BG67567B1 - Метод за количествена оценка за бързо прогнозиране и контрол на дисбиози при кърмачета на възраст от един месец до една година - Google Patents
Метод за количествена оценка за бързо прогнозиране и контрол на дисбиози при кърмачета на възраст от един месец до една година Download PDFInfo
- Publication number
- BG67567B1 BG67567B1 BG113148A BG11314820A BG67567B1 BG 67567 B1 BG67567 B1 BG 67567B1 BG 113148 A BG113148 A BG 113148A BG 11314820 A BG11314820 A BG 11314820A BG 67567 B1 BG67567 B1 BG 67567B1
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- breast milk
- sample
- feces
- infant
- dysbiosis
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 230000007140 dysbiosis Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 208000027244 Dysbiosis Diseases 0.000 title claims abstract description 21
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 title abstract 2
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 claims abstract description 56
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 claims abstract description 56
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 51
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 47
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 26
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims abstract description 25
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 241000736262 Microbiota Species 0.000 claims description 21
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 6
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 claims 1
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 claims 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 abstract description 21
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 abstract description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 15
- 238000013459 approach Methods 0.000 abstract description 7
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 abstract description 6
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 abstract description 6
- 239000008101 lactose Substances 0.000 abstract description 6
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 abstract description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 abstract description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 abstract description 5
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 41
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 40
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 35
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 34
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 33
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 28
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 26
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 25
- 150000004666 short chain fatty acids Chemical class 0.000 description 19
- 235000021391 short chain fatty acids Nutrition 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 241000894007 species Species 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 12
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 12
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 11
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 11
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 241000606125 Bacteroides Species 0.000 description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 9
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 9
- 108010061314 alpha-L-Fucosidase Proteins 0.000 description 9
- 102000012086 alpha-L-Fucosidase Human genes 0.000 description 9
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 9
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 8
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 2-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 7
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 7
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 6
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 6
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 6
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 6
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 description 6
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 description 6
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 6
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 6
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YILIDCGSXCGACV-SQKFTNEHSA-N 4-nitrophenyl alpha-L-fucoside Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 YILIDCGSXCGACV-SQKFTNEHSA-N 0.000 description 5
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 244000005702 human microbiome Species 0.000 description 5
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 4
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 description 4
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 4
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 4
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 4
- IFBHRQDFSNCLOZ-IIRVCBMXSA-N 4-nitrophenyl-α-d-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 IFBHRQDFSNCLOZ-IIRVCBMXSA-N 0.000 description 3
- 206010003645 Atopy Diseases 0.000 description 3
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 3
- 102100033448 Lysosomal alpha-glucosidase Human genes 0.000 description 3
- 208000037656 Respiratory Sounds Diseases 0.000 description 3
- 206010047924 Wheezing Diseases 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 3
- HMQPEDMEOBLSQB-RCBHQUQDSA-N beta-D-Galp-(1->3)-alpha-D-GlcpNAc Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HMQPEDMEOBLSQB-RCBHQUQDSA-N 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 229930191176 lacto-N-biose Natural products 0.000 description 3
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 2
- PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 2-(4-chloro-2-methylphenoxy)acetic acid;n-methylmethanamine Chemical compound CNC.CC1=CC(Cl)=CC=C1OCC(O)=O PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IFBHRQDFSNCLOZ-ZIQFBCGOSA-N 4-nitrophenyl alpha-D-glucoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 IFBHRQDFSNCLOZ-ZIQFBCGOSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 101000984736 Agkistrodon piscivorus piscivorus Bradykinin-potentiating peptide F Proteins 0.000 description 2
- 241001608472 Bifidobacterium longum Species 0.000 description 2
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 2
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 150000008493 L-fucopyranosides Chemical class 0.000 description 2
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 238000010818 SYBR green PCR Master Mix Methods 0.000 description 2
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 2
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000001013 cariogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 2
- LDHQCZJRKDOVOX-NSCUHMNNSA-N crotonic acid Chemical compound C\C=C\C(O)=O LDHQCZJRKDOVOX-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 208000002925 dental caries Diseases 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 229940054192 micro-guard Drugs 0.000 description 2
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 2
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- -1 p-nitrophenol α-D-glucopyranoside Chemical class 0.000 description 2
- LVZSQWIWCANHPF-UHFFFAOYSA-N p-nitrophenyl palmitate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LVZSQWIWCANHPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 2
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- OBHRVMZSZIDDEK-UHFFFAOYSA-N urobilinogen Chemical compound CCC1=C(C)C(=O)NC1CC1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(CC3C(=C(CC)C(=O)N3)C)N2)CCC(O)=O)N1 OBHRVMZSZIDDEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006533 ATP-Binding Cassette Transporters Proteins 0.000 description 1
- 102000005416 ATP-Binding Cassette Transporters Human genes 0.000 description 1
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 241001148536 Bacteroides sp. Species 0.000 description 1
- 241000186016 Bifidobacterium bifidum Species 0.000 description 1
- 241000186012 Bifidobacterium breve Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 1
- 241001430149 Clostridiaceae Species 0.000 description 1
- 208000002881 Colic Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000010445 Lactoferrin Human genes 0.000 description 1
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 description 1
- 241001453171 Leptotrichia Species 0.000 description 1
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010051606 Necrotising colitis Diseases 0.000 description 1
- 208000031662 Noncommunicable disease Diseases 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010036590 Premature baby Diseases 0.000 description 1
- 241000605861 Prevotella Species 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 description 1
- 240000007591 Tilia tomentosa Species 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- AXQLFFDZXPOFPO-UHFFFAOYSA-N UNPD216 Natural products O1C(CO)C(O)C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(NC(=O)C)C1OC(C1O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)OC1CO AXQLFFDZXPOFPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001148134 Veillonella Species 0.000 description 1
- 241001430183 Veillonellaceae Species 0.000 description 1
- AVMNFQHJOOYCAP-UHFFFAOYSA-N acetic acid;propanoic acid Chemical compound CC(O)=O.CCC(O)=O AVMNFQHJOOYCAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- HMQPEDMEOBLSQB-UFLFEMAHSA-N beta-D-Galp-(1->3)-beta-D-GalpNAc Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HMQPEDMEOBLSQB-UFLFEMAHSA-N 0.000 description 1
- AXQLFFDZXPOFPO-UNTPKZLMSA-N beta-D-Galp-(1->3)-beta-D-GlcpNAc-(1->3)-beta-D-Galp-(1->4)-beta-D-Glcp Chemical compound O([C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]([C@H]1O)O[C@H]1[C@@H]([C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O1)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)O)NC(=O)C)[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]1CO AXQLFFDZXPOFPO-UNTPKZLMSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 235000020299 breve Nutrition 0.000 description 1
- 150000004652 butanoic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940021722 caseins Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 235000013325 dietary fiber Nutrition 0.000 description 1
- 235000021004 dietary regimen Nutrition 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- UBLXEEBHYISRFM-UHFFFAOYSA-M folin's reagent Chemical compound [Na+].C1=CC=C2C(S(=O)(=O)[O-])=CC(=O)C(=O)C2=C1 UBLXEEBHYISRFM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000033581 fucosylation Effects 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 108010081954 galacto-N-biose Proteins 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M hexadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000007366 host health Effects 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 description 1
- QCQYVCMYGCHVMR-UHFFFAOYSA-N lacto-N-biose I Natural products CC(=O)NC(C=O)C(C(O)C(O)CO)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O QCQYVCMYGCHVMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088312 lacto-N-biosidase Proteins 0.000 description 1
- USIPEGYTBGEPJN-UHFFFAOYSA-N lacto-N-tetraose Natural products O1C(CO)C(O)C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(NC(=O)C)C1OC1C(O)C(CO)OC(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)C1O USIPEGYTBGEPJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 description 1
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 description 1
- 229940046892 lead acetate Drugs 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004066 metabolic change Effects 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 208000004995 necrotizing enterocolitis Diseases 0.000 description 1
- HVFSJXUIRWUHRG-UHFFFAOYSA-N oic acid Natural products C1CC2C3CC=C4CC(OC5C(C(O)C(O)C(CO)O5)O)CC(O)C4(C)C3CCC2(C)C1C(C)C(O)CC(C)=C(C)C(=O)OC1OC(COC(C)=O)C(O)C(O)C1OC(C(C1O)O)OC(COC(C)=O)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HVFSJXUIRWUHRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 201000006195 perinatal necrotizing enterocolitis Diseases 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 1
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000092 prognostic biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000009979 protective mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/10—Enterobacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2570/00—Omics, e.g. proteomics, glycomics or lipidomics; Methods of analysis focusing on the entire complement of classes of biological molecules or subsets thereof, i.e. focusing on proteomes, glycomes or lipidomes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/06—Gastro-intestinal diseases
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретението се отнася до метод за ин витро оценка и прогноза за балансиране на чревната микробиота при новородени от един месец до една година, основаващ се на интегриран подход с изчисляване на коефициенти на корелация между ключови показатели, разделени на три основни групи: 1. Корелация между състав и количество на микроорганизмите в майчина кърма и във фецес на детето; 2. Корелация между ензимен профил и активност на ензимите, отговорни за усвояването и метаболизирането на компонентите на кърмата (лактоза, липиди, олигозахариди, протеини) в проби от кърма и фецес на детето; 3. Корелация между количеството на метаболитите, получени от метаболизирането на основните компоненти на кърмата от микробиотата в кърмата и във фецеса на детето. Методът съгласно изобретението осигурява възможност за бързо прогнозиране на дисбиози при кърмачета от един месец до една година. По този начин той ще намери приложение в алгоритъма при прецизна диагностика на чревната микробиота при новородени на възраст от един месец до една година, като методът спомага и за бързо последващо установяване на вида на дисбиозата и степента на нарушение.
Description
Настоящото изобретение се отнася до областта на медицинската диагностика, фармацията, биотехнологиите.
Предшестващо състояние на техниката
Съществуват различни данни, че кърменето осигурява значителна защита срещу инфекциозни и възпалителни заболявания, различни увреждания и подобрява познавателните способности (Bartick and Reinhold, 2010; Dieterich et al., 2013; Kramer et al., 2009). Това до голяма степен се дължи на свойствата на кърмата и съдържащите се в нея олигозахариди да повлияват микробиалното колонизиране при новородените. Palmer et al. (2007) показват, че бебетата се колонизират с приблизително 107 различни вида микроорганизми през първата седмица от живота. Тези тесни взаимоотношения на организма с гастроинтестиналната микрофлора може да са в основата и да бъдат критични по отношение на здравето на новороденото, както и с риска от развитие на различни други неинфекциозни заболявания. Оптималното кърмене всъщност остава високо ефективна стратегия за общественото здраве за оцеляване на бебетата, особено за намаляване на смъртността поради гастроентерит и пневмония в развиващите се страни (Bhutta et al., 2013). Изследванията на кърменето показват защитната роля на кърмата срещу много хронични и имунни състояния, по-специално, диабет тип 1, некротизиращ ентероколит, астма и левкемия (Bartick and Reinhold, 2010).
Развитието на микробиотата в храносмилателната система на новороденото е постепенен и динамичен процес, който се определя от няколко фактора, като например начин на раждане, недоносеност, вида на хранене, свързани заболявания и антибиотичната терапия, както и от влиянието на околната среда, което налага персонализиран подход (Wall et al. 2009). Освен това процесът на колонизацията е силно повлиян от диетата (кърмата и /или изкуственото мляко). По време на първия месец след раждането бифидобактериите и колиформите (в частност Е. coli) са преобладаващи, последвани от Lactobacillus spp. и Bacteroides и се различава в широки граници между отделните индивиди (Wall et al., 2009). Промени в съотношението на доминиращите представители на чревната микрофлора на новородените се появяват след около една година от живота, главно в резултат на въвеждане на нова храна в диетата на бебето. Броят на представителите на Lactobacillus spp., Bacteroides spp. и Clostridia се увеличава, докато бифиброидите и Е. coli намаляват. Найнакрая на възраст от около 2 години, микробните съобщества в червата достигат по състав, подобен на този открит в червата на възрастните (Koenig et al. 2011). Видът Bifidobacterium longum е най-честият първоначален колонизатор на гастроинтестиналният тракт на новородените (Palmer et al., 2007).
Човешкото мляко притежава множество механизми за защита на новородените: клетки на имунният отговор, имуноглобулини, вродени защитни протеини, пептиди, свободни мастни киселини, цитокини и хемокини, гликани и олигозахариди (Ballard and Morrow, 2013). Сред различните биоактивни компоненти на човешкото мляко, олигозахаридите са най-разпространените и включват значително повече от 100 различни биоактивни въглехидрата, изградени от 3 до 32 монозахарида (Newburg et al., 2005). Като клас олигозахаридите са 6 - 12 g/L от кърмата и до голяма степен се синтезират от лактоза (Bode, 2012). Човешката коластра съдържа приблизително 22 - 24 g/L млечни олигозахариди (Newburg et al., 1995; Urashima et al., 2012). В човешкото мляко олигозахаридите са третият по концентрация компонент след лактозата и липидите и тяхното количество е доста по-високо от количеството на протеините (Newburg et al., 1995). Структурата на повече от 100 човешки олигозахариди е характеризирана до момента (Urashima et al., 2011а, b; Kobata, 2010). Характеризирането на физиологията бифидо бактериите е фокусирано в голяма степен върху способността им да метаболизират различни хранителни олигозахариди. Този род бактерии разполагат с набор от трансмембранни пермеази, осигуряващи метаболизирането на различни въглехидратни полимери, като хранителни фибри, включително човешки млечни олигозахариди, които преминават неразградени до дисталните отдели на храносмилателния тракт (Moro et al., 2006; Macfarlane and Cummings, 1999).
Съществуват данни само за няколко вида бифидобактерии, способни да метаболизират и използват, като въглероден източник човешки млечни олигозахариди. Такива видове типично са изолирани предимно от микрофлората на гастроинтестиналният тракт на новородени. Установено е, че асоциирани с новороденото бифидобактерии са способни да усвояват предимно лакто-N-тетраози (LNT) или лакто-N-неотетраози (LNnT) (LoCascio et al., 2007).
B bifidum секретира извънклетъчна 1,2-п-1-фукозидаза (ЕС 3.2.1.63), която разцепва крайни 1,2-вфукозилови връзки, които защитават галактозните остатъци в лакто-N-биоза, като по този начин позволяват продължаване на катаболитните процеси до пълното им усвояване (Katayama et al., 2004; Nagae et al., 2007). В допълнение, лакто-N-биозидаза (EC 3.2.1.140) освобождава лакто-N-биоза от лакто-N-тетраоза и от други млечни олигозахариди, в които липсва фукозилиране или сиалиране (Wada et at., 2008). Веднъж получена, лакто-N-биозата се транспортира през клетъчната мембрана от специален ABC транспортер, който интегрира лакто-N-биозо свързваща субединица (Suzuki et al., 2008; Wada et al., 2007). Известно е също така, че B. longum използва ендо-п-N-ацетилгалактозаминидаза (ЕС 3.2.1.97) за извличане на галакто-N-биоза от О-свързани муцинови гликани (Fujita et al., 2005). Всъщност, присъствието на както ендо-N-ацетилгалактозаминидаза, така и на фукозидазната активност дава възможност на В. bifidum да разгражда муцин (Ruas-Madiedo et al., 2008). Данните за усвояване на олигозахаридите от майчината кърма от лактобацилите и останалата съпътстваща микрофлора са оскъдни, като липсват конкретни корелации в посока тип ензим-ензимна активност-вид микроорганизъм-количество микроорганизми.
Метаболитите са следствие на физиологичното състояние на човешкия организъм от една страна, а от друга на физиологичната активност на съпътстващата микрофлора в интестиналния тракт. Това ги прави идеален начин за проследяване на промените, предизвикани от болестно състояние или при лечение. Оценката на количеството и разнообразието на метаболити е особено важен момент за разбирането на многобройните взаимодействия между генетика, околна среда и микробиота. В ключови точки от метаболитните процеси, където те се пресичат нискомолекулните метаболити посредничат при тези взаимоотношения.
Изследователите разглеждат микробиома, като потенциален източник на биомаркери за различни заболявания. Въпреки че това може да е плодородна зона за биомаркерите, има много примери за това, че различни метаболити могат да се свързват с едно и също заболяване, което намалява надежността им, като биомаркери.
Друг показател, чийто потенциал се изследва за биомаркер са стойностите на pH на фекални проби. Има данни, че те директно корелират с бактериалните видове, колонизиращи червата на бебето. Например установена е пряка връзка между по-ниските стойности на pH на фекални проби и значително намалени количества на потенциално патогенни бактериални популации (т. е. Clostridiaceae, Enterobacteriaceae, Peptosteptoccocaceae и Veillonellaceae). Друг пример е констатираната корелация между изобилието от специфични видове Enterobacteriaceae, които предизвикват възпаление на червата и наличие на колики при кърмачета. Тези не благоприятни ефекти могат да се дължат на факта, че липополизахаридите, получени от ентеробактерии, индуцират по-силни възпалителна активност в сравнение с други бактерии, произвеждащи липополизахариди.
Астмата е най-разпространеното хронично заболяване на детството. Установена е от канадски учени корелация между настъпващи промени в микробиома на червата при бебета до една година (дисбиоза), които повлияват развитието на астма. Изследвани са ефектите на микробиалната дисбиоза на червата върху атопичен хрип при население, живеещо в развиващи се страни с нисък икономически стандарт. Микробиални дисбиози на 3-месечна възраст се свързват с по-късно развитие на атопичен хрип. Например наблюдавана е дисбиоза при еквадорските бебета, включващи различни бактериални таксони, включително и няколко таксона микроскопични гъбички. Нивата на фекалните късоверижни мастни киселини при тримесечни бебета с атопичен хрип показват ясни тенденции на увеличена концентрация на ацетат и намалена концентрация на капронова киселина.
Някои от защитните механизми на човешкото мляко се дължат на олигозахаридите. Като се има предвид нарастващата степен на заболявания, свързани с нерегулираната микробиота и имунитет на гостоприемника, налице е глобален интерес за тестване на нови хранителни подходи и функционални храни, съответстващи на тези, открити в кърмата, за да се оптимизира здравето на гостоприемника и да се възстанови бактериалната флора. Описаните дотук данни от литературата доказват, че използваните модели на изследване както за диагностични цели, така и за контрол на микробиотата при деца на възраст до една година не могат да предоставят алгоритъм за бърза и надежна оценка състоянието на чревната микробиота и асоциирането й с различни заболявания, защото са линейни, отнесени само за един показател.
Създаването на метод за количествена оценка за бързо прогнозиране на дисбиози при кърмачета от 1 месец до 1 година и за изследване на отклонения в човешката микробиота изисква интердисциплинарен подход и при крайната оценка може да включва данните от различни методи на изследване, които се обработват като бази данни със специфични изчислителни техники.
Техническа същност на изобретението
Задачата на изобретението е да създаде метод на база ин витро количествена оценка, който да осигури възможност за бързо прогнозиране на дисбиози при кърмачета на възраст от 1 месец до 1 година, и който да намери приложение в създаване на модел (алгоритъм) за прецизна диагностика на чревната микробиота при новородени на възраст от един месец до една година, като методът спомага и бързо последващо установяване на вида на дисбиозата и степента на нарушение. Методът се базира на интердисциплинарен подход при анализ на количествения и качествен състав на микробиота, вида и количеството на ключови ензими и метаболити и анализ на данните посредством информационна система.
През последните няколко години в проучвания са разкрили, че и коластрата и кърмата от здрави жени съдържа бактерии, включително стафилококи, стрептококи, коринебактерии, млечнокисели бактерии, пропионобактерии и бифидобактерии (Fernandez et al., 2013). Напоследък прилагането на различни техники, включително и метагеномни подходи потвърди присъствието на ДНК от тези и други бактериални родове в кърмата и коластрата (Hunt et al., 2011; Cabrera-Rubio et al., 2012; Fernandez et al., 2013; Jost et al., 2013, 2014; Ward et al., 2013; Jimenez et at.,2015). Следователно, тези биологични течности са непрекъснати източници на живи бактерии към стомашно-чревния тракт (McGuire and McGuire, 2015) Други проучвания показват, че има трансфер на бактериални щамове от майка към бебето в процеса на кърмене (Albesharat et al., 2011; Martin et al., 2012; Jost et al., 2014). Въпреки някои установени корелации на количеството и състава на чревната микробиота с детекция на определени заболявания, и използваните молекулярно-биологични методи са продължителни и скъпи за ежедневната практика, което ги прави недостъпни за масова употреба. Няма установени корелационни зависимости с данните за ключови ензими и метаболити, отговорни за усвояването на специфични компоненти от коластрата и кърмата и динамиката на концентрацията им при промяна на диетата и за преодоляване на чревни дисбиози.
Някои бактерии от устната кухина на бебето могат да замърсят млякото по време на сучене поради поток на мляко обратно в млечните канали (Ramsey et al., 2004). Установено е, че в рамките на 24 часа след раждането, коластрата съдържа типични устни бактерии като Veillonella, Leptotrichia и Prevotella (CabreraRubio et al., 2012). Въпреки, че произходът на човешкия слюнчен микробиом все още е доста не добре проучен (Zaura et al., 2014), Streptococcus spp. изглежда е един от доминиращите видове както при възрастни (Nasidze et al., 2009; Yang et al., 2012) така и при бебета (Bearfield et al., 2002; Cephas et al., 2011). Стрептококите също са сред доминиращите видове в човешката коластра и кърма (Jimenez et al., 2008а, b; Hunt et al., 2011; Martin et al., 2015). Доказано е, че устното здраве на майката корелира тясно с вероятността за развитие на зъбен кариес при детето (Zaura et al., 2014). Някои съединения в човешкото мляко (например, човешки млечни олигозахариди, протеини) могат да повлияят на колонизацията на отделни видове индиректно. Например, открити са млечни протеини, като казеини и лактоферин, които имат способност да инхибират прикрепването на кариогенни стрептококи към хидроксиапатит и да насърчават прикрепването на коменсални бактерии in vitro (Johansson и Lif Holgerson, 2011). Няма проведени достатъчно мащабни и за продължително време проучвания, характеризиращи развитието на оралната микрофлора по време на неонаталният период и детството. В първоначални проучвания се е смятало, че оралната колонизация от бактерии, причиняващи зъбен кариес може да се случи след поникване на първите млечни зъби при новороденото, като по-късно обаче е доказано, че кариогенният Streptococcus mutans може да присъства в устната кухина на бебето преди появата на твърди тъкани там (Law et al., 2007).
Епидемиологичните изследвания разкриват редица експозиции в околната среда, свързани с астма. Това би могло да обясни ескалацията на астмата през последните 30 години. Бебетата, изложени на риск от астма, проявяват преходни състояния на чревна дисбиоза и промени в метаболизма (например уробилиноген) през първите 3 месеца от живота. Тези метаболитите или разликите в микробиомите се използват при проектирането на предварително за използване на пробиотици или да послужат, като прогностични биомаркери. Разработен е модел чрез комбиниране оценки на производителността на екосистемите и генерирането на екосистемни услуги за дефиницията на дисбиоза при кърмачета. Според него микробиома на червата се характеризира с:1) без смущения в състава и количествата на таксоните при промяна на диетата или приема на антибиотици; 2) висока податливост на инвазия от външни таксони; и 3) слабо използване на наличните ресурси (в т. ч. олигозахариди от кърма). Здравословното/балансираното състояние на микробиотата се характеризира, като високо функционираща екосистема, когато микробиома на червата е: 1) стабилен във времето по състав и количество на таксоните, 2) устойчив на инвазия от алохтонни бактерии; и 3) да демонстрира висока конверсия на олигозахаридите на кърмата в крайни продукти и биомаса от полза за бебетата. Този модел е агностичен по метод и индекс на избор и осигурява количествен показател и обективен подход за оценка микробиома, но е ограничен основно в данни за състава и количеството на микроорганизмите и не се базира на корелационни зависимости между състав и количество на микроорганизмите, активност на ензимите, отговорни за усвояването на олигозахаридите от кърмата и количеството на метаболитите, секретирани от микробиотата.
Настоящата заявка за патент се отнася до разработването на специфичен метод за ин витро количествена оценка за бързо прогнозиране на дисбиози при кърмачета на възраст от 1 месец до 1 година, при което се постига възможност за контрол на човешкия микробиом, като при метода, съгласно описанието се отчитат от една страна общи показатели като възраст и пол, а от друга специфичните показатели за здравословното състояние на човека. Предлаганият метод е основан на обработването на данни от анализи на разнообразието и съотношението на микроорганизмите в интестиналния тракт на детето и други телесни течности (слюнка, кърма, фецес), количество на метаболити използвани, като биомаркери и отчитане на нивото на ензимна активност на ензими, използвани като биомаркери, като се позволява отчитане на индивидуалните особености на хората.
Методът, предмет на настоящата заявка за патент се основава на интегриран подход за ин витро анализ на баланса на чревната микробиота при деца от един до дванадесет месеца и прогноза за нейното възстановяване при установена дисбиоза, посредством изчисляване на коефициенти на корелация между ключови показатели, разделени на три основни групи:
1. Корелация между състав и количество на микроорганизмите в майчина кърма и във фецес на детето.
2. Корелация между ензимен профил и активност на ензимите, отговорни за усвояването и метаболизирането на компонентите на кърмата (лактоза, липиди, олигозахариди, протеини) в проба от кърма и проба от фецес на детето.
3. Корелация между количеството на метаболитите, получени от метаболизирането на основните компоненти на кърмата от микробиотата в кърмата и във фецеса на детето.
Методът за ин витро количествена оценка за бързо прогнозиране на дисбиози при кърмачета до една година изисква следния ход на анализа:
1. Протокол за количествен анализ на човешка микробиота чрез в реално време qPCR. Представеният протокол може да се прилага за установяване на отклонения за анализ на дисбиоза при новородени от един до дванадесет месеца и да бъде включен към алгоритъм за идентифициране на състояние, отклонения и правила за възстановяване баланса на микробиотата. Чрез него ще могат да се определят количествено различни групи микроорганизми от полезната и патогенната микрофлора, които да се използват за изчисляване на съотношенията между отделните видове (таблица 1). От съществено значение за определяне степента на дисбиоза представляват съотношенията бифидобактерии/ бактероиди; лактобацили/бактероиди; (бифидобактерии+лактобацили)/бактероиди;(бифидо-бактерии+лактобацили)/дрожди;
(бифидобактерии+лактобацили)/Е. coli. Друг важен показател е съотношението между бифидобактериите и основните ензими, отговорни за усвояването на основните компоненти на кърмата (лактоза, липиди, протеини, олигозахариди).
Стойностите на отделните съотношения варират в зависимост от възрастта, здравословното състояние и диетата. Диапазонът на съотношенията при здрави индивиди е представен в таблица 6.
| Би LAB Вас Др Би Е а- С- a- Lip Pro Μ фи ter aw фа cob да! gat fuc ase tea em df old du du/ act att mi se аб es asi an das on 5 des das e am е e μ | |||||||
| we Sacreraitfes Дрожди | |||||||
| £_ еоМ а- | — | ______ 1 | |||||
| в-gatactasfdasn | |||||||
| a-fucosidosc Lipase Protease | — | --- | |||||
| | | |||||||
| Метаболити | L | 1 |
BG 67567 Bl
Таблица 1. Модел на съпоставяне на данните от изследваните 12 показатели.
2. Анализ на ензими в проби от майчина кърма и фецес от деца от един до дванадесет месеца, които са отговорни за метаболизирането на основните компоненти на кърмата (лактоза, олигозахариди, липиди, протеини - β-галактозидаза, α-галактозидаза, а-глюкозидаза, β-глюкозидаза, α-фукозидаза, липаза, протеаза). За целите на метода се изчисляват съотношенията между отделните ензими, което дава информация за типа на метаболитните процеси, които се осъществяват, а от друга страна дават информация за капацитета на полезната микрофлора за поддържане баланса на чревната микрофлора. Ензимът α-фукозидаза дава пряка информация за потенциала на адхезия на полезната микрофлора (бифидобактерии и лактобацили) върху епителните клетки на чревната лигавица, докато останалите ензими дават информация за скоростта на размножаване на полезните микроорганизми и мястото им с тази специфична екологична ниша. Данните за количеството на ензимите корелират с данните за количеството метаболити, установени в съответните проби. Диапазонът на съотношенията на стойностите на ензимните активност е описан в таблица 6.
3. Анализ на количеството късоверижни мастни киселини в проби от кърма и фецес на бебета от един до дванадесет месеца. Количественият анализ на лактат, ацетат пропионат и бутират в проби от кърма и фецес на бебета на възраст до една година дават обективна информация за метаболитните процеси осъществявани и с участието на съпътстващата микробиота. Наличие на късоверижни мастни киселини е пряко потвърждение за функционалната активност на бифидобактериите и лактобацилите. Съотношението между отделните групи микроорганизми, описани в първа точка на предлагания метод и количеството на късоверижните мастни киселини предоставя съществена информация за баланса на микробиотата и за нейното функционално състояние. Освен това за целите на предлагания метод могат да се изчислят съотношенията между ензимните активности на ензимите от втора точка (вторият етап на анализа) и количеството на късоверижните мастни киселини. Диапазонът на съотношенията на стойностите на ензимните активност е описан в таблица 6.
4. Изчисляване корелационните зависимости между съотношенията на отделните компоненти за дефиниране на статуса на микробиома при деца от един до дванадесет месеца. Предлаганият от нас ин витро модел за определяне на чревната дисбиоза при деца от един до дванадесет месеца, като състояние на специфичната екологична ниша в интестиналния тракт, корелиращо с намаляване на риска от остри и хронични заболявания. Освен това моделът може да предоставя рамка за оценка на ефективността на стратегии за превенция и лечение на чревни дисбиози.
Примери на изпълнение на изобретението
Пример 1
Ин витро изследване на 12 показателя по оценка на баланса на микробиотата при бебета от един месец до дванадесет месеца:
1. Протокол за количествен анализ на човешката микробиота чрез в реално време qPCR.
Представеният протокол може да се прилага за установяване на отклонения за анализ на дисбиоза при новородени от един до дванадесет месеца и да бъде включен към алгоритъм за идентифициране на състояние, отклонения и правила за възстановяване баланса на микробиотата.
А. Праймери и флуоресцентно белязани сонди за провеждане в реално време qPCR детекция на бактериални групи и видове в проби от таргетните групи.
Праймерните двойки и флуоресцентно белязани сонди за провеждане в реално време qPCR детекция на бактериални видове и съобщества и в проби от таргетните групи са представени в таблица 2
Таблица 2. Праймери и флуоресцентно белязани сонди за провеждане в реално време qPCR детекция на бактериални групи и видове в представеното изследване.
| Ttprentt Ойитришпа груп· ИМ пял | ПргВчгрки инди | HaTirfttWK i | |
| Bifidobacterium ip. | Bif-F Bif-R | TCGCGTC KGGTGTGAAAG CCAC ATCCAGCRТССАС | Rinffita e! cl!, 2004 ____________________[, |
| iumr/ildel, Г r t v е 1 t i i a FcWsfiiyrmtioriiH | BPP-F BPP-R | GGTGTCGCrCTTA AGTGCCAT CGGAYGTAAGGGCCGTGC | tiirwia fl al. 20&t |
| Loctobucilius | Lacb-F 1 .act*· Fl | AGCAGTAGGGAATC ГГССА CАСГПСТАСACACATGGAG | Wafer ci ui.. iWf Heitigfio!t |
| Bijidchaetemirrt | F Bifid 04c RBiHd 06 | CGGGTGAGTA ATGUGTG ACC TGATAGGACGCGACCCCA | Fuw ei a! |
| Bacteraidei, PrcvotcHe | F Barter II R Bartct 08 | CCTWCOATGGATAGGGGTT C ACGCTACTTCXXTTGGTTCA G | Fuki et uL 2i?(W |
| Luctiihailllti» Ltueotoitnc, РеЛостСгит | FJ.actt DS R L-Mto tM | agc act aggg a atcttcc a cgccactggtgttcvtccatata | Fum ft tit-. 1009 |
| Тотална 4pciha бактериални микрофлора | F Ban 1369 R~Prokl4« | cggtgaatacgttcccgg tacggctaccttgttacgactt | cl pl,. lOM |
| F CkptOD RCiept DU | CCTTCCGTGCCQSAGTTA GAATTAAACCACATACTCCACTOCTT | Fwct ct at 1009 | |
| CiaiSritiivm ctxcaitlei | FCcoc 07 R_Ccoc 14 | GACGCCOCGTGAAGGA AGCCCC AGCCTTTC ACATC | Fiwt etat. 1009 |
| Bifiitfibaeieriiiirt | сонда P_Bifid | tFAM-CTCCTGGAAAC6<4i TG-HHQ-I | Furet at at.. 2009 |
| Butltrfildfi, Pwalella | OWJW PBkJOj | HEX-AAGGTCCCCCACATTG- bmq-i | Atanzcfat, 1996 |
| To Тил на ЧрбКна бактериална ни ирофлпра | Сонда P TMISIOF | ό F A M*CTTG T A C A C ACCGCCC □ ТС BHQ-I | Sublet ft al., 2000 |
| Ootfridutm itptum | Сонда FclepOl | 6FAM- CACAATAAGTAATCCACCBHQ- | Fortt tint.. 2009 |
| ' Clwiridwm eocenides | Сснкля F_Lr«4H2 | HEX- CGGTACCTGACTAAGAAGUHQ*I | Frenis eta), i9Wi |
BG 67567 Bl
2. Контролни бактериални щамове
Бактериални щамове, използвани за контрол на специфичността на използваните праймери и белязани сонди, както за количествена оценка на отделни бактериални видове и съобщества са представени в таблица 3. Използваните щамове са закупени от Националната банка за промишлени микроорганизми и клетъчни култури (НБПМК) и German collection of Microorganisms and cell cultures (DSMZ). Щамовете се култивират аеробно или анаеробно в селективни хранително среди, съгласно препоръките на НБПМК и DSMZ. От развитите култури за всеки щам се правят серии от разреждания, които се поставят върху съответната агарова среда в петрита, за да се определи общ брой бактерии-колоно-образуващи единици (CFU). Допълнително от направените разреждания се вземат проби от по 1,0 ml, които се центрофугират при следните условия: 12000 rpm/3min. Получените утайки от бактериални клетки се съхраняват при - 80°С до използването им за анализ.
Таблица 3 Контролни бактериални щамове използвани в изследването
| Щди | Hrwmrc | Првлакпик n rtsoMM ДНК ιψ· ipeuaw PCR _ |
| Lactobacillus deibruectit subip. ButgarKus 1113-2 T | ΗΕΠΜΚΚ | детекция нв Lactnhaciilus, без югалаванс нд флуоресцентни сонди |
| Laciobacillm acidophilus IBW T | НБПМКК | летеици* на Laetabaciifus, 6ci нцгщшмне на флуоресцентни сити |
| tjiiiiituKittui rhuittnasur 1010 T | HbilMKK | детекция на Loctolmciil^ без нзпалавзнг на фтуорссисиши сонди |
| BtfiitebacteruM longvm iubsp. inngum DSM*20219 | DSMZ | детекция на Bifidobaciermni, без използване на флуоресцентни «ндИ |
| Bacieraidet /rugllil DSM-2151 | DSMZ | детекция нв без нзпшшше на флуоресцентни ишдн |
| ndulescintis 3 | DSMZ | детекция па Bifidirhticteriitm, с флуоресцентно белязани сонди |
| BifidobtKiifrmm Icmgwn sutsp. infunhs D$M-2M88 | D5MZ | детекция на Bijidiibacterium, е флуоресцентно белязани сонди |
| Bifidobacterium breve DSM-202 i J | DSMZ | детекция на Bifidobacterium, с флуоресцентно белязани сонди |
| Ch>slridiun> tepirtm ΟΐΜ-753 | DSMZ | детекция кд с флуоресцентно белязани сонди |
| Clostridium eoeeoidtt (Siautla iueeoidts) D5M-935 | DSMZ | детекция нв Closindium е флуоресцентно бета йнн сонди |
BG 67567 Bl
3. Изолиране на ДНК от бактериални култури и проби от таргетните групи
Бактериалната геномна ДНК от контролните щамове и изолати от проби на таргетните групи се екстрахира чрез използване на Blood and Tissue kit DNeasy (Qiagen, Hilden, Germany).
Микробиална ДНК от фекални проби и от кърма се изолира QIAamp DNA Stool mini kit (Qiagen, Hilden, Germany). Първоначално 200 mg фекална проба/кърма се разреждат с 1,8 ml стерилен Pbs буфер. Към 200 μΐ разредена фекална проба се прибавят 20 μΐ лизозим (150 mg/ml) и 130 μΐ лизиращ буфер (2,0 Mm Na2EDTA; 20 Mm Tris-HCL; 1,2 1.2% Triton X-100). Сместа се инкубира при 37°С за 30 min, след което се изолира ДНК.
4. Количествено определяне на ДНК
Количеството и честотата на бактериалната геномна ДНК изолирана от щамовете стандарти и от изследваните проби се определя спектрофотометрично. За целта се определя абсорбцията на подходящо разредените проби ДНК при дължини на вълните 260 nm и 280 nm. Измерванията се извършват на спектрофотометър Shimadzu UV-2600 при светлинен лъч 8,5 mm, след нулиране на апарата срещу кювета с елуираш буфер. Еднородността на геномната ДНК се определи чрез визуализиране на изолираната ДНК в 1% (w/v) агарозен гел чрез електрофореза и оцветяване с етидиев бромид. Пробите с изолираната ДНК се съхраняват при -20°С.
5. Провеждане на В реално време qPCR
В реално време qPCR реакциите за детекция и количествено определяне без използване флуоресцентни сонди се използва SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Реакциите се залагат в 96-ямкови плаки с краен обем на всяка 25 μΐ. Реакциите се провеждат в реално време PCR CFX96 Touch (BIO-RAD) с версия на софтуера 3.0.1224 при условия за всяка от целевите групи посочени в таблица 4.
Таблица 4 Праймери и реакционни условия за провеждане на в реално време qPCR за количествено определяне на бактерии във фекални проби.
| ДряЦямрн· дмМкя | Целеи срути | Реанштта умвшц it |
| Bi UF и Bif-R 1 | Bifiiiubaclcrimii | Прий мери - 0,5 μ М всека; Предснстураиия-З m in^5 *C; Дсщтурзцш - |5 “C; Свързивпе па ираймерите 20 , Уям*авднс “ 30 sci/72 X; Детекция )0 «сХОХ; Брой тгижлн - 35- |
| BPP-F в BPP-R | Улгркугптопт | ПрЙЙиерц -0.5 дМ кскч; Прсжнитурапиг - 5 ntih/95 X; Дсииураци* |5«t/95X; Свързване на праймсрнте - 20 “С; Улължааше - 30 sec/72 X; Детекция - 30 ЗСС&О X; Брой цикли -35. |
| Latb-F и | LaclabaciHia | Праймери 0,5 μΜ вмкн; Преде мкггураиил - 5 Ηΐίη/95 X; Дсн^тураляя - 15 sw-45 X: Свързване на праймерате - 20 «с/58 X; Удъ-1г*нва1»е - 30 мс/72 X; Детекция - 30 kCSO X; Брой инклн-35. |
F Jjirto 05 и R_Latie> 04
Првймер^ - 0,2 μ M Ьсекн; Прсде(|щгу1И11нв - 10 min'95 Деиятурацня - 30 soc^S X; € вързване на пряймсрлтс - 30 («Μ X;
Удио*айанг I min.T2 °C;
Детекция - 30 тес/ЯО *С Брой цнклц Ю.
BG 67567 Bl
В реално време qPCR реакциите за детекция и количествено определяне на бактерии с използване на флуоресцентно белязани сонди се използва TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Реакциите се залагат в 96-ямкови плаки с краен обем на всяка реакция 25 μΐ. Условия за провеждане на всеки от анализите за определяне на целевите групи бактерии са посочени в таблица 5.
Таблица 5. Праймери, флуоресцентни сонди и реакционни условия за провеждане на В реално време qPCR за количествено определяне на бактерии във фекални проби.
| ПраЬмкрпдм&к* | Целеи група | yr И детекция |
| 1 F Bifid 09c, R Bifid 06. сонда | Bifidobacterium | Прдймсри - 0,2 μ M всеки; Сонда - 0,2 μΜ: Преленатурацил - 10 min^S C; Денатурацчя - 30 sec/95 ΎΖ; Удължаване на нраймерте н детскина = 1 τηϊπ/60 С: Spoil цикли = 40. |
| F Bactcr 11, R Banter OS, сонда РВасЗОЗ | Bacteniide*. Prevaietla | |
| F Bart 1369. R 1492, сонда | Определяне на общо кпличегтно бактерии | |
| F Ckpt 09, R Clepi 08, сонда PilepOl | Clostridium leprum | |
| F CcocOT, R Ccoc 14, сонда P”Erec482 | Ciostndt urn caecaides |
BG 67567 Bl
Всички В реално време qPCR анализи на количествено определяне на бактерии във фекални проби и кърма се провеждат с минимум двукратно повторение от различни анализи.
6. Електрофоретичен анализ на ДНК фрагменти, получени след провеждане на В реално време qPCR.
За проверка на размера и интегритета на амплимерите, получени след провеждане на В реално време qPCR, се провежда агарозна гел-електрофореза на реакционните продукти. Разделянето на фрагментите, ДНК се извършва в 2% агарозен гел, при напрежение 35 V и 25 mA сила на тока. Разделените фрагменти се визуализрат флуоресцентно - чрез обработка на гела с етидиев бромид и осветяване с UB светлина. Приблизителните размери на ДНК фрагментите се определят чрез съпоставка със стандар, съдържащ малки ДНК фрагменти с известни размери - SmartLadder SF (Eurogentec, Belgium).
7. Статистическа обработка на данните
Статистическата обработка на данните и тяхното графично представяне се извършват със софтуер SYSTAT версия 13.2 и SigmaPlot версия 12.0 (Systat Software Inc., USA).
Анализ на ензими в проби от майчина кърма и фецес от новородено
1. Определяне на ензимна активност на β-галактозидаза (ЕС 3.2.1.23)
Ензимната реакция се проведе при условия: 100 тМ натриево ацетатен буфер, pH 6.0, съдържащ 2 тМ разтвор на о-нитрофенил-З-О-галактопиранозид (ONP-Gal) и подходящо разредени клетки или надутаечна течност след дезинтегриране на клетките при 37°С Реакцията се спира с 1 М натриев карбонат. Една единица активност на ензима катализира получаването на 1.0 pmol о-нитрофенол за една минута при pH 4.0 и 37°С. Съдържанието на о-нитрофенол се определя спектрофотометрично при 410 nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800.
Всички експерименти за определяне на ензимната активност са проведени с трикратна повтаряемост.
2. Определяне активността на α-галактозидаза (ЕС 3.2.1.22)
Ензимната реакция се проведе при условия: 400 тМ цитратен буфер, pH 4.0, съдържащ 9.9 тМ разтвор на р-нитрофенил a-D-галактопиранозид (PNP-Gal) (приготвя се в дестилирана вода чрез разтваряне на рнитрофенол a-D-галактопиранозид, Sigma кат. N.« N-0877) и подходящо разредени клетки или надутаечна течност след дезинтегриране на клетките при 37°С. Реакцията се спира с 200 тМ боратен буфер, pH 9.8. Една единица активност превръща 1.0 qmole от р-нитрофенил a-D-галактопиранозид в о-нитрофенол и D-галактоза за една минута при pH 4.0 и 37°С.
Съдържанието на р-нитрофенол се определя спектрофотометрично при 405 nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800.
Всички експерименти за определяне на ензимната активност са проведени с трикратна повтаряемост.
3. Определяне активността на α-L - фукозидаза (ЕС 3.2.1.51)
Ензимната реакция се проведе при условия: 100 mМ цитратен буфер, pH 6.5, съдържащ 10 mМ разтвор на р-нитрофенил a-L-фукопиранозид (PNP-FUC) (приготвя се посредством разреждане на р-нитрофенил a-Lфукопиранозид (Sigma кат. № N3628) с дестилирана вода и подходящо разредени клетки при 37°С . Реакцията се спира с 200 mМ боратен буфер, pH 9.8. Една единица активност превръща 1.0 pmole от р-нитрофенил a-Lфукопиранозид в р-нитрофенол и L-фукопиранозид за една минута при pH 4.0 и 37°С. Съдържанието на рнитрофенол се определя спектрофотометрично при 405 nm дължина на вълната на спектрофотометьр Beckman Coulter DU 800.
Всички експерименти за определяне на ензимна активност са проведени с трикратна повтаряемост.
4. Определяне активността на α-глюкозидаза (ЕС 3.2.1.20)
Ензимната реакция се проведе при условия: 100 mМ ацетатен буфер, pH 6,0, съдържащ 1.25 mМ разтвор на р-нитрофенил a-D-глюкопиранозид (приготвя се посредством разреждане на р-нитрофенил a-Dглюкопиранозид (Sigma кат. № N3628) с дестилирана вода, и подходящо разредени клетки при 37°С. Реакцията се спира с 0.5 М натриев карбонат. Една единица активност превръща 1.0 pmоlе от р-нитрофенол a-D-глюкопиранозид в р-нитрофенол и D-глюкопиранозид за една минута при pH 6.0 и 37°С. Съдържанието на р-нитрофенол се определя спектрофотометрично при 405 nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU800.
Всички експерименти за определяне на ензимна активност са проведени с трикратна повтаряемост.
5. Определяне активността на β-глюкозидаза (ЕС 3.2.1.28)
Ензимната реакция се проведе при условия: 0.1 М ацетатен буфер, pH 5.0, съдържащ 20 mM разтвор на р-нитрофенил-b-D-глюкопиранозид (ONP-Glu) и подходящо разредени клетки при 37°С. Реакцията се спира с 0.2 М натриев карбонат. Една единица активност превръща 1.0 pmole от р-нитрофенил a-D-глюкопиранозид в р-нитрофенол и D-глюкопиранозид за една минута при pH 5.0 и 37°С. Съдържанието на р-нитрофенол се определя спектрофотометрично при 405 nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800.
Всички експерименти за определяне на ензимна активност са проведени с трикратна повтаряемост.
6. Определяне активността на протеаза
Протеазната активност на клетките и надутаечната течност (HYT) се изследва в присъствие на казеин (Fluka) като субстрат. Една единица (U) активност на протеазата се дефинира като количеството ензим, което хидролизира казеина до 1 pmol тирозин за 1 минута, при pH 7,5 и 37°С.
Ензимната реакция се провежда при следните условия: в 50 mМ фосфатен буфер, pH 7,5 се разтвяря 0,65% (w/v) казеин и 1,0 ml подходящо разредена проба (клетки или HYT). Реакцията протича за 10 min при 37°С на водна баня. Реакцията се спира с добавяне на 110 тМ трихлорооцетна киселина (ТХО) (Merck) при 37°С. Пробите се инкубират с ТХО за 30 минути при същата температура. За отделяне на неразградения казеин, пробите се центрофугират при 9000 об./15 min, 4°С. Надутаечната течност се анализира за количество освободен тирозин, от разграждането на казеина, в присъствие на 500 mM NazCOs и 0,5 М разтвор на Фолин реагент (Merck) при 37°С за 30 минути. Измерва се абсорбцията при Z = 660 nm (А660) на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800, спрямо контрола, съдържаща вместо проба дестилирана вода. От измерената А660 по стандартна права се определя концентрацията на тирозина (pmol). За построяването на стандартна права се използва като стандарт L-тирозин (Sigma-Aldrich).
Всички експерименти за определяне на протеазна активност са проведени минимум с трикратна повторяемост.
7. Определяне активността на липаза (ЕС 3.1.1.3)
Ензимната реакция се проведе при условия: 0.1 М ацетатен буфер, pH 7,6, съдържащ 0,8 mМ разтвор на р-нитрофенил-палмитат и подходящо разредени клетки при 37°С. Реакцията се спира с 0.2 М оловен ацeтат lеаd (II). Една единица активност превръща 1.0 pmole от р-нитрофенил палмитат в р-нитрофенол и палмитат за една минута при pH 7,6 и 37°С. Съдържанието на р-нитрофенол се определя спектрофотометрично при 405 nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800.
Всички експерименти за определяне на ензимна активност са проведени с трикратна повторяемост.
Анализ на късоверижни мастни киселини в проби от кърма и фецес на бебета от един до дванадесет месеца.
За показването на късоверижните мастни киселини в пробите от екскременти е разработен следният протокол:
1. Изолиране на късоверижни мастни киселини от екскременти.
Към 100 mg прясна фекална проба или майчина кърма се добавя 2% НзРО4 или 0,05% H2SO4 в съотношение 1:10. Пробите се хомогенизират много добре на вортекс 2 пъти по 2 min. Полученият хомогенизат се центрофугира 10 min, 13 000 rpm, след което се отделя супернатанта. От супернатанта се вземат 200 pL, които се екстрахират с 200 μL органичен разтворител (CH2CI2, AcCN, EtOH, EtOAc). Пробите се хомогензират, след което се центрофугира 5 min, 13 000 rpm. Полученият органичен слой се отделя и подлага на HPLC анализ.
2. HPLC метод за анализ на късоверижни мастни киселини.
Използвана е HPLC ситема Konik-Tech (Испания) снабдена с колона Aminex НРХ-87Н Ion Exclusion Column (7.8 mm i.d. x 30 cm, Biorad, Richmond, СА) и предколона Micro-Guard Cation-H (4.6 mm i.d. x 30 mm, Biorad). Определянето на пробите е осъществено с UV детектор при дължина на вълната 210 nm, при подвижна фаза 0,005М H2SO4, скорост на потока 0,6 ml/min и температура на колоната Т = 40°С.
Идентифицирането на пиковете е осъществено по времената на задържане спрямо стандарти на късоверижни мастни киселини: млечна киселина, оцетна киселина, пропионова киселина и бутенова киселина. За количественото определяне на късоверижните мастни киселини са изготвени стандартни прави в концентрации 25 - 1,56 mmol/L. Изведени са корелационни уравнения, описващи площа на ника (у) и концентрацията на късоверижните мастни киселини (х, mmol/L). Стандартните прави са с линейни участъци между 25 - 1,65 mmol/L и с коефициент на корелация 2 > 0,9999.
| | Параметри | Кърма | Фецес |
| | Видове микроорганизми | ||
| 1 1. Бифндобактсрни | 10-10* | |
| 2 Лактобацилн | 1040* | 10М0* |
| 3. Клостридин | ПВ-10* | |
| 4. Bacte™ deles | * | J0M0? |
| 5. Ентероюки | 1О5-1О7 | KH-IO |
| 6 Е. кол и — типични | - | |
| 7- Дражлоподобни гъбички от род Candida | - | 103-1 ¢5 |
BG 67567 Bl
| 1. Алфв-галактозндаза (U/mg протеин 1 | 0,1 АЗ | 0JA1 |
| 2. Бета-гапактозидата (П/mg протеин) | 0,4-2,0 | 0,2-1,0 |
| 3. Алфа-П юкозндаза (U/mg протеин) | 0,2-1,2 | 0.1 А5 |
| 4, Бста-глютпндвза (U/mg протеин) | одая | одая |
| 5. А глфа-фукозиддча (U/mg протеин) | одая | 0,05 АЗ |
| 6. Липата (IJ/mg протеин) | ||
| 7. npoTtaia (U/mg протеин) | 0,5-3,0 | 0,2-1.5 , |
| Мета&олнти | ||
| 1. Млечна кисел н на {mmol/g) | 0.5-1.2 | 0,2-0.8 |
| 2. Опетни киселина (mmol/g) | 0,2-0,6 | 0,3-0,7 |
| 3. Пропионова к нсслин a 1mmoi/g) | 0JA3 | 0,05-0,3 |
| 4. Маслена киселина (mmol'g) | 0.05-02 | 0,02-0.13 |
Таблица 6. Диапазон на стойностите на измерваните показатели при здрави деца на възраст от един до дванадесет месеца.
В резултат на проведените анализи на тестваните майчина кърма и фецес от новородено на възраст между един и дванадесет месеца се изчисляват следните коефициентни съотношения:
- количеството Бифидобактерии/Бактероиди >1.0;
- количеството Бифидобактерии/Лактобацили >1.0;
- количеството Бифидобактерии+Лактобацили/Бактероиди >1.0;
- количеството Бифидобактерии+Лактобацили/Дрожди (за фецес от детето) >1.0;
- количеството Бактероиди/Дрожди (за фецес от детето) >1.0;
- количеството Бифидобактерии+Лактобацили/Е. Коли >1.0;
- количеството Бифидобактерии+Лактобацили/активност на бета-галактозидаза при съотношение от 0,1 - 1,0;
- количеството Бифидобактерии+Лактобацили/активност на алфа-фукозидаза при съотношение от 0,1 > 1,0;
- ензимните активности бета-галактозидаза/алфа-галактозидаза при съотношение от 0,1 > 1,0;
- ензимните активности бета-галактозидаза/алфа-фукозидаза при съотношение от 0,1 > 1,0;
- ензимните активности бета-галактозидаза/липаза при съотношение от 0,1 > 1,0;
- ензимните активности бета-галактозидаза/протеаза при съотношение от 0,1 > 1,0;
- ензимните активности бета-галактозидаза+алфа-галактозидаза/алфа-фукозидаза при съотношение от 0,1 >1,0;
- метаболитите млечна киселина/оцетна киселина/маслена киселина при съотношение от 0,1 > 1,0.
BG 67567 Bl
Където:
1. С - съотношение между числеността на бактерии (ензими, метаболити) А и В;
2. А - численост на бактерии (ензими, метаболити) А;
3. A nom.min. - долната граница на нормата за численост на бактерии (ензими, метаболити)А;
A nom.max. - горна граница на нормата за численост на бактерии (ензими, метаболити) А; В - численост на бактерии (ензими, метаболити) В;
В nom.min. - долната граница на нормата за численост на бактерии (ензими, метаболити) В;
В nom.max. - горна граница на нормата за численост на бактерии (ензими, метаболити) В.
Тенденциите при отчитане на съотношенията са изразени в таблица 7, които се получават при съответното съотношение на показателя от колоната на таблицата към показателя реда на таблицата.
BG 67567 Bl
Бифидо
LAB
Bacteroides
Дрожди
Бифидо+МКБ
E. coli «- galactosidase в-gatactoiidase a-fucasidase
Lipase
Protease
Метоболити
| Би | LAB | Вас | Др | Би | Е. |
| фи | ter | от | фи | cofl | |
| да | aid | ди | до+ | ||
| МК |
Б
| а- | в | σ- | up | Pro | Me |
| gal | № | O5C | tea | I7T0 | |
| ЕГ€£ | act | asi | se | ||
| OS) | das | urn | |||
| dos | das | е | U | ||
| е | е |
Таблица 7. Тенденции на съотношенията между отделните показатели, със стрелка нагоре се отбелязва положителен ефект върху микробиотата, а със стрелка надолу отрицателен ефект върху микробиотата.
Пример 2.
Ин витро изследване на 6 показателя по оценка на баланса на микробиотата при бебета от един месец до дванадесет месеца:
1. Протокол за количествен анализ на човешка микробиота чрез в реално време qPCR.
Представеният протокол може да се прилага за установяване на отклонения за анализ на дисбиоза при новородени от един до дванадесет месеца и да бъде включен към алгоритъм за идентифициране на състояния, отклонения и правила за възстановяване баланса на микробиотата.
А. Праймери и флуоресцентно белязани сонди за в реално време qPCR детекция на бактериални групи и видове в проби от таргетни групи
Праймерните двойки и флуоресцентно белязани сонди за провеждане на в реално време qPCR детекция на бактериални видове и съобщества в проби от различни таргетни групи са представени в таблица 8
Таблица 8. Праймери и флуоресцентно белязани сонди за в реално време qPCR детекция на бактериални групи и видове, използвани в представеното изследване
| TftprrTUI баГПфШдв» група ИЛИ МНО | ПрвЖмсрни СОПДН | 5*3 | HiTwmur |
| Bifidatsacterium sp. | Qif-F ЖСК | TCGCGTC YGGTGTGA A AG CC AC АГСС AGC RTCCAC | Rinlftlu eiaL, 2004 |
| Вас tetuides, Р r е v d t с 11 a, Porpfyrun/ιηίΙ, | dpp-f ЯРР-R | GGTGTCGGCTTA AGTGCCAT CGG A YGTA AGGGCCG TGC | Binifiln ei ai. |
| Lactobacilli | Lacb-F Lacb-R | AGCAGTAGGGAATC ГГССА C ACCGCTAC AC AC ATOG AG | Waiter el til.. 2001 2001 |
| Btfidoftaclerium | F_Ili|id09c I 06 | CGGGTGA GTA Al GCG TG ACC TGATAGGACCCGACCCCA | Furetet al., 2009 |
| Bacteroidei, Prcvofiila | F_Bactcr 11 R_Bactcr OS | CCTWCG ATGG A1AGGGGTT CACGCTACTTGGCTGGTTCAG | Puret etal, 2009 |
| LaciahaciilMt, Leμζvη os 1 pc, Pediacoccus | F_Lacio 05 R^Laclo 04 | AGC AGTAGCiG A ATCTTCC A CGCC ACTGGTGTTC YTCC ATATA - - | Pitret er ai.t 2009 1 |
BG 67567 Bl
2. Контролни бактериални щамове
Бактериални щамове, използвани за контрол на специфичността на използваните праймери и белязани сонди, както и за количествена оценка на отделни бактериални видове и съобщества са представени в таблица 2. Използваните щамове са закупени от Националната банка за промишлени микроорганизми и клетъчни култури (НБПМК) и German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ). Щамовете се култивират аеробно или анаеробно в селективни хранителни среди, съгласно препоръките на DSMZ и НБПМК. От развитите култури за всеки щам се правят серия от разреждания, които се посяват върху съответната агарова среда в петрита, за да се определи общ брой бактерии - колоно-образуващи единици (CFU). Допълнително, от направените разреждания се вземат проби от по 1,0 ml, които се центрофугират при следните условия: 12000 rpm/3min. Получените утайки от бактериални клетки се съхраняват при -80°С до използването им за анализ.
Таблица 9. Контролни бактериални щамове, използвани в изследването.
| Щам | HjTvHinik | Приливни щ гтвкная ДЦК npw ruJb din« HR |
| Lactobacillus deibrueekii зиЬзр, BulgonciL! 1132 Т | НБГ1МКК | Детекция ня Lactobacillus, Get изполааанс на флуоресцентни сонди |
| Lactobacillia acidophilus Α89ά Т | НБПМКК | петекшн па Lactobacillus. без използване на флуоресцентни сонди |
| Laclobacitiia rhamtu/xiu 1-010 1 | НБПМКК | дстсяния на LactfrbtiLiliux, без тпотшмне на флуцресцеггтни сонан |
| Bifidfd>actcrium tongam subsp, Amgum DSM-3Q2I9 | DSMZ | детекция иа Bifidobacterium, без използване на флуоресцентни сонди |
| BacteroidcJJragdis DS M-2151 | DSMZ | детекция на Bacte^ides. без изполляалс на флуоресцентни сонди |
| Bifidobacterium adtdnscertii.t DSM*2OO8j | DSMZ | детекция на Bifidobacterium, с флуоресцентно белязани сонди |
| Bifidobacterium Itmgum iubsp. Infinitis DSM-200S8 | DSMZ | детекция на Bifidobacterium, е флуоресцентно белязани сонди |
| Bifidohctclerium breve DSM’20213 | DSMZ | детекция на Bifidobacterium. е флуоресцентно беляздни сонди |
| C/tumdium leptum DSM-75J | DSMZ | детекция на Clostridium с флуоресцентно белязани сонди |
| Clostridium caccaidex ifHuuiia coceoidej} DSM-9JS | DSMZ | детекция иа Closfr/dtum с флуоресцентно белязани сонди |
BG 67567 Bl
3. Изолиране на ДНК от бактериални култури и проби от таргетните групи
Бактериална геномна ДНК от контролните щамове и изолати от проби на таргетните групи се екстрахира чрез използване на Blood and Tissue kit DNeasy (Qiagen, Hilden, Germany). Микробиална ДНК от фекални проби и от кърма се изолира чрез използване на QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Първоначално 200 mg фекалната проба/кърма се разрежда в 1,8 ml стерилен PBS буфер. Към 200 μΐ разредена фекална проба се добавят 20 μΐ лизозим (150 mg/ml) и 130 (лизиращ буфер (2,0 mM Na2EDTA; 20 тМ TrisНС1; 1,2% Triton X-100). Сместа се инкубира при 37°С за 30 минути, след което се изолира ДНК.
4. Количествено определяне на ДНК
Количеството и чистотата на бактериалната геномна ДНК изолирана от щамовете стандарти и от изследваните проби се определят спектофотометрично. За целта се определя абсорбцията на подходящо разредените проби ДНК при дължини на вълните 260 nm и 280 nm. Измерванията се извършват на спектофотометър Shimadzu UV-2600 при светлинен път 8,5 mm, след нулиране на апарата срещу кювета с елуираш буфер. Еднородността на геномната ДНК се определи чрез визуализиране на изолираната ДНК в 1% (w/v) агарозен гел чрез електрофореза и оцветяване е етидиев бромид. Пробите с изолираната ДНК се съхраняват при -20°С.
5. Провеждане на В реално време qPCR
В В реално време qPCR реакциите за детекция и количествено определяне на бактерии без използване на флуорсцентни сонди се използва SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Реакциите се залагат в 96-ямкови плаки с краен обем на всяка реакция 25 pL. Реакциите се провеждат на В реално време PCR CFX96 Touch (BIO-RAD) с версия на софтуера 3.0.1224 при условия за всяка от целевите групи бактерии, посочени в таблица 10.
Таблица 10. Праймери и реакционни условия за провеждане на В реално време qPCR за количествено определяне на бактерия във фекални проби.
| 1 | Цч|«ж* група | уздм· а ЙГПКЩМ L |
| ЗГ-F н Bif R | mfidetiacurium | пдоиерн - 0.5 um всеки; Прсденатураика S min/95 °C; - 15 IC; Свързване на премерите - 20 «a/ii Tl; Удължаване -= 30 ксг73 °C; Детткаииа 30 десЦЮ °C; Брой uukjih - J5, |
| ΕϊΡΡ-F н HPP-R 1 | f'nrphyromamii | Праймери -0,5 μΜ всеки; П редени т^рация — 5 пйпОД f; Денатурадця = 15 -С; СвърЗЬалС на праймернтс - -0 5Съ:68 *С. I Удължаване — J0 ЗсС/72 С; Д«е*ШИ- 30 кс/ВД | Брой анали - 35. |
| Lacb-F и Lteb-Я | Праймери - 0,5 μΜ всеки; Преде нитурдии! — 5 °C: Денатураиля - [5 я&45 *С; Свързване на праймерте — 20 °C; Улължаяие - Ю кес/72 °C; Детекция - ЗОмсЛЮ °C; bpoil ιιηικλη-35. | |
| F Leclo 05 н R_Licto 04 | /WinJet'uj | ЙраРмсрн -0,1 цМ всеки. Предена ураияя - 10 °C. Лс№пурвн1№1 - 30 иСУЗ °C; Спршне нд цранмерше - ID κΰόΟ *С; Упмжлмне ~ 1 mln/73 °C; । Дияцив 30 «е/ВО *С; Крой цикли - 40. |
BG 67567 Bl
В реално време qPCR реакциите за детекция и количествено определяне на бактерии с използване на флуоресцентно белязани сонди се използва TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Реакциите се залагат в 96-ямкови плаки с краен обем на всяка реакция 25 pL. Условия за провеждане на всеки от анализите за определяне на целевите групи бактерии са посочени в таблица 11.
Таблица 11. Праймери, флуоресцентни сонди и реакционни условия за провеждане на В реално време qPCR за количествено определяне на бактерии във фекални проби.
| 1 Пдоймфи· а : фяуорстЦсипи бслжпиа озда | Целнм група | ————=----------. ----1 Рс1кпжяпП1 зтлмка дгтооиг» |
| 09c, R Bifid 06, сонда Ρ_ΒίίΜ | BifltiotutcKrfvm | Прайчери -0,2 μΜ кекн: Сонда -0,2 μΜ: Прсдснатурацна- IB min/95 “С; Дснату раци* - 30 sec^S “С. Удължаване на гтрай перите и дете кцня - 1 ηίη'&ϋ Έ. |
| F Bactcr 1L, R Bader 08, ctwm Р^ВлсУВ F Baa 1369, R >492, сонди РЛМ13Я9Р | Raeferotdtn, Γηνοίίϋϋ Определяне на общо количество бактерии ——_____ |
BG 67567 Bl
Всички В реално време qPCR анализи на количествено определяне на бактерии във фекални проби и кърма се провеждат с минимум двукратно повторение от различни анализи.
6. Електрофоретичен анализ на ДНК фрагменти, получени след провеждане на В реално време qPCR
За проверка на размера и интегритета на амплимерите, получени след провеждане на В реално време qPCR, се провежда агарозна гел-електрофореза на реакционните продукти. Разделянето на фрагментите ДНК се извършва в 2% агарозен гел, при напрежение 35 V и 25 mA сила на тока. Разделените фрагменти се визуализрат флуоресцентно - чрез обработка на гела с етидиев бромид и осветяване с UB светлина. Приблизителните размери на ДНК фрагментите се определят чрез съпоставка със стандар, съдържащ малки ДНК фрагменти с известни размери - SmartLadder SF (Eurogentec, Belgium).
7. Статистическа обработка на данните
Статистическата обработка на данните и тяхното графично представяне се извършват със софтуер SYSTAT версия 13.2 и SigmaPlot версия 12.0 (Systat Software Inc., USA).
Анализ на ензими в проби от майчина кърма и фецес от новородено
1. Определяне на ензимна активност на О-галактозидаза (ЕС 3.2.1.23)
Ензимната реакция се проведе при условия: 100 тМ натриево ацетатен буфер, pH 6.0, съдържащ 2 тМ разтвор на о-нитрофенил-Б-О-галактопиранозид (ONP-Gal) и подходящо разредени клетки или надутаечна течност след дезинтегриране на клетките при 37°С. Реакцията се спира с 1 М натриев карбонат. Една единица активност на ензима катализира получаването на 1.0 pmol о-нитрофенол за една минута при pH 4.0 и 37°С. Съдържанието на о-нитрофенол се определя спектрофотометрично при 410 nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800.
Всички експерименти за определяне на ензимната активност са проведени с трикратна повтаряемост.
2. Определяне активността на a-L-фукозидаза (ЕС 3.2.1.51)
Ензимната реакция се проведе при условия: 100 тМ цитратен буфер, pH 6.5, съдържащ 10 тМ разтвор на р-нитрофенил a-L-фукопиранозид (PNP-FUC) (приготвя се посредством разреждане на р-нитрофенил a-Lфукопиранозид (Sigma кат. № N3628) с дестилирана вода и подходящо разредени клетки при 37°С. Реакцията се спира с 200 тМ боратен буфер, pH 9.8. Една единица активност превръща 1.0 pmole от р-нитрофенил a-L фукопиранозид в р-нитрофенол и L-фукопиранозид за една минута при pH 4.0 и 37°С. Съдържанието на рнитрофенол се определя спектрофотометрично при 405 nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800.
Всички експерименти за определяне на ензимна активност са проведени с трикратна повтаряемост.
Анализ на късоверижни мастни киселини в проби от кърма и фсцес на бебета от един до дванадесет месеца.
За доказването на късоверижните мастни киселини в пробите от екскременти е разработен следният протокол:
3. Изолиране на късоверижни мастни киселини от екскременти.
Към 100 mg прясна фекална проба или майчина кърма се добавя 2% НЗРО4 или 0,05% H2SO4 в съотношение 1:10. Пробите се хомогенизират много добре на вортекс 2 пъти по 2 min. Полученият хомогенизат се центрофугира 10 min, 13 000 rpm, след което се отделя супернатанта. От супернтанта се вземат 200 pL, които се екстрахират с 200 pL органичен разтворител (СН2С12, AcCN, EtOH, EtOAc). Пробите се хомогензират, след което се центрофугира 5 min, 13 000 rpm. Полученият органичен слой се отделя и подлага на HPLC анализ.
4. HPLC метод за анализ на късоверижни мастни киселини.
Използвана е HPLC ситема Konik-Tech (Испания) снабдена с колона Aminex НРХ-87Н Ion Exclusion Column (7.8 mm i.d. x 30 cm, Biorad, Richmond, СА) и предколона Micro-Guard Cation-H (4.6 mm i.d. x 30 mm, Biorad). Определянето на пробите е осъществено с UV детектор при дължина на вълната 210 nm, при подвижна фаза 0,005М H2SO4, скорост на потока 0,6 ml/min и температура на колоната Т = 40°С.
Идентифицирането на пиковете е осъществено по времената на задържане спрямо стандарти на късоверижни мастни киселини: млечна киселина, оцетна киселина, пропионова киселина и бутенова киселина. За количественото определяне на късоверижните мастни киселини са изготвени стандартни прави в концентрации 25 - 1,56 mmol/L. Изведени са корелационни уравнения, описващи площта на пика (у) и концентрацията на късоверижните мастни киселини (х, mmol/L). Стандартните прави са с линейни участъци между 25 - 1,65 mmol/L и с коефициент на корелация г2 > 0,9999.
Таблица 12. Диапазон на параметри, изследвани при деца от един до дванадесет месеца.
BG 67567 Bl
| Параметри | Фешс | |
| Rhjhw чнкрооргаинзкн | ||
| 1. Бнфидобшсрпи | 10=-10т | ИР-Юн |
| 2. Лактийчодли | 10»-10« | |
| 3. BacteraidetEi | - | I0L | от |
| Ензими | ||
| 4. Бета·галагнимдаза (LP^mg протеин) | 0.4-2,0 | 0.2-1.0 |
| 5, А лфд~фукйпНДилл (U/mg ΠρίπτΗΉ } | 0J4J.S | 0.05-0,3 |
| МегаВслитм | ||
| 6. Млечна каеспнна (rnmol/g) | 0.5-1Д | 0.2-О.8 |
| 7. Оистна киселина (mmol/g) | ДЗ-0,7 |
| а | ПрОПМгюаа Киселини i|mma|/g) | 0.I-OJ | 0.05-0,3 |
| 9. | Маслена кнеелннн (minol/g} | 0.05-03 | 0,02-О.Н |
В резултат на проведените анализи на тестваните майчина кърма и фецес от новородено на възраст между един и дванадесет месеца се изчисляват следните коефициенти:
1. Съотношение на количеството Бифидобактерии/Бактероиди;
2. Съотношението на количеството Бифидобактерии/Лактобацили;
3. Съотношението на количеството (Бифидобактерии+Лактобацили)/Бактероиди;
4. Съотношението на количеството (Бифидобактерии+Лактобацили)/активност на бета-галактозидаза;
5. Съотношението на количеството (Бифидобактерии+Лактобацили)/активност на алфа-фукозидаза;
6. Съотношението на ензимните активности бета-галактозидаза/алфа-фукозидаза;
7. Съотношението на ензимните активности бета-галактозидаза/протеаза;
8. Съотношение на метаболитите млечна киселина/оцетна киселина/маслена киселина.
Изчисленията се правят по посочената формула.
Таблица 13. Тенденции на съотношенията между отделните показатели, със стрелка нагоре се отбелязва положителен ефект върху микробиотата, а със стрелка надолу отрицателен ефект върху микробиотата.
| Би | LAB | Bat | Su | β | Й- | Me |
| фи | ter | фи | gat | ma | ||
| до | aid | oct | ||||
| es | MX | oil | dm | |||
| Б | dos | e | 0 |
L40 eactetaides
BG 67567 Bl
Бифидо+МКБ
S-galactosidase a-fucasidose
МетаНолита
Claims (1)
- Метод за количествена оценка за бързо прогнозиране и контрол на дисбиози при кърмачета от един месец до една година чрез оценка на количествения и качествен състав на микробиома на проба от кърма на майката и проба от фецес на кърмачето, вид и количество на ензими и метаболити, характеризиращ се с това, че методът включва следните етапи: а) провеждане на in vitro анализи на разнообразието и съотношението на микроорганизми в проба от фецес на кърмачето и на проба от кърма на майката; б) определяне на количество на метаболити, използвани като биомаркери от проба от фецес на кърмачето и на проба от кърма на майката; в) отчитане на нивото на ензимна активност на ензими, използвани като биомаркери, от проба от фецес на кърмачето и на проба от кърма на майката; г) обработване по математически модел на данните от предходните етапи, който като резултат извеждат: - изчислени коефициенти на корелация между състав и количество на микроорганизмите от проба от фецес на кърмачето и на проба от кърма на майката. - изчислени коефициенти на корелация между ензимен профил и активност, ензимите отговорни за усвояването и метаболизирането на компонентите на проба от фецес на кърмачето и на проба от кърма на майката; - изчислени коефициенти на корелация между количеството на метаболитите, получени от метаболизирането на основните компоненти на микробиотата от проба от фецес на кърмачето и основните компоненти на микробиотата от проба от кърма на майката.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BG113148A BG67567B1 (bg) | 2020-05-27 | 2020-05-27 | Метод за количествена оценка за бързо прогнозиране и контрол на дисбиози при кърмачета на възраст от един месец до една година |
| EP20742153.8A EP4162081A1 (en) | 2020-05-27 | 2020-05-28 | Method for quantitative evaluation (mqe both for rapid prognosis of disbiosis in infants -up to 1 year of age(mqe/rpdi-1y), and for multi-factural diseases (mqe/mfd) |
| PCT/BG2020/050001 WO2021237312A1 (en) | 2020-05-27 | 2020-05-28 | Method for quantitative evaluation (mqe both for rapid prognosis of disbiosis in infants -up to 1 year of age(mqe/rpdi-1y), and for multi-factural diseases (mqe/mfd) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BG113148A BG67567B1 (bg) | 2020-05-27 | 2020-05-27 | Метод за количествена оценка за бързо прогнозиране и контрол на дисбиози при кърмачета на възраст от един месец до една година |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG113148A BG113148A (bg) | 2021-12-15 |
| BG67567B1 true BG67567B1 (bg) | 2023-09-15 |
Family
ID=71661600
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG113148A BG67567B1 (bg) | 2020-05-27 | 2020-05-27 | Метод за количествена оценка за бързо прогнозиране и контрол на дисбиози при кърмачета на възраст от един месец до една година |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP4162081A1 (bg) |
| BG (1) | BG67567B1 (bg) |
| WO (1) | WO2021237312A1 (bg) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT202200008705A1 (it) * | 2022-04-29 | 2023-10-29 | Wellmicro S R L | Metodo per determinare una funzionalita’ metabolica di una popolazione batterica e apparato per eseguire detto metodo |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20160243138A1 (en) * | 2014-10-29 | 2016-08-25 | Glycom A/S | Composition comprising HMSs/HMOs and use thereof |
| SG11201811227QA (en) * | 2016-07-01 | 2019-01-30 | Evolve Biosystems Inc | Method for facilitating maturation of the mammalian immune system |
| EP3551194B1 (en) * | 2016-12-06 | 2023-10-18 | DSM Nutritional Products, LLC | Glycan polymers and related methods thereof |
| US11666611B2 (en) * | 2017-12-11 | 2023-06-06 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Defined therapeutic microbiota and methods of use thereof |
-
2020
- 2020-05-27 BG BG113148A patent/BG67567B1/bg unknown
- 2020-05-28 WO PCT/BG2020/050001 patent/WO2021237312A1/en unknown
- 2020-05-28 EP EP20742153.8A patent/EP4162081A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2021237312A1 (en) | 2021-12-02 |
| BG113148A (bg) | 2021-12-15 |
| EP4162081A1 (en) | 2023-04-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9669059B2 (en) | Butyrogenic bacteria as probiotics to treat clostridium difficile | |
| Tamanai-Shacoori et al. | Roseburia spp.: a marker of health? | |
| Milani et al. | The first microbial colonizers of the human gut: composition, activities, and health implications of the infant gut microbiota | |
| Ignacio et al. | Correlation between body mass index and faecal microbiota from children | |
| Rigsbee et al. | Quantitative profiling of gut microbiota of children with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome | |
| Bridgman et al. | Gut microbiota and allergic disease in children | |
| McNulty et al. | The impact of a consortium of fermented milk strains on the gut microbiome of gnotobiotic mice and monozygotic twins | |
| Cecchini et al. | Functional metagenomics reveals novel pathways of prebiotic breakdown by human gut bacteria | |
| US20150104423A1 (en) | Use of blood group status iii | |
| EP2598155A2 (en) | Use of blood group status iii | |
| Sirilun et al. | Impact of maternal bifidobacteria and the mode of delivery on Bifidobacterium microbiota in infants | |
| Hirano et al. | Next-generation prebiotic promotes selective growth of bifidobacteria, suppressing Clostridioides difficile | |
| Rocha Martin et al. | Colonization of Cutibacterium avidum during infant gut microbiota establishment | |
| Rubio-del-Campo et al. | Human milk and mucosa-associated disaccharides impact on cultured infant fecal microbiota | |
| Damé-Teixeira et al. | Gene expression profile of Scardovia spp. in the metatranscriptome of root caries | |
| Song et al. | An investigation into the correlation of intestinal flora with obesity and gestational diabetes mellitus | |
| Park et al. | Comprehensive analysis of the effect of probiotic intake by the mother on human breast milk and infant fecal microbiota | |
| Xin et al. | Preventive effects of Lactobacillus johnsonii on the renal injury of mice induced by high fluoride exposure: Insights from colonic microbiota and co-occurrence network analysis | |
| BG67567B1 (bg) | Метод за количествена оценка за бързо прогнозиране и контрол на дисбиози при кърмачета на възраст от един месец до една година | |
| Yazdi et al. | Long-term daily high-protein, drained yoghurt consumption alters abundance of selected functional groups of the human gut microbiota and fecal short-chain fatty acid profiles in a cohort of overweight and obese women | |
| Mollova et al. | In vitro Digestion: Exploring the probiotic abilities and metabolization of human milk oligosaccharides by two strains of Limosilactobacillus fermentum isolated from breast milk | |
| Zhu et al. | Comparison between the molecular diagnostic test and chest X-ray combined with multi-slice spiral CT in the diagnosis of lobar pneumonia | |
| Ingribelli et al. | Culture-dependent screening of endospore-forming clostridia in infant feces | |
| Wang et al. | Intestinal persistence of Bifidobacterium infantis is determined by interaction of host genetics and antibiotic exposure | |
| Odenwald et al. | Prebiotic activity of lactulose optimizes gut metabolites and prevents systemic infection in liver disease patients |