BG113148A - Quantitative assessment method for quick prognosis and control of dysbiosis of the gastrointestinal tract in infants aged up to one year and for multifactorial diseases - Google Patents
Quantitative assessment method for quick prognosis and control of dysbiosis of the gastrointestinal tract in infants aged up to one year and for multifactorial diseases Download PDFInfo
- Publication number
- BG113148A BG113148A BG113148A BG11314820A BG113148A BG 113148 A BG113148 A BG 113148A BG 113148 A BG113148 A BG 113148A BG 11314820 A BG11314820 A BG 11314820A BG 113148 A BG113148 A BG 113148A
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- correlation
- galactosidase
- amount
- bifidobacteria
- beta
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/10—Enterobacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2570/00—Omics, e.g. proteomics, glycomics or lipidomics; Methods of analysis focusing on the entire complement of classes of biological molecules or subsets thereof, i.e. focusing on proteomes, glycomes or lipidomes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/06—Gastro-intestinal diseases
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
МЕТОД ЗА КОЛИЧЕСТВЕНА ОЦЕНКА ЗА БЪРЗО ПРОГНОЗИРАНЕ И КОНТРОЛ НА ДИСБИОЗИ НА СТОМАШНО-ЧРЕВНИЯ ТРАКТ ПРИ КЪРМАЧЕТА НАQUANTITATIVE ASSESSMENT METHOD FOR RAPID PREDICTION AND CONTROL OF GASTROINTESTINAL TRACT DYSBIOSIS IN INFANTS OF
ВЪЗРАСТ ДО ЕДНА ГОДИНА И ЗА МНОГОФАКТОРНИ ЗАБОЛЯВАНИЯAGE UP TO ONE YEAR AND FOR MULTIFACTOR DISEASES
I. ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТАI. TECHNICAL FIELD
Настоящото изобретение се отнася до областта на медицинската диагностика, фармацията, биотехнологиите.The present invention relates to the field of medical diagnostics, pharmacy, biotechnology.
II. ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТАII. PRIOR ART
Съществуват различни данни, че кърменето осигурява значителна защита срещу инфекциозни и възпалителни заболявания, различни увреждания и подобрява познавателните способности (Bartick and Reinhold, 2010; Dieterich et al., 2013; Kramer et aL, 2009). Това до голяма степен се дължи на свойствата на кърмата и съдържащите се в нея олигозахариди да повлияват микробиалното колонизиране при новородените. Palmer et al. (2007) показват, че бебетата се колонизират с приблизително 107 различни вида микроорганизми през първата седмица от живота. Тези тесни взаимоотношения на организма с гастроинтестиналната микрофлора може да са в основата и да бъдат критични по отношение на здравето на новороденото, както и с риска от развитие на различни други неинфекциозни заболявания. Оптималното кърмене всъщност остава високо ефективна стратегия за общественото здраве за оцеляване на бебетата, особено за намаляване на смъртността поради гастроентерит и пневмония в развиващите се страни (Bhutta et al., 2013). Изследванията на кърменето показват защитната роля на кърмата срещу много хронични и имунни състояния, по-специално, диабет тип 1, некротизиращ ентероколит, астма и левкемия (Bartick and Reinhold, 2010).There is mixed evidence that breastfeeding provides significant protection against infectious and inflammatory diseases, various disabilities and improves cognition (Bartick and Reinhold, 2010; Dieterich et al., 2013; Kramer et al, 2009). This is largely due to the properties of breast milk and its oligosaccharides to influence microbial colonization in newborns. Palmer et al. (2007) showed that infants are colonized with approximately 107 different types of microorganisms during the first week of life. These close relationships of the organism with the gastrointestinal microflora may underlie and be critical in relation to the health of the newborn, as well as the risk of developing various other non-infectious diseases. In fact, optimal breastfeeding remains a highly effective public health strategy for infant survival, especially for reducing mortality due to gastroenteritis and pneumonia in developing countries (Bhutta et al., 2013). Research on breastfeeding has shown the protective role of breast milk against many chronic and immune conditions, in particular, type 1 diabetes, necrotizing enterocolitis, asthma and leukemia (Bartick and Reinhold, 2010).
Развитието на микробиотата в храносмилателната система на новороденото е постепенен и динамичен процес, който се определя от няколко фактора, като например начин на раждане, недоносеност, вида на хранене, свързани заболявания и антибиотичната терапия, както и от влиянието на околната среда, което налага персонализиран подход (Wall et al. 2009). Освен това процесът на колонизацията е силно повлиян от диетата ( кърмата и /или изкуственото мляко). По време на първия месец след раждането бифидобактериите и колиформите ( ш частност Е. coli) са преобладаващи, последвани от Lactobacillus spp. и Bacteroides и се различава в широки граници между отделните индивиди (Wall et al., 2009). Промени в съотношението на доминиращите представители на чревната микрофлора на новородените се появяват след около една година от живота, главно в резултат на въвеждане на нова храна в диетата на бебето. Броят на представителите на Lactobacillus spp., Bacteroides spp. и Clostridia се увеличава, докато бифиброидите и Е. coli намаляват. Най-накрая на възраст от около 2 години, микробните съобщества в червата достигат по състав, подобен на този открит в червата на възрастните (Koenig et al. 2011). Видът Bifidobacterium longum е найчестият първоначален колонизатор на гастроинтестиналният тракт на новородените (Palmer et al., 2007).The development of the microbiota in the digestive system of the newborn is a gradual and dynamic process that is determined by several factors, such as mode of birth, prematurity, type of feeding, associated diseases and antibiotic therapy, as well as environmental influences, which necessitates a personalized approach (Wall et al. 2009). In addition, the colonization process is strongly influenced by the diet (breast milk and/or artificial milk). During the first month after birth, bifidobacteria and coliforms (especially E. coli) are predominant, followed by Lactobacillus spp. and Bacteroides and varies widely between individuals (Wall et al., 2009). Changes in the ratio of the dominant representatives of the intestinal microflora of newborns appear after about one year of life, mainly as a result of introducing new food into the baby's diet. The number of representatives of Lactobacillus spp., Bacteroides spp. and Clostridia increased while bifibroids and E. coli decreased. Finally, at about 2 years of age, gut microbial communities reach a composition similar to that found in the adult gut (Koenig et al. 2011). The species Bifidobacterium longum is the most common initial colonizer of the gastrointestinal tract of neonates (Palmer et al., 2007).
Човешкото мляко притежава множество механизми за защита на новородените: клетки на имунният отговор, имуноглобулини, вродени защитни протеини, пептиди, свободни мастни киселини, цитокини и хемокини, гликани и олигозахариди (Ballard and Morrow, 2013). Сред различните биоактивни компоненти на човешкото мляко, олигозахаридите са найразпространените и включват значително повече от 100 различни биоактивни въглехидрата, изградени от 3 до 32 монозахарида (Newburg et al., 2005). Като клас олигозахаридите са 6-12 g / L от кърмата и до голяма степен се синтезират от лактоза (Bode, 2012). Човешката коластра съдържа приблизително 22-24 g/L млечни олигозахариди (Newburg et al., 1995; Urashima et al., 2012). В човешкото мляко олигозахаридите са третият по концентрация компонент след лактозата и липидите и тяхното количество е доста по - високо от количеството на протеините (Newburg et al., 1995). Структурата на повече от 100 човешки олигозахарида е характеризирана до момента (Urashima et al., 201 la,b; Kobata, 2010). Характеризирането на физиологията бифидо бактериите е фокусирано в голяма степен върху способността им да метаболизират различни хранителни олигозахариди. Този род бактерии разполагат с набор от трансмембранни пермеази, осигуряващи метаболизирането на различни въглехидратни полимери, като хранителни фибри, включително човешки млечни олигозахариди, които преминават неразградени до дисталните отдели на храносмилателният тракт (Moro et aL, 2006; Macfarlane and Cummings, 1999). Съществуват данни само за няколко вида бифидобактерии, способни да метаболизират и използват като въглероден източник човешки млечни олигозахариди. Такива видове типично са изолирани предимно от микрофлората на гастоинтестиналният тракт на новородени. Установено е, че асоциирани с новороденото бифидобактерии са способни да усвояват предимно лакто -N- тетраози (LNT; Gal β l-3GlcNAc β 1-3 Gal β l-4Glc) или лакто-N-неотетраози (LNnT; Gal β l-4GlcNAc β 1-3 Gal β l-4Glc) (LoCascio et al., 2007).Human milk possesses multiple mechanisms to protect newborns: immune response cells, immunoglobulins, innate defense proteins, peptides, free fatty acids, cytokines and chemokines, glycans and oligosaccharides (Ballard and Morrow, 2013). Among the various bioactive components of human milk, oligosaccharides are the most abundant and include significantly more than 100 different bioactive carbohydrates built from 3 to 32 monosaccharides (Newburg et al., 2005). As a class, oligosaccharides are 6–12 g/L of breast milk and are largely synthesized from lactose (Bode, 2012). Human colostrum contains approximately 22-24 g/L milk oligosaccharides (Newburg et al., 1995; Urashima et al., 2012). In human milk, oligosaccharides are the third most concentrated component after lactose and lipids, and their amount is much higher than the amount of proteins (Newburg et al., 1995). The structure of more than 100 human oligosaccharides has been characterized to date (Urashima et al., 201 la,b; Kobata, 2010). Characterization of the physiology of bifidobacteria has focused largely on their ability to metabolize various dietary oligosaccharides. This genus of bacteria has a set of transmembrane permeases that ensure the metabolism of various carbohydrate polymers, such as dietary fiber, including human milk oligosaccharides, which pass undigested to the distal parts of the digestive tract (Moro et al, 2006; Macfarlane and Cummings, 1999). There are only a few species of bifidobacteria capable of metabolizing and using human milk oligosaccharides as a carbon source. Such species are typically isolated primarily from the microflora of the gastrointestinal tract of newborns. Neonatal-associated bifidobacteria have been found to be capable of predominantly digesting lacto-N-tetraoses (LNT; Gal β l-3GlcNAc β 1-3 Gal β l-4Glc) or lacto-N-neotetraoses (LNnT; Gal β l-4GlcNAc β 1-3 Gal β l-4Glc) (LoCascio et al., 2007).
B. bifidum секретира извънклетъчна 1,2-а-1-фукозидаза (EC 3.2.1.63), която разцепва крайни 1,2-а-фукозилови връзки, които защитават галактозните остатъци в лакто-И-биоза, като по този начин позволяват продължаване на катаболитните процеси до пълното им усвояване (Katayama et al., 2004; Nagae et al., 2007). В допълнение, лакто-№биозидаза (ЕСЗ.2.1.140) освобождава лакто^-биоза от лакто-М-тетраоза и от други млечни олигозахариди, в които липсва фукозилиране или сиалиране (Wada et al., 2008). Веднъж възраст се свързват с по-късно развитие на атопичен хрип. Например наблюдавана е дисбиоза при Еквадорските бебета, включващи различни бактериални таксони, включително и няколко таксона микроскопични гъбички. Нивата на фекалните късоверижни мастни киселини при тримесечни бебета с атопичен хрип показват ясни тенденции на увеличена концентрация на ацетат и намалена концентрация на капронова киселина.B. bifidum secretes an extracellular 1,2-α-1-fucosidase (EC 3.2.1.63) that cleaves terminal 1,2-α-fucosyl bonds that protect the galactose residues in lacto-I-biose, thereby allowing continued of catabolite processes until their complete absorption (Katayama et al., 2004; Nagae et al., 2007). In addition, lacto-β-biosidase (EC3.2.1.140) releases lacto-biose from lacto-M-tetraose and from other milk oligosaccharides lacking fucosylation or sialylation (Wada et al., 2008). Once age is associated with later development of atopic wheezing. For example, dysbiosis was observed in Ecuadorian infants involving various bacterial taxa, including several taxa of microscopic fungi. Faecal short-chain fatty acid levels in three-month-old infants with atopic wheezing showed clear trends of increased acetate concentration and decreased caproic acid concentration.
Някои от защитните механизми на човешкото мляко се дължат на олигозахаридите. Като се има предвид нарастващата степен на заболявания, свързани с нерегулираната микробиота и имунитет на гостоприемника, налице е глобален интерес за тестване на нови хранителни подходи и функционални храни, съответстващи на тези, открити в кърмата, за да се оптимизира здравето на гостоприемника и да се възстанови бактериалната флора. Описаните дотук данни от литературата доказват, че използваните модели на изследване както за диагностични цели, така и за контрол на микробиотата при деца на възраст до една година не могат да предоставят алгоритъм за бърза и надежна оценка състоянието на чревната микробиота и асоциирането й с различни заболчвания, защото са линейни, отнесени само за един показател.Some of the protective mechanisms of human milk are due to oligosaccharides. Given the increasing rate of disease associated with dysregulated microbiota and host immunity, there is global interest in testing new nutritional approaches and functional foods matching those found in breast milk to optimize host health and restore the bacterial flora. The literature data described so far prove that the research models used both for diagnostic purposes and for microbiota control in children up to one year of age cannot provide an algorithm for a quick and reliable assessment of the state of the intestinal microbiota and its association with various diseases , because they are linear, referred to only one indicator.
Създаването на метод за количествена оценка за бързо прогнозиране на дисбиози при кърмачета до 1 година и за мултифакторни заболявания за изследване на отклонения в човешката микробиота изисква интердисциплинарен подход и при крайната оценка може да включва данните от различни методи на изследване, които се обработват като бази данни със специфични изчислителни техники.The creation of a quantitative assessment method for the rapid prediction of dysbiosis in infants up to 1 year and for multifactorial diseases for the study of deviations in the human microbiota requires an interdisciplinary approach and in the final assessment may include the data from different research methods that are processed as databases with specific computational techniques.
Ш. ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТОSH. TECHNICAL ESSENCE OF THE INVENTION
Задачата на изобретението е да създаде метод за на база ин витро количествена оценка за който осигурява възможност за бързо прогнозиране на дисбиози при кърмачета до 1 година, който може да намери приложение в създаване на модел (алгоритъм) за прецизна диагностика на чревната микробиота при новородени на възраст от един месец до една година като методът спомага и бързо последващо установяване на вида на дисбиозата и степента на нарушение. Методът се базира на интердисциплинарен подход при анализ на количествения и качествен състав на микробиота, вида и количеството на ключови ензими и метаболити и анализ на данните посредством информационна система.The task of the invention is to create a method for in vitro quantitative assessment, which provides an opportunity for rapid prediction of dysbiosis in infants up to 1 year old, which can be used in creating a model (algorithm) for precise diagnosis of the intestinal microbiota in newborns age from one month to one year, as the method also helps to quickly establish the type of dysbiosis and the degree of violation. The method is based on an interdisciplinary approach in the analysis of the quantitative and qualitative composition of the microbiota, the type and quantity of key enzymes and metabolites and data analysis by means of an information system.
През последните няколко години проучвания са разкрили, че и коластрата и кърмата от здрави жени съдържа бактерии, включително стафилококи, стрептококи, коринебактерии, млечнокисели бактерии, пропионобактерии и бифидобактерии (Fernandez et al., 2013). Напоследък прилагането на различни техники, включително и метагеномни подходи, потвърди присъствието на ДНК от тези и други бактериални родове в кърмата и коластрата (Hunt et al., 2011; Cabrera-Rubio et al., 2012; Fernandez et al., 2013; Jost et al., 2013, 2014; Ward et al., 2013; Jimenez et al.,2015). Следователно, тези биологични течности са непрекъснати източници на живи бактерии към стомашно-чревния тракт (McGuire and McGuire, 2015) Други проучванията показват, че има трансфер на бактериални щамове от майка към бебето в процеса на кърмене (Albesharat et aL, 2011; Martin et al., 2012; Jost et al., 2014). Въпреки някои установени корелации на количеството и състава на чревната микробиота е детекция на определени заболявания, използваните молекулярно-биологични методи са продължителни и скъпи за ежедневната практика, което ги прави недостъпни за масова употреба. Няма установени корелационни зависимости с данните за ключови ензими и метаболити, отговорни за усвояването на специфични компоненти от коластрата и кърмата и динамиката на концентрацията им при промяна на диетата и за преодоляване на чревни дисбиози.In the past few years, studies have revealed that both colostrum and breast milk from healthy women contain bacteria, including staphylococci, streptococci, corynebacteria, lactic acid bacteria, propionobacteria, and bifidobacteria (Fernandez et al., 2013). Recently, the application of various techniques, including metagenomic approaches, confirmed the presence of DNA from these and other bacterial genera in breast milk and colostrum (Hunt et al., 2011; Cabrera-Rubio et al., 2012; Fernandez et al., 2013; Jost et al., 2013, 2014; Ward et al., 2013; Jimenez et al., 2015). Therefore, these biological fluids are continuous sources of live bacteria to the gastrointestinal tract (McGuire and McGuire, 2015) Other studies have shown that there is a transfer of bacterial strains from mother to infant in the breastfeeding process (Albesharat et al, 2011; Martin et al al., 2012; Jost et al., 2014). Despite some established correlations of the amount and composition of the intestinal microbiota in the detection of certain diseases, the molecular biological methods used are lengthy and expensive for daily practice, which makes them unavailable for mass use. There are no correlations established with data on key enzymes and metabolites responsible for the absorption of specific components from colostrum and breast milk and their concentration dynamics when changing the diet and overcoming intestinal dysbiosis.
Някои бактерии от устната кухина на бебето могат да замърсят млякото по време на сучене поради поток на мляко обратно в млечните канали (Ramsey et al., 2004). Установено е, че в рамките на 24 часа след раждането коластрата съдържа типични устни бактерии като Veillonella, Leptotrichia и Prevotella (Cabrera-Rubio et al., 2012). Въпреки, че произходът на човешкия слюнчен микробиом все още е доста не добре проучен (Zaura et al., 2014), Streptococcus spp. изглежда е един от доминиращите видове както при възрастни (Nasidze et al., 2009; Yang et aL, 2012) така и при бебета (Bearfield et al., 2002; Cephas et al., 2011). Стрептококите също са сред доминиращите видове в човешката коластра и кърма (Jimenez et al., 2008а, b; Hunt et aL, 2011; Martin et aL, 2015). Доказано е че устното здраве на майката корелира тясно с вероятността за развитие на зъбен кариес при детето (Zaura et aL, 2014). Някои съединения в човешкото мляко (например, човешки млечни олигозахариди, протеини) могат да повлияят колонизацията на отделни видове индиректно. Например, открити са млечни протеини, като казеини и лактоферин, които имат способност да инхибират прикрепването на кариогенни стрептококи към хидроксиапатит и да насърчават прикрепването на коменсални бактерии in vitro (Johansson и Lif Holgerson, 2011). Няма проведени достатъчно мащабни и за продължително време проучвания, характеризиращи развитието на оралната микрофлора по време на неонаталният период и детството. В първоначални проучвания се е смятало, че оралната колонизация от бактерии, причиняващи зъбен кариес може да се случи след поникване на първите млечни зъби при новороденото, като по-късно обаче е доказано, че кариогенният Streptococcus mutans може да присъства в устната кухина на бебето преди появата на твърди тъкани там (Law et aL, 2007).Some bacteria from the infant's oral cavity can contaminate milk during suckling due to backflow of milk into the milk ducts (Ramsey et al., 2004). Within 24 hours after birth, colostrum has been found to contain typical oral bacteria such as Veillonella, Leptotrichia and Prevotella (Cabrera-Rubio et al., 2012). Although the origin of the human salivary microbiome is still rather poorly understood (Zaura et al., 2014), Streptococcus spp. appears to be one of the dominant species in both adults (Nasidze et al., 2009; Yang et al., 2012) and infants (Bearfield et al., 2002; Cephas et al., 2011). Streptococci are also among the dominant species in human colostrum and breast milk (Jimenez et al., 2008a, b; Hunt et al., 2011; Martin et al., 2015). It has been proven that the oral health of the mother correlates closely with the likelihood of developing dental caries in the child (Zaura et al, 2014). Certain compounds in human milk (eg, human milk oligosaccharides, proteins) may affect the colonization of individual species indirectly. For example, milk proteins such as caseins and lactoferrin have been found to have the ability to inhibit the attachment of cariogenic streptococci to hydroxyapatite and promote the attachment of commensal bacteria in vitro (Johansson and Lif Holgerson, 2011). No sufficiently large-scale and long-term studies characterizing the development of the oral microflora during the neonatal period and childhood have been conducted. In initial studies, it was thought that oral colonization by dental caries-causing bacteria could occur after the first baby teeth erupted in the newborn, but it was later shown that the cariogenic Streptococcus mutans could be present in the infant's oral cavity before the appearance of hard tissues there (Law et al, 2007).
Епидемиологичните изследвания разкриват редица експозиции в околната среда, свързани с астма. Това би могло да обясни ескалацията на астмата през последните 30 години.Epidemiological studies reveal a number of environmental exposures associated with asthma. This could explain the escalation of asthma over the past 30 years.
Бебетата, изложени на риск от астма, проявяват преходни сътояния на чревна дисбиоза и промени в метаболома (например уробилиноген) през първите 3 месеца от живота. Тези метаболитите или разликите в микробиомите се използват при проектирането на предварително за използване на пробиотици или да послужат като прогностични биомаркери. Разработен е модел чрез комбиниране оценки на производителността на екосистемите и генерирането на екосистемни услуги за дефиницията на дисбиоза при кърмачета. Според него микробиома на червата се характеризира с (1) без смущения в състава и количествата на таксоните при промяна на диетата или приема на антибиотици; (2) висока податливост на инвазия от външни таксони; и (3) слабо използване на наличните ресурси (в т.ч. олигозахариди от кърма). Здравословното/балансираното състояние на микробиотата се характеризира като високо функционираща екосистема, когато микробиома на червата е: (1) стабилен във времето по състав и количество на таксоните, (2) устойчив на инвазия от алохтонни бактерии; и (3) да демонстрира висока конверсия на олигозахаридите на кърмата в крайни продукти и биомаса от полза за бебетата. Този модел е агностичен по метод и индекс на избор и осигурява количествен показател и обективен подход за оценка микробиома, но е ограничен основно в данни за състава и количеството на микроорганизмите и не се базира на корелационни зависимости между състав и количество на микроорганизмите, активност на ензимите, отговорни за усвояването на олигозахаридите от кърмата и количеството на метаболитите, секретирани от микробиотата.Infants at risk of asthma exhibit transient states of intestinal dysbiosis and changes in the metabolome (eg, urobilinogen) during the first 3 months of life. These metabolites or differences in the microbiome are used in the design of advance for the use of probiotics or to serve as prognostic biomarkers. A model was developed by combining estimates of ecosystem productivity and the generation of ecosystem services for the definition of dysbiosis in infants. According to him, the gut microbiome is characterized by (1) no perturbation in taxon composition and amounts upon dietary change or antibiotic intake; (2) high susceptibility to invasion by extraneous taxa; and (3) poor utilization of available resources (including breast milk oligosaccharides). A healthy/balanced microbiota state is characterized as a highly functioning ecosystem when the gut microbiome is: (1) stable over time in taxon composition and abundance, (2) resistant to invasion by allochthonous bacteria; and (3) demonstrate high conversion of breast milk oligosaccharides into end products and biomass beneficial to infants. This model is method and selection index agnostic and provides a quantitative indicator and an objective approach to microbiome assessment, but is mainly limited in data on the composition and quantity of microorganisms and is not based on correlations between composition and quantity of microorganisms, enzyme activity , responsible for the absorption of oligosaccharides from breast milk and the amount of metabolites secreted by the microbiota.
Настоящата заявка за патент се отнася до разработването на специфичен метод за ин витро количествена оценка за бързо прогнозиране на дисбиози при кърмачета до 1 година при което се постига възможност за контрол на човешкия микробиом, като при метода, съгласно описанието се отчитат от една страна общи показатели като възраст и пол, а от друга специфичните показатели за здравословното състояние на човека. Предлагания метод е основан на обработването на данни от анализи на разнообразието и съотношението на микроорганизмите в интестиналния тракт и други телесни течности (слюнка, кърма, фецес), количество на метаболити, използвани като биомаркери и отчитане на нивото на ензимна активност на ензими, използвани като биомаркери, като се позволява отчитане на индивидуалните особености на хората.The present patent application relates to the development of a specific method for in vitro quantitative assessment for the rapid prediction of dysbiosis in infants up to 1 year of age, in which the possibility of controlling the human microbiome is achieved, and in the method, according to the description, general indicators are reported on the one hand such as age and gender, and on the other hand the specific indicators of a person's state of health. The proposed method is based on processing data from analyzes of the diversity and ratio of microorganisms in the intestinal tract and other body fluids (saliva, breast milk, feces), the amount of metabolites used as biomarkers and reporting the level of enzyme activity of enzymes used as biomarkers, allowing consideration of individual characteristics of people.
Методът, предмет на настоящата заявка за патент се основава на интегриран подход за ин витро анализ на баланса на чревната микробиота при деца от един до дванадесет месеца и прогноза за нейното възстановяване при установена дисбиоза посредством изчисляване на коефициенти на корелация между ключови показатели, разделени на три основни групи:The method subject to the present patent application is based on an integrated approach for in vitro analysis of the intestinal microbiota balance in children from one to twelve months and prediction of its restoration in case of established dysbiosis by calculating correlation coefficients between key indicators divided into three main groups:
1. Корелация между състав и количество на микроорганизмите в майчина кърма и във фецес на детето;1. Correlation between composition and amount of microorganisms in mother's breast milk and in the child's feces;
2. Корелация между ензимен профил и активност на ензимите, отговорни за усвояването и метаболизирането на компонентите на кърмата (лактоза, липиди, олигозахариди, протеини) в проби от кърма и фецес на детето;2. Correlation between enzyme profile and activity of enzymes responsible for absorption and metabolization of breast milk components (lactose, lipids, oligosaccharides, proteins) in samples of breast milk and child's feces;
3. Корелация между количеството на метаболитите, получени от метаболизирането на основните компоненти на кърмата от микробиотата в кърмата и във фецеса на детето.3. Correlation between the amount of metabolites obtained from the metabolization of the main components of breast milk by the microbiota in breast milk and in the child's feces.
Методът за ин витро количествена оценка за бързо прогнозиране на дисбиози при кърмачета до една година и за мултифакторни заболявания изисква следния ход на анализа:The method of in vitro quantitative assessment for rapid prediction of dysbiosis in infants up to one year and for multifactorial diseases requires the following course of analysis:
1. Протокол за количествен анализ на човешка микробиота чрез в реално времев реално време qPCR. Представеният протокол може да се прилага за установяване на отклонения за анализ на дисбиоза при новородени от един до дванадесет месеца и да бъде включен към алгоритъм за идентифициране на състояние, отклонения и правила за възстановяване баланса на микробиотата. Чрез него ще могат да се определят количествено различни групи микроорганизми от полезната и патогенната микрофлора, които да се използват за изчисляване на съотношенията между отделните видове(таблица 1). От съществено значение за определяне степента на дисбиоза представляват съотношенията бифидобактерии/ бактероиди; лактобацили/бактероиди; (бифидобактерии +лактобацили)/бактероиди; (бифидо-бактерии+лактобацили)/дрожди; (бифидобактерии+лактобацили)/Е. coli. Друг важен показател е съотношението между бифидобактериите и основните ензими, отговорни за усвояването на основните компоненти на кърмата (лактоза, липиди, протеини, олигозахариди).1. Protocol for quantitative analysis of human microbiota by real-time qPCR. The presented protocol can be applied to establish deviations for analysis of dysbiosis in newborns from one to twelve months and be included in an algorithm for identifying condition, deviations and rules for restoring the balance of the microbiota. Through it, it will be possible to quantify different groups of microorganisms from the beneficial and pathogenic microflora, which can be used to calculate the ratios between individual species (table 1). Of essential importance for determining the degree of dysbiosis are the bifidobacteria/bacteroid ratios; lactobacilli/bacteroides; (bifidobacteria + lactobacilli)/bacteroids; (bifido-bacteria+lactobacilli)/yeasts; (bifidobacteria+lactobacilli)/E. coli. Another important indicator is the ratio between bifidobacteria and the main enzymes responsible for digesting the main components of breast milk (lactose, lipids, proteins, oligosaccharides).
Стойностите на отделните съотношения варират в зависимост от възрастта, здравословното състояние и диетата. Диапазонът на съотношенията при здрави индивиди е представен в таблица 6.The values of the individual ratios vary depending on age, health and diet. The range of ratios in healthy subjects is presented in Table 6.
Таблица 1. Модел на съпоставяне на данните от изследваните 12 показатели.Table 1. Model of comparison of the data from the 12 investigated indicators.
2. Анализ на ензими в проби от майчина кърма и фецес от деца от един до дванадесет месеца, които са отговорни за метаболизирането на основните компоненти на кърмата (лактоза, олигозахариди, липиди, протеини - β-галактозидаза, α-галактозидаза, аглюкозидаза, β-глюкозидаза, α-фукозидаза, липаза, протеаза. За целите на метода се изчисляват съотношенията между отделните ензими, което дава информация за типа на метаболитните процеси, които се осъществяват, а от друга страна дават информация за капацитета на полезната микрофлора за поддържане баланса на чревната микрофлора. Ензимът α-фукозидаза дава пряка информация за потенциала на адхезия на полезната микрофлора (бифидобактерии и лактобацили) върху епителните клетки на чревната лигавица, докато останалите ензими дават информация за скоростта на размножаване на полезните микроорганизми и мястото им е тази специфична екологична ниша. Данните за количеството на ензимите корелират с данните за количеството метаболити, установени в съответните проби. Диапазонът на съотношенията на стойностите на ензимните активност е описан в таблица 6.2. Analysis of enzymes in samples of breast milk and feces from children from one to twelve months, which are responsible for metabolizing the main components of breast milk (lactose, oligosaccharides, lipids, proteins - β-galactosidase, α-galactosidase, aglucosidase, β -glucosidase, α-fucosidase, lipase, protease. For the purpose of the method, the ratios between the individual enzymes are calculated, which gives information about the type of metabolic processes that take place, and on the other hand, they give information about the capacity of the beneficial microflora to maintain the balance of the intestinal microflora The α-fucosidase enzyme gives direct information about the adhesion potential of the beneficial microflora (bifidobacteria and lactobacilli) on the epithelial cells of the intestinal mucosa, while the other enzymes give information about the rate of reproduction of the beneficial microorganisms and their place is this specific ecological niche. The data on the amount of enzymes correlate with the data on the amount of metabolites established in the respective paragraphs slaves. The ratio range of enzyme activity values is described in Table 6.
3. Анализ на количеството късоверижни мастни киселини в проби от кърма и фецес на бебета от един до дванадесет месеца. Количественият анализ на лактат, ацетат пропионат и бутират в проби от кърма и фецес на бебета на възраст до една година дават обективна информация за метаболитните процеси осъществявани и с участието на съпътстващата микробиота. Наличиети на късоверижни мастни киселини е пряко потвърдение за функционалната активност на бифидобактериите и лактобацилите. Съотношението между отделните групи микроорганизми, описани в първа точка на предлагания метод и количеството на късоверижните мастни киселини предоставя съществена информация за баланса на микробиотата и за нейното функционално състояние. Освен това за целите на предлагания метод могат да се изчислят съотношенията между ензимните активности на ензимите от втора точка (вторият етап на анализа) и количеството на късоверижните мастни киселини. Диапазонът на съотношенията на стойностите на ензимните активност е описан в таблица 6.3. Analysis of the amount of short-chain fatty acids in samples of breast milk and feces of babies from one to twelve months. The quantitative analysis of lactate, acetate propionate and butyrate in samples of breast milk and feces of babies up to one year of age provide objective information about the metabolic processes carried out with the participation of the accompanying microbiota. The presence of short-chain fatty acids is a direct confirmation of the functional activity of bifidobacteria and lactobacilli. The ratio between the individual groups of microorganisms described in the first point of the proposed method and the amount of short-chain fatty acids provides essential information about the balance of the microbiota and its functional state. Furthermore, for the purposes of the proposed method, the ratios between the enzyme activities of the enzymes from the second point (the second stage of the analysis) and the amount of short-chain fatty acids can be calculated. The ratio range of enzyme activity values is described in Table 6.
4. Изчисляване корелационните зависимости между съотнишенията на отделните компоненти за дефиниране на статуса на микробиома при деца от един до дванадесет месеца. Предлаганият от нас ин витро модел за определяне на чревната дисбиоза при деца от един до дванадест месеца като състояние на специфичната екологична ниша в интестиналния тракт, корелиращо с намаляване на риска от остри и хронични заболявания. Освен това моделът може да предоставя рамка за за оценка ефективността на стратегии за превенция и лечение на чревни дисбиози.4. Calculation of the correlation dependences between the ratios of the individual components to define the status of the microbiome in children from one to twelve months. Our proposed in vitro model to determine intestinal dysbiosis in children from one to twelve months as a state of the specific ecological niche in the intestinal tract, correlating with a reduction in the risk of acute and chronic diseases. Furthermore, the model may provide a framework for evaluating the effectiveness of strategies for the prevention and treatment of intestinal dysbiosis.
IV. ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТОIV. EXAMPLES OF IMPLEMENTATION OF THE INVENTION
Пример 1. Ин витро изследване на 12 показателя по оценка на баланса на микробиотата при бебета от един до дванадесет месеца:Example 1. In vitro study of 12 indicators for assessing the balance of the microbiota in babies from one to twelve months:
1. Протокол за количествен анализ на човешка микробиота чрез в реално времев реално време qPCR1. Protocol for quantitative analysis of human microbiota by real-time qPCR
Представеният протокол може да се прилага за установяване на отклонения за анализ на дисбиоза при новородени от един до дванадесет месеца и да бъде включен към алгоритъм за идентифициране на състояние, отклонения и правила за възстановяване баланса на микробиотата.The presented protocol can be applied to establish deviations for analysis of dysbiosis in newborns from one to twelve months and be included in an algorithm for identifying condition, deviations and rules for restoring the balance of the microbiota.
А. Праймери и флуоресцентно белязани сонди за в реално времев реално време PCR детекция на бактериални групи и видове в проби от таргетните групиA. Primers and fluorescently labeled probes for real-time real-time PCR detection of bacterial groups and species in samples from the target groups
Праймерните двойки и флуоресцентно белязани сонди за провеждане на в реално време qPCR детекция на бактериални видове и съобщества в проби от различни таргетни групи са представени в Таблица 2.Primer pairs and fluorescently labeled probes for performing real-time qPCR detection of bacterial species and communities in samples from different target groups are presented in Table 2.
Таблица 2. Праймери и флуоресцентно белязани сонди за в реално време qPCR детекция на бактериални групи и видове, използвани в представеното изследване.Table 2. Primers and fluorescently labeled probes for real-time qPCR detection of bacterial groups and species used in the presented study.
2. Контролни бактериални щамове2. Control bacterial strains
Бактериални щамове, използвани за контрол на специфичността на използваните праймери и белязани сонди, както и за количествена оценка на отделни бактериални видове и съобщества са представени в Таблица 3. Използваните щамове са закупени от Националната банка за промишлени микроорганизми и клетъчни култури (НБПМК) и German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ). Щамовете се култивират аеробно или анаеробно в селективни хранителни среди, съгласно препоръките на DSMZ и НБПМК. От развитите култури за всеки щам се правят серия от разреждания, които се посяват върху съответната агарова среда в петрита, за да се определи общ брой бактерии - колоно-образуващи единици (CFU). Допълнително, от направните разреждания се вземат проби от по 1,0 ml, които се центрофугират при следните условия: 12000rpm/3min. Получените утайки от бактериални клетки се съхраняват при -80°С до използването им за анализ.Bacterial strains used to control the specificity of the primers and labeled probes used, as well as for the quantitative evaluation of individual bacterial species and communities are presented in Table 3. The strains used were purchased from the National Bank for Industrial Microorganisms and Cell Cultures (NBPMK) and German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ). The strains are cultivated aerobically or anaerobically in selective nutrient media, according to the recommendations of DSMZ and NBPMK. A series of dilutions is made from the developed cultures for each strain and plated on the corresponding agar medium in a petri dish to determine the total number of bacteria - colony-forming units (CFU). Additionally, samples of 1.0 ml are taken from the preparation dilutions, which are centrifuged under the following conditions: 12000rpm/3min. The resulting bacterial cell pellets were stored at -80°C until used for analysis.
Таблица 3. Контролни бактериални щамове, използвани в изследването.Table 3. Control bacterial strains used in the study.
3. Изолиране на ДНК от бактериални култури и проби от таргетните групи3. Isolation of DNA from bacterial cultures and samples from the target groups
Бактериална геномна ДНК от контролните щамове и изолати от проби на таргетните групи се екстахира чрез използване на Blood and Tissue kit DNeasy (Qiagen, Hilden, Germany)..Bacterial genomic DNA from the control strains and isolates from samples of the target groups was extracted using the Blood and Tissue kit DNeasy (Qiagen, Hilden, Germany).
Микробиална ДНК от фекални проби и от кърма се изолира чрез използване на QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Първоначално 200 mg фекалната проба/кърма се разрежда в 1,8 ml стерилен PBS буфер. Към 200 μΐ разредена фекална проба се добавят 20 μΐ лизозим (150 mg/ml) и 130 μΐ лизиращ буфер (2,0 mM Na2EDTA; 20 mM Tris-HCl; 1,2% Triton Х-100). Сместа се инкубира при 37°С за 30 минути, след което се изолира ДНК.Microbial DNA from faecal samples and from breast milk was isolated using the QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Initially, 200 mg of faecal sample/milk was diluted in 1.8 ml of sterile PBS buffer. 20 μΐ lysozyme (150 mg/ml) and 130 μΐ lysis buffer (2.0 mM Na2EDTA; 20 mM Tris-HCl; 1.2% Triton X-100) were added to 200 μΐ of diluted fecal sample. The mixture was incubated at 37°C for 30 min, after which DNA was isolated.
4. Количествено определяне на ДНК4. Quantification of DNA
Количеството и чистотата на бактериалната геномна ДНК излорана от щамовете стандарти и от изследваните проби се определят спектофотометрично. За целта се определя абсорбцията на подходящо разререните проби ДНК при дължини на вълните 260 nm и 280 nm. Измерванията се извършват на спектофотометър Shimadzu UV-2600 при светлинен път 8,5 mm, след нулиране на апарата срещу кювета с елуираш буфер. Еднородността на геномната ДНК се определи чрез визуализиране на изолираната ДНК в 1 % (w/v) агарозен тел чрез електрофореза и оцветяване с етидиев бромид. Пробите с изолираната ДНК се съхраняват при -20°С.The quantity and purity of the bacterial genomic DNA extracted from the standard strains and from the tested samples were determined spectrophotometrically. For this purpose, the absorbance of the suitably diluted DNA samples is determined at wavelengths of 260 nm and 280 nm. Measurements were performed on a Shimadzu UV-2600 spectrophotometer at a light path of 8.5 mm, after zeroing the apparatus against a cuvette with elution buffer. Homogeneity of genomic DNA was determined by visualizing the isolated DNA in a 1% (w/v) agarose gel by electrophoresis and staining with ethidium bromide. Samples with isolated DNA were stored at -20°C.
5. Провеждане на В реално време qPCR5. Conduct Real-time qPCR
В В реално време qPCR реакциите за детекция и количествено определяне на бактерии без използване на флуорсцентни сонди се използва SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Реакциите се залагат в 96-ямкови плаки с краен обем на всяка реакция 25 pL. Реакциите се провеждат на В реално време PCR CFX96 Touch (BIO-RAD) с версия на софтуера 3.0.1224 при условия за всяка от целевите групи бактерии, посочени в Таблица 4.In real-time qPCR reactions for the detection and quantification of bacteria without the use of fluorescent probes, SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) was used. Reactions were plated in 96-well plates with a final volume of each reaction of 25 pL. Reactions were run on a Real-time PCR CFX96 Touch (BIO-RAD) with software version 3.0.1224 under conditions for each of the target groups of bacteria listed in Table 4.
Таблица 4. Праймери и реакционни услоловия за провеждане на В реално време qPCR за количествено определяне на бактерии във фекални проби.Table 4. Primers and reaction conditions for conducting Real-time qPCR for the quantification of bacteria in faecal samples.
В реално време qPCR реакциите за детекция и количествено определяне на бактерии с използване на флуоресцентно белязани сонди се използва TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Реакциите се залагат в 96-ямкови плаки с краен обем на всяка реакция 25 pL. Условия за провеждане на всеки от анализите за определяне на целевите групи бактерии са посочени в Таблица 5.Real-time qPCR reactions for detection and quantification of bacteria using fluorescently labeled probes used TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Reactions were plated in 96-well plates with a final volume of each reaction of 25 pL. Conditions for conducting each of the analyzes to determine the target groups of bacteria are indicated in Table 5.
Таблица 5. Праймери, флуоресцентни сонди и реакционни условия за провеждане на В реално време qPCR за количествено определяне на бактерии във фекални проби.Table 5. Primers, fluorescent probes and reaction conditions for conducting Real-time qPCR for the quantification of bacteria in faecal samples.
Всички В реално време qPCR анализи на количествено определяне на бактерии във фекални проби и кърма се провеждат с минимум двукратно повторение от различни анализи.All Real-time qPCR assays for bacterial quantification in faecal samples and breast milk were performed with a minimum of two replicates from different assays.
6. Електрофоретичен анализ на ДНК фрагменти, получени след провеждане на В реално време qPCR6. Electrophoretic analysis of DNA fragments obtained after performing real-time qPCR
За проверка на размера и интегритета на амплимерите, получени след провеждане на В реално време qPCR, се провежда агарозна гел-електрофореза на реакционните продукти. Разделянето на фрагмените ДНК се извършва в 2% агарозен гел, при напрежение 35V и 25 mA сила на тока. Разделените фрагменти се визуализрат флуоресцентно - чрез обработка на гела с етидиев бромид и осветяване е УВ светлина. Приблизителните размери на ДНК фрагментите се определят чрез съпоставка със стандар, съдържащ малки ДНК фрагменти с известни размери - SmartLadder SF (Eurogentec, Belgium).Agarose gel electrophoresis of the reaction products was performed to verify the size and integrity of the amplimers obtained after performing real-time qPCR. The separation of the DNA fragments was performed in a 2% agarose gel, at a voltage of 35V and a current of 25 mA. The separated fragments are visualized fluorescently - by treating the gel with ethidium bromide and illuminating with UV light. The approximate sizes of the DNA fragments are determined by comparison with a standard containing small DNA fragments of known sizes - SmartLadder SF (Eurogentec, Belgium).
7. Статистическа обработка на данните7. Statistical data processing
Статистическата обработка на данните и тяхното графично представяне се извършват със със софтуер SYSTAT версия 13.2 и SigmaPlot версия 12.0 (Systat Software Inc., USA).Statistical processing of the data and their graphical presentation were performed with SYSTAT version 13.2 and SigmaPlot version 12.0 software (Systat Software Inc., USA).
IL Анализ на ензими в проби от майчина кърма и фецес от новороденоIL Analysis of enzymes in breast milk and newborn faeces samples
1. Определяне на ензимна активност на β-галактозидаза (ЕС 3.2.1.23)1. Determination of β-galactosidase enzyme activity (EU 3.2.1.23)
Ензимната реакция се проведе при условия: 100 тМ натриево ацетатен буфер, pH 6.0, съдържащ 2 тМ разтвор на о-нитрофенил-В-О-галактопиранозид (ONP-Gal) и подходящо разредени клетки или надутаечна течност след дезинтегриране на клетките при 37оС . Реакцията се спира с 1 М натриев карбонат. Една единица активност на ензима катализира получаването на 1.0 gmol о-нитрофенол за една минута при pH 4.0 и 37°С. Съдържанието на о- нитрофенол се определя спектрофотометрично при 410nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800.The enzyme reaction was carried out under conditions: 100 mM sodium acetate buffer, pH 6.0, containing 2 mM solution of o-nitrophenyl-B-O-galactopyranoside (ONP-Gal) and appropriately diluted cells or supernatant after disintegration of cells at 37oC. The reaction was quenched with 1 M sodium carbonate. One unit of enzyme activity catalyzes the production of 1.0 gmol of o-nitrophenol in one minute at pH 4.0 and 37°C. The o-nitrophenol content was determined spectrophotometrically at 410 nm wavelength on a Beckman Coulter DU 800 spectrophotometer.
Всички експерименти за определяне на ензимната активност са проведени с трикратна повтаряемост.All experiments for the determination of enzyme activity were performed in triplicate.
2. Определяне активността на α-галактозидаза (ЕС 3.2.1.22)2. Determination of α-galactosidase activity (EC 3.2.1.22)
Ензимната реакция се проведе при условия: 400 тМ цитратен буфер, pH 4.0, съдържащ 9.9 тМ разтвор на р-нитрофенил a-D-галактопиранозид (PNP-Gal) (приготвя се в дестилирана вода чрез разтваряне на р-нитрофенил a-D-галактопиранозид, Sigma кат. № N-0877) и подходящо разредени клетки или надутаечна течност след дезинтегриране на клетките при 37оС . Реакцията се спира с 200 тМ боратен буфер, pH 9.8. Една единица активност превръща 1.0 gmole от р-нитрофенил a-D-галактопиранозид в о-нитрофенол и D-галактоза за една минута при pH 4.0 и 37°С.The enzyme reaction was carried out under conditions: 400 mM citrate buffer, pH 4.0, containing 9.9 mM solution of p-nitrophenyl α-D-galactopyranoside (PNP-Gal) (prepared in distilled water by dissolving p-nitrophenyl α-D-galactopyranoside, Sigma cat. No. N-0877) and appropriately diluted cells or superfluid after disintegration of the cells at 37°C. The reaction was stopped with 200 mM borate buffer, pH 9.8. One unit of activity converts 1.0 gmole of p-nitrophenyl α-D-galactopyranoside to o-nitrophenol and D-galactose in one minute at pH 4.0 and 37°C.
Съдържанието на р-нитрофенол се определя спектрофотометрично при 405 nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800.The p-nitrophenol content was determined spectrophotometrically at 405 nm wavelength on a Beckman Coulter DU 800 spectrophotometer.
Всички експерименти за определяне на ензимната активност са проведени с трикратна повтаряемост.All experiments for the determination of enzyme activity were performed in triplicate.
3. Определяне активността на α-L - фукозидаза (ЕС 3.2.1.51)3. Determination of the activity of α-L - fucosidase (EU 3.2.1.51)
Ензимната реакция се проведе при условия: 100 тМ цитратен буфер, pH 6.5, съдържащ 10 тМ разтвор на р-нитрофенил a-L-фукопиранозид (PNP-FUC) (приготвя си посредством разреждане на р-нитрофенил a-L-фукопиранозид (Sigma кат. № N3628) с дестилирана вода и подходящо разредени клетки при 37оС . Реакцията се спира с 200 тМ боратен буфер, pH 9.8. Една единица активност превръща 1.0 pmole от р-нитрофенил a-L-фукопиранозид в рнитрофенол и L-фукопиранозид за една минута при pH 4.0 и 37°С. Съдържанието на рнитрофенол се определя спектрофотометрично при 405 nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800.The enzyme reaction was carried out under conditions: 100 mM citrate buffer, pH 6.5, containing 10 mM solution of p-nitrophenyl α-L-fucopyranoside (PNP-FUC) (prepared by diluting p-nitrophenyl α-L-fucopyranoside (Sigma cat. no. N3628) with distilled water and appropriately diluted cells at 37°C. The reaction was stopped with 200 mM borate buffer, pH 9.8. One unit of activity converted 1.0 pmole of p-nitrophenyl α-L-fucopyranoside to r-nitrophenol and L-fucopyranoside in one minute at pH 4.0 and 37° C. Nitrophenol content was determined spectrophotometrically at 405 nm wavelength on a Beckman Coulter DU 800 spectrophotometer.
Всички експерименти за определяне на ензимна активност са проведени с трикратна повтаряемост.All experiments for the determination of enzyme activity were performed in triplicate.
4. Определяне активността на α-глюкозидаза (ЕС 3.2.1.20)4. Determination of α-glucosidase activity (EC 3.2.1.20)
Ензимната реакция се проведе при условия: 100 тМ ацетатен буфер, pH 6,0, съдържащ 1.25 тМ разтвор на р-нитрофенил a-D-глюкопиранозид (приготвя си посредством разреждане на р-нитрофенил a-D-глюкопиранозид (Sigma кат. № N3628) с дестилирана вода, и подходящо разредени клетки при 37оС . Реакцията се спира с 0.5 М натриев карбонат. Една единица активност превръща 1.0 pmole от р-нитрофенол a-D-глюкопиранозид в рнитрофенол и D-глюкопиранозид за една минута при pH 6.0 и 37°С. Съдържанието на рнитрофенол се определя спектрофотометрично при 405 nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU800.The enzyme reaction was carried out under conditions: 100 mM acetate buffer, pH 6.0, containing 1.25 mM solution of p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside (prepared by diluting p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside (Sigma cat. no. N3628) with distilled water , and suitably diluted cells at 37°C. The reaction was stopped with 0.5 M sodium carbonate. One unit of activity converted 1.0 pmole of p-nitrophenol α-D-glucopyranoside to rnitrophenol and D-glucopyranoside in one minute at pH 6.0 and 37°C. The rnitrophenol content was determined spectrophotometrically at 405 nm wavelength on a Beckman Coulter DU800 spectrophotometer.
Всички експерименти за определяне на ензимна активност са проведени с трикратна повтаряемост.All experiments for the determination of enzyme activity were performed in triplicate.
5. Определяне активността на β-глюкозидаза (ЕС 3.2.1.28)5. Determination of β-glucosidase activity (EC 3.2.1.28)
Ензимната реакция се проведе при условия: 0.1 М ацетатен буфер, pH 5.0, съдържащ 20 тМ разтвор на р-нитрофенил-В-О- глюкопиранозид (ONP-Glu) и подходящо разредени клетки при 37оС . Реакцията се спира с 0.2 М натриев карбонат. Една еденица активност превръща 1.0 pmole от р-нитрофенил a-D-глюкопиранозид в р-нитрофенол и Dглюкопиранозид за една минута при pH 5.0 и 37°С. Съдържанието на р-нитрофенол се определя спектрофотометрично при 405 nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800.The enzyme reaction was carried out under conditions: 0.1 M acetate buffer, pH 5.0, containing a 20 mM solution of p-nitrophenyl-B-O-glucopyranoside (ONP-Glu) and appropriately diluted cells at 37°C. The reaction was stopped with 0.2 M sodium carbonate. One unit of activity converts 1.0 pmole of p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside to p-nitrophenol and D-glucopyranoside in one minute at pH 5.0 and 37°C. The p-nitrophenol content was determined spectrophotometrically at 405 nm wavelength on a Beckman Coulter DU 800 spectrophotometer.
Всички експерименти за определяне на ензимна активност са проведени с трикратна повтаряемост.All experiments for the determination of enzyme activity were performed in triplicate.
6. Определяне активността на протеаза6. Determination of protease activity
Протеазната активност на клетките и надутаечната течност (НУТ) се изследва в присъствие на казеин (Fluka) като субстрат. Една единица (U) активност на протеазата се дефинира като количеството ензим, което хидролизира казеина до Ipmol тирозин за 1 минута, при pH 7,5 и 37°С.Protease activity of cells and CSF was assayed in the presence of casein (Fluka) as a substrate. One unit (U) of protease activity is defined as the amount of enzyme that hydrolyzes casein to Ipmol tyrosine in 1 minute, at pH 7.5 and 37°C.
Ензимната реакция се провежда при следните условия: в 50 тМ фосфатен буфер, pH 7,5 се разтвяря 0,65% (w/v) казеин и 1,0 ml подходящо разредена проба (клетки или НУТ). Реакцията протича за 10 мин. при 37°С на водна баня. Реакцията се спира с добавяне на 110 тМ трихлорооцетна киселина (ТХО) (Merck) при 37°С. Пробите се инкубират с ТХО за 30 минути при същата температура. За отделяне на неразградения казеин, пробите се центрофугират при 9000об./15 мин., 4°С. Надутаечната течност се анализира за количество освободен тирозин, от разграждането на казеина, в присъствие на 500 тМ №2СОз и 0,5 М разтвор на Фолин реагент (Merck) при 37°С за 30 минути. Измерва се абсорбцията при λ=660 nm (АббОпт) на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800, спрямо контрола, съдържаща вместо проба дестилирана вода. От измерената АббОпт по стандартна права се определя концентрацията на тирозина (pmol). За построяването на стандартна права се използва като стандарт L-тирозин (Sigma-Aldrich).The enzyme reaction was carried out under the following conditions: in 50 mM phosphate buffer, pH 7.5, 0.65% (w/v) casein and 1.0 ml of an appropriately diluted sample (cells or HUT) were dissolved. The reaction takes place for 10 min at 37°C in a water bath. The reaction was stopped by the addition of 110 mM trichloroacetic acid (THO) (Merck) at 37°C. Samples were incubated with THO for 30 min at the same temperature. To separate the undegraded casein, the samples are centrifuged at 9000 rpm/15 min., 4°C. The supernatant was analyzed for the amount of tyrosine released from the degradation of casein in the presence of 500 mM #2 CO 3 and 0.5 M Folin's reagent solution (Merck) at 37°C for 30 minutes. The absorbance at λ=660 nm (AbbOpt) was measured on a Beckman Coulter DU 800 spectrophotometer, relative to a control containing distilled water instead of the sample. The concentration of tyrosine (pmol) was determined from the measured AbbOpt by a standard curve. L-tyrosine (Sigma-Aldrich) was used as a standard for the construction of a standard curve.
Всички експерименти за определяне на протеазна активност са проведени минимум с трикратна повторяемост.All experiments for the determination of protease activity were performed with a minimum of three-fold repeatability.
7. Определяне активността на липаза (ЕС 3.1.1.3)7. Determination of lipase activity (EU 3.1.1.3)
Ензимната реакция се проведе при условия: 0.1 М ацетатен буфер, pH 7,6, съдържащ 0,8 тМ разтвор на р-нитрофенил-палмитат и подходящо разредени клетки при 37оС . Реакцията се спира с 0.2 М оловен ацетат1еаб (II). Една единица активност превръща 1.0 pmole от р-нитрофенил палмитат в р-нитрофенол и палмитат за една минута при pH 7,6 и 37°С. Съдържанието на р-нитрофенол се определя спектрофотометрично при 405 nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800.The enzyme reaction was carried out under the following conditions: 0.1 M acetate buffer, pH 7.6, containing 0.8 mM p-nitrophenyl palmitate solution and appropriately diluted cells at 37°C. The reaction was stopped with 0.2 M lead acetate (II). One unit of activity converts 1.0 pmole of p-nitrophenyl palmitate to p-nitrophenol and palmitate in one minute at pH 7.6 and 37°C. The p-nitrophenol content was determined spectrophotometrically at 405 nm wavelength on a Beckman Coulter DU 800 spectrophotometer.
Всички експерименти за определяне на ензимна активност са проведени с трикратна повтаряемост.All experiments for the determination of enzyme activity were performed in triplicate.
III. Анализ на късоверижни мастни киселини в проби от кърма и фецес на бебета от един до дванадесет месеца.III. Analysis of short-chain fatty acids in breast milk and faecal samples of one- to twelve-month-old infants.
За доказването на късоверижните масни киселни в пробите от екскременти е разработен следният протокол:The following protocol has been developed for the detection of short-chain fatty acids in excrement samples:
1. Изолиране на късоверижни мастни киселини от екскременти.1. Isolation of short-chain fatty acids from excreta.
Към 100 mg прясна фекална проба или майчина кърма се добавя 2% НзРОд или 0,05% H2SO4 в съотношение 1:10. Пробите се хомогенизират много добре на вортекс 2 пъти по 2 min. Полученият хомогенизат се центрофугира 10 min, 13 000 rpm, след което се отделя супернатанта. От супернтанта се вземат 200 pL, които се екстрахират с 200 pL органичен разтворител (CH2CI2, AcCN, EtOH, EtOAc). Пробите се хомогензират, след което се центрофугира 5 min, 13 000 rpm. Полученият органичен слой се отделя и подлага на HPLC анализ.To 100 mg of fresh fecal sample or mother's breast milk, 2% H3POd or 0.05% H2SO4 is added in a ratio of 1:10. The samples are homogenized very well on a vortex 2 times for 2 min each. The resulting homogenate was centrifuged for 10 min, 13,000 rpm, after which the supernatant was separated. 200 pL were taken from the supernatant and extracted with 200 pL organic solvent (CH 2 Cl 2 , AcCN, EtOH, EtOAc). Samples were homogenized, then centrifuged for 5 min, 13,000 rpm. The resulting organic layer was separated and subjected to HPLC analysis.
2. HPLC метод за анализ на късоверижни мастни киселини.2. HPLC method for the analysis of short-chain fatty acids.
Използвана е HPLC ситема Konik-Tech (Испания) снабдена е колона Aminex НРХ-87Н Ion Exclusion Column (7.8 mm i.d. x 30 cm, Biorad, Richmond, СА) и предколона Micro-Guard Cation-H (4.6 mm i.d. x 30 mm, Biorad). Определянето на пробите е осъществено с UV детектор при дължина на вълната 210 nm, при подвижна фаза 0,005М H2SO4, скорост на потока 0,6 ml/min и температура на колоната Т=40°С.A Konik-Tech (Spain) HPLC system was used, equipped with an Aminex НХ-87Н Ion Exclusion Column (7.8 mm i.d. x 30 cm, Biorad, Richmond, CA) and a Micro-Guard Cation-H pre-column (4.6 mm i.d. x 30 mm, Biorad). The determination of the samples was carried out with a UV detector at a wavelength of 210 nm, with a mobile phase of 0.005M H2SO4, a flow rate of 0.6 ml/min and a column temperature of Т=40°C.
Идентифицирането на пиковете е осъществено по времената на задържане спрямо стандарти на късоверижни мастни киселини: млечна киселина, ацетна киселиан, пропионова киселина и бутенова киселина. За количественото определяне на късоверижните мастни киселини са изготвени стандартни прави в концентрации 25 - 1,56 mmol/L. Изведени са корелационни уравнения, описващи площта на пика (у) и концентрацията на късоверижните мастни киселини (х, mmol/L). Стандартните прави са с линейни участъци между 25 - 1,65 mmol/L и с коефициент на корелация г2 > 0,9999.Peaks were identified by retention times against standards of short-chain fatty acids: lactic acid, acetic acid, propionic acid, and butenoic acid. For the quantitative determination of short-chain fatty acids, standard lines were prepared in concentrations of 25 - 1.56 mmol/L. Correlation equations describing the peak area (y) and the concentration of short-chain fatty acids (x, mmol/L) were derived. The standard lines are with linear sections between 25 - 1.65 mmol/L and with a correlation coefficient r2 > 0.9999.
Таблица 6. Диапазон на стойностите на измерваните показатели при здрави деца на възраст от един до дванадесет месеца.Table 6. Range of values of measured indicators in healthy children aged one to twelve months.
В резултат на проведените анализи на тестуваните майчина кърма и фецес от новородено на възраст между един и дванадесет месеца се изчисляват следните коефициенти:As a result of the analyzes of the tested mother's breast milk and feces from a newborn between the ages of one and twelve months, the following coefficients are calculated:
1. Съотношение на количеството Бифидобактерии/Бактероиди1. Ratio of the quantity of Bifidobacteria/Bacteroides
2. Съотношението на количеството Бифидобактерии/Лактобацили2. The ratio of the amount of Bifidobacteria/Lactobacilli
3. Съотношението на количеството (Бифидобактерии+Лактобацили)/Бактероиди3. The ratio of the quantity (Bifidobacteria+Lactobacilli)/Bacteroides
4. Съотношението на количеството (Бифидобактерии+Лактобацили)/Дрожди4. The ratio of the quantity (Bifidobacteria+Lactobacilli)/Yeast
5. Съотношението на количеството Бактероиди/Дрожди5. The ratio of the amount of Bacteroids / Yeast
6. Съотношението на количеството (Бифидобактерии+Лактобацили)/Е. коли6. The ratio of the quantity (Bifidobacteria+Lactobacilli)/E. cars
7. Съотношението на количеството (Бифидобактерии+Лактобацили)/активност на бетагалактозидаза7. The ratio of the quantity (Bifidobacteria+Lactobacilli)/betagalactosidase activity
8. Съотношението на количеството (Бифидобактерии+Лактобацили)/активност на алфафукозидаза8. The ratio of the amount of (Bifidobacteria+Lactobacilli)/alphafucosidase activity
9. Съотношението на ензимните активности бета-галактозидаза/алфа-галактозидаза9. The ratio of beta-galactosidase/alpha-galactosidase enzyme activities
10. Съотношението на ензимните активности бета-галактозидаза/алфа-фукозидаза10. The ratio of beta-galactosidase/alpha-fucosidase enzyme activities
11. Съотношението на ензимните активности бета-галактозидаза/липаза11. The ratio of beta-galactosidase/lipase enzyme activities
12. Съотношението на ензимните активности бета-галактозидаза/протеаза12. The ratio of beta-galactosidase/protease enzyme activities
13. Съотношението на ензимните активности (бета-галактозидаза+алфа-галактозидаза)/ алфа-фукозидаза13. The ratio of enzyme activities (beta-galactosidase+alpha-galactosidase)/alpha-fucosidase
14. Съотношение на метаболитите млечнакиселина/оцетна киселина/маслена киселина Изчислява се като съотношение между числеността на съответните бактерии (ензими, метаболити), където като мярка за численост на бактериите (ензимите, метаболитите) се използва относителната стойност на числеността спрямо средата на интервала от нормалните и стойности.14. Ratio of metabolites lactic acid/acetic acid/butyric acid It is calculated as a ratio between the numbers of the corresponding bacteria (enzymes, metabolites), where as a measure of the number of bacteria (enzymes, metabolites) the relative value of the number is used compared to the middle of the interval of the normal and values.
' W .ШсГ' W .ShsG
Където:Where:
1. С — съотношение между числеността на бактерии (ензими, метаболити) А и В;1. C — ratio between the number of bacteria (enzymes, metabolites) A and B;
2. А - численост на бактерии (ензими, метаболити) А;2. A - number of bacteria (enzymes, metabolites) A;
3. A nom.min. - долната граница на нормата за численост на бактерии (ензими, метаболити)А;3. A nom. min. - the lower limit of the norm for the number of bacteria (enzymes, metabolites) A;
A nom.max. - горна граница на нормата за численост на бактерии (ензими, метаболити) А;A nom.max. - upper limit of the norm for the number of bacteria (enzymes, metabolites) A;
В - численост на бактерии (ензими, метаболити) В;B - number of bacteria (enzymes, metabolites) B;
В nom.min. - долната граница на нормата за численост на бактерии (ензими, метаболити) В;In nom.min. - the lower limit of the norm for the number of bacteria (enzymes, metabolites) B;
В nom.max. - горна граница на нормата за численост на бактерии (ензими, метаболити) В.In nom.max. - upper limit of the norm for the number of bacteria (enzymes, metabolites) B.
Тенденциите при отчитане на съотношениеята са изразени в таблица 7, които се получават при съответното съотношение на показателя от колоната на таблицата към показателя от реда на таблицата.The trends in reporting the ratio are expressed in Table 7, which are obtained at the corresponding ratio of the indicator from the column of the table to the indicator from the row of the table.
Таблица 7. Тенденции на съотношенията между отделните показатели, с червена стрелка се отбелязва положителен ефект върху микробиотата, а със синя отрицателен ефект върху микробиотата.Table 7. Trends of the ratios between the individual indicators, a red arrow indicates a positive effect on the microbiota, and a blue arrow indicates a negative effect on the microbiota.
1-Бифидо1-Bifido
1-Бифидо _____1-Bifido _____
.....................♦fSKS.....................♦fSKS
3-Bacteroides _______3-Bacteroides _______
Б-едиде«МК6B-edide« MK6
6- Е. coll6- E. coll
7- A-galactosidasa ф (7/1)φ7- A-galactosidase φ (7/1)φ
8-8-galactosldase φ (8/1)48-8-galactosldase φ (8/1)4
9-A-fucosidasa φ (9/1)Φ9-A-fucosidase φ (9/1)Φ
ЩЦрам φ (10/1)4Shaft φ (10/1)4
U-Protease φ (11/1)4U-Protease φ (11/1)4
2-LAB 3-Bacteroid«2-LAB 3-Bacteroid
4-Доожди t (1/6) f (2/6)4-Rains t (1/6) f (2/6)
12-Метаболити ♦ σ/а»4 t ¢/2)4 t (9/2)4 t (10/2)4 * (11/2)412-Metabolites ♦ σ/a»4 t ¢/2)4 t (9/2)4 t (10/2)4 * (11/2)4
f (5/6) ♦ (6/5)4 ♦ ¢/5)4 + (8/S)4 + (9/S)4 t (10/5)4 t (11/5)4f (5/6) ♦ (6/5)4 ♦ ¢/5)4 + (8/S)4 + (9/S)4 t (10/5)4 t (11/5)4
7-A-placto$ldase 8-B*galactosidase 9-A-fuco$idase 10-LipaseT 11-Protease 12-Метаболити + (3/10) 4 + ¢/11)4 ______________________________________«ΛΦ 4 T (4/11)4 t (7/12)4 t (8/12)4 f (9/12)4 t (10/12) 47-A-placto$ldase 8-B*galactosidase 9-A-fuco$idase 10-LipaseT 11-Protease 12-Metabolites + (3/10) 4 + ¢/11)4 ______________________________________«ΛΦ 4 T (4/11 )4 t (7/12)4 t (8/12)4 f (9/12)4 t (10/12) 4
........ ......... * (11/12) 4........ ......... * (11/12) 4
Пример 2. Ин витро изследване на 6 показателя по оценка на баланса на микробиотата при бебета от един до дванадесет месеца:Example 2. In vitro study of 6 indicators for assessing the balance of the microbiota in babies from one to twelve months:
1. Протокол за количествен анализ на човешка микробиота чрез в реално времев реално време qPCR1. Protocol for quantitative analysis of human microbiota by real-time qPCR
Представеният протокол може да се прилага за установяване на отклонения за анализ на дисбиоза при новородени от един до дванадесет месеца и да бъде включен към алгоритъм за идентифициране на състояние, отклонения и правила за възстановяване баланса на микробиотата.The presented protocol can be applied to establish deviations for analysis of dysbiosis in newborns from one to twelve months and be included in an algorithm for identifying condition, deviations and rules for restoring the balance of the microbiota.
А. Праймери и флуоресцентно белязани сонди за в реално времев реално време PCR детекция на бактериални групи и видове в проби от таргетните групиA. Primers and fluorescently labeled probes for real-time real-time PCR detection of bacterial groups and species in samples from the target groups
Праймерните двойки и флуоресцентно белязани сонди за провеждане на в реално време qPCR детекция на бактериални видове и съобщества в проби от различни таргетни групи са представени в Таблица 8.Primer pairs and fluorescently labeled probes for performing real-time qPCR detection of bacterial species and communities in samples from different target groups are presented in Table 8.
Таблица 8. Праймери и флуоресцентно белязани сонди за в реално време qPCR детекция на бактериални групи и видове, използвани в представеното изследване.Table 8. Primers and fluorescently labeled probes for real-time qPCR detection of bacterial groups and species used in the presented study.
2. Контролни бактериални щамове2. Control bacterial strains
Бактериални щамове, използвани за контрол на специфичността на използваните праймери и белязани сонди, както и за количествена оценка на отделни бактериални видове и съобщества са представени в Таблица 2. Използваните щамове са закупени от Националната банка за промишлени микроорганизми и клетъчни култури (НБПМК) и German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ). Щамовете се култивират аеробно или анаеробно в селективни хранителни среди, съгласно препоръките на DSMZ и НБПМК. От развитите култури за всеки щам се правят серия от разреждания, които се посяват върху съответната агарова среда в петрита, за да се определи общ брой бактерии - колоно-образуващи единици (CFU). Допълнително, от направните разреждания се вземат проби от по 1,0 ml, които се центрофугират при следните условия: 12000rpm/3min. Получените утайки от бактериални клетки се съхраняват при -80°С до използването им за анализ.Bacterial strains used to control the specificity of the primers and labeled probes used, as well as for the quantitative assessment of individual bacterial species and communities are presented in Table 2. The strains used were purchased from the National Bank for Industrial Microorganisms and Cell Cultures (NBPMK) and German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ). The strains are cultivated aerobically or anaerobically in selective nutrient media, according to the recommendations of DSMZ and NBPMK. A series of dilutions is made from the developed cultures for each strain and plated on the corresponding agar medium in a petri dish to determine the total number of bacteria - colony-forming units (CFU). Additionally, samples of 1.0 ml are taken from the preparation dilutions, which are centrifuged under the following conditions: 12000rpm/3min. The resulting bacterial cell pellets were stored at -80°C until used for analysis.
Таблица 9. Контролни бактериални щамове, използвани в изследването.Table 9. Control bacterial strains used in the study.
3. Изолиране на ДНК от бактериални култури и проби от таргетните групи3. Isolation of DNA from bacterial cultures and samples from the target groups
Бактериална геномна ДНК от контролните щамове и изолати от проби на таргетните групи се екстахира чрез използване на Blood and Tissue kit DNeasy (Qiagen, Hilden, Germany).. Микробиална ДНК от фекални проби и от кърма се изолира чрез използване на QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Първоначално 200 mg фекалната проба/кърма се разрежда в 1,8 ml стерилен PBS буфер. Към 200 μΐ разредена фекална проба се добавят 20 μΐ лизозим (150 mg/ml) и 130 μΐ лизиращ буфер (2,0 mM NazEDTA; 20 тМ Tris-HCl; 1,2% Triton Х-100). Сместа се инкубира при 37°С за 30 минути, след което се изолира ДНК.Bacterial genomic DNA from control strains and isolates from target group samples was extracted using the Blood and Tissue kit DNeasy (Qiagen, Hilden, Germany). Microbial DNA from faecal samples and from breast milk was isolated using the QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Initially, 200 mg of faecal sample/milk was diluted in 1.8 ml of sterile PBS buffer. 20 μΐ lysozyme (150 mg/ml) and 130 μΐ lysis buffer (2.0 mM NazEDTA; 20 mM Tris-HCl; 1.2% Triton X-100) were added to 200 μΐ diluted fecal sample. The mixture was incubated at 37°C for 30 min, after which DNA was isolated.
4. Количествено определяне на ДНК4. Quantification of DNA
Количеството и чистотата на бактериалната геномна ДНК излорана от щамовете стандарти и от изследваните проби се определят спектофотометрично. За целта се определя абсорбцията на подходящо разререните проби ДНК при дължини на вълните 260 nm и 280 nm. Измерванията се извършват на спектофотометър Shimadzu UV-2600 при светлинен път 8,5 mm, след нулиране на апарата срещу кювета с елуираш буфер. Еднородността на геномната ДНК се определи чрез визуализиране на изолираната ДНК в 1% (w/v) агарозен гел чрез електрофореза и оцветяване с етидиев бромид. Пробите с изолираната ДНК се съхраняват при -20°С.The quantity and purity of the bacterial genomic DNA extracted from the standard strains and from the tested samples were determined spectrophotometrically. For this purpose, the absorbance of the suitably diluted DNA samples is determined at wavelengths of 260 nm and 280 nm. Measurements were performed on a Shimadzu UV-2600 spectrophotometer at a light path of 8.5 mm, after zeroing the apparatus against a cuvette with elution buffer. Homogeneity of genomic DNA was determined by visualizing the isolated DNA in a 1% (w/v) agarose gel by electrophoresis and staining with ethidium bromide. Samples with isolated DNA were stored at -20°C.
5. Провеждане на В реално време qPCR5. Conduct Real-time qPCR
В В реално време qPCR реакциите за детекция и количествено определяне на бактерии без използване на флуорсцентни сонди се използва SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Реакциите се залагат в 96-ямкови плаки с краен обем на всяка реакция 25 μΕ. Реакциите се провеждат на В реално време PCR CFX96 Touch (BIO-RAD) с версия на софтуера 3.0.1224 при условия за всяка от целевите групи бактерии, посочени в Таблица 10.In real-time qPCR reactions for the detection and quantification of bacteria without the use of fluorescent probes, SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) was used. Reactions were plated in 96-well plates with a final volume of each reaction of 25 μΕ. Reactions were run on a Real-Time PCR CFX96 Touch (BIO-RAD) with software version 3.0.1224 under conditions for each of the target groups of bacteria listed in Table 10.
Таблица 10. Праймери и реакционни услоловия за провеждане на В реално време qPCR за количествено определяне на бактерии във фекални проби.Table 10. Primers and reaction conditions for conducting Real-time qPCR for the quantification of bacteria in fecal samples.
В реално време qPCR реакциите за детекция и количествено определяне на бактерии с използване на флуоресцентно белязани сонди се използва TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Реакциите се залагат в 96-ямкови плаки с краен обем на всяка реакция 25 pL. Условия за провеждане на всеки от анализите за определяне на целевите групи бактерии са посочени в Таблица 11.Real-time qPCR reactions for detection and quantification of bacteria using fluorescently labeled probes used TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Reactions were plated in 96-well plates with a final volume of each reaction of 25 pL. Conditions for conducting each of the analyzes to determine the target groups of bacteria are indicated in Table 11.
Таблица 11. Праймери, флуоресцентни сонди и реакционни условия за провеждане на В реално време qPCR за количествено определяне на бактерии във фекални проби.Table 11. Primers, fluorescent probes and reaction conditions for conducting Real-time qPCR for the quantification of bacteria in faecal samples.
Всички В реално време qPCR анализи на количествено определяне на бактерии във фекални проби и кърма се провеждат с минимум двукратно повторение от различни анализи.All Real-time qPCR assays for bacterial quantification in faecal samples and breast milk were performed with a minimum of two replicates from different assays.
6. Електрофоретичен анализ на ДНК фрагменти, получени след провеждане на В реално време qPCR6. Electrophoretic analysis of DNA fragments obtained after performing real-time qPCR
За проверка на размера и интегритета на амплимерите, получени след провеждане на В реално време qPCR, се провежда агарозна гел-електрофореза на реакционните продукти. Разделянето на фрагмените ДНК се извършва в 2% агарозен гел, при напрежение 35V и 25 mA сила на тока. Разделените фрагменти се визуализрат флуоресцентно - чрез обработка на гела с етидиев бромид и осветяване с VB светлина. Приблизителните размери на ДНК фрагментите се определят чрез съпоставка със стандар, съдържащ малки ДНК фрагменти с известни размери - SmartLadder SF (Eurogentec, Belgium).Agarose gel electrophoresis of the reaction products was performed to verify the size and integrity of the amplimers obtained after performing real-time qPCR. The separation of the DNA fragments was performed in a 2% agarose gel, at a voltage of 35V and a current of 25 mA. The separated fragments are visualized fluorescently - by treating the gel with ethidium bromide and illuminating with VB light. The approximate sizes of the DNA fragments are determined by comparison with a standard containing small DNA fragments of known sizes - SmartLadder SF (Eurogentec, Belgium).
7. Статистическа обработка на данните7. Statistical data processing
Статистическата обработка на данните и тяхното графично представяне се извършват със със софтуер SYSTAT версия 13.2 и SigmaPlot версия 12.0 (Systat Software Inc., USA).Statistical processing of the data and their graphical presentation were performed with SYSTAT version 13.2 and SigmaPlot version 12.0 software (Systat Software Inc., USA).
II. Анализ на ензими в проби от майчина кърма и фецес от новороденоII. Analysis of enzymes in breast milk and newborn fecal samples
1. Определяне на ензимна активност на β-галактозидаза (ЕС 3.2.1.23)1. Determination of β-galactosidase enzyme activity (EU 3.2.1.23)
Ензимната реакция се проведе при условия: 100 тМ натриево ацетатен буфер, pH 6.0, съдържащ 2 тМ разтвор на о-нитрофенил-В-О-галактопиранозид (ONP-Gal) и подходящо разредени клетки или надутаечна течност след дезинтегриране на клетките при 37оС . Реакцията се спира с 1 М натриев карбонат. Една единица активност на ензима катализира получаването на 1.0 pmol о-нитрофенол за една минута при pH 4.0 и 37°С. Съдържанието на о- нитрофенол се определя спектрофотометрично при 410nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800.The enzyme reaction was carried out under conditions: 100 mM sodium acetate buffer, pH 6.0, containing 2 mM solution of o-nitrophenyl-B-O-galactopyranoside (ONP-Gal) and appropriately diluted cells or supernatant after disintegration of cells at 37oC. The reaction was quenched with 1 M sodium carbonate. One unit of enzyme activity catalyzes the production of 1.0 pmol of o-nitrophenol in one minute at pH 4.0 and 37°C. The o-nitrophenol content was determined spectrophotometrically at 410 nm wavelength on a Beckman Coulter DU 800 spectrophotometer.
Всички експерименти за определяне на ензимната активност са проведени с трикратна повтаряемост.All experiments for the determination of enzyme activity were performed in triplicate.
2. Определяне активността на α-L- фукозидаза (ЕС 3.2.1.51)2. Determination of α-L-fucosidase activity (EU 3.2.1.51)
Ензимната реакция се проведе при условия: 100 тМ цитратен буфер, pH 6.5, съдържащ 10 тМ разтвор на р-нитрофенил a-L-фукопиранозид (PNP-FUC) (приготвя си посредством разреждане на р-нитрофенил a-L-фукопиранозид (Sigma кат. № N3628) с дестилирана вода и подходящо разредени клетки при 37оС . Реакцията се спира с 200 тМ боратен буфер, pH 9.8. Една единица активност превръща 1.0 pmole от р-нитрофенил a-L-фукопиранозид в рнитрофенол и L-фукопиранозид за една минута при pH 4.0 и 37°С. Съдържанието на рнитрофенол се определя спектрофотометрично при 405 nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800.The enzyme reaction was carried out under conditions: 100 mM citrate buffer, pH 6.5, containing 10 mM solution of p-nitrophenyl α-L-fucopyranoside (PNP-FUC) (prepared by diluting p-nitrophenyl α-L-fucopyranoside (Sigma cat. no. N3628) with distilled water and appropriately diluted cells at 37°C. The reaction was stopped with 200 mM borate buffer, pH 9.8. One unit of activity converted 1.0 pmole of p-nitrophenyl α-L-fucopyranoside to r-nitrophenol and L-fucopyranoside in one minute at pH 4.0 and 37° C. Nitrophenol content was determined spectrophotometrically at 405 nm wavelength on a Beckman Coulter DU 800 spectrophotometer.
Всички експерименти за определяне на ензимна активност са проведени с трикратна повтаряемост.All experiments for the determination of enzyme activity were performed in triplicate.
III. Анализ на късоверижни мастни киселини в проби от кърма и фецес на бебета от един до дванадесет месеца.III. Analysis of short-chain fatty acids in breast milk and faecal samples of one- to twelve-month-old infants.
За доказването на късоверижните масни киселни в пробите от екскременти е разработен следният протокол:The following protocol has been developed for the detection of short-chain fatty acids in excrement samples:
3. Изолиране на късоверижни мастни киселини от екскременти.3. Isolation of short-chain fatty acids from excrement.
Към 100 mg прясна фекална проба или майчина кърма се добавя 2% НЗРО4 или 0,05% H2SO4 в съотношение 1:10. Пробите се хомогенизират много добре на вортекс 2 пъти по 2 min. Полученият хомогенизат се центрофугира 10 min, 13 000 rpm, след което се отделя супернатанта. От супернтанта се вземат 200 pL, които се екстрахират с 200 pL органичен разтворител (СН2С12 , AcCN, EtOH, EtOAc). Пробите се хомогензират, след което се центрофугира 5 min, 13 000 rpm. Полученият органичен слой се отделя и подлага на HPLC анализ.2% HPO4 or 0.05% H2SO4 in a ratio of 1:10 is added to 100 mg of fresh fecal sample or breast milk. The samples are homogenized very well on a vortex 2 times for 2 min each. The resulting homogenate was centrifuged for 10 min, 13,000 rpm, after which the supernatant was separated. 200 pL were taken from the supernatant and extracted with 200 pL organic solvent (CH 2 Cl 2 , AcCN, EtOH, EtOAc). Samples were homogenized, then centrifuged for 5 min, 13,000 rpm. The resulting organic layer was separated and subjected to HPLC analysis.
4. HPLC метод за анализ на късоверижни мастни киселини.4. HPLC method for the analysis of short-chain fatty acids.
Използвана е HPLC ситема Konik-Tech (Испания) снабдена с колона Aminex НРХ-87Н Ion Exclusion Column (7.8 mm i.d. x 30 cm, Biorad, Richmond, СА) и предколона Micro-Guard Cation-H (4.6 mm i.d. x 30 mm, Biorad). Определянето на пробите е осъществено с UV детектор при дължина на вълната 210 nm, при подвижна фаза 0,005М H2SO4, скорост на потока 0,6 ml/min и температура на колоната Т=40°С.A Konik-Tech (Spain) HPLC system equipped with an Aminex НХ-87Н Ion Exclusion Column (7.8 mm i.d. x 30 cm, Biorad, Richmond, CA) and a Micro-Guard Cation-H pre-column (4.6 mm i.d. x 30 mm, Biorad). The determination of the samples was carried out with a UV detector at a wavelength of 210 nm, with a mobile phase of 0.005M H2SO4, a flow rate of 0.6 ml/min and a column temperature of Т=40°С.
Идентифицирането на пиковете е осъществено по времената на задържане спрямо стандарти на късоверижни мастни киселини: млечна киселина, ацетна киселиан, пропионова киселина и бутенова киселина. За количественото определяне на късоверижните мастни киселини са изготвени стандартни прави в концентрации 25 - 1,56 mmol/L. Изведени са корелационни уравнения, описващи площта на пика (у) и концентрацията на късоверижните мастни киселини (х, mmol/L). Стандартните прави са с линейни участъци между 25 - 1,65 mmol/L и с коефициент на корелация г2 > 0,9999.Peaks were identified by retention times against standards of short-chain fatty acids: lactic acid, acetic acid, propionic acid, and butenoic acid. For the quantitative determination of short-chain fatty acids, standard lines were prepared in concentrations of 25 - 1.56 mmol/L. Correlation equations describing the peak area (y) and the concentration of short-chain fatty acids (x, mmol/L) were derived. The standard lines are with linear sections between 25 - 1.65 mmol/L and with a correlation coefficient r2 > 0.9999.
Таблица 12. Диапазон на параметри, изследвани при деца от един до дванадесет месеца.Table 12. Range of parameters studied in children from one to twelve months.
В резултат на проведените анализи на тестуваните майчина кърма и фецес от новородено на възраст между един и дванадесет месеца се изчисляват следните коефициенти:As a result of the analyzes of the tested mother's breast milk and feces from a newborn between the ages of one and twelve months, the following coefficients are calculated:
1. Съотношение на количеството Бифидобактерии/Бактероиди1. Ratio of the quantity of Bifidobacteria/Bacteroides
2. Съотношението на количеството Бифидобактерии/Лактобацили2. The ratio of the amount of Bifidobacteria/Lactobacilli
3. Съотношението на количеството (Бифидобактерии+Лактобацили)/Бактероиди3. The ratio of the quantity (Bifidobacteria+Lactobacilli)/Bacteroides
4. Съотношението на количеството (Бифидобактерии+Лактобацили)/активност на бета-галактозидаза4. The ratio of the quantity (Bifidobacteria+Lactobacilli)/beta-galactosidase activity
5. Съотношението на количеството (Бифидобактерии+Лактобацили)/активност на алфа-фукозидаза5. The ratio of the amount of (Bifidobacteria+Lactobacilli)/alpha-fucosidase activity
6. Съотношението на ензимните активности бета-галактозидаза/алфа-фукозидаза6. The ratio of beta-galactosidase/alpha-fucosidase enzyme activities
7. Съотношението на ензимните активности бета-галактозидаза/протеаза7. The ratio of beta-galactosidase/protease enzyme activities
8. Съотношение на метаболитите млечнакиселина/оцетна киселина/маслена киселина8. Lactic acid/acetic acid/butyric acid metabolite ratio
Изчисленията се правят по посочената формула.Calculations are made according to the specified formula.
Таблица 13. Тенденции на съотношенията между отделните показатели, с червена стрелка се отбелязва положителен ефект върху микробиотата, а със синя отрицателен ефект върху микробиотата.Table 13. Trends of the ratios between the individual indicators, a red arrow indicates a positive effect on the microbiota, and a blue arrow indicates a negative effect on the microbiota.
................ _ 1-Бифидо 2-LAB З-Bacterotdes 4-Бифидо+МКБ................ _ 1-Bifido 2-LAB H-Bacterotdes 4-Bifido+MKB
1-Бифидо1-Bifido
2-LAB .......... ___________________2-LAB .......... ___________________
[3-Bacteroides 1ИЯИВНИ[3-Bacteroides 1IIIVNI
4-Бифидо+МКБ4-Bifido+MKB
5-B-galactosidase(5/1) ф ф (5/2) ф ф (5/4) ф б-А-fucosidase ф (6/1) ф Ф (5/1) ф ф (6/4) ф5-B-galactosidase(5/1) f f (5/2) f f (5/4) f b-A-fucosidase f (6/1) f f (5/1) f f (6/4) f
7-Метаболити7- Metabolites
5-B-galactosidase б-А-fucosidase 7-Метаболити5-B-galactosidase b-A-fucosidase 7-Metabolites
(5/7) Ψ (6/7) ф(5/7) Ψ (6/7) f
Литература:Literature:
1. Albesharat, R., Ehrmann, M.A., Korakli, M., Yazaji, S., Vogel, R.F., 2011. Phenotypic and genotypic analyses of lactic acid bacteria in local fermented food, breast milk and faeces of mothers and their babies. Systematic and Applied Microbiology 34, 148-155.1. Albesharat, R., Ehrmann, M.A., Korakli, M., Yazaji, S., Vogel, R.F., 2011. Phenotypic and genotypic analyzes of lactic acid bacteria in local fermented food, breast milk and faeces of mothers and their babies. Systematic and Applied Microbiology 34, 148-155.
2. Ballard, O., Morrow, A.L., 2013. Human milk composition: nutrients and bioactive factors. Pediatric Clinics of North America 60 (1), 49-74.2. Ballard, O., Morrow, A.L., 2013. Human milk composition: nutrients and bioactive factors. Pediatric Clinics of North America 60(1), 49-74.
3. Bartick, M., Reinhold, A., 2010. The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis. Pediatrics 125 (5), el048-el056.3. Bartick, M., Reinhold, A., 2010. The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis. Pediatrics 125 (5), el048-el056.
4. Bhutta, Z.A., Das, J.K., Walker, N., et al., 2013. Interventions to address deaths from childhood pneumonia and diarrhoea equitably: what works and at what cost? Lancet 381 (9875), 1417-1429.4. Bhutta, Z.A., Das, J.K., Walker, N., et al., 2013. Interventions to address deaths from childhood pneumonia and diarrhea equitably: what works and at what cost? Lancet 381 (9875), 1417-1429.
5. Bode, L., Jantscher-Krenn, E., 2012. Structure-function relationships of human milk oligosaccharides. Advances in Nutrition 3 (3), 383S-391S.5. Bode, L., Jantscher-Krenn, E., 2012. Structure-function relationships of human milk oligosaccharides. Advances in Nutrition 3 (3), 383S-391S.
6. Cabrera-Rubio, R., Collado, M.C., Laitinen, K., Salminen, S., Isolauri, E., Mira, A., 2012. The human milk microbiome changes over lactation and is shaped by maternal weight and mode of delivery. American Journal of Clinical Nutrition 96 (3), 544-551.6. Cabrera-Rubio, R., Collado, M.C., Laitinen, K., Salminen, S., Isolauri, E., Mira, A., 2012. The human milk microbiome changes over lactation and is shaped by maternal weight and mode of delivery. American Journal of Clinical Nutrition 96(3), 544-551.
7. Cephas, K.D., Kim, J., Mathai, R.A., Barry, K.A., Dowd, S.E., Meline, B.S., Swanson, K.S., 2011. Comparative analysis of salivary bacterial microbiome diversity in edentulous infants and their mothers or primary care givers using pyrosequencing. PLoS ONE 6, e23503.7. Cephas, K.D., Kim, J., Mathai, R.A., Barry, K.A., Dowd, S.E., Meline, B.S., Swanson, K.S., 2011. Comparative analysis of salivary bacterial microbiome diversity in edentulous infants and their mothers or primary care givers. using pyrosequencing. PLoS ONE 6, e23503.
8. Dieterich, C.M., Felice, J.P., O’Sullivan, E., Rasmussen, K.M., 2013. Breastfeeding and health outcomes for the mother-infant dyad. Pediatric Clinics of North America 60 (1), 3148.8. Dieterich, C.M., Felice, J.P., O'Sullivan, E., Rasmussen, K.M., 2013. Breastfeeding and health outcomes for the mother-infant dyad. Pediatric Clinics of North America 60 (1), 3148.
9. Jimenez, E., de Andres, J., Manrique, M., Pareja-Tobes, P, Tobes, R., Martinez-Blanch, J.F., Codoner, F.M., Ramon, D., Fernandez, L., Rodriguez, J.M., 2015. Metagenomic analysis of milk of healthy and mastitis-suffering women. Journal of Human Lactation 31, 406-415.9. Jimenez, E., de Andres, J., Manrique, M., Pareja-Tobes, P, Tobes, R., Martinez-Blanch, J.F., Codoner, F.M., Ramon, D., Fernandez, L., Rodriguez , J.M., 2015. Metagenomic analysis of milk of healthy and mastitis-suffering women. Journal of Human Lactation 31, 406-415.
10. Jimenez, E., de Andres, J., Manrique, M., Pareja-Tobes, P., Tobes, R., Martinez-Blanch, J.F., Codoner, F.M., Ramon, D., Fernandez, L., Rodriguez, J.M., 2015. Metagenomic analysis of milk of healthy and mastitis-suffering women. Journal of Human Lactation 31, 406-415.10. Jimenez, E., de Andres, J., Manrique, M., Pareja-Tobes, P., Tobes, R., Martinez-Blanch, J.F., Codoner, F.M., Ramon, D., Fernandez, L., Rodriguez, J.M., 2015. Metagenomic analysis of milk of healthy and mastitis-suffering women. Journal of Human Lactation 31, 406-415.
11. Johnson, P., Watkins, W., 1982. Separation of an alpha-3-L-fucosyltransferase from the blood-group-Legene-specified alpha-3/4-L-fucosyltransferase in human milk. Biochemical Society Transactions., 10:445—446.11. Johnson, P., Watkins, W., 1982. Separation of an alpha-3-L-fucosyltransferase from the blood-group-Legene-specified alpha-3/4-L-fucosyltransferase in human milk. Biochemical Society Transactions., 10:445—446.
12. Katayama, T., et al., 2004. Molecular cloning and characterization of Bifidobacterium bifidum 1,2-alpha-L-fucosidase (AfcA), a novel inverting glycosidase (glycoside hydrolase family 95). Journal of Bacteriology 186 (15), 4885-4893.12. Katayama, T., et al., 2004. Molecular cloning and characterization of Bifidobacterium bifidum 1,2-alpha-L-fucosidase (AfcA), a novel inverting glycosidase (glycoside hydrolase family 95). Journal of Bacteriology 186 (15), 4885-4893.
13. Kobata, A., 2010. Structures and application of oligosaccharides in human milk. Proceedings of Japan Academy, Series B, Physical and Biological Sciences 86, 1-17.13. Kobata, A., 2010. Structures and application of oligosaccharides in human milk. Proceedings of the Japanese Academy, Series B, Physical and Biological Sciences 86, 1-17.
14. Koenig, J.E., et al., 2011. Succession of microbial consortia in the developing infant gut microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108 (Suppl. 1), 4578^1585.14. Koenig, J.E., et al., 2011. Succession of microbial consortia in the developing infant gut microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108 (Suppl. 1), 4578^1585.
15. Kramer, M.S., Matush, L., Bogdanovich, N., et al., 2009. Health and development outcomes in 6.5-y-old children breastfed exclusively for 3 or 6 mo. The American Journal of Clinical Nutrition 90 (4), 1070-1074.15. Kramer, M.S., Matush, L., Bogdanovich, N., et al., 2009. Health and development outcomes in 6.5-y-old children breastfed exclusively for 3 or 6 mo. The American Journal of Clinical Nutrition 90 (4), 1070-1074.
16. Law, V., Scow, W.K., Townsend, G., 2007. Factors influencing oral colonization of mutans streptococci in young children. Australian Dental Journal 52, 93-100.16. Law, V., Scow, W.K., Townsend, G., 2007. Factors influencing oral colonization of mutans streptococci in young children. Australian Dental Journal 52, 93-100.
17. LoCascio, R.G., et aL, 2009. A versatile and scalable strategy for glycoprofiling bifidobacterial consumption of human milk oligosaccharides. Microbial Biotechnology 2 (3), 333-342.17. LoCascio, R.G., et aL, 2009. A versatile and scalable strategy for glycoprofiling bifidobacterial consumption of human milk oligosaccharides. Microbial Biotechnology 2 (3), 333-342.
18. Macfarlane, G.T., Cummings, J.H., 1999. Probiotics and prebiotics: can regulating the activities of intestinal bacteria benefit health? BMJ 318 (7189), 999-1003.18. Macfarlane, G.T., Cummings, J.H., 1999. Probiotics and prebiotics: can regulating the activities of intestinal bacteria benefit health? BMJ 318(7189), 999-1003.
19. Martin, R., Langa, S., Reviriego, C., Jiminez, E., Marin, M.L., Xaus, J., Fernandez, L., Rodriguez, J.M., 2012. Human milk is a source of lactic acid bacteria for the infant gut. Journal of Pediatrics 143, 754-758.19. Martin, R., Langa, S., Reviriego, C., Jiminez, E., Marin, M.L., Xaus, J., Fernandez, L., Rodriguez, J.M., 2012. Human milk is a source of lactic acid bacteria for the infant gut. Journal of Pediatrics 143, 754-758.
20. McGuire, M.K., McGuire, M.A., 2015. Human milk: mother nature’s prototypical probiotic food? Advances in Nutrition 6, 112-123.20. McGuire, M.K., McGuire, M.A., 2015. Human milk: mother nature’s prototypical probiotic food? Advances in Nutrition 6, 112-123.
21. Moro, G., et al., 2006. A mixture of prebiotic oligosaccharides reduces the incidence of atopic dermatitis during the first six months of age. Archives of Disease in Childhood 91 (10), 814-819.21. Moro, G., et al., 2006. A mixture of prebiotic oligosaccharides reduces the incidence of atopic dermatitis during the first six months of age. Archives of Disease in Childhood 91 (10), 814-819.
22. Nagae, M., et al., 2007. Structural basis of the catalytic reaction mechanism of novel 1,2alpha-L-fucosidase from Bifidobacterium bifidum . Journal of Biological Chemistry 282 (25), 18497-18509.22. Nagae, M., et al., 2007. Structural basis of the catalytic reaction mechanism of novel 1,2alpha-L-fucosidase from Bifidobacterium bifidum. Journal of Biological Chemistry 282 (25), 18497-18509.
23. Nasidze, 1., Li, J., Quinque, D., Tang, K., Stoneking, M., 2009. Global diversity in the human salivary microbiome. Genome Research 19, 636-643.23. Nasidze, 1., Li, J., Quinque, D., Tang, K., Stoneking, M., 2009. Global diversity in the human salivary microbiome. Genome Research 19, 636-643.
24. Newburg, D.S., Naubauer, S.H., 1995. Carbohydrates in milks: analysis, quantities and significance. In: Jensen, R.G. (Ed.), Handbook of Milk Composition. Academic Press, San Diego, pp. 273-349.24. Newburg, D.S., Naubauer, S.H., 1995. Carbohydrates in milks: analysis, quantities and significance. In: Jensen, R.G. (Ed.), Handbook of Milk Composition. Academic Press, San Diego, pp. 273-349.
25. Palmer, C., et al., 2007. Development of the human infant intestinal microbiota. PLoS Biology 5 (7), el77.25. Palmer, C., et al., 2007. Development of the human infant intestinal microbiota. PLoS Biology 5 (7), el77.
26. Urashima, T., Fujita, S., Fukuda, K., Nakamura, T., Saito, T., Cowan, P., Messer, M., 2012. Chemical characterization of milk oligosaccharides of the common brushtail possum (Trichosurus vulpecula). Glycoconjugate Journal 31, 387-399.26. Urashima, T., Fujita, S., Fukuda, K., Nakamura, T., Saito, T., Cowan, P., Messer, M., 2012. Chemical characterization of milk oligosaccharides of the common brushtail possum ( Trichosurus vulpecula). Glycoconjugate Journal 31, 387-399.
27. Urashima, T., Messer, M., Oftedal, O.T., 2011. Comparative biochemistry and evolution of milk oligosaccharides of monotremes, marsupials, and eutherians. In: Pontarotti, P. (Ed.), Evolutionary Biology: Genome Evolution, Speciation, Coevolution and Origin of Life. Springer, Switzerland, pp. 1-33.27. Urashima, T., Messer, M., Oftedal, O.T., 2011. Comparative biochemistry and evolution of milk oligosaccharides of monotremes, marsupials, and eutherians. In: Pontarotti, P. (Ed.), Evolutionary Biology: Genome Evolution, Speciation, Coevolution and Origin of Life. Springer, Switzerland, pp. 1-33.
28. Wada, J., et al., 2007. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the galacto-N-biose-/lacto-N-biose I-binding protein (GL-BP) of the ABC transporter from Bifidobacterium longum JCM1217. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization 63 (Pt 9), 751-753.28. Wada, J., et al., 2007. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the galacto-N-biose-/lacto-N-biose I-binding protein (GL-BP) of the ABC transporter from Bifidobacterium longum JCM1217. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization 63 (Pt 9), 751-753.
29. Wall, R., Ross, R. P., Shanahan, F., O ’ Mahony, L., O ’ Mahony, C., Coakley, M., et al., 2009. Metabolic activity of the enteric microbiota in fl uences the fatty acid composition of murine and porcine liver and adipose tissues. The American Journal of Clinical Nutrition, 89, 1393- 1401.29. Wall, R., Ross, R. P., Shanahan, F., O' Mahony, L., O' Mahony, C., Coakley, M., et al., 2009. Metabolic activity of the enteric microbiota in influenza the fatty acid composition of murine and porcine liver and adipose tissues. The American Journal of Clinical Nutrition, 89, 1393-1401.
30. Ward, T.L., Hosid, S., loshikhes, 1., Altosaar, I., 2013. Human milk metagenome: a functional capacity analysis. BMC Microbiology 13, 116.30. Ward, T.L., Hosid, S., loshikhes, 1., Altosaar, I., 2013. Human milk metagenome: a functional capacity analysis. BMC Microbiology 13, 116.
31. Yang, F., Zeng, X., Ning, K., Liu, K.L., Lo, C.C., Wang, W., Chen, J., Wang, D., Huang, R., Chang, X., Chain, P.S., Xie, G., Ling, J., Xu, J., 2012. Saliva microbiomes distinguish caries-active from healthy human populations. ISME Journal 6, 1-10.31. Yang, F., Zeng, X., Ning, K., Liu, K.L., Lo, C.C., Wang, W., Chen, J., Wang, D., Huang, R., Chang, X., Chain, P.S., Xie, G., Ling, J., Xu, J., 2012. Saliva microbiomes distinguish caries-active from healthy human populations. ISME Journal 6, 1-10.
32. Zaura, E., Nicu, E.A., Krom, B.P., Keijser, B.J., 2014. Acquiring and maintaining a normal oral microbiome: current perspective. Frontiers in Cell Infection and Microbiology 24, 85.32. Zaura, E., Nicu, E.A., Krom, B.P., Keijser, B.J., 2014. Acquiring and maintaining a normal oral microbiome: current perspective. Frontiers in Cell Infection and Microbiology 24, 85.
33. Newburg, D.S., Naubauer, S.H., 2005. Carbohydrates in milks: analysis, quantities and significance. In: Jensen, R.G. (Ed.), Handbook of Milk Composition. Academic Press, San Diego, pp. 273-349.33. Newburg, D.S., Naubauer, S.H., 2005. Carbohydrates in milks: analysis, quantities and significance. In: Jensen, R.G. (Ed.), Handbook of Milk Composition. Academic Press, San Diego, pp. 273-349.
34. Wada, J., et al., 2008. Bifidobacterium bifidum lacto-N-biosidase, a critical enzyme for the degradation of human milk oligosaccharides with a type 1 structure. Applied and Environmental Microbiology 74 (13), 3996^1004.34. Wada, J., et al., 2008. Bifidobacterium bifidum lacto-N-biosidase, a critical enzyme for the degradation of human milk oligosaccharides with a type 1 structure. Applied and Environmental Microbiology 74 (13), 3996^1004.
35. Suzuki, R., et al., 2008. Structural and thermodynamic analyses of solute-binding protein from Bifidobacterium longum specific for core 1 disaccharide and lacto-N-biose I. Journal of Biological Chemistry 283 (19), 13165-13173.35. Suzuki, R., et al., 2008. Structural and thermodynamic analyzes of solute-binding protein from Bifidobacterium longum specific for core 1 disaccharide and lacto-N-biose I. Journal of Biological Chemistry 283 (19), 13165-13173 .
36. Fujita, K., et al., 2005. Identification and molecular cloning of a novel glycoside hydrolase family of core 1 type O-glycan-specific endo-alpha-N-acetylgalactosaminidase from Bifidobacterium longum . Journal of Biological Chemistry 280 (45), 37415-37422.36. Fujita, K., et al., 2005. Identification and molecular cloning of a novel glycoside hydrolase family of core 1 type O-glycan-specific endo-alpha-N-acetylgalactosaminidase from Bifidobacterium longum. Journal of Biological Chemistry 280 (45), 37415-37422.
37. Ruas-Madiedo, P., et al., 2008. Mucin degradation by Bifidobacterium strains isolated from the human intestinal microbiota. Applied and Environmental Microbiology 74 (6), 1936-1940.37. Ruas-Madiedo, P., et al., 2008. Mucin degradation by Bifidobacterium strains isolated from the human intestinal microbiota. Applied and Environmental Microbiology 74 (6), 1936-1940.
38. Cabrera-Rubio, R., Collado, M.C., Laitinen, K., Salminen, S., Isolauri, E., Mira, A., 2012. The human milk microbiome changes over lactation and is shaped by maternal weight and mode of delivery. American Journal of Clinical Nutrition 96 (3), 544-551.38. Cabrera-Rubio, R., Collado, M.C., Laitinen, K., Salminen, S., Isolauri, E., Mira, A., 2012. The human milk microbiome changes over lactation and is shaped by maternal weight and mode of delivery. American Journal of Clinical Nutrition 96(3), 544-551.
39. Fernandez, L., Langa, S., Martin, V., Maldonado, A., Jimenez, E., Martin, R., Rodriguez, J.M., 2013. The human milk microbiota: origin and potential roles in health and disease. Pharmacological Research 69, 1-10.39. Fernandez, L., Langa, S., Martin, V., Maldonado, A., Jimenez, E., Martin, R., Rodriguez, J.M., 2013. The human milk microbiota: origin and potential roles in health and disease. Pharmacological Research 69, 1-10.
40. Jost, T., Lacroix, C., Braegger, C., Rochat, F., Chassard, C., 2014. Vertical mother-neonate transfer of maternal gut bacteria via breastfeeding. Environmental Microbiology 16 (9), 2891-2904.40. Jost, T., Lacroix, C., Braegger, C., Rochat, F., Chassard, C., 2014. Vertical mother-neonate transfer of maternal gut bacteria via breastfeeding. Environmental Microbiology 16 (9), 2891-2904.
41. Ward, T.L., Hosid, S., loshikhes, I., Altosaar, I., 2013. Human milk metagenome: a functional capacity analysis. BMC Microbiology 13, 116.41. Ward, T.L., Hosid, S., loshikhes, I., Altosaar, I., 2013. Human milk metagenome: a functional capacity analysis. BMC Microbiology 13, 116.
Claims (6)
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
BG113148A BG67567B1 (en) | 2020-05-27 | 2020-05-27 | Quantitative assessment method for rapid prediction and control of dysbiosis in breast-fed newborns aged one month to one year |
PCT/BG2020/050001 WO2021237312A1 (en) | 2020-05-27 | 2020-05-28 | Method for quantitative evaluation (mqe both for rapid prognosis of disbiosis in infants -up to 1 year of age(mqe/rpdi-1y), and for multi-factural diseases (mqe/mfd) |
EP20742153.8A EP4162081A1 (en) | 2020-05-27 | 2020-05-28 | Method for quantitative evaluation (mqe both for rapid prognosis of disbiosis in infants -up to 1 year of age(mqe/rpdi-1y), and for multi-factural diseases (mqe/mfd) |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
BG113148A BG67567B1 (en) | 2020-05-27 | 2020-05-27 | Quantitative assessment method for rapid prediction and control of dysbiosis in breast-fed newborns aged one month to one year |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
BG113148A true BG113148A (en) | 2021-12-15 |
BG67567B1 BG67567B1 (en) | 2023-09-15 |
Family
ID=71661600
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
BG113148A BG67567B1 (en) | 2020-05-27 | 2020-05-27 | Quantitative assessment method for rapid prediction and control of dysbiosis in breast-fed newborns aged one month to one year |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP4162081A1 (en) |
BG (1) | BG67567B1 (en) |
WO (1) | WO2021237312A1 (en) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IT202200008705A1 (en) * | 2022-04-29 | 2023-10-29 | Wellmicro S R L | METHOD FOR DETERMINING A METABOLIC FUNCTION OF A BACTERIAL POPULATION AND APPARATUS FOR CARRYING OUT SAID METHOD |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20160243138A1 (en) * | 2014-10-29 | 2016-08-25 | Glycom A/S | Composition comprising HMSs/HMOs and use thereof |
CA3029631A1 (en) * | 2016-07-01 | 2018-01-04 | Evolve Biosystems, Inc. | Method for facilitating maturation of the mammalian immune system |
CA3046207A1 (en) * | 2016-12-06 | 2018-06-14 | Kaleido Biosciences, Inc. | Glycan polymers and related methods thereof |
WO2019118510A1 (en) * | 2017-12-11 | 2019-06-20 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Defined therapeutic microbiota and methods of use thereof |
-
2020
- 2020-05-27 BG BG113148A patent/BG67567B1/en unknown
- 2020-05-28 WO PCT/BG2020/050001 patent/WO2021237312A1/en unknown
- 2020-05-28 EP EP20742153.8A patent/EP4162081A1/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP4162081A1 (en) | 2023-04-12 |
WO2021237312A1 (en) | 2021-12-02 |
BG67567B1 (en) | 2023-09-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Rigsbee et al. | Quantitative profiling of gut microbiota of children with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome | |
Milani et al. | The first microbial colonizers of the human gut: composition, activities, and health implications of the infant gut microbiota | |
Moles et al. | Bacterial diversity in meconium of preterm neonates and evolution of their fecal microbiota during the first month of life | |
Ignacio et al. | Correlation between body mass index and faecal microbiota from children | |
Cecchini et al. | Functional metagenomics reveals novel pathways of prebiotic breakdown by human gut bacteria | |
US9669059B2 (en) | Butyrogenic bacteria as probiotics to treat clostridium difficile | |
Penders et al. | Establishment of the intestinal microbiota and its role for atopic dermatitis in early childhood | |
Pärtty et al. | Compositional development of Bifidobacterium and Lactobacillus microbiota is linked with crying and fussing in early infancy | |
Bridgman et al. | Gut microbiota and allergic disease in children | |
Koga et al. | Age-associated effect of kestose on Faecalibacterium prausnitzii and symptoms in the atopic dermatitis infants | |
Liu et al. | Starch and starch hydrolysates are favorable carbon sources for Bifidobacteria in the human gut | |
US20150104423A1 (en) | Use of blood group status iii | |
EP2598155A2 (en) | Use of blood group status iii | |
Qi et al. | Lactation-dependent vertical transmission of natural probiotics from the mother to the infant gut through breast milk | |
Korpela et al. | Microbiome of the first stool after birth and infantile colic | |
Sirilun et al. | Impact of maternal bifidobacteria and the mode of delivery on Bifidobacterium microbiota in infants | |
Kok et al. | An in vitro enrichment strategy for formulating synergistic synbiotics | |
Mroczynska et al. | Beta-glucuronidase and beta-glucosidase activity of Lactobacillus and Enterococcus isolated from human feces | |
Rubio-del-Campo et al. | Human milk and mucosa-associated disaccharides impact on cultured infant fecal microbiota | |
Gold et al. | Effects of an amino acid-based formula supplemented with two human milk oligosaccharides on growth, tolerability, safety, and gut microbiome in infants with cow’s milk protein allergy | |
Song et al. | An investigation into the correlation of intestinal flora with obesity and gestational diabetes mellitus | |
Selma-Royo et al. | Human milk microbiota: what did we learn in the last 20 years? | |
BG113148A (en) | Quantitative assessment method for quick prognosis and control of dysbiosis of the gastrointestinal tract in infants aged up to one year and for multifactorial diseases | |
Hiraku et al. | Early probiotic supplementation of healthy term infants with bifidobacterium longum subsp. infantis M-63 is safe and leads to the development of bifidobacterium-predominant gut microbiota: a double-blind, placebo-controlled trial | |
Fijan et al. | Probiotic microorganisms and their benefit to human health |