BG67567B1 - Quantitative assessment method for rapid prediction and control of dysbiosis in breast-fed newborns aged one month to one year - Google Patents
Quantitative assessment method for rapid prediction and control of dysbiosis in breast-fed newborns aged one month to one year Download PDFInfo
- Publication number
- BG67567B1 BG67567B1 BG113148A BG11314820A BG67567B1 BG 67567 B1 BG67567 B1 BG 67567B1 BG 113148 A BG113148 A BG 113148A BG 11314820 A BG11314820 A BG 11314820A BG 67567 B1 BG67567 B1 BG 67567B1
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- breast milk
- sample
- feces
- infant
- dysbiosis
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 230000007140 dysbiosis Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 208000027244 Dysbiosis Diseases 0.000 title claims abstract description 21
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 title abstract 2
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 claims abstract description 56
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 claims abstract description 56
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 51
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 47
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 26
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims abstract description 25
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 241000736262 Microbiota Species 0.000 claims description 21
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 6
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 claims 1
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 claims 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 abstract description 21
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 abstract description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 15
- 238000013459 approach Methods 0.000 abstract description 7
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 abstract description 6
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 abstract description 6
- 239000008101 lactose Substances 0.000 abstract description 6
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 abstract description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 abstract description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 abstract description 5
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 41
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 40
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 35
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 34
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 33
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 28
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 26
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 25
- 150000004666 short chain fatty acids Chemical class 0.000 description 19
- 235000021391 short chain fatty acids Nutrition 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 241000894007 species Species 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 12
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 12
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 11
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 11
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 241000606125 Bacteroides Species 0.000 description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 9
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 9
- 108010061314 alpha-L-Fucosidase Proteins 0.000 description 9
- 102000012086 alpha-L-Fucosidase Human genes 0.000 description 9
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 9
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 8
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 2-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 7
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 7
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 6
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 6
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 6
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 6
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 description 6
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 description 6
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 6
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 6
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YILIDCGSXCGACV-SQKFTNEHSA-N 4-nitrophenyl alpha-L-fucoside Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 YILIDCGSXCGACV-SQKFTNEHSA-N 0.000 description 5
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 244000005702 human microbiome Species 0.000 description 5
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 4
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 description 4
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 4
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 4
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 4
- IFBHRQDFSNCLOZ-IIRVCBMXSA-N 4-nitrophenyl-α-d-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 IFBHRQDFSNCLOZ-IIRVCBMXSA-N 0.000 description 3
- 206010003645 Atopy Diseases 0.000 description 3
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 3
- 102100033448 Lysosomal alpha-glucosidase Human genes 0.000 description 3
- 208000037656 Respiratory Sounds Diseases 0.000 description 3
- 206010047924 Wheezing Diseases 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 3
- HMQPEDMEOBLSQB-RCBHQUQDSA-N beta-D-Galp-(1->3)-alpha-D-GlcpNAc Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HMQPEDMEOBLSQB-RCBHQUQDSA-N 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 229930191176 lacto-N-biose Natural products 0.000 description 3
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 2
- PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 2-(4-chloro-2-methylphenoxy)acetic acid;n-methylmethanamine Chemical compound CNC.CC1=CC(Cl)=CC=C1OCC(O)=O PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IFBHRQDFSNCLOZ-ZIQFBCGOSA-N 4-nitrophenyl alpha-D-glucoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 IFBHRQDFSNCLOZ-ZIQFBCGOSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 101000984736 Agkistrodon piscivorus piscivorus Bradykinin-potentiating peptide F Proteins 0.000 description 2
- 241001608472 Bifidobacterium longum Species 0.000 description 2
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 2
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 150000008493 L-fucopyranosides Chemical class 0.000 description 2
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 238000010818 SYBR green PCR Master Mix Methods 0.000 description 2
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 2
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000001013 cariogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 2
- LDHQCZJRKDOVOX-NSCUHMNNSA-N crotonic acid Chemical compound C\C=C\C(O)=O LDHQCZJRKDOVOX-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 208000002925 dental caries Diseases 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 229940054192 micro-guard Drugs 0.000 description 2
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 2
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- -1 p-nitrophenol α-D-glucopyranoside Chemical class 0.000 description 2
- LVZSQWIWCANHPF-UHFFFAOYSA-N p-nitrophenyl palmitate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LVZSQWIWCANHPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 2
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- OBHRVMZSZIDDEK-UHFFFAOYSA-N urobilinogen Chemical compound CCC1=C(C)C(=O)NC1CC1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(CC3C(=C(CC)C(=O)N3)C)N2)CCC(O)=O)N1 OBHRVMZSZIDDEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006533 ATP-Binding Cassette Transporters Proteins 0.000 description 1
- 102000005416 ATP-Binding Cassette Transporters Human genes 0.000 description 1
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 241001148536 Bacteroides sp. Species 0.000 description 1
- 241000186016 Bifidobacterium bifidum Species 0.000 description 1
- 241000186012 Bifidobacterium breve Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 1
- 241001430149 Clostridiaceae Species 0.000 description 1
- 208000002881 Colic Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000010445 Lactoferrin Human genes 0.000 description 1
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 description 1
- 241001453171 Leptotrichia Species 0.000 description 1
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010051606 Necrotising colitis Diseases 0.000 description 1
- 208000031662 Noncommunicable disease Diseases 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010036590 Premature baby Diseases 0.000 description 1
- 241000605861 Prevotella Species 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 description 1
- 240000007591 Tilia tomentosa Species 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- AXQLFFDZXPOFPO-UHFFFAOYSA-N UNPD216 Natural products O1C(CO)C(O)C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(NC(=O)C)C1OC(C1O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)OC1CO AXQLFFDZXPOFPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001148134 Veillonella Species 0.000 description 1
- 241001430183 Veillonellaceae Species 0.000 description 1
- AVMNFQHJOOYCAP-UHFFFAOYSA-N acetic acid;propanoic acid Chemical compound CC(O)=O.CCC(O)=O AVMNFQHJOOYCAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- HMQPEDMEOBLSQB-UFLFEMAHSA-N beta-D-Galp-(1->3)-beta-D-GalpNAc Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HMQPEDMEOBLSQB-UFLFEMAHSA-N 0.000 description 1
- AXQLFFDZXPOFPO-UNTPKZLMSA-N beta-D-Galp-(1->3)-beta-D-GlcpNAc-(1->3)-beta-D-Galp-(1->4)-beta-D-Glcp Chemical compound O([C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]([C@H]1O)O[C@H]1[C@@H]([C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O1)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)O)NC(=O)C)[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]1CO AXQLFFDZXPOFPO-UNTPKZLMSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 235000020299 breve Nutrition 0.000 description 1
- 150000004652 butanoic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940021722 caseins Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 235000013325 dietary fiber Nutrition 0.000 description 1
- 235000021004 dietary regimen Nutrition 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- UBLXEEBHYISRFM-UHFFFAOYSA-M folin's reagent Chemical compound [Na+].C1=CC=C2C(S(=O)(=O)[O-])=CC(=O)C(=O)C2=C1 UBLXEEBHYISRFM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000033581 fucosylation Effects 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 108010081954 galacto-N-biose Proteins 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M hexadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000007366 host health Effects 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 description 1
- QCQYVCMYGCHVMR-UHFFFAOYSA-N lacto-N-biose I Natural products CC(=O)NC(C=O)C(C(O)C(O)CO)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O QCQYVCMYGCHVMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088312 lacto-N-biosidase Proteins 0.000 description 1
- USIPEGYTBGEPJN-UHFFFAOYSA-N lacto-N-tetraose Natural products O1C(CO)C(O)C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(NC(=O)C)C1OC1C(O)C(CO)OC(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)C1O USIPEGYTBGEPJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 description 1
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 description 1
- 229940046892 lead acetate Drugs 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004066 metabolic change Effects 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 208000004995 necrotizing enterocolitis Diseases 0.000 description 1
- HVFSJXUIRWUHRG-UHFFFAOYSA-N oic acid Natural products C1CC2C3CC=C4CC(OC5C(C(O)C(O)C(CO)O5)O)CC(O)C4(C)C3CCC2(C)C1C(C)C(O)CC(C)=C(C)C(=O)OC1OC(COC(C)=O)C(O)C(O)C1OC(C(C1O)O)OC(COC(C)=O)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HVFSJXUIRWUHRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 201000006195 perinatal necrotizing enterocolitis Diseases 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 1
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000092 prognostic biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000009979 protective mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/10—Enterobacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2570/00—Omics, e.g. proteomics, glycomics or lipidomics; Methods of analysis focusing on the entire complement of classes of biological molecules or subsets thereof, i.e. focusing on proteomes, glycomes or lipidomes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/06—Gastro-intestinal diseases
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Настоящото изобретение се отнася до областта на медицинската диагностика, фармацията, биотехнологиите.The present invention relates to the field of medical diagnostics, pharmacy, biotechnology.
Предшестващо състояние на техникатаPrior art
Съществуват различни данни, че кърменето осигурява значителна защита срещу инфекциозни и възпалителни заболявания, различни увреждания и подобрява познавателните способности (Bartick and Reinhold, 2010; Dieterich et al., 2013; Kramer et al., 2009). Това до голяма степен се дължи на свойствата на кърмата и съдържащите се в нея олигозахариди да повлияват микробиалното колонизиране при новородените. Palmer et al. (2007) показват, че бебетата се колонизират с приблизително 107 различни вида микроорганизми през първата седмица от живота. Тези тесни взаимоотношения на организма с гастроинтестиналната микрофлора може да са в основата и да бъдат критични по отношение на здравето на новороденото, както и с риска от развитие на различни други неинфекциозни заболявания. Оптималното кърмене всъщност остава високо ефективна стратегия за общественото здраве за оцеляване на бебетата, особено за намаляване на смъртността поради гастроентерит и пневмония в развиващите се страни (Bhutta et al., 2013). Изследванията на кърменето показват защитната роля на кърмата срещу много хронични и имунни състояния, по-специално, диабет тип 1, некротизиращ ентероколит, астма и левкемия (Bartick and Reinhold, 2010).There is mixed evidence that breastfeeding provides significant protection against infectious and inflammatory diseases, various disabilities, and improves cognition (Bartick and Reinhold, 2010; Dieterich et al., 2013; Kramer et al., 2009). This is largely due to the properties of breast milk and its oligosaccharides to influence microbial colonization in newborns. Palmer et al. (2007) showed that infants are colonized with approximately 107 different types of microorganisms during the first week of life. These close relationships of the organism with the gastrointestinal microflora may underlie and be critical in relation to the health of the newborn, as well as the risk of developing various other non-infectious diseases. In fact, optimal breastfeeding remains a highly effective public health strategy for infant survival, especially for reducing mortality due to gastroenteritis and pneumonia in developing countries (Bhutta et al., 2013). Research on breastfeeding has shown the protective role of breast milk against many chronic and immune conditions, in particular, type 1 diabetes, necrotizing enterocolitis, asthma and leukemia (Bartick and Reinhold, 2010).
Развитието на микробиотата в храносмилателната система на новороденото е постепенен и динамичен процес, който се определя от няколко фактора, като например начин на раждане, недоносеност, вида на хранене, свързани заболявания и антибиотичната терапия, както и от влиянието на околната среда, което налага персонализиран подход (Wall et al. 2009). Освен това процесът на колонизацията е силно повлиян от диетата (кърмата и /или изкуственото мляко). По време на първия месец след раждането бифидобактериите и колиформите (в частност Е. coli) са преобладаващи, последвани от Lactobacillus spp. и Bacteroides и се различава в широки граници между отделните индивиди (Wall et al., 2009). Промени в съотношението на доминиращите представители на чревната микрофлора на новородените се появяват след около една година от живота, главно в резултат на въвеждане на нова храна в диетата на бебето. Броят на представителите на Lactobacillus spp., Bacteroides spp. и Clostridia се увеличава, докато бифиброидите и Е. coli намаляват. Найнакрая на възраст от около 2 години, микробните съобщества в червата достигат по състав, подобен на този открит в червата на възрастните (Koenig et al. 2011). Видът Bifidobacterium longum е най-честият първоначален колонизатор на гастроинтестиналният тракт на новородените (Palmer et al., 2007).The development of the microbiota in the digestive system of the newborn is a gradual and dynamic process that is determined by several factors, such as mode of birth, prematurity, type of feeding, associated diseases and antibiotic therapy, as well as environmental influences, which necessitates a personalized approach (Wall et al. 2009). In addition, the colonization process is strongly influenced by the diet (milk and/or formula). During the first month after birth, bifidobacteria and coliforms (especially E. coli) are predominant, followed by Lactobacillus spp. and Bacteroides and varies widely between individuals (Wall et al., 2009). Changes in the ratio of the dominant representatives of the intestinal microflora of newborns appear after about one year of life, mainly as a result of introducing new food into the baby's diet. The number of representatives of Lactobacillus spp., Bacteroides spp. and Clostridia increased while bifibroids and E. coli decreased. Finally, at around 2 years of age, gut microbial communities reach a composition similar to that found in the adult gut (Koenig et al. 2011). The species Bifidobacterium longum is the most common initial colonizer of the gastrointestinal tract of neonates (Palmer et al., 2007).
Човешкото мляко притежава множество механизми за защита на новородените: клетки на имунният отговор, имуноглобулини, вродени защитни протеини, пептиди, свободни мастни киселини, цитокини и хемокини, гликани и олигозахариди (Ballard and Morrow, 2013). Сред различните биоактивни компоненти на човешкото мляко, олигозахаридите са най-разпространените и включват значително повече от 100 различни биоактивни въглехидрата, изградени от 3 до 32 монозахарида (Newburg et al., 2005). Като клас олигозахаридите са 6 - 12 g/L от кърмата и до голяма степен се синтезират от лактоза (Bode, 2012). Човешката коластра съдържа приблизително 22 - 24 g/L млечни олигозахариди (Newburg et al., 1995; Urashima et al., 2012). В човешкото мляко олигозахаридите са третият по концентрация компонент след лактозата и липидите и тяхното количество е доста по-високо от количеството на протеините (Newburg et al., 1995). Структурата на повече от 100 човешки олигозахариди е характеризирана до момента (Urashima et al., 2011а, b; Kobata, 2010). Характеризирането на физиологията бифидо бактериите е фокусирано в голяма степен върху способността им да метаболизират различни хранителни олигозахариди. Този род бактерии разполагат с набор от трансмембранни пермеази, осигуряващи метаболизирането на различни въглехидратни полимери, като хранителни фибри, включително човешки млечни олигозахариди, които преминават неразградени до дисталните отдели на храносмилателния тракт (Moro et al., 2006; Macfarlane and Cummings, 1999).Human milk possesses multiple mechanisms to protect newborns: immune response cells, immunoglobulins, innate defense proteins, peptides, free fatty acids, cytokines and chemokines, glycans and oligosaccharides (Ballard and Morrow, 2013). Among the various bioactive components of human milk, oligosaccharides are the most abundant and include significantly more than 100 different bioactive carbohydrates built from 3 to 32 monosaccharides (Newburg et al., 2005). As a class, oligosaccharides are 6 - 12 g/L of breast milk and are largely synthesized from lactose (Bode, 2012). Human colostrum contains approximately 22 - 24 g/L milk oligosaccharides (Newburg et al., 1995; Urashima et al., 2012). In human milk, oligosaccharides are the third most concentrated component after lactose and lipids, and their amount is much higher than that of proteins (Newburg et al., 1995). The structure of more than 100 human oligosaccharides has been characterized to date (Urashima et al., 2011a,b; Kobata, 2010). Characterization of the physiology of bifidobacteria has focused largely on their ability to metabolize various dietary oligosaccharides. This genus of bacteria possesses a set of transmembrane permeases that ensure the metabolism of various carbohydrate polymers, such as dietary fiber, including human milk oligosaccharides, which pass undigested to the distal parts of the digestive tract (Moro et al., 2006; Macfarlane and Cummings, 1999).
Съществуват данни само за няколко вида бифидобактерии, способни да метаболизират и използват, като въглероден източник човешки млечни олигозахариди. Такива видове типично са изолирани предимно от микрофлората на гастроинтестиналният тракт на новородени. Установено е, че асоциирани с новороденото бифидобактерии са способни да усвояват предимно лакто-N-тетраози (LNT) или лакто-N-неотетраози (LNnT) (LoCascio et al., 2007).There are only a few species of bifidobacteria capable of metabolizing and using human milk oligosaccharides as a carbon source. Such species are typically isolated primarily from the microflora of the gastrointestinal tract of newborns. Neonatal-associated bifidobacteria have been found to be capable of predominantly digesting lacto-N-tetraoses (LNT) or lacto-N-neotetraoses (LNnT) (LoCascio et al., 2007).
B bifidum секретира извънклетъчна 1,2-п-1-фукозидаза (ЕС 3.2.1.63), която разцепва крайни 1,2-вфукозилови връзки, които защитават галактозните остатъци в лакто-N-биоза, като по този начин позволяват продължаване на катаболитните процеси до пълното им усвояване (Katayama et al., 2004; Nagae et al., 2007). В допълнение, лакто-N-биозидаза (EC 3.2.1.140) освобождава лакто-N-биоза от лакто-N-тетраоза и от други млечни олигозахариди, в които липсва фукозилиране или сиалиране (Wada et at., 2008). Веднъж получена, лакто-N-биозата се транспортира през клетъчната мембрана от специален ABC транспортер, който интегрира лакто-N-биозо свързваща субединица (Suzuki et al., 2008; Wada et al., 2007). Известно е също така, че B. longum използва ендо-п-N-ацетилгалактозаминидаза (ЕС 3.2.1.97) за извличане на галакто-N-биоза от О-свързани муцинови гликани (Fujita et al., 2005). Всъщност, присъствието на както ендо-N-ацетилгалактозаминидаза, така и на фукозидазната активност дава възможност на В. bifidum да разгражда муцин (Ruas-Madiedo et al., 2008). Данните за усвояване на олигозахаридите от майчината кърма от лактобацилите и останалата съпътстваща микрофлора са оскъдни, като липсват конкретни корелации в посока тип ензим-ензимна активност-вид микроорганизъм-количество микроорганизми.B bifidum secretes an extracellular 1,2-n-1-fucosidase (EC 3.2.1.63) that cleaves terminal 1,2-vfucosyl bonds that protect galactose residues in lacto-N-biose, thus allowing catabolite processes to continue until their complete absorption (Katayama et al., 2004; Nagae et al., 2007). In addition, lacto-N-biosidase (EC 3.2.1.140) releases lacto-N-biose from lacto-N-tetraose and from other milk oligosaccharides lacking fucosylation or sialylation (Wada et at., 2008). Once produced, lacto-N-biose is transported across the cell membrane by a special ABC transporter that integrates a lacto-N-bioso binding subunit (Suzuki et al., 2008; Wada et al., 2007). B. longum is also known to use endo-β-N-acetylgalactosaminidase (EC 3.2.1.97) to extract galacto-N-biose from O-linked mucin glycans (Fujita et al., 2005). Indeed, the presence of both endo-N-acetylgalactosaminidase and fucosidase activity enables B. bifidum to degrade mucin (Ruas-Madiedo et al., 2008). Data on the absorption of oligosaccharides from breast milk by lactobacilli and the remaining accompanying microflora are scarce, as there are no specific correlations in the direction of type of enzyme-enzyme activity-type of microorganism-quantity of microorganisms.
Метаболитите са следствие на физиологичното състояние на човешкия организъм от една страна, а от друга на физиологичната активност на съпътстващата микрофлора в интестиналния тракт. Това ги прави идеален начин за проследяване на промените, предизвикани от болестно състояние или при лечение. Оценката на количеството и разнообразието на метаболити е особено важен момент за разбирането на многобройните взаимодействия между генетика, околна среда и микробиота. В ключови точки от метаболитните процеси, където те се пресичат нискомолекулните метаболити посредничат при тези взаимоотношения.Metabolites are a consequence of the physiological state of the human organism on the one hand, and on the other hand of the physiological activity of the accompanying microflora in the intestinal tract. This makes them an ideal way to track changes caused by a disease state or treatment. Assessing the amount and diversity of metabolites is particularly important for understanding the multiple interactions between genetics, environment, and microbiota. At key points in the metabolic processes where they intersect, low molecular weight metabolites mediate these relationships.
Изследователите разглеждат микробиома, като потенциален източник на биомаркери за различни заболявания. Въпреки че това може да е плодородна зона за биомаркерите, има много примери за това, че различни метаболити могат да се свързват с едно и също заболяване, което намалява надежността им, като биомаркери.Researchers are looking at the microbiome as a potential source of biomarkers for various diseases. Although this may be a fertile area for biomarkers, there are many examples of different metabolites being associated with the same disease, which reduces their reliability as biomarkers.
Друг показател, чийто потенциал се изследва за биомаркер са стойностите на pH на фекални проби. Има данни, че те директно корелират с бактериалните видове, колонизиращи червата на бебето. Например установена е пряка връзка между по-ниските стойности на pH на фекални проби и значително намалени количества на потенциално патогенни бактериални популации (т. е. Clostridiaceae, Enterobacteriaceae, Peptosteptoccocaceae и Veillonellaceae). Друг пример е констатираната корелация между изобилието от специфични видове Enterobacteriaceae, които предизвикват възпаление на червата и наличие на колики при кърмачета. Тези не благоприятни ефекти могат да се дължат на факта, че липополизахаридите, получени от ентеробактерии, индуцират по-силни възпалителна активност в сравнение с други бактерии, произвеждащи липополизахариди.Another indicator whose potential is being investigated as a biomarker is the pH values of faecal samples. There is evidence that they directly correlate with the bacterial species colonizing the baby's gut. For example, a direct correlation was found between lower pH values of faecal samples and significantly reduced amounts of potentially pathogenic bacterial populations (ie Clostridiaceae, Enterobacteriaceae, Peptosteptoccocaceae and Veillonellaceae). Another example is the correlation found between the abundance of specific Enterobacteriaceae species that cause intestinal inflammation and the presence of colic in infants. These unfavorable effects may be due to the fact that lipopolysaccharides derived from enterobacteria induce stronger inflammatory activity compared to other lipopolysaccharide-producing bacteria.
Астмата е най-разпространеното хронично заболяване на детството. Установена е от канадски учени корелация между настъпващи промени в микробиома на червата при бебета до една година (дисбиоза), които повлияват развитието на астма. Изследвани са ефектите на микробиалната дисбиоза на червата върху атопичен хрип при население, живеещо в развиващи се страни с нисък икономически стандарт. Микробиални дисбиози на 3-месечна възраст се свързват с по-късно развитие на атопичен хрип. Например наблюдавана е дисбиоза при еквадорските бебета, включващи различни бактериални таксони, включително и няколко таксона микроскопични гъбички. Нивата на фекалните късоверижни мастни киселини при тримесечни бебета с атопичен хрип показват ясни тенденции на увеличена концентрация на ацетат и намалена концентрация на капронова киселина.Asthma is the most common chronic disease of childhood. A correlation has been established by Canadian scientists between changes in the gut microbiome in babies up to one year (dysbiosis) that affect the development of asthma. The effects of gut microbial dysbiosis on atopic wheezing in a population living in developing countries with a low economic standard were investigated. Microbial dysbiosis at 3 months of age is associated with later development of atopic wheezing. For example, dysbiosis was observed in Ecuadorian infants involving various bacterial taxa, including several taxa of microscopic fungi. Faecal short-chain fatty acid levels in three-month-old infants with atopic wheezing showed clear trends of increased acetate concentration and decreased caproic acid concentration.
Някои от защитните механизми на човешкото мляко се дължат на олигозахаридите. Като се има предвид нарастващата степен на заболявания, свързани с нерегулираната микробиота и имунитет на гостоприемника, налице е глобален интерес за тестване на нови хранителни подходи и функционални храни, съответстващи на тези, открити в кърмата, за да се оптимизира здравето на гостоприемника и да се възстанови бактериалната флора. Описаните дотук данни от литературата доказват, че използваните модели на изследване както за диагностични цели, така и за контрол на микробиотата при деца на възраст до една година не могат да предоставят алгоритъм за бърза и надежна оценка състоянието на чревната микробиота и асоциирането й с различни заболявания, защото са линейни, отнесени само за един показател.Some of the protective mechanisms of human milk are due to oligosaccharides. Given the increasing rate of disease associated with dysregulated host microbiota and immunity, there is global interest in testing novel nutritional approaches and functional foods matching those found in breast milk to optimize host health and restore the bacterial flora. The data from the literature described so far prove that the research models used both for diagnostic purposes and for microbiota control in children up to one year of age cannot provide an algorithm for a quick and reliable assessment of the state of the intestinal microbiota and its association with various diseases , because they are linear, referred to only one indicator.
Създаването на метод за количествена оценка за бързо прогнозиране на дисбиози при кърмачета от 1 месец до 1 година и за изследване на отклонения в човешката микробиота изисква интердисциплинарен подход и при крайната оценка може да включва данните от различни методи на изследване, които се обработват като бази данни със специфични изчислителни техники.The creation of a quantitative assessment method for the rapid prediction of dysbiosis in infants from 1 month to 1 year and for the study of deviations in the human microbiota requires an interdisciplinary approach and in the final assessment may include the data from different research methods that are processed as databases with specific computational techniques.
Техническа същност на изобретениетоTechnical essence of the invention
Задачата на изобретението е да създаде метод на база ин витро количествена оценка, който да осигури възможност за бързо прогнозиране на дисбиози при кърмачета на възраст от 1 месец до 1 година, и който да намери приложение в създаване на модел (алгоритъм) за прецизна диагностика на чревната микробиота при новородени на възраст от един месец до една година, като методът спомага и бързо последващо установяване на вида на дисбиозата и степента на нарушение. Методът се базира на интердисциплинарен подход при анализ на количествения и качествен състав на микробиота, вида и количеството на ключови ензими и метаболити и анализ на данните посредством информационна система.The task of the invention is to create a method based on in vitro quantitative assessment, which will provide an opportunity for rapid prediction of dysbiosis in infants aged 1 month to 1 year, and which will find application in creating a model (algorithm) for precise diagnosis of the intestinal microbiota in newborns aged one month to one year, and the method also helps to quickly establish the type of dysbiosis and the degree of disorder. The method is based on an interdisciplinary approach in the analysis of the quantitative and qualitative composition of the microbiota, the type and quantity of key enzymes and metabolites and data analysis by means of an information system.
През последните няколко години в проучвания са разкрили, че и коластрата и кърмата от здрави жени съдържа бактерии, включително стафилококи, стрептококи, коринебактерии, млечнокисели бактерии, пропионобактерии и бифидобактерии (Fernandez et al., 2013). Напоследък прилагането на различни техники, включително и метагеномни подходи потвърди присъствието на ДНК от тези и други бактериални родове в кърмата и коластрата (Hunt et al., 2011; Cabrera-Rubio et al., 2012; Fernandez et al., 2013; Jost et al., 2013, 2014; Ward et al., 2013; Jimenez et at.,2015). Следователно, тези биологични течности са непрекъснати източници на живи бактерии към стомашно-чревния тракт (McGuire and McGuire, 2015) Други проучвания показват, че има трансфер на бактериални щамове от майка към бебето в процеса на кърмене (Albesharat et al., 2011; Martin et al., 2012; Jost et al., 2014). Въпреки някои установени корелации на количеството и състава на чревната микробиота с детекция на определени заболявания, и използваните молекулярно-биологични методи са продължителни и скъпи за ежедневната практика, което ги прави недостъпни за масова употреба. Няма установени корелационни зависимости с данните за ключови ензими и метаболити, отговорни за усвояването на специфични компоненти от коластрата и кърмата и динамиката на концентрацията им при промяна на диетата и за преодоляване на чревни дисбиози.Over the past few years, studies have revealed that both colostrum and breast milk from healthy women contain bacteria, including staphylococci, streptococci, corynebacteria, lactic acid bacteria, propionobacteria, and bifidobacteria (Fernandez et al., 2013). Recently, the application of various techniques, including metagenomic approaches, confirmed the presence of DNA from these and other bacterial genera in breast milk and colostrum (Hunt et al., 2011; Cabrera-Rubio et al., 2012; Fernandez et al., 2013; Jost et al. al., 2013, 2014; Ward et al., 2013; Jimenez et al., 2015). Therefore, these biological fluids are continuous sources of live bacteria to the gastrointestinal tract (McGuire and McGuire, 2015) Other studies have shown that there is a transfer of bacterial strains from mother to infant in the breastfeeding process (Albesharat et al., 2011; Martin et al., 2012; Jost et al., 2014). Despite some established correlations of the amount and composition of the intestinal microbiota with the detection of certain diseases, the molecular biological methods used are lengthy and expensive for daily practice, which makes them inaccessible for mass use. There are no established correlations with data on key enzymes and metabolites responsible for the absorption of specific components from colostrum and breast milk and their concentration dynamics when changing the diet and overcoming intestinal dysbiosis.
Някои бактерии от устната кухина на бебето могат да замърсят млякото по време на сучене поради поток на мляко обратно в млечните канали (Ramsey et al., 2004). Установено е, че в рамките на 24 часа след раждането, коластрата съдържа типични устни бактерии като Veillonella, Leptotrichia и Prevotella (CabreraRubio et al., 2012). Въпреки, че произходът на човешкия слюнчен микробиом все още е доста не добре проучен (Zaura et al., 2014), Streptococcus spp. изглежда е един от доминиращите видове както при възрастни (Nasidze et al., 2009; Yang et al., 2012) така и при бебета (Bearfield et al., 2002; Cephas et al., 2011). Стрептококите също са сред доминиращите видове в човешката коластра и кърма (Jimenez et al., 2008а, b; Hunt et al., 2011; Martin et al., 2015). Доказано е, че устното здраве на майката корелира тясно с вероятността за развитие на зъбен кариес при детето (Zaura et al., 2014). Някои съединения в човешкото мляко (например, човешки млечни олигозахариди, протеини) могат да повлияят на колонизацията на отделни видове индиректно. Например, открити са млечни протеини, като казеини и лактоферин, които имат способност да инхибират прикрепването на кариогенни стрептококи към хидроксиапатит и да насърчават прикрепването на коменсални бактерии in vitro (Johansson и Lif Holgerson, 2011). Няма проведени достатъчно мащабни и за продължително време проучвания, характеризиращи развитието на оралната микрофлора по време на неонаталният период и детството. В първоначални проучвания се е смятало, че оралната колонизация от бактерии, причиняващи зъбен кариес може да се случи след поникване на първите млечни зъби при новороденото, като по-късно обаче е доказано, че кариогенният Streptococcus mutans може да присъства в устната кухина на бебето преди появата на твърди тъкани там (Law et al., 2007).Some bacteria from the infant's oral cavity can contaminate milk during suckling due to backflow of milk into the milk ducts (Ramsey et al., 2004). Within 24 hours after birth, colostrum has been found to contain typical oral bacteria such as Veillonella, Leptotrichia and Prevotella (CabreraRubio et al., 2012). Although the origin of the human salivary microbiome is still rather poorly understood (Zaura et al., 2014), Streptococcus spp. appears to be one of the dominant species in both adults (Nasidze et al., 2009; Yang et al., 2012) and infants (Bearfield et al., 2002; Cephas et al., 2011). Streptococci are also among the dominant species in human colostrum and breast milk (Jimenez et al., 2008a, b; Hunt et al., 2011; Martin et al., 2015). It has been shown that the oral health of the mother correlates closely with the likelihood of developing dental caries in the child (Zaura et al., 2014). Certain compounds in human milk (eg, human milk oligosaccharides, proteins) may affect the colonization of individual species indirectly. For example, milk proteins such as caseins and lactoferrin have been found to have the ability to inhibit the attachment of cariogenic streptococci to hydroxyapatite and promote the attachment of commensal bacteria in vitro (Johansson and Lif Holgerson, 2011). There have been no sufficiently large-scale and long-term studies characterizing the development of the oral microflora during the neonatal period and childhood. In initial studies, it was thought that oral colonization by dental caries-causing bacteria could occur after the first baby teeth erupted in the newborn, but it was later shown that the cariogenic Streptococcus mutans could be present in the infant's oral cavity before the appearance of hard tissues there (Law et al., 2007).
Епидемиологичните изследвания разкриват редица експозиции в околната среда, свързани с астма. Това би могло да обясни ескалацията на астмата през последните 30 години. Бебетата, изложени на риск от астма, проявяват преходни състояния на чревна дисбиоза и промени в метаболизма (например уробилиноген) през първите 3 месеца от живота. Тези метаболитите или разликите в микробиомите се използват при проектирането на предварително за използване на пробиотици или да послужат, като прогностични биомаркери. Разработен е модел чрез комбиниране оценки на производителността на екосистемите и генерирането на екосистемни услуги за дефиницията на дисбиоза при кърмачета. Според него микробиома на червата се характеризира с:1) без смущения в състава и количествата на таксоните при промяна на диетата или приема на антибиотици; 2) висока податливост на инвазия от външни таксони; и 3) слабо използване на наличните ресурси (в т. ч. олигозахариди от кърма). Здравословното/балансираното състояние на микробиотата се характеризира, като високо функционираща екосистема, когато микробиома на червата е: 1) стабилен във времето по състав и количество на таксоните, 2) устойчив на инвазия от алохтонни бактерии; и 3) да демонстрира висока конверсия на олигозахаридите на кърмата в крайни продукти и биомаса от полза за бебетата. Този модел е агностичен по метод и индекс на избор и осигурява количествен показател и обективен подход за оценка микробиома, но е ограничен основно в данни за състава и количеството на микроорганизмите и не се базира на корелационни зависимости между състав и количество на микроорганизмите, активност на ензимите, отговорни за усвояването на олигозахаридите от кърмата и количеството на метаболитите, секретирани от микробиотата.Epidemiological studies reveal a number of environmental exposures associated with asthma. This could explain the escalation of asthma over the past 30 years. Infants at risk of asthma exhibit transient states of gut dysbiosis and metabolic changes (eg, urobilinogen) during the first 3 months of life. These metabolites or differences in the microbiome are used in the design of advance for the use of probiotics or to serve as prognostic biomarkers. A model was developed by combining estimates of ecosystem productivity and the generation of ecosystem services for the definition of dysbiosis in infants. According to him, the gut microbiome is characterized by: 1) no disturbance in the composition and amounts of taxa when changing the diet or taking antibiotics; 2) high susceptibility to invasion by external taxa; and 3) poor use of available resources (including breast milk oligosaccharides). The healthy/balanced state of the microbiota is characterized as a highly functioning ecosystem when the gut microbiome is: 1) stable over time in terms of composition and amount of taxa, 2) resistant to invasion by allochthonous bacteria; and 3) to demonstrate high conversion of breast milk oligosaccharides into end products and biomass beneficial to infants. This model is agnostic by method and selection index and provides a quantitative indicator and an objective approach to assess the microbiome, but it is mainly limited in data on the composition and quantity of microorganisms and is not based on correlations between composition and quantity of microorganisms, activity of enzymes , responsible for the absorption of oligosaccharides from breast milk and the amount of metabolites secreted by the microbiota.
Настоящата заявка за патент се отнася до разработването на специфичен метод за ин витро количествена оценка за бързо прогнозиране на дисбиози при кърмачета на възраст от 1 месец до 1 година, при което се постига възможност за контрол на човешкия микробиом, като при метода, съгласно описанието се отчитат от една страна общи показатели като възраст и пол, а от друга специфичните показатели за здравословното състояние на човека. Предлаганият метод е основан на обработването на данни от анализи на разнообразието и съотношението на микроорганизмите в интестиналния тракт на детето и други телесни течности (слюнка, кърма, фецес), количество на метаболити използвани, като биомаркери и отчитане на нивото на ензимна активност на ензими, използвани като биомаркери, като се позволява отчитане на индивидуалните особености на хората.The present patent application relates to the development of a specific in vitro quantitative assessment method for the rapid prediction of dysbiosis in infants aged 1 month to 1 year, in which the possibility of controlling the human microbiome is achieved, as the method described take into account, on the one hand, general indicators such as age and gender, and on the other hand, the specific indicators of a person's state of health. The proposed method is based on the processing of data from analyzes of the diversity and ratio of microorganisms in the intestinal tract of the child and other body fluids (saliva, breast milk, feces), the amount of metabolites used as biomarkers and reporting the level of enzyme activity of enzymes, used as biomarkers, allowing consideration of the individual characteristics of people.
Методът, предмет на настоящата заявка за патент се основава на интегриран подход за ин витро анализ на баланса на чревната микробиота при деца от един до дванадесет месеца и прогноза за нейното възстановяване при установена дисбиоза, посредством изчисляване на коефициенти на корелация между ключови показатели, разделени на три основни групи:The method, the subject of the present patent application, is based on an integrated approach for in vitro analysis of the balance of the intestinal microbiota in children from one to twelve months and prediction of its recovery in case of established dysbiosis, by means of the calculation of correlation coefficients between key indicators divided into three main groups:
1. Корелация между състав и количество на микроорганизмите в майчина кърма и във фецес на детето.1. Correlation between composition and amount of microorganisms in mother's breast milk and in the child's feces.
2. Корелация между ензимен профил и активност на ензимите, отговорни за усвояването и метаболизирането на компонентите на кърмата (лактоза, липиди, олигозахариди, протеини) в проба от кърма и проба от фецес на детето.2. Correlation between enzyme profile and activity of enzymes responsible for absorption and metabolization of breast milk components (lactose, lipids, oligosaccharides, proteins) in a sample of breast milk and a sample of the child's feces.
3. Корелация между количеството на метаболитите, получени от метаболизирането на основните компоненти на кърмата от микробиотата в кърмата и във фецеса на детето.3. Correlation between the amount of metabolites obtained from the metabolization of the main components of breast milk by the microbiota in breast milk and in the child's feces.
Методът за ин витро количествена оценка за бързо прогнозиране на дисбиози при кърмачета до една година изисква следния ход на анализа:The in vitro quantitative assessment method for rapid prediction of dysbiosis in infants up to one year requires the following course of analysis:
1. Протокол за количествен анализ на човешка микробиота чрез в реално време qPCR. Представеният протокол може да се прилага за установяване на отклонения за анализ на дисбиоза при новородени от един до дванадесет месеца и да бъде включен към алгоритъм за идентифициране на състояние, отклонения и правила за възстановяване баланса на микробиотата. Чрез него ще могат да се определят количествено различни групи микроорганизми от полезната и патогенната микрофлора, които да се използват за изчисляване на съотношенията между отделните видове (таблица 1). От съществено значение за определяне степента на дисбиоза представляват съотношенията бифидобактерии/ бактероиди; лактобацили/бактероиди; (бифидобактерии+лактобацили)/бактероиди;(бифидо-бактерии+лактобацили)/дрожди;1. Protocol for quantitative analysis of human microbiota by real-time qPCR. The presented protocol can be applied to establish deviations for analysis of dysbiosis in newborns from one to twelve months and be included in an algorithm for identifying condition, deviations and rules for restoring the microbiota balance. Through it, it will be possible to quantify different groups of microorganisms from the beneficial and pathogenic microflora, which can be used to calculate the ratios between individual species (table 1). Of essential importance for determining the degree of dysbiosis are the bifidobacteria/bacteroid ratios; lactobacilli/bacteroides; (bifidobacteria+lactobacilli)/bacteroids;(bifidobacteria+lactobacilli)/yeasts;
(бифидобактерии+лактобацили)/Е. coli. Друг важен показател е съотношението между бифидобактериите и основните ензими, отговорни за усвояването на основните компоненти на кърмата (лактоза, липиди, протеини, олигозахариди).(bifidobacteria+lactobacilli)/E. coli. Another important indicator is the ratio between bifidobacteria and the main enzymes responsible for digesting the main components of breast milk (lactose, lipids, proteins, oligosaccharides).
Стойностите на отделните съотношения варират в зависимост от възрастта, здравословното състояние и диетата. Диапазонът на съотношенията при здрави индивиди е представен в таблица 6.The values of the individual ratios vary depending on age, health and diet. The range of ratios in healthy subjects is presented in Table 6.
BG 67567 BlBG 67567 Bl
Таблица 1. Модел на съпоставяне на данните от изследваните 12 показатели.Table 1. Model of comparison of the data from the 12 investigated indicators.
2. Анализ на ензими в проби от майчина кърма и фецес от деца от един до дванадесет месеца, които са отговорни за метаболизирането на основните компоненти на кърмата (лактоза, олигозахариди, липиди, протеини - β-галактозидаза, α-галактозидаза, а-глюкозидаза, β-глюкозидаза, α-фукозидаза, липаза, протеаза). За целите на метода се изчисляват съотношенията между отделните ензими, което дава информация за типа на метаболитните процеси, които се осъществяват, а от друга страна дават информация за капацитета на полезната микрофлора за поддържане баланса на чревната микрофлора. Ензимът α-фукозидаза дава пряка информация за потенциала на адхезия на полезната микрофлора (бифидобактерии и лактобацили) върху епителните клетки на чревната лигавица, докато останалите ензими дават информация за скоростта на размножаване на полезните микроорганизми и мястото им с тази специфична екологична ниша. Данните за количеството на ензимите корелират с данните за количеството метаболити, установени в съответните проби. Диапазонът на съотношенията на стойностите на ензимните активност е описан в таблица 6.2. Analysis of enzymes in samples of breast milk and feces from children from one to twelve months, which are responsible for metabolizing the main components of breast milk (lactose, oligosaccharides, lipids, proteins - β-galactosidase, α-galactosidase, α-glucosidase , β-glucosidase, α-fucosidase, lipase, protease). For the purposes of the method, the ratios between the individual enzymes are calculated, which gives information about the type of metabolic processes that take place, and on the other hand, they give information about the capacity of the beneficial microflora to maintain the balance of the intestinal microflora. The enzyme α-fucosidase gives direct information about the adhesion potential of the beneficial microflora (bifidobacteria and lactobacilli) on the epithelial cells of the intestinal mucosa, while the other enzymes give information about the rate of reproduction of the beneficial microorganisms and their place with this specific ecological niche. Enzyme amount data correlates with metabolite amount data found in the respective samples. The ratio range of enzyme activity values is described in Table 6.
3. Анализ на количеството късоверижни мастни киселини в проби от кърма и фецес на бебета от един до дванадесет месеца. Количественият анализ на лактат, ацетат пропионат и бутират в проби от кърма и фецес на бебета на възраст до една година дават обективна информация за метаболитните процеси осъществявани и с участието на съпътстващата микробиота. Наличие на късоверижни мастни киселини е пряко потвърждение за функционалната активност на бифидобактериите и лактобацилите. Съотношението между отделните групи микроорганизми, описани в първа точка на предлагания метод и количеството на късоверижните мастни киселини предоставя съществена информация за баланса на микробиотата и за нейното функционално състояние. Освен това за целите на предлагания метод могат да се изчислят съотношенията между ензимните активности на ензимите от втора точка (вторият етап на анализа) и количеството на късоверижните мастни киселини. Диапазонът на съотношенията на стойностите на ензимните активност е описан в таблица 6.3. Analysis of the amount of short-chain fatty acids in samples of breast milk and feces of infants from one to twelve months. The quantitative analysis of lactate, acetate propionate and butyrate in samples of breast milk and feces of babies up to one year of age provide objective information about the metabolic processes carried out with the participation of the accompanying microbiota. The presence of short-chain fatty acids is a direct confirmation of the functional activity of bifidobacteria and lactobacilli. The ratio between the individual groups of microorganisms described in the first point of the proposed method and the amount of short-chain fatty acids provides essential information about the balance of the microbiota and its functional state. Furthermore, for the purposes of the proposed method, the ratios between the enzyme activities of the enzymes from the second point (the second stage of the analysis) and the amount of short-chain fatty acids can be calculated. The ratio range of enzyme activity values is described in Table 6.
4. Изчисляване корелационните зависимости между съотношенията на отделните компоненти за дефиниране на статуса на микробиома при деца от един до дванадесет месеца. Предлаганият от нас ин витро модел за определяне на чревната дисбиоза при деца от един до дванадесет месеца, като състояние на специфичната екологична ниша в интестиналния тракт, корелиращо с намаляване на риска от остри и хронични заболявания. Освен това моделът може да предоставя рамка за оценка на ефективността на стратегии за превенция и лечение на чревни дисбиози.4. Calculation of the correlation dependences between the ratios of the individual components to define the status of the microbiome in children from one to twelve months. Our proposed in vitro model for the determination of intestinal dysbiosis in children from one to twelve months, as a state of the specific ecological niche in the intestinal tract, correlating with a reduction in the risk of acute and chronic diseases. In addition, the model may provide a framework for evaluating the effectiveness of strategies for the prevention and treatment of intestinal dysbiosis.
Примери на изпълнение на изобретениетоExamples of implementation of the invention
Пример 1Example 1
Ин витро изследване на 12 показателя по оценка на баланса на микробиотата при бебета от един месец до дванадесет месеца:In vitro study of 12 indicators of microbiota balance assessment in infants from one month to twelve months:
1. Протокол за количествен анализ на човешката микробиота чрез в реално време qPCR.1. Protocol for quantitative analysis of the human microbiota by real-time qPCR.
Представеният протокол може да се прилага за установяване на отклонения за анализ на дисбиоза при новородени от един до дванадесет месеца и да бъде включен към алгоритъм за идентифициране на състояние, отклонения и правила за възстановяване баланса на микробиотата.The presented protocol can be applied to establish deviations for analysis of dysbiosis in newborns from one to twelve months and be included in an algorithm for identifying condition, deviations and rules for restoring the microbiota balance.
А. Праймери и флуоресцентно белязани сонди за провеждане в реално време qPCR детекция на бактериални групи и видове в проби от таргетните групи.A. Primers and fluorescently labeled probes for real-time qPCR detection of bacterial groups and species in samples from target groups.
Праймерните двойки и флуоресцентно белязани сонди за провеждане в реално време qPCR детекция на бактериални видове и съобщества и в проби от таргетните групи са представени в таблица 2Primer pairs and fluorescently labeled probes for performing real-time qPCR detection of bacterial species and communities and in samples from the target groups are presented in Table 2
Таблица 2. Праймери и флуоресцентно белязани сонди за провеждане в реално време qPCR детекция на бактериални групи и видове в представеното изследване.Table 2. Primers and fluorescently labeled probes for real-time qPCR detection of bacterial groups and species in the presented study.
BG 67567 BlBG 67567 Bl
2. Контролни бактериални щамове2. Control bacterial strains
Бактериални щамове, използвани за контрол на специфичността на използваните праймери и белязани сонди, както за количествена оценка на отделни бактериални видове и съобщества са представени в таблица 3. Използваните щамове са закупени от Националната банка за промишлени микроорганизми и клетъчни култури (НБПМК) и German collection of Microorganisms and cell cultures (DSMZ). Щамовете се култивират аеробно или анаеробно в селективни хранително среди, съгласно препоръките на НБПМК и DSMZ. От развитите култури за всеки щам се правят серии от разреждания, които се поставят върху съответната агарова среда в петрита, за да се определи общ брой бактерии-колоно-образуващи единици (CFU). Допълнително от направените разреждания се вземат проби от по 1,0 ml, които се центрофугират при следните условия: 12000 rpm/3min. Получените утайки от бактериални клетки се съхраняват при - 80°С до използването им за анализ.Bacterial strains used to control the specificity of the primers and labeled probes used, as well as for the quantitative assessment of individual bacterial species and communities are presented in Table 3. The strains used were purchased from the National Bank for Industrial Microorganisms and Cell Cultures (NBPMK) and the German collection of Microorganisms and cell cultures (DSMZ). The strains are cultivated aerobically or anaerobically in selective nutrient media, according to the recommendations of NBPMK and DSMZ. Dilution series were made from the grown cultures for each strain and plated on the appropriate agar medium in a petri dish to determine the total number of bacterial colony-forming units (CFU). Additionally, samples of 1.0 ml are taken from the dilutions, which are centrifuged under the following conditions: 12000 rpm/3min. The obtained sediments of bacterial cells were stored at - 80°C until their use for analysis.
Таблица 3 Контролни бактериални щамове използвани в изследванетоTable 3 Control bacterial strains used in the study
BG 67567 BlBG 67567 Bl
3. Изолиране на ДНК от бактериални култури и проби от таргетните групи3. Isolation of DNA from bacterial cultures and samples from the target groups
Бактериалната геномна ДНК от контролните щамове и изолати от проби на таргетните групи се екстрахира чрез използване на Blood and Tissue kit DNeasy (Qiagen, Hilden, Germany).Bacterial genomic DNA from control strains and isolates from target group samples was extracted using the Blood and Tissue kit DNeasy (Qiagen, Hilden, Germany).
Микробиална ДНК от фекални проби и от кърма се изолира QIAamp DNA Stool mini kit (Qiagen, Hilden, Germany). Първоначално 200 mg фекална проба/кърма се разреждат с 1,8 ml стерилен Pbs буфер. Към 200 μΐ разредена фекална проба се прибавят 20 μΐ лизозим (150 mg/ml) и 130 μΐ лизиращ буфер (2,0 Mm Na2EDTA; 20 Mm Tris-HCL; 1,2 1.2% Triton X-100). Сместа се инкубира при 37°С за 30 min, след което се изолира ДНК.Microbial DNA from faecal samples and from breast milk was isolated QIAamp DNA Stool mini kit (Qiagen, Hilden, Germany). Initially, 200 mg of faecal sample/milk was diluted with 1.8 ml of sterile Pbs buffer. To 200 μΐ diluted faecal sample, 20 μΐ lysozyme (150 mg/ml) and 130 μΐ lysis buffer (2.0 Mm Na2EDTA; 20 Mm Tris-HCL; 1.2 1.2% Triton X-100) were added. The mixture was incubated at 37°C for 30 min, after which DNA was isolated.
4. Количествено определяне на ДНК4. Quantification of DNA
Количеството и честотата на бактериалната геномна ДНК изолирана от щамовете стандарти и от изследваните проби се определя спектрофотометрично. За целта се определя абсорбцията на подходящо разредените проби ДНК при дължини на вълните 260 nm и 280 nm. Измерванията се извършват на спектрофотометър Shimadzu UV-2600 при светлинен лъч 8,5 mm, след нулиране на апарата срещу кювета с елуираш буфер. Еднородността на геномната ДНК се определи чрез визуализиране на изолираната ДНК в 1% (w/v) агарозен гел чрез електрофореза и оцветяване с етидиев бромид. Пробите с изолираната ДНК се съхраняват при -20°С.The amount and frequency of bacterial genomic DNA isolated from the standard strains and from the tested samples was determined spectrophotometrically. For this purpose, the absorbance of the suitably diluted DNA samples was determined at wavelengths of 260 nm and 280 nm. Measurements were performed on a Shimadzu UV-2600 spectrophotometer at an 8.5 mm light beam, after zeroing the apparatus against a cuvette with elution buffer. Homogeneity of genomic DNA was determined by visualizing the isolated DNA in a 1% (w/v) agarose gel by electrophoresis and staining with ethidium bromide. Samples with isolated DNA were stored at -20°C.
5. Провеждане на В реално време qPCR5. Conduct Real-time qPCR
В реално време qPCR реакциите за детекция и количествено определяне без използване флуоресцентни сонди се използва SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Реакциите се залагат в 96-ямкови плаки с краен обем на всяка 25 μΐ. Реакциите се провеждат в реално време PCR CFX96 Touch (BIO-RAD) с версия на софтуера 3.0.1224 при условия за всяка от целевите групи посочени в таблица 4.Real-time qPCR reactions for detection and quantification without using fluorescent probes used SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Reactions were plated in 96-well plates with a final volume of 25 μΐ each. Reactions were performed on a real-time PCR CFX96 Touch (BIO-RAD) with software version 3.0.1224 under conditions for each of the target groups indicated in Table 4.
Таблица 4 Праймери и реакционни условия за провеждане на в реално време qPCR за количествено определяне на бактерии във фекални проби.Table 4 Primers and reaction conditions for performing real-time qPCR for the quantification of bacteria in faecal samples.
F Jjirto 05 и R_Latie> 04F Jjirto 05 and R_Latie> 04
Првймер^ - 0,2 μ M Ьсекн; Прсде(|щгу1И11нв - 10 min'95 Деиятурацня - 30 soc^S X; € вързване на пряймсрлтс - 30 («Μ X;Example^ - 0.2 μ M lsec; Prsde(|shgu1I11nv - 10 min'95 Deiaturation - 30 soc^S X; € binding of primesrlts - 30 («Μ X;
Удио*айанг I min.T2 °C;Udio*ayang I min.T2 °C;
Детекция - 30 тес/ЯО *С Брой цнклц Ю.Detection - 30 tes/NAU *With Number of tsnclcs Yu.
BG 67567 BlBG 67567 Bl
В реално време qPCR реакциите за детекция и количествено определяне на бактерии с използване на флуоресцентно белязани сонди се използва TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Реакциите се залагат в 96-ямкови плаки с краен обем на всяка реакция 25 μΐ. Условия за провеждане на всеки от анализите за определяне на целевите групи бактерии са посочени в таблица 5.Real-time qPCR reactions for detection and quantification of bacteria using fluorescently labeled probes used TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Reactions were seeded in 96-well plates with a final volume of each reaction of 25 μΐ. Conditions for conducting each of the assays to determine the target groups of bacteria are listed in Table 5.
Таблица 5. Праймери, флуоресцентни сонди и реакционни условия за провеждане на В реално време qPCR за количествено определяне на бактерии във фекални проби.Table 5. Primers, fluorescent probes and reaction conditions for conducting Real-time qPCR for the quantification of bacteria in faecal samples.
BG 67567 BlBG 67567 Bl
Всички В реално време qPCR анализи на количествено определяне на бактерии във фекални проби и кърма се провеждат с минимум двукратно повторение от различни анализи.All Real-time qPCR assays for bacterial quantification in faecal samples and breast milk were performed with a minimum of two replicates from different assays.
6. Електрофоретичен анализ на ДНК фрагменти, получени след провеждане на В реално време qPCR.6. Electrophoretic analysis of DNA fragments obtained after performing real-time qPCR.
За проверка на размера и интегритета на амплимерите, получени след провеждане на В реално време qPCR, се провежда агарозна гел-електрофореза на реакционните продукти. Разделянето на фрагментите, ДНК се извършва в 2% агарозен гел, при напрежение 35 V и 25 mA сила на тока. Разделените фрагменти се визуализрат флуоресцентно - чрез обработка на гела с етидиев бромид и осветяване с UB светлина. Приблизителните размери на ДНК фрагментите се определят чрез съпоставка със стандар, съдържащ малки ДНК фрагменти с известни размери - SmartLadder SF (Eurogentec, Belgium).Agarose gel electrophoresis of the reaction products was performed to verify the size and integrity of the amplimers obtained after performing real-time qPCR. The separation of the DNA fragments was performed in a 2% agarose gel at a voltage of 35 V and a current of 25 mA. The separated fragments are visualized fluorescently - by treating the gel with ethidium bromide and illuminating with UB light. The approximate sizes of the DNA fragments are determined by comparison with a standard containing small DNA fragments of known sizes - SmartLadder SF (Eurogentec, Belgium).
7. Статистическа обработка на данните7. Statistical data processing
Статистическата обработка на данните и тяхното графично представяне се извършват със софтуер SYSTAT версия 13.2 и SigmaPlot версия 12.0 (Systat Software Inc., USA).Statistical processing of the data and their graphical presentation were performed with SYSTAT version 13.2 and SigmaPlot version 12.0 software (Systat Software Inc., USA).
Анализ на ензими в проби от майчина кърма и фецес от новороденоAnalysis of enzymes in breast milk and newborn fecal samples
1. Определяне на ензимна активност на β-галактозидаза (ЕС 3.2.1.23)1. Determination of β-galactosidase enzyme activity (EU 3.2.1.23)
Ензимната реакция се проведе при условия: 100 тМ натриево ацетатен буфер, pH 6.0, съдържащ 2 тМ разтвор на о-нитрофенил-З-О-галактопиранозид (ONP-Gal) и подходящо разредени клетки или надутаечна течност след дезинтегриране на клетките при 37°С Реакцията се спира с 1 М натриев карбонат. Една единица активност на ензима катализира получаването на 1.0 pmol о-нитрофенол за една минута при pH 4.0 и 37°С. Съдържанието на о-нитрофенол се определя спектрофотометрично при 410 nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800.The enzyme reaction was carried out under the following conditions: 100 mM sodium acetate buffer, pH 6.0, containing a 2 mM solution of o-nitrophenyl-3-O-galactopyranoside (ONP-Gal) and appropriately diluted cells or supernatant after cell disintegration at 37°C The reaction was quenched with 1 M sodium carbonate. One unit of enzyme activity catalyzes the production of 1.0 pmol o-nitrophenol in one minute at pH 4.0 and 37°C. The o-nitrophenol content was determined spectrophotometrically at 410 nm wavelength on a Beckman Coulter DU 800 spectrophotometer.
Всички експерименти за определяне на ензимната активност са проведени с трикратна повтаряемост.All experiments for the determination of enzyme activity were performed in triplicate.
2. Определяне активността на α-галактозидаза (ЕС 3.2.1.22)2. Determination of α-galactosidase activity (EU 3.2.1.22)
Ензимната реакция се проведе при условия: 400 тМ цитратен буфер, pH 4.0, съдържащ 9.9 тМ разтвор на р-нитрофенил a-D-галактопиранозид (PNP-Gal) (приготвя се в дестилирана вода чрез разтваряне на рнитрофенол a-D-галактопиранозид, Sigma кат. N.« N-0877) и подходящо разредени клетки или надутаечна течност след дезинтегриране на клетките при 37°С. Реакцията се спира с 200 тМ боратен буфер, pH 9.8. Една единица активност превръща 1.0 qmole от р-нитрофенил a-D-галактопиранозид в о-нитрофенол и D-галактоза за една минута при pH 4.0 и 37°С.The enzyme reaction was carried out under conditions: 400 mM citrate buffer, pH 4.0, containing a 9.9 mM p-nitrophenyl α-D-galactopyranoside (PNP-Gal) solution (prepared in distilled water by dissolving p-nitrophenol α-D-galactopyranoside, Sigma cat. N. « N-0877) and appropriately diluted cells or supernatant after disintegration of the cells at 37°C. The reaction was stopped with 200 mM borate buffer, pH 9.8. One unit of activity converts 1.0 qmole of p-nitrophenyl α-D-galactopyranoside to o-nitrophenol and D-galactose in one minute at pH 4.0 and 37°C.
Съдържанието на р-нитрофенол се определя спектрофотометрично при 405 nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800.The p-nitrophenol content was determined spectrophotometrically at 405 nm wavelength on a Beckman Coulter DU 800 spectrophotometer.
Всички експерименти за определяне на ензимната активност са проведени с трикратна повтаряемост.All experiments for the determination of enzyme activity were performed in triplicate.
3. Определяне активността на α-L - фукозидаза (ЕС 3.2.1.51)3. Determination of the activity of α-L - fucosidase (EU 3.2.1.51)
Ензимната реакция се проведе при условия: 100 mМ цитратен буфер, pH 6.5, съдържащ 10 mМ разтвор на р-нитрофенил a-L-фукопиранозид (PNP-FUC) (приготвя се посредством разреждане на р-нитрофенил a-Lфукопиранозид (Sigma кат. № N3628) с дестилирана вода и подходящо разредени клетки при 37°С . Реакцията се спира с 200 mМ боратен буфер, pH 9.8. Една единица активност превръща 1.0 pmole от р-нитрофенил a-Lфукопиранозид в р-нитрофенол и L-фукопиранозид за една минута при pH 4.0 и 37°С. Съдържанието на рнитрофенол се определя спектрофотометрично при 405 nm дължина на вълната на спектрофотометьр Beckman Coulter DU 800.The enzyme reaction was carried out under conditions: 100 mM citrate buffer, pH 6.5, containing 10 mM solution of p-nitrophenyl α-L-fucopyranoside (PNP-FUC) (prepared by diluting p-nitrophenyl α-Lfucopyranoside (Sigma cat. no. N3628) with distilled water and appropriately diluted cells at 37° C. The reaction is stopped with 200 mM borate buffer, pH 9.8. One unit of activity converts 1.0 pmole of p-nitrophenyl α-L-fucopyranoside to p-nitrophenol and L-fucopyranoside in one minute at pH 4.0 and 37° C. Nitrophenol content was determined spectrophotometrically at 405 nm wavelength on a Beckman Coulter DU 800 spectrophotometer.
Всички експерименти за определяне на ензимна активност са проведени с трикратна повтаряемост.All experiments for the determination of enzyme activity were performed in triplicate.
4. Определяне активността на α-глюкозидаза (ЕС 3.2.1.20)4. Determination of α-glucosidase activity (EC 3.2.1.20)
Ензимната реакция се проведе при условия: 100 mМ ацетатен буфер, pH 6,0, съдържащ 1.25 mМ разтвор на р-нитрофенил a-D-глюкопиранозид (приготвя се посредством разреждане на р-нитрофенил a-Dглюкопиранозид (Sigma кат. № N3628) с дестилирана вода, и подходящо разредени клетки при 37°С. Реакцията се спира с 0.5 М натриев карбонат. Една единица активност превръща 1.0 pmоlе от р-нитрофенол a-D-глюкопиранозид в р-нитрофенол и D-глюкопиранозид за една минута при pH 6.0 и 37°С. Съдържанието на р-нитрофенол се определя спектрофотометрично при 405 nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU800.The enzyme reaction was carried out under conditions: 100 mM acetate buffer, pH 6.0, containing 1.25 mM solution of p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside (prepared by diluting p-nitrophenyl α-Dglucopyranoside (Sigma cat. no. N3628) with distilled water , and suitably diluted cells at 37° C. The reaction was stopped with 0.5 M sodium carbonate. One unit of activity converted 1.0 pmol of p-nitrophenol α-D-glucopyranoside to p-nitrophenol and D-glucopyranoside in one minute at pH 6.0 and 37° C The p-nitrophenol content was determined spectrophotometrically at 405 nm wavelength on a Beckman Coulter DU800 spectrophotometer.
Всички експерименти за определяне на ензимна активност са проведени с трикратна повтаряемост.All experiments for the determination of enzyme activity were performed in triplicate.
5. Определяне активността на β-глюкозидаза (ЕС 3.2.1.28)5. Determination of β-glucosidase activity (EU 3.2.1.28)
Ензимната реакция се проведе при условия: 0.1 М ацетатен буфер, pH 5.0, съдържащ 20 mM разтвор на р-нитрофенил-b-D-глюкопиранозид (ONP-Glu) и подходящо разредени клетки при 37°С. Реакцията се спира с 0.2 М натриев карбонат. Една единица активност превръща 1.0 pmole от р-нитрофенил a-D-глюкопиранозид в р-нитрофенол и D-глюкопиранозид за една минута при pH 5.0 и 37°С. Съдържанието на р-нитрофенол се определя спектрофотометрично при 405 nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800.The enzyme reaction was carried out under conditions: 0.1 M acetate buffer, pH 5.0, containing a 20 mM solution of p-nitrophenyl-b-D-glucopyranoside (ONP-Glu) and appropriately diluted cells at 37°C. The reaction was stopped with 0.2 M sodium carbonate. One unit of activity converts 1.0 pmole of p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside to p-nitrophenol and D-glucopyranoside in one minute at pH 5.0 and 37°C. The p-nitrophenol content was determined spectrophotometrically at 405 nm wavelength on a Beckman Coulter DU 800 spectrophotometer.
Всички експерименти за определяне на ензимна активност са проведени с трикратна повтаряемост.All experiments for the determination of enzyme activity were performed in triplicate.
6. Определяне активността на протеаза6. Determination of protease activity
Протеазната активност на клетките и надутаечната течност (HYT) се изследва в присъствие на казеин (Fluka) като субстрат. Една единица (U) активност на протеазата се дефинира като количеството ензим, което хидролизира казеина до 1 pmol тирозин за 1 минута, при pH 7,5 и 37°С.Protease activity of cells and hydatid fluid (HYT) was assayed in the presence of casein (Fluka) as a substrate. One unit (U) of protease activity is defined as the amount of enzyme that hydrolyzes casein to 1 pmol of tyrosine in 1 minute, at pH 7.5 and 37°C.
Ензимната реакция се провежда при следните условия: в 50 mМ фосфатен буфер, pH 7,5 се разтвяря 0,65% (w/v) казеин и 1,0 ml подходящо разредена проба (клетки или HYT). Реакцията протича за 10 min при 37°С на водна баня. Реакцията се спира с добавяне на 110 тМ трихлорооцетна киселина (ТХО) (Merck) при 37°С. Пробите се инкубират с ТХО за 30 минути при същата температура. За отделяне на неразградения казеин, пробите се центрофугират при 9000 об./15 min, 4°С. Надутаечната течност се анализира за количество освободен тирозин, от разграждането на казеина, в присъствие на 500 mM NazCOs и 0,5 М разтвор на Фолин реагент (Merck) при 37°С за 30 минути. Измерва се абсорбцията при Z = 660 nm (А660) на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800, спрямо контрола, съдържаща вместо проба дестилирана вода. От измерената А660 по стандартна права се определя концентрацията на тирозина (pmol). За построяването на стандартна права се използва като стандарт L-тирозин (Sigma-Aldrich).The enzyme reaction was carried out under the following conditions: 0.65% (w/v) casein and 1.0 ml of appropriately diluted sample (cells or HYT) were dissolved in 50 mM phosphate buffer, pH 7.5. The reaction takes place for 10 min at 37°C in a water bath. The reaction was stopped by the addition of 110 mM trichloroacetic acid (THO) (Merck) at 37°C. Samples were incubated with THO for 30 min at the same temperature. To separate the undegraded casein, the samples were centrifuged at 9000 rpm/15 min, 4°C. The supernatant was analyzed for the amount of tyrosine released, from the degradation of casein, in the presence of 500 mM NazCOs and 0.5 M Folin's reagent solution (Merck) at 37°C for 30 minutes. Absorbance at Z = 660 nm (A660) was measured on a Beckman Coulter DU 800 spectrophotometer against a control containing distilled water instead of sample. The tyrosine concentration (pmol) was determined from the measured A660 according to a standard curve. L-tyrosine (Sigma-Aldrich) was used as a standard for the construction of a standard curve.
Всички експерименти за определяне на протеазна активност са проведени минимум с трикратна повторяемост.All experiments for the determination of protease activity were performed in triplicate at least.
7. Определяне активността на липаза (ЕС 3.1.1.3)7. Determination of lipase activity (EU 3.1.1.3)
Ензимната реакция се проведе при условия: 0.1 М ацетатен буфер, pH 7,6, съдържащ 0,8 mМ разтвор на р-нитрофенил-палмитат и подходящо разредени клетки при 37°С. Реакцията се спира с 0.2 М оловен ацeтат lеаd (II). Една единица активност превръща 1.0 pmole от р-нитрофенил палмитат в р-нитрофенол и палмитат за една минута при pH 7,6 и 37°С. Съдържанието на р-нитрофенол се определя спектрофотометрично при 405 nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800.The enzyme reaction was carried out under conditions: 0.1 M acetate buffer, pH 7.6, containing 0.8 mM solution of p-nitrophenyl-palmitate and appropriately diluted cells at 37°C. The reaction was stopped with 0.2 M lead acetate lead (II). One unit of activity converts 1.0 pmole of p-nitrophenyl palmitate to p-nitrophenol and palmitate in one minute at pH 7.6 and 37°C. The p-nitrophenol content was determined spectrophotometrically at 405 nm wavelength on a Beckman Coulter DU 800 spectrophotometer.
Всички експерименти за определяне на ензимна активност са проведени с трикратна повторяемост.All experiments for the determination of enzyme activity were performed in triplicate.
Анализ на късоверижни мастни киселини в проби от кърма и фецес на бебета от един до дванадесет месеца.Analysis of short-chain fatty acids in breast milk and faecal samples of one- to twelve-month-old infants.
За показването на късоверижните мастни киселини в пробите от екскременти е разработен следният протокол:The following protocol has been developed for the display of short-chain fatty acids in excrement samples:
1. Изолиране на късоверижни мастни киселини от екскременти.1. Isolation of short-chain fatty acids from excreta.
Към 100 mg прясна фекална проба или майчина кърма се добавя 2% НзРО4 или 0,05% H2SO4 в съотношение 1:10. Пробите се хомогенизират много добре на вортекс 2 пъти по 2 min. Полученият хомогенизат се центрофугира 10 min, 13 000 rpm, след което се отделя супернатанта. От супернатанта се вземат 200 pL, които се екстрахират с 200 μL органичен разтворител (CH2CI2, AcCN, EtOH, EtOAc). Пробите се хомогензират, след което се центрофугира 5 min, 13 000 rpm. Полученият органичен слой се отделя и подлага на HPLC анализ.2% H3PO4 or 0.05% H2SO4 in a ratio of 1:10 is added to 100 mg of fresh fecal sample or breast milk. The samples are homogenized very well on a vortex 2 times for 2 min each. The resulting homogenate was centrifuged for 10 min, 13,000 rpm, after which the supernatant was separated. 200 pL were taken from the supernatant and extracted with 200 μL organic solvent (CH 2 Cl 2 , AcCN, EtOH, EtOAc). Samples were homogenized, then centrifuged for 5 min, 13,000 rpm. The resulting organic layer was separated and subjected to HPLC analysis.
2. HPLC метод за анализ на късоверижни мастни киселини.2. HPLC method for the analysis of short-chain fatty acids.
Използвана е HPLC ситема Konik-Tech (Испания) снабдена с колона Aminex НРХ-87Н Ion Exclusion Column (7.8 mm i.d. x 30 cm, Biorad, Richmond, СА) и предколона Micro-Guard Cation-H (4.6 mm i.d. x 30 mm, Biorad). Определянето на пробите е осъществено с UV детектор при дължина на вълната 210 nm, при подвижна фаза 0,005М H2SO4, скорост на потока 0,6 ml/min и температура на колоната Т = 40°С.A Konik-Tech (Spain) HPLC system equipped with an Aminex НХ-87Н Ion Exclusion Column (7.8 mm i.d. x 30 cm, Biorad, Richmond, CA) and a Micro-Guard Cation-H pre-column (4.6 mm i.d. x 30 mm, Biorad). The determination of the samples was carried out with a UV detector at a wavelength of 210 nm, with a mobile phase of 0.005 M H2SO4, a flow rate of 0.6 ml/min and a column temperature T = 40°C.
Идентифицирането на пиковете е осъществено по времената на задържане спрямо стандарти на късоверижни мастни киселини: млечна киселина, оцетна киселина, пропионова киселина и бутенова киселина. За количественото определяне на късоверижните мастни киселини са изготвени стандартни прави в концентрации 25 - 1,56 mmol/L. Изведени са корелационни уравнения, описващи площа на ника (у) и концентрацията на късоверижните мастни киселини (х, mmol/L). Стандартните прави са с линейни участъци между 25 - 1,65 mmol/L и с коефициент на корелация 2 > 0,9999.Peaks were identified by retention times against standards of short chain fatty acids: lactic acid, acetic acid, propionic acid and butenoic acid. For the quantitative determination of short-chain fatty acids, standard lines were prepared in concentrations of 25 - 1.56 mmol/L. Correlation equations describing the area of the nick (y) and the concentration of short-chain fatty acids (x, mmol/L) were derived. The standard lines have linear sections between 25 - 1.65 mmol/L and a correlation coefficient of 2 > 0.9999.
BG 67567 BlBG 67567 Bl
Таблица 6. Диапазон на стойностите на измерваните показатели при здрави деца на възраст от един до дванадесет месеца.Table 6. Range of values of measured indicators in healthy children aged one to twelve months.
В резултат на проведените анализи на тестваните майчина кърма и фецес от новородено на възраст между един и дванадесет месеца се изчисляват следните коефициентни съотношения:As a result of the analyzes of the tested mother's breast milk and feces from a newborn between the ages of one and twelve months, the following coefficient ratios are calculated:
- количеството Бифидобактерии/Бактероиди >1.0;- the amount of Bifidobacteria/Bacteroides >1.0;
- количеството Бифидобактерии/Лактобацили >1.0;- the amount of Bifidobacteria/Lactobacilli >1.0;
- количеството Бифидобактерии+Лактобацили/Бактероиди >1.0;- the amount of Bifidobacteria+Lactobacilli/Bacteroides >1.0;
- количеството Бифидобактерии+Лактобацили/Дрожди (за фецес от детето) >1.0;- the amount of Bifidobacteria+Lactobacilli/Yeast (for feces from the child) >1.0;
- количеството Бактероиди/Дрожди (за фецес от детето) >1.0;- the amount of Bacteroides/Yeast (for feces from the child) >1.0;
- количеството Бифидобактерии+Лактобацили/Е. Коли >1.0;- the amount of Bifidobacteria+Lactobacilli/E. Cars >1.0;
- количеството Бифидобактерии+Лактобацили/активност на бета-галактозидаза при съотношение от 0,1 - 1,0;- the amount of Bifidobacteria+Lactobacilli/beta-galactosidase activity at a ratio of 0.1 - 1.0;
- количеството Бифидобактерии+Лактобацили/активност на алфа-фукозидаза при съотношение от 0,1 > 1,0;- the amount of Bifidobacteria+Lactobacilli/alpha-fucosidase activity at a ratio of 0.1 > 1.0;
- ензимните активности бета-галактозидаза/алфа-галактозидаза при съотношение от 0,1 > 1,0;- the enzyme activities beta-galactosidase/alpha-galactosidase at a ratio of 0.1 > 1.0;
- ензимните активности бета-галактозидаза/алфа-фукозидаза при съотношение от 0,1 > 1,0;- the enzyme activities beta-galactosidase/alpha-fucosidase at a ratio of 0.1 > 1.0;
- ензимните активности бета-галактозидаза/липаза при съотношение от 0,1 > 1,0;- beta-galactosidase/lipase enzyme activities at a ratio of 0.1 > 1.0;
- ензимните активности бета-галактозидаза/протеаза при съотношение от 0,1 > 1,0;- beta-galactosidase/protease enzyme activities at a ratio of 0.1 > 1.0;
- ензимните активности бета-галактозидаза+алфа-галактозидаза/алфа-фукозидаза при съотношение от 0,1 >1,0;- the enzyme activities beta-galactosidase+alpha-galactosidase/alpha-fucosidase at a ratio of 0.1 >1.0;
- метаболитите млечна киселина/оцетна киселина/маслена киселина при съотношение от 0,1 > 1,0.- the metabolites lactic acid/acetic acid/butyric acid at a ratio of 0.1 > 1.0.
BG 67567 BlBG 67567 Bl
Където:Where:
1. С - съотношение между числеността на бактерии (ензими, метаболити) А и В;1. C - ratio between the number of bacteria (enzymes, metabolites) A and B;
2. А - численост на бактерии (ензими, метаболити) А;2. A - number of bacteria (enzymes, metabolites) A;
3. A nom.min. - долната граница на нормата за численост на бактерии (ензими, метаболити)А;3. A nom. min. - the lower limit of the norm for the number of bacteria (enzymes, metabolites) A;
A nom.max. - горна граница на нормата за численост на бактерии (ензими, метаболити) А; В - численост на бактерии (ензими, метаболити) В;A nom.max. - upper limit of the norm for the number of bacteria (enzymes, metabolites) A; B - number of bacteria (enzymes, metabolites) B;
В nom.min. - долната граница на нормата за численост на бактерии (ензими, метаболити) В;In nom.min. - the lower limit of the norm for the number of bacteria (enzymes, metabolites) B;
В nom.max. - горна граница на нормата за численост на бактерии (ензими, метаболити) В.In nom.max. - upper limit of the norm for the number of bacteria (enzymes, metabolites) B.
Тенденциите при отчитане на съотношенията са изразени в таблица 7, които се получават при съответното съотношение на показателя от колоната на таблицата към показателя реда на таблицата.The trends in reporting ratios are expressed in Table 7, which are obtained at the corresponding ratio of the indicator from the column of the table to the indicator of the row of the table.
BG 67567 BlBG 67567 Bl
БифидоBifido
LABLAB
BacteroidesBacteroides
ДрождиYeast
Бифидо+МКБBifido + ICD
E. coli «- galactosidase в-gatactoiidase a-fucasidaseE. coli «-galactosidase β-gatactoiidase α-fucasidase
LipaseLipase
ProteaseProtease
МетоболитиMetabolites
БB
Таблица 7. Тенденции на съотношенията между отделните показатели, със стрелка нагоре се отбелязва положителен ефект върху микробиотата, а със стрелка надолу отрицателен ефект върху микробиотата.Table 7. Trends of the ratios between the individual indicators, an upward arrow indicates a positive effect on the microbiota, and a downward arrow indicates a negative effect on the microbiota.
Пример 2.Example 2.
Ин витро изследване на 6 показателя по оценка на баланса на микробиотата при бебета от един месец до дванадесет месеца:In vitro study of 6 indicators for assessing the balance of the microbiota in babies from one month to twelve months:
1. Протокол за количествен анализ на човешка микробиота чрез в реално време qPCR.1. Protocol for quantitative analysis of human microbiota by real-time qPCR.
Представеният протокол може да се прилага за установяване на отклонения за анализ на дисбиоза при новородени от един до дванадесет месеца и да бъде включен към алгоритъм за идентифициране на състояния, отклонения и правила за възстановяване баланса на микробиотата.The presented protocol can be applied to establish deviations for analysis of dysbiosis in newborns from one to twelve months and be included in an algorithm for identifying conditions, deviations and rules for restoring the balance of the microbiota.
А. Праймери и флуоресцентно белязани сонди за в реално време qPCR детекция на бактериални групи и видове в проби от таргетни групиA. Primers and fluorescently labeled probes for real-time qPCR detection of bacterial groups and species in target group samples
Праймерните двойки и флуоресцентно белязани сонди за провеждане на в реално време qPCR детекция на бактериални видове и съобщества в проби от различни таргетни групи са представени в таблица 8Primer pairs and fluorescently labeled probes for real-time qPCR detection of bacterial species and communities in samples from different target groups are presented in Table 8
Таблица 8. Праймери и флуоресцентно белязани сонди за в реално време qPCR детекция на бактериални групи и видове, използвани в представеното изследванеTable 8. Primers and fluorescently labeled probes for real-time qPCR detection of bacterial groups and species used in the presented study
BG 67567 BlBG 67567 Bl
2. Контролни бактериални щамове2. Control bacterial strains
Бактериални щамове, използвани за контрол на специфичността на използваните праймери и белязани сонди, както и за количествена оценка на отделни бактериални видове и съобщества са представени в таблица 2. Използваните щамове са закупени от Националната банка за промишлени микроорганизми и клетъчни култури (НБПМК) и German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ). Щамовете се култивират аеробно или анаеробно в селективни хранителни среди, съгласно препоръките на DSMZ и НБПМК. От развитите култури за всеки щам се правят серия от разреждания, които се посяват върху съответната агарова среда в петрита, за да се определи общ брой бактерии - колоно-образуващи единици (CFU). Допълнително, от направените разреждания се вземат проби от по 1,0 ml, които се центрофугират при следните условия: 12000 rpm/3min. Получените утайки от бактериални клетки се съхраняват при -80°С до използването им за анализ.Bacterial strains used to control the specificity of the primers and labeled probes used, as well as for the quantitative evaluation of individual bacterial species and communities are presented in Table 2. The strains used were purchased from the National Bank for Industrial Microorganisms and Cell Cultures (NBPMK) and German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ). The strains are cultivated aerobically or anaerobically in selective nutrient media, according to the recommendations of DSMZ and NBPMK. A series of dilutions is made from the developed cultures for each strain and plated on the corresponding agar medium in a petri dish to determine the total number of bacteria - colony-forming units (CFU). Additionally, samples of 1.0 ml are taken from the dilutions, which are centrifuged under the following conditions: 12000 rpm/3min. The resulting bacterial cell pellets were stored at -80°C until used for analysis.
Таблица 9. Контролни бактериални щамове, използвани в изследването.Table 9. Control bacterial strains used in the study.
BG 67567 BlBG 67567 Bl
3. Изолиране на ДНК от бактериални култури и проби от таргетните групи3. Isolation of DNA from bacterial cultures and samples from the target groups
Бактериална геномна ДНК от контролните щамове и изолати от проби на таргетните групи се екстрахира чрез използване на Blood and Tissue kit DNeasy (Qiagen, Hilden, Germany). Микробиална ДНК от фекални проби и от кърма се изолира чрез използване на QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Първоначално 200 mg фекалната проба/кърма се разрежда в 1,8 ml стерилен PBS буфер. Към 200 μΐ разредена фекална проба се добавят 20 μΐ лизозим (150 mg/ml) и 130 (лизиращ буфер (2,0 mM Na2EDTA; 20 тМ TrisНС1; 1,2% Triton X-100). Сместа се инкубира при 37°С за 30 минути, след което се изолира ДНК.Bacterial genomic DNA from control strains and isolates from target group samples was extracted using the Blood and Tissue kit DNeasy (Qiagen, Hilden, Germany). Microbial DNA from faecal samples and from breast milk was isolated using the QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Initially, 200 mg of faecal sample/milk was diluted in 1.8 ml of sterile PBS buffer. To 200 μΐ of diluted fecal sample, 20 μΐ of lysozyme (150 mg/ml) and 130 μΐ of lysis buffer (2.0 mM Na2EDTA; 20 mM TrisHC1; 1.2% Triton X-100) were added. The mixture was incubated at 37°C for 30 min, after which DNA was isolated.
4. Количествено определяне на ДНК4. Quantification of DNA
Количеството и чистотата на бактериалната геномна ДНК изолирана от щамовете стандарти и от изследваните проби се определят спектофотометрично. За целта се определя абсорбцията на подходящо разредените проби ДНК при дължини на вълните 260 nm и 280 nm. Измерванията се извършват на спектофотометър Shimadzu UV-2600 при светлинен път 8,5 mm, след нулиране на апарата срещу кювета с елуираш буфер. Еднородността на геномната ДНК се определи чрез визуализиране на изолираната ДНК в 1% (w/v) агарозен гел чрез електрофореза и оцветяване е етидиев бромид. Пробите с изолираната ДНК се съхраняват при -20°С.The quantity and purity of the bacterial genomic DNA isolated from the standard strains and from the tested samples were determined spectrophotometrically. For this purpose, the absorbance of the suitably diluted DNA samples was determined at wavelengths of 260 nm and 280 nm. Measurements were performed on a Shimadzu UV-2600 spectrophotometer at a light path of 8.5 mm, after zeroing the apparatus against a cuvette with elution buffer. Homogeneity of genomic DNA was determined by visualizing the isolated DNA in a 1% (w/v) agarose gel by electrophoresis and ethidium bromide staining. Samples with isolated DNA were stored at -20°C.
5. Провеждане на В реално време qPCR5. Conduct Real-time qPCR
В В реално време qPCR реакциите за детекция и количествено определяне на бактерии без използване на флуорсцентни сонди се използва SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Реакциите се залагат в 96-ямкови плаки с краен обем на всяка реакция 25 pL. Реакциите се провеждат на В реално време PCR CFX96 Touch (BIO-RAD) с версия на софтуера 3.0.1224 при условия за всяка от целевите групи бактерии, посочени в таблица 10.In real-time qPCR reactions for the detection and quantification of bacteria without the use of fluorescent probes, SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) was used. Reactions were plated in 96-well plates with a final volume of each reaction of 25 pL. Reactions were run on a Real-Time PCR CFX96 Touch (BIO-RAD) with software version 3.0.1224 under conditions for each of the target groups of bacteria listed in Table 10.
Таблица 10. Праймери и реакционни условия за провеждане на В реално време qPCR за количествено определяне на бактерия във фекални проби.Table 10. Primers and reaction conditions for conducting Real-time qPCR for quantification of bacteria in fecal samples.
BG 67567 BlBG 67567 Bl
В реално време qPCR реакциите за детекция и количествено определяне на бактерии с използване на флуоресцентно белязани сонди се използва TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Реакциите се залагат в 96-ямкови плаки с краен обем на всяка реакция 25 pL. Условия за провеждане на всеки от анализите за определяне на целевите групи бактерии са посочени в таблица 11.Real-time qPCR reactions for detection and quantification of bacteria using fluorescently labeled probes used TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Reactions were plated in 96-well plates with a final volume of each reaction of 25 pL. Conditions for conducting each of the analyzes to determine the target groups of bacteria are indicated in Table 11.
Таблица 11. Праймери, флуоресцентни сонди и реакционни условия за провеждане на В реално време qPCR за количествено определяне на бактерии във фекални проби.Table 11. Primers, fluorescent probes and reaction conditions for conducting Real-time qPCR for the quantification of bacteria in faecal samples.
BG 67567 BlBG 67567 Bl
Всички В реално време qPCR анализи на количествено определяне на бактерии във фекални проби и кърма се провеждат с минимум двукратно повторение от различни анализи.All Real-time qPCR assays for bacterial quantification in faecal samples and breast milk were performed with a minimum of two replicates from different assays.
6. Електрофоретичен анализ на ДНК фрагменти, получени след провеждане на В реално време qPCR6. Electrophoretic analysis of DNA fragments obtained after performing real-time qPCR
За проверка на размера и интегритета на амплимерите, получени след провеждане на В реално време qPCR, се провежда агарозна гел-електрофореза на реакционните продукти. Разделянето на фрагментите ДНК се извършва в 2% агарозен гел, при напрежение 35 V и 25 mA сила на тока. Разделените фрагменти се визуализрат флуоресцентно - чрез обработка на гела с етидиев бромид и осветяване с UB светлина. Приблизителните размери на ДНК фрагментите се определят чрез съпоставка със стандар, съдържащ малки ДНК фрагменти с известни размери - SmartLadder SF (Eurogentec, Belgium).Agarose gel electrophoresis of the reaction products was performed to verify the size and integrity of the amplimers obtained after performing real-time qPCR. The separation of the DNA fragments was performed in a 2% agarose gel, at a voltage of 35 V and a current of 25 mA. The separated fragments are visualized fluorescently - by treating the gel with ethidium bromide and illuminating with UB light. The approximate sizes of the DNA fragments are determined by comparison with a standard containing small DNA fragments of known sizes - SmartLadder SF (Eurogentec, Belgium).
7. Статистическа обработка на данните7. Statistical data processing
Статистическата обработка на данните и тяхното графично представяне се извършват със софтуер SYSTAT версия 13.2 и SigmaPlot версия 12.0 (Systat Software Inc., USA).Statistical processing of the data and their graphical presentation were performed with SYSTAT version 13.2 and SigmaPlot version 12.0 software (Systat Software Inc., USA).
Анализ на ензими в проби от майчина кърма и фецес от новороденоAnalysis of enzymes in breast milk and newborn fecal samples
1. Определяне на ензимна активност на О-галактозидаза (ЕС 3.2.1.23)1. Determination of enzymatic activity of O-galactosidase (EU 3.2.1.23)
Ензимната реакция се проведе при условия: 100 тМ натриево ацетатен буфер, pH 6.0, съдържащ 2 тМ разтвор на о-нитрофенил-Б-О-галактопиранозид (ONP-Gal) и подходящо разредени клетки или надутаечна течност след дезинтегриране на клетките при 37°С. Реакцията се спира с 1 М натриев карбонат. Една единица активност на ензима катализира получаването на 1.0 pmol о-нитрофенол за една минута при pH 4.0 и 37°С. Съдържанието на о-нитрофенол се определя спектрофотометрично при 410 nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800.The enzyme reaction was carried out under the following conditions: 100 mM sodium acetate buffer, pH 6.0, containing a 2 mM solution of o-nitrophenyl-B-O-galactopyranoside (ONP-Gal) and appropriately diluted cells or supernatant after cell disintegration at 37°C . The reaction was quenched with 1 M sodium carbonate. One unit of enzyme activity catalyzes the production of 1.0 pmol o-nitrophenol in one minute at pH 4.0 and 37°C. The o-nitrophenol content was determined spectrophotometrically at 410 nm wavelength on a Beckman Coulter DU 800 spectrophotometer.
Всички експерименти за определяне на ензимната активност са проведени с трикратна повтаряемост.All experiments for the determination of enzyme activity were performed in triplicate.
2. Определяне активността на a-L-фукозидаза (ЕС 3.2.1.51)2. Determination of the activity of a-L-fucosidase (EU 3.2.1.51)
Ензимната реакция се проведе при условия: 100 тМ цитратен буфер, pH 6.5, съдържащ 10 тМ разтвор на р-нитрофенил a-L-фукопиранозид (PNP-FUC) (приготвя се посредством разреждане на р-нитрофенил a-Lфукопиранозид (Sigma кат. № N3628) с дестилирана вода и подходящо разредени клетки при 37°С. Реакцията се спира с 200 тМ боратен буфер, pH 9.8. Една единица активност превръща 1.0 pmole от р-нитрофенил a-L фукопиранозид в р-нитрофенол и L-фукопиранозид за една минута при pH 4.0 и 37°С. Съдържанието на рнитрофенол се определя спектрофотометрично при 405 nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800.The enzyme reaction was carried out under conditions: 100 mM citrate buffer, pH 6.5, containing 10 mM solution of p-nitrophenyl α-L-fucopyranoside (PNP-FUC) (prepared by diluting p-nitrophenyl α-Lfucopyranoside (Sigma cat. no. N3628) with distilled water and appropriately diluted cells at 37° C. The reaction is stopped with 200 mM borate buffer, pH 9.8. One unit of activity converts 1.0 pmole of p-nitrophenyl a-L fucopyranoside to p-nitrophenol and L-fucopyranoside in one minute at pH 4.0 and 37° C. Nitrophenol content was determined spectrophotometrically at 405 nm wavelength on a Beckman Coulter DU 800 spectrophotometer.
Всички експерименти за определяне на ензимна активност са проведени с трикратна повтаряемост.All experiments for the determination of enzyme activity were performed in triplicate.
Анализ на късоверижни мастни киселини в проби от кърма и фсцес на бебета от един до дванадесет месеца.Analysis of short-chain fatty acids in breast milk and CSF samples of one- to twelve-month-old infants.
За доказването на късоверижните мастни киселини в пробите от екскременти е разработен следният протокол:The following protocol has been developed for the detection of short-chain fatty acids in excrement samples:
3. Изолиране на късоверижни мастни киселини от екскременти.3. Isolation of short-chain fatty acids from excrement.
Към 100 mg прясна фекална проба или майчина кърма се добавя 2% НЗРО4 или 0,05% H2SO4 в съотношение 1:10. Пробите се хомогенизират много добре на вортекс 2 пъти по 2 min. Полученият хомогенизат се центрофугира 10 min, 13 000 rpm, след което се отделя супернатанта. От супернтанта се вземат 200 pL, които се екстрахират с 200 pL органичен разтворител (СН2С12, AcCN, EtOH, EtOAc). Пробите се хомогензират, след което се центрофугира 5 min, 13 000 rpm. Полученият органичен слой се отделя и подлага на HPLC анализ.2% HPO4 or 0.05% H2SO4 in a ratio of 1:10 is added to 100 mg of fresh fecal sample or breast milk. The samples are homogenized very well on a vortex 2 times for 2 min each. The resulting homogenate was centrifuged for 10 min, 13,000 rpm, after which the supernatant was separated. 200 pL were taken from the supernatant and extracted with 200 pL organic solvent (CH 2 Cl 2 , AcCN, EtOH, EtOAc). Samples were homogenized, then centrifuged for 5 min, 13,000 rpm. The resulting organic layer was separated and subjected to HPLC analysis.
4. HPLC метод за анализ на късоверижни мастни киселини.4. HPLC method for the analysis of short-chain fatty acids.
Използвана е HPLC ситема Konik-Tech (Испания) снабдена с колона Aminex НРХ-87Н Ion Exclusion Column (7.8 mm i.d. x 30 cm, Biorad, Richmond, СА) и предколона Micro-Guard Cation-H (4.6 mm i.d. x 30 mm, Biorad). Определянето на пробите е осъществено с UV детектор при дължина на вълната 210 nm, при подвижна фаза 0,005М H2SO4, скорост на потока 0,6 ml/min и температура на колоната Т = 40°С.A Konik-Tech (Spain) HPLC system equipped with an Aminex НХ-87Н Ion Exclusion Column (7.8 mm i.d. x 30 cm, Biorad, Richmond, CA) and a Micro-Guard Cation-H pre-column (4.6 mm i.d. x 30 mm, Biorad). The determination of the samples was carried out with a UV detector at a wavelength of 210 nm, with a mobile phase of 0.005 M H2SO4, a flow rate of 0.6 ml/min and a column temperature T = 40°C.
Идентифицирането на пиковете е осъществено по времената на задържане спрямо стандарти на късоверижни мастни киселини: млечна киселина, оцетна киселина, пропионова киселина и бутенова киселина. За количественото определяне на късоверижните мастни киселини са изготвени стандартни прави в концентрации 25 - 1,56 mmol/L. Изведени са корелационни уравнения, описващи площта на пика (у) и концентрацията на късоверижните мастни киселини (х, mmol/L). Стандартните прави са с линейни участъци между 25 - 1,65 mmol/L и с коефициент на корелация г2 > 0,9999.Peaks were identified by retention times against standards of short chain fatty acids: lactic acid, acetic acid, propionic acid and butenoic acid. For the quantitative determination of short-chain fatty acids, standard lines were prepared in concentrations of 25 - 1.56 mmol/L. Correlation equations describing the peak area (y) and the concentration of short-chain fatty acids (x, mmol/L) were derived. The standard lines are with linear sections between 25 - 1.65 mmol/L and with a correlation coefficient r2 > 0.9999.
Таблица 12. Диапазон на параметри, изследвани при деца от един до дванадесет месеца.Table 12. Range of parameters studied in children from one to twelve months.
BG 67567 BlBG 67567 Bl
В резултат на проведените анализи на тестваните майчина кърма и фецес от новородено на възраст между един и дванадесет месеца се изчисляват следните коефициенти:As a result of the analyzes of the tested mother's breast milk and feces from a newborn between the ages of one and twelve months, the following coefficients are calculated:
1. Съотношение на количеството Бифидобактерии/Бактероиди;1. Ratio of the amount of Bifidobacteria/Bacteroides;
2. Съотношението на количеството Бифидобактерии/Лактобацили;2. The ratio of the amount of Bifidobacteria/Lactobacilli;
3. Съотношението на количеството (Бифидобактерии+Лактобацили)/Бактероиди;3. The ratio of the quantity (Bifidobacteria+Lactobacilli)/Bacteroides;
4. Съотношението на количеството (Бифидобактерии+Лактобацили)/активност на бета-галактозидаза;4. The ratio of the quantity (Bifidobacteria+Lactobacilli)/beta-galactosidase activity;
5. Съотношението на количеството (Бифидобактерии+Лактобацили)/активност на алфа-фукозидаза;5. The ratio of the quantity (Bifidobacteria+Lactobacilli)/alpha-fucosidase activity;
6. Съотношението на ензимните активности бета-галактозидаза/алфа-фукозидаза;6. The ratio of beta-galactosidase/alpha-fucosidase enzyme activities;
7. Съотношението на ензимните активности бета-галактозидаза/протеаза;7. The ratio of beta-galactosidase/protease enzyme activities;
8. Съотношение на метаболитите млечна киселина/оцетна киселина/маслена киселина.8. Lactic acid/acetic acid/butyric acid metabolite ratio.
Изчисленията се правят по посочената формула.Calculations are made according to the specified formula.
Таблица 13. Тенденции на съотношенията между отделните показатели, със стрелка нагоре се отбелязва положителен ефект върху микробиотата, а със стрелка надолу отрицателен ефект върху микробиотата.Table 13. Trends of the ratios between the individual indicators, an upward arrow indicates a positive effect on the microbiota, and a downward arrow indicates a negative effect on the microbiota.
L40 eactetaidesL40 eactetaides
BG 67567 BlBG 67567 Bl
Бифидо+МКБBifido + ICD
S-galactosidase a-fucasidoseS-galactosidase α-fucasidose
МетаНолитаMetaNolita
Claims (1)
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
BG113148A BG67567B1 (en) | 2020-05-27 | 2020-05-27 | Quantitative assessment method for rapid prediction and control of dysbiosis in breast-fed newborns aged one month to one year |
PCT/BG2020/050001 WO2021237312A1 (en) | 2020-05-27 | 2020-05-28 | Method for quantitative evaluation (mqe both for rapid prognosis of disbiosis in infants -up to 1 year of age(mqe/rpdi-1y), and for multi-factural diseases (mqe/mfd) |
EP20742153.8A EP4162081A1 (en) | 2020-05-27 | 2020-05-28 | Method for quantitative evaluation (mqe both for rapid prognosis of disbiosis in infants -up to 1 year of age(mqe/rpdi-1y), and for multi-factural diseases (mqe/mfd) |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
BG113148A BG67567B1 (en) | 2020-05-27 | 2020-05-27 | Quantitative assessment method for rapid prediction and control of dysbiosis in breast-fed newborns aged one month to one year |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
BG113148A BG113148A (en) | 2021-12-15 |
BG67567B1 true BG67567B1 (en) | 2023-09-15 |
Family
ID=71661600
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
BG113148A BG67567B1 (en) | 2020-05-27 | 2020-05-27 | Quantitative assessment method for rapid prediction and control of dysbiosis in breast-fed newborns aged one month to one year |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP4162081A1 (en) |
BG (1) | BG67567B1 (en) |
WO (1) | WO2021237312A1 (en) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IT202200008705A1 (en) * | 2022-04-29 | 2023-10-29 | Wellmicro S R L | METHOD FOR DETERMINING A METABOLIC FUNCTION OF A BACTERIAL POPULATION AND APPARATUS FOR CARRYING OUT SAID METHOD |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20160243138A1 (en) * | 2014-10-29 | 2016-08-25 | Glycom A/S | Composition comprising HMSs/HMOs and use thereof |
CN109475169A (en) * | 2016-07-01 | 2019-03-15 | 进化生物系统股份有限公司 | Promote the method for immune system maturation |
EP3551194B1 (en) * | 2016-12-06 | 2023-10-18 | DSM Nutritional Products, LLC | Glycan polymers and related methods thereof |
WO2019118510A1 (en) * | 2017-12-11 | 2019-06-20 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Defined therapeutic microbiota and methods of use thereof |
-
2020
- 2020-05-27 BG BG113148A patent/BG67567B1/en unknown
- 2020-05-28 EP EP20742153.8A patent/EP4162081A1/en active Pending
- 2020-05-28 WO PCT/BG2020/050001 patent/WO2021237312A1/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BG113148A (en) | 2021-12-15 |
EP4162081A1 (en) | 2023-04-12 |
WO2021237312A1 (en) | 2021-12-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Milani et al. | The first microbial colonizers of the human gut: composition, activities, and health implications of the infant gut microbiota | |
Ignacio et al. | Correlation between body mass index and faecal microbiota from children | |
Rigsbee et al. | Quantitative profiling of gut microbiota of children with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome | |
Bridgman et al. | Gut microbiota and allergic disease in children | |
Pham et al. | Lactate-utilizing community is associated with gut microbiota dysbiosis in colicky infants | |
McNulty et al. | The impact of a consortium of fermented milk strains on the gut microbiome of gnotobiotic mice and monozygotic twins | |
US20160022745A1 (en) | Butyrogenic bacteria as probiotics to treat clostridium difficile | |
Cecchini et al. | Functional metagenomics reveals novel pathways of prebiotic breakdown by human gut bacteria | |
US20150104423A1 (en) | Use of blood group status iii | |
WO2012013861A2 (en) | Use of blood group status iii | |
Sirilun et al. | Impact of maternal bifidobacteria and the mode of delivery on Bifidobacterium microbiota in infants | |
Hirano et al. | Next-generation prebiotic promotes selective growth of bifidobacteria, suppressing Clostridioides difficile | |
Rocha Martin et al. | Colonization of Cutibacterium avidum during infant gut microbiota establishment | |
Rubio-del-Campo et al. | Human milk and mucosa-associated disaccharides impact on cultured infant fecal microbiota | |
Song et al. | An investigation into the correlation of intestinal flora with obesity and gestational diabetes mellitus | |
Park et al. | Comprehensive analysis of the effect of probiotic intake by the mother on human breast milk and infant fecal microbiota | |
Xin et al. | Preventive effects of Lactobacillus johnsonii on the renal injury of mice induced by high fluoride exposure: Insights from colonic microbiota and co-occurrence network analysis | |
BG67567B1 (en) | Quantitative assessment method for rapid prediction and control of dysbiosis in breast-fed newborns aged one month to one year | |
Yazdi et al. | Long-term daily high-protein, drained yoghurt consumption alters abundance of selected functional groups of the human gut microbiota and fecal short-chain fatty acid profiles in a cohort of overweight and obese women | |
Mollova et al. | In vitro Digestion: Exploring the probiotic abilities and metabolization of human milk oligosaccharides by two strains of Limosilactobacillus fermentum isolated from breast milk | |
Zhu et al. | Comparison between the molecular diagnostic test and chest X-ray combined with multi-slice spiral CT in the diagnosis of lobar pneumonia | |
Ingribelli et al. | Culture-dependent screening of endospore-forming clostridia in infant feces | |
Odenwald et al. | Prebiotic activity of lactulose optimizes gut metabolites and prevents systemic infection in liver disease patients | |
Szilagyi et al. | Lack of effect of lactose digestion status on baseline fecal microflora | |
Nagano et al. | Effects of different types of dietary fibers on fermentation by intestinal flora |