrectal, cardiopatía coronaria, arteriopatía coronaria (CAD), diabetes (tipo II), enfermedad renal en estadio terminal, VIH, enfermedad inflamatoria del intestino, ataque isquémico, síndrome metabólico, enfermedad de hígado graso no alcohólica (NAFLD), obesidad, síntomas intestinales agudos inducidos por radiación (RIAIS) y accidente cerebrovascular,
comprendiendo dicho método:
seleccionar una preparación de polímero de glicano basándose en o con el conocimiento de que modula la producción o el nivel del metabolito, y
administrar una cantidad de la preparación de polímero de glicano eficaz para dar como resultado una modulación del nivel del metabolito, tratando de ese modo la enfermedad o trastorno, en donde la preparación de polímero de glicano comprende glucosa y al menos un enlace alfa-glicosídico, opcionalmente, en donde el enlace alfa-glicosídico es enlace alfa-1,3-glicosídico, enlace alfa-1,4-glicosídico, o una combinación de los mismos, y
en donde el grado de polimerización (DP) medio de la preparación es de entre DP3-15.
2. Preparación de polímero de glicano para su uso según la reivindicación 1, en donde la preparación de polímero de glicano comprende una, dos, tres, o todas, de las siguientes características:
i. la preparación de polímero de glicano comprende además polímeros de glicano que comprenden al menos un enlace beta-glicosídico, opcionalmente en donde el enlace beta-glicosídico es enlace beta-1,3 glicosídico, enlace beta-1,4 glicosídico o una combinación de los mismos;
ii. la preparación de polímero de glicano comprende además polímeros de glicano que comprenden galactosa (por ejemplo, una preparación de glu-gal);
iii. la preparación de polímero de glicano comprende además polímeros de glicano que comprenden manosa (por ejemplo, una preparación de glu-man); y
iv. la preparación de polímero de glicano comprende además polímeros de glicano que comprenden galactosa y manosa (por ejemplo, una preparación de glu-gal-man).
3. Preparación de polímero de glicano para su uso según las reivindicaciones 1 o 2, en donde los polímeros de glicano, o al menos el 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 99 % (en peso o número) de los polímeros de glicano, de la preparación de polímero de glicano, es un sustrato para una enzima glicosidasa,
en donde la enzima glicosidasa está opcionalmente presente en un microbio intestinal humano, o
en donde el microbio intestinal humano es opcionalmente un miembro de los glicotaxones clase 2, taxones bacterianos negativos para el gen cutC.
4. Preparación de polímero de glicano para su uso según la reivindicación 3, en donde el polímero de glicano es un sustrato para una enzima glicosidasa seleccionada de una o más de, por ejemplo, dos, tres, cuatro, o más de a) familia CAZy GT11, GT10, GH92, GH51, GH35, GH29, GH28, GH20, GH130, GH13 subfamilia 8, o GH13 subfamilia 14; o
b) familia CAZy GT2, GT4, GH2, GH23, GH3, GT8, GT51, GT9, GH1, GH92, GH73, GH31, GH20, GH28, GT25, GT28, GT35, GH18, GT0, GH13, GH36, GH97, GH105, GH25, GH4, GH32, GH78, GH29, GH0, GH51, GT10 o GH77.
5. Preparación de polímero de glicano para su uso según la reivindicación 1, en donde la enfermedad o trastorno es una enfermedad crónica (por ejemplo, enfermedad renal crónica o enfermedad renal en estadio terminal, cardiopatía crónica, insuficiencia cardíaca crónica, enfermedad vascular crónica), o
en donde la enfermedad o trastorno es enfermedad de hígado graso no alcohólica (NAFLD).
6. Preparación de polímero de glicano para su uso según la reivindicación 5, en donde el nivel de metabolito está disminuido en el sujeto o una muestra adecuada del sujeto que tiene la enfermedad o trastorno, por ejemplo, disminuido en comparación con una referencia, por ejemplo, un valor de referencia predeterminado, el nivel en el sujeto antes del tratamiento o un control sano, opcionalmente que comprende además evaluar el nivel del metabolito, o un síntoma de un nivel no deseado del metabolito, por ejemplo, adquiriendo un nivel del metabolito, opcionalmente antes de tratar al sujeto (por ejemplo, como nivel inicial), durante el tratamiento (por ejemplo, para monitorizar el éxito del tratamiento) y/o después del tratamiento (por ejemplo, para evaluar la recaída de la enfermedad o trastorno).
7. Preparación de polímero de glicano para su uso según la reivindicación 6, en donde el nivel (por ejemplo, nivel sistémico, por ejemplo niveles sanguíneos o fecales) de TMA está disminuido (por ejemplo, la tasa o el nivel de conversión de colina en TMA, por ejemplo, por microbios gastrointestinales, está reducido), por ejemplo, en relación con un sujeto no tratado con la preparación de polímero de glicano.
8. Preparación de polímero de glicano para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende además seleccionar un sujeto para el tratamiento basándose en o en respuesta a adquirir conocimiento de uno, dos, tres, cuatro o más cualesquiera de:
a) que el sujeto tiene un nivel no deseado de TMA o TMAO,
b) que el sujeto tiene una enfermedad o trastorno (por ejemplo, una enfermedad o trastorno según la reivindicación 5),
c) que el sujeto tiene una disbiosis de la microbiota intestinal (por ejemplo, niveles/abundancia relativa mal calibrados de, por ejemplo taxones bacterianos de clase 2 según la reivindicación 3),
d) que el sujeto ha respondido a un tratamiento previo con un polímero de glicano (por ejemplo, un polímero de glicano según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2),
e) que el sujeto se ha sometido a terapia u otro entorno que da como resultado disbiosis, por ejemplo, tratamiento con antibióticos, o cirugía gástrica antes del tratamiento,
comprendiendo opcionalmente adquirir un valor adecuado para determinar los criterios de selección.
9. Preparación de polímero de glicano para su uso según la reivindicación 8, en donde puede adquirirse un valor adecuado analizando una muestra biológica adecuada del sujeto, en donde la muestra es opcionalmente sangre, heces, orina, saliva o una muestra de tejido orgánico.
10. Preparación de polímero de glicano para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el nivel no deseado del metabolito disminuye (por ejemplo, en el sujeto o en una muestra adecuada tomada del sujeto tratado) en un 3 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 % o 50 % después de un periodo de tratamiento (por ejemplo, en comparación con una referencia, por ejemplo, un valor de referencia predeterminado, el nivel en el sujeto antes del tratamiento o un control sano).
11. Preparación de polímero de glicano para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el tratamiento comprende además administrar un segundo agente terapéutico (por ejemplo, un agente terapéutico distinto del polímero de glicano para tratar la enfermedad o trastorno y/o para modular el nivel del metabolito), o
administrar una preparación de un microbio intestinal (por ejemplo, un microbio intestinal humano),
en donde el microbio intestinal (por ejemplo, un microbio intestinal humano) es preferiblemente una clase 2 (por ejemplo, taxones bacterianos negativos para el gen cutC), en donde el microbio intestinal se selecciona opcionalmente basándose en su asociación con el metabolito (por ejemplo, basándose en su correlación positiva, negativa o falta de correlación con el metabolito), en donde la selección del microbio intestinal comprende opcionalmente elegir un microbio intestinal de la tabla 3 basándose en la asociación del microbio intestinal con el metabolito (por ejemplo, basándose en su correlación positiva, negativa o falta de correlación con el metabolito).
12. Preparación de polímero de glicano para su uso según la reivindicación 11, en donde el polímero de glicano es un sustrato del microbio intestinal (por ejemplo, un microbio intestinal humano).
13. Preparación de polímero de glicano para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el polímero de glicano es un sustrato de una enzima glicosidasa microbiana intestinal y promueve el crecimiento del microbio intestinal.
14. Preparación de polímero de glicano para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde la preparación de glicano
a) se administra diariamente;
b) se administra durante un único periodo de tratamiento, o
c) se administra durante más de un periodo de tratamiento, por ejemplo, en donde un periodo entre tratamientos es más largo que uno o ambos de los periodos de tratamiento adyacentes o en donde un periodo entre tratamientos es más corto que uno o ambos de los periodos de tratamiento adyacentes.
15. Preparación de polímero de glicano para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde el polímero de glicano es un sustrato para un constituyente microbiano del colon o el intestino, en donde la preparación de polímero de glicano se administra opcionalmente por vía oral o rectal.
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