BG113148A - Метод за количествена оценка за бързо прогнозиране и контрол на дисбиози на стомашно-чревния тракт при кърмачета на възраст до една година и за многофакторни заболявания - Google Patents

Метод за количествена оценка за бързо прогнозиране и контрол на дисбиози на стомашно-чревния тракт при кърмачета на възраст до една година и за многофакторни заболявания Download PDF

Info

Publication number
BG113148A
BG113148A BG113148A BG11314820A BG113148A BG 113148 A BG113148 A BG 113148A BG 113148 A BG113148 A BG 113148A BG 11314820 A BG11314820 A BG 11314820A BG 113148 A BG113148 A BG 113148A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
correlation
galactosidase
amount
bifidobacteria
beta
Prior art date
Application number
BG113148A
Other languages
English (en)
Other versions
BG67567B1 (bg
Inventor
Илия ИЛИЕВ
Николов Илиев Илия
Деян Прокопов
Крумов Прокопов Деян
Вълко Калинкин
Иванов Калинкин Вълко
Тонка Василева
Атанасова Василева Тонка
Веселин Биволарски
Петров Биволарски Веселин
Мариана Николова
Манолова Николова Мариана
Даниела Моллова
Георгиева Моллова Даниела
Original Assignee
Гама Консулт-Калинкин, Прокопов И С-Ие Сд
Гама Консулт-Калинкин
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Гама Консулт-Калинкин, Прокопов И С-Ие Сд, Гама Консулт-Калинкин filed Critical Гама Консулт-Калинкин, Прокопов И С-Ие Сд
Priority to BG113148A priority Critical patent/BG67567B1/bg
Priority to PCT/BG2020/050001 priority patent/WO2021237312A1/en
Priority to EP20742153.8A priority patent/EP4162081A1/en
Publication of BG113148A publication Critical patent/BG113148A/bg
Publication of BG67567B1 publication Critical patent/BG67567B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/10—Enterobacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2570/00—Omics, e.g. proteomics, glycomics or lipidomics; Methods of analysis focusing on the entire complement of classes of biological molecules or subsets thereof, i.e. focusing on proteomes, glycomes or lipidomes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/06—Gastro-intestinal diseases

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до метод за ин витро оценка и прогноза за балансиране на чревната микробиота при новородени от един месец до една година, основаващ се на интегриран подход с изчисляване на коефициенти на корелация между ключови показатели, разделени на три основни групи: 1. Корелация между състав и количество на микроорганизмите в майчина кърма и във фецес на детето; 2. Корелация между ензимен профил и активност на ензимите, отговорни за усвояването и метаболизирането на компонентите на кърмата (лактоза, липиди, олигозахариди, протеини) в проби от кърма и фецес на детето; 3. Корелация между количеството на метаболитите, получени от метаболизирането на основните компоненти на кърмата от микробиотата в кърмата и във фецеса на детето. Методът съгласно изобретението осигурява възможност за бързо прогнозиране на дисбиози при кърмачета до една година. По този начин той ще намери приложение в алгоритъма при прецизна диагностика на чревната микробиота при новородени на възраст от един месец до една година, като методът спомага и за бързо последващо установяване на вида на дисбиозата и степента на нарушение.

Description

МЕТОД ЗА КОЛИЧЕСТВЕНА ОЦЕНКА ЗА БЪРЗО ПРОГНОЗИРАНЕ И КОНТРОЛ НА ДИСБИОЗИ НА СТОМАШНО-ЧРЕВНИЯ ТРАКТ ПРИ КЪРМАЧЕТА НА
ВЪЗРАСТ ДО ЕДНА ГОДИНА И ЗА МНОГОФАКТОРНИ ЗАБОЛЯВАНИЯ
I. ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА
Настоящото изобретение се отнася до областта на медицинската диагностика, фармацията, биотехнологиите.
II. ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА
Съществуват различни данни, че кърменето осигурява значителна защита срещу инфекциозни и възпалителни заболявания, различни увреждания и подобрява познавателните способности (Bartick and Reinhold, 2010; Dieterich et al., 2013; Kramer et aL, 2009). Това до голяма степен се дължи на свойствата на кърмата и съдържащите се в нея олигозахариди да повлияват микробиалното колонизиране при новородените. Palmer et al. (2007) показват, че бебетата се колонизират с приблизително 107 различни вида микроорганизми през първата седмица от живота. Тези тесни взаимоотношения на организма с гастроинтестиналната микрофлора може да са в основата и да бъдат критични по отношение на здравето на новороденото, както и с риска от развитие на различни други неинфекциозни заболявания. Оптималното кърмене всъщност остава високо ефективна стратегия за общественото здраве за оцеляване на бебетата, особено за намаляване на смъртността поради гастроентерит и пневмония в развиващите се страни (Bhutta et al., 2013). Изследванията на кърменето показват защитната роля на кърмата срещу много хронични и имунни състояния, по-специално, диабет тип 1, некротизиращ ентероколит, астма и левкемия (Bartick and Reinhold, 2010).
Развитието на микробиотата в храносмилателната система на новороденото е постепенен и динамичен процес, който се определя от няколко фактора, като например начин на раждане, недоносеност, вида на хранене, свързани заболявания и антибиотичната терапия, както и от влиянието на околната среда, което налага персонализиран подход (Wall et al. 2009). Освен това процесът на колонизацията е силно повлиян от диетата ( кърмата и /или изкуственото мляко). По време на първия месец след раждането бифидобактериите и колиформите ( ш частност Е. coli) са преобладаващи, последвани от Lactobacillus spp. и Bacteroides и се различава в широки граници между отделните индивиди (Wall et al., 2009). Промени в съотношението на доминиращите представители на чревната микрофлора на новородените се появяват след около една година от живота, главно в резултат на въвеждане на нова храна в диетата на бебето. Броят на представителите на Lactobacillus spp., Bacteroides spp. и Clostridia се увеличава, докато бифиброидите и Е. coli намаляват. Най-накрая на възраст от около 2 години, микробните съобщества в червата достигат по състав, подобен на този открит в червата на възрастните (Koenig et al. 2011). Видът Bifidobacterium longum е найчестият първоначален колонизатор на гастроинтестиналният тракт на новородените (Palmer et al., 2007).
Човешкото мляко притежава множество механизми за защита на новородените: клетки на имунният отговор, имуноглобулини, вродени защитни протеини, пептиди, свободни мастни киселини, цитокини и хемокини, гликани и олигозахариди (Ballard and Morrow, 2013). Сред различните биоактивни компоненти на човешкото мляко, олигозахаридите са найразпространените и включват значително повече от 100 различни биоактивни въглехидрата, изградени от 3 до 32 монозахарида (Newburg et al., 2005). Като клас олигозахаридите са 6-12 g / L от кърмата и до голяма степен се синтезират от лактоза (Bode, 2012). Човешката коластра съдържа приблизително 22-24 g/L млечни олигозахариди (Newburg et al., 1995; Urashima et al., 2012). В човешкото мляко олигозахаридите са третият по концентрация компонент след лактозата и липидите и тяхното количество е доста по - високо от количеството на протеините (Newburg et al., 1995). Структурата на повече от 100 човешки олигозахарида е характеризирана до момента (Urashima et al., 201 la,b; Kobata, 2010). Характеризирането на физиологията бифидо бактериите е фокусирано в голяма степен върху способността им да метаболизират различни хранителни олигозахариди. Този род бактерии разполагат с набор от трансмембранни пермеази, осигуряващи метаболизирането на различни въглехидратни полимери, като хранителни фибри, включително човешки млечни олигозахариди, които преминават неразградени до дисталните отдели на храносмилателният тракт (Moro et aL, 2006; Macfarlane and Cummings, 1999). Съществуват данни само за няколко вида бифидобактерии, способни да метаболизират и използват като въглероден източник човешки млечни олигозахариди. Такива видове типично са изолирани предимно от микрофлората на гастоинтестиналният тракт на новородени. Установено е, че асоциирани с новороденото бифидобактерии са способни да усвояват предимно лакто -N- тетраози (LNT; Gal β l-3GlcNAc β 1-3 Gal β l-4Glc) или лакто-N-неотетраози (LNnT; Gal β l-4GlcNAc β 1-3 Gal β l-4Glc) (LoCascio et al., 2007).
B. bifidum секретира извънклетъчна 1,2-а-1-фукозидаза (EC 3.2.1.63), която разцепва крайни 1,2-а-фукозилови връзки, които защитават галактозните остатъци в лакто-И-биоза, като по този начин позволяват продължаване на катаболитните процеси до пълното им усвояване (Katayama et al., 2004; Nagae et al., 2007). В допълнение, лакто-№биозидаза (ЕСЗ.2.1.140) освобождава лакто^-биоза от лакто-М-тетраоза и от други млечни олигозахариди, в които липсва фукозилиране или сиалиране (Wada et al., 2008). Веднъж възраст се свързват с по-късно развитие на атопичен хрип. Например наблюдавана е дисбиоза при Еквадорските бебета, включващи различни бактериални таксони, включително и няколко таксона микроскопични гъбички. Нивата на фекалните късоверижни мастни киселини при тримесечни бебета с атопичен хрип показват ясни тенденции на увеличена концентрация на ацетат и намалена концентрация на капронова киселина.
Някои от защитните механизми на човешкото мляко се дължат на олигозахаридите. Като се има предвид нарастващата степен на заболявания, свързани с нерегулираната микробиота и имунитет на гостоприемника, налице е глобален интерес за тестване на нови хранителни подходи и функционални храни, съответстващи на тези, открити в кърмата, за да се оптимизира здравето на гостоприемника и да се възстанови бактериалната флора. Описаните дотук данни от литературата доказват, че използваните модели на изследване както за диагностични цели, така и за контрол на микробиотата при деца на възраст до една година не могат да предоставят алгоритъм за бърза и надежна оценка състоянието на чревната микробиота и асоциирането й с различни заболчвания, защото са линейни, отнесени само за един показател.
Създаването на метод за количествена оценка за бързо прогнозиране на дисбиози при кърмачета до 1 година и за мултифакторни заболявания за изследване на отклонения в човешката микробиота изисква интердисциплинарен подход и при крайната оценка може да включва данните от различни методи на изследване, които се обработват като бази данни със специфични изчислителни техники.
Ш. ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Задачата на изобретението е да създаде метод за на база ин витро количествена оценка за който осигурява възможност за бързо прогнозиране на дисбиози при кърмачета до 1 година, който може да намери приложение в създаване на модел (алгоритъм) за прецизна диагностика на чревната микробиота при новородени на възраст от един месец до една година като методът спомага и бързо последващо установяване на вида на дисбиозата и степента на нарушение. Методът се базира на интердисциплинарен подход при анализ на количествения и качествен състав на микробиота, вида и количеството на ключови ензими и метаболити и анализ на данните посредством информационна система.
През последните няколко години проучвания са разкрили, че и коластрата и кърмата от здрави жени съдържа бактерии, включително стафилококи, стрептококи, коринебактерии, млечнокисели бактерии, пропионобактерии и бифидобактерии (Fernandez et al., 2013). Напоследък прилагането на различни техники, включително и метагеномни подходи, потвърди присъствието на ДНК от тези и други бактериални родове в кърмата и коластрата (Hunt et al., 2011; Cabrera-Rubio et al., 2012; Fernandez et al., 2013; Jost et al., 2013, 2014; Ward et al., 2013; Jimenez et al.,2015). Следователно, тези биологични течности са непрекъснати източници на живи бактерии към стомашно-чревния тракт (McGuire and McGuire, 2015) Други проучванията показват, че има трансфер на бактериални щамове от майка към бебето в процеса на кърмене (Albesharat et aL, 2011; Martin et al., 2012; Jost et al., 2014). Въпреки някои установени корелации на количеството и състава на чревната микробиота е детекция на определени заболявания, използваните молекулярно-биологични методи са продължителни и скъпи за ежедневната практика, което ги прави недостъпни за масова употреба. Няма установени корелационни зависимости с данните за ключови ензими и метаболити, отговорни за усвояването на специфични компоненти от коластрата и кърмата и динамиката на концентрацията им при промяна на диетата и за преодоляване на чревни дисбиози.
Някои бактерии от устната кухина на бебето могат да замърсят млякото по време на сучене поради поток на мляко обратно в млечните канали (Ramsey et al., 2004). Установено е, че в рамките на 24 часа след раждането коластрата съдържа типични устни бактерии като Veillonella, Leptotrichia и Prevotella (Cabrera-Rubio et al., 2012). Въпреки, че произходът на човешкия слюнчен микробиом все още е доста не добре проучен (Zaura et al., 2014), Streptococcus spp. изглежда е един от доминиращите видове както при възрастни (Nasidze et al., 2009; Yang et aL, 2012) така и при бебета (Bearfield et al., 2002; Cephas et al., 2011). Стрептококите също са сред доминиращите видове в човешката коластра и кърма (Jimenez et al., 2008а, b; Hunt et aL, 2011; Martin et aL, 2015). Доказано е че устното здраве на майката корелира тясно с вероятността за развитие на зъбен кариес при детето (Zaura et aL, 2014). Някои съединения в човешкото мляко (например, човешки млечни олигозахариди, протеини) могат да повлияят колонизацията на отделни видове индиректно. Например, открити са млечни протеини, като казеини и лактоферин, които имат способност да инхибират прикрепването на кариогенни стрептококи към хидроксиапатит и да насърчават прикрепването на коменсални бактерии in vitro (Johansson и Lif Holgerson, 2011). Няма проведени достатъчно мащабни и за продължително време проучвания, характеризиращи развитието на оралната микрофлора по време на неонаталният период и детството. В първоначални проучвания се е смятало, че оралната колонизация от бактерии, причиняващи зъбен кариес може да се случи след поникване на първите млечни зъби при новороденото, като по-късно обаче е доказано, че кариогенният Streptococcus mutans може да присъства в устната кухина на бебето преди появата на твърди тъкани там (Law et aL, 2007).
Епидемиологичните изследвания разкриват редица експозиции в околната среда, свързани с астма. Това би могло да обясни ескалацията на астмата през последните 30 години.
Бебетата, изложени на риск от астма, проявяват преходни сътояния на чревна дисбиоза и промени в метаболома (например уробилиноген) през първите 3 месеца от живота. Тези метаболитите или разликите в микробиомите се използват при проектирането на предварително за използване на пробиотици или да послужат като прогностични биомаркери. Разработен е модел чрез комбиниране оценки на производителността на екосистемите и генерирането на екосистемни услуги за дефиницията на дисбиоза при кърмачета. Според него микробиома на червата се характеризира с (1) без смущения в състава и количествата на таксоните при промяна на диетата или приема на антибиотици; (2) висока податливост на инвазия от външни таксони; и (3) слабо използване на наличните ресурси (в т.ч. олигозахариди от кърма). Здравословното/балансираното състояние на микробиотата се характеризира като високо функционираща екосистема, когато микробиома на червата е: (1) стабилен във времето по състав и количество на таксоните, (2) устойчив на инвазия от алохтонни бактерии; и (3) да демонстрира висока конверсия на олигозахаридите на кърмата в крайни продукти и биомаса от полза за бебетата. Този модел е агностичен по метод и индекс на избор и осигурява количествен показател и обективен подход за оценка микробиома, но е ограничен основно в данни за състава и количеството на микроорганизмите и не се базира на корелационни зависимости между състав и количество на микроорганизмите, активност на ензимите, отговорни за усвояването на олигозахаридите от кърмата и количеството на метаболитите, секретирани от микробиотата.
Настоящата заявка за патент се отнася до разработването на специфичен метод за ин витро количествена оценка за бързо прогнозиране на дисбиози при кърмачета до 1 година при което се постига възможност за контрол на човешкия микробиом, като при метода, съгласно описанието се отчитат от една страна общи показатели като възраст и пол, а от друга специфичните показатели за здравословното състояние на човека. Предлагания метод е основан на обработването на данни от анализи на разнообразието и съотношението на микроорганизмите в интестиналния тракт и други телесни течности (слюнка, кърма, фецес), количество на метаболити, използвани като биомаркери и отчитане на нивото на ензимна активност на ензими, използвани като биомаркери, като се позволява отчитане на индивидуалните особености на хората.
Методът, предмет на настоящата заявка за патент се основава на интегриран подход за ин витро анализ на баланса на чревната микробиота при деца от един до дванадесет месеца и прогноза за нейното възстановяване при установена дисбиоза посредством изчисляване на коефициенти на корелация между ключови показатели, разделени на три основни групи:
1. Корелация между състав и количество на микроорганизмите в майчина кърма и във фецес на детето;
2. Корелация между ензимен профил и активност на ензимите, отговорни за усвояването и метаболизирането на компонентите на кърмата (лактоза, липиди, олигозахариди, протеини) в проби от кърма и фецес на детето;
3. Корелация между количеството на метаболитите, получени от метаболизирането на основните компоненти на кърмата от микробиотата в кърмата и във фецеса на детето.
Методът за ин витро количествена оценка за бързо прогнозиране на дисбиози при кърмачета до една година и за мултифакторни заболявания изисква следния ход на анализа:
1. Протокол за количествен анализ на човешка микробиота чрез в реално времев реално време qPCR. Представеният протокол може да се прилага за установяване на отклонения за анализ на дисбиоза при новородени от един до дванадесет месеца и да бъде включен към алгоритъм за идентифициране на състояние, отклонения и правила за възстановяване баланса на микробиотата. Чрез него ще могат да се определят количествено различни групи микроорганизми от полезната и патогенната микрофлора, които да се използват за изчисляване на съотношенията между отделните видове(таблица 1). От съществено значение за определяне степента на дисбиоза представляват съотношенията бифидобактерии/ бактероиди; лактобацили/бактероиди; (бифидобактерии +лактобацили)/бактероиди; (бифидо-бактерии+лактобацили)/дрожди; (бифидобактерии+лактобацили)/Е. coli. Друг важен показател е съотношението между бифидобактериите и основните ензими, отговорни за усвояването на основните компоненти на кърмата (лактоза, липиди, протеини, олигозахариди).
Стойностите на отделните съотношения варират в зависимост от възрастта, здравословното състояние и диетата. Диапазонът на съотношенията при здрави индивиди е представен в таблица 6.
Таблица 1. Модел на съпоставяне на данните от изследваните 12 показатели.
2. Анализ на ензими в проби от майчина кърма и фецес от деца от един до дванадесет месеца, които са отговорни за метаболизирането на основните компоненти на кърмата (лактоза, олигозахариди, липиди, протеини - β-галактозидаза, α-галактозидаза, аглюкозидаза, β-глюкозидаза, α-фукозидаза, липаза, протеаза. За целите на метода се изчисляват съотношенията между отделните ензими, което дава информация за типа на метаболитните процеси, които се осъществяват, а от друга страна дават информация за капацитета на полезната микрофлора за поддържане баланса на чревната микрофлора. Ензимът α-фукозидаза дава пряка информация за потенциала на адхезия на полезната микрофлора (бифидобактерии и лактобацили) върху епителните клетки на чревната лигавица, докато останалите ензими дават информация за скоростта на размножаване на полезните микроорганизми и мястото им е тази специфична екологична ниша. Данните за количеството на ензимите корелират с данните за количеството метаболити, установени в съответните проби. Диапазонът на съотношенията на стойностите на ензимните активност е описан в таблица 6.
3. Анализ на количеството късоверижни мастни киселини в проби от кърма и фецес на бебета от един до дванадесет месеца. Количественият анализ на лактат, ацетат пропионат и бутират в проби от кърма и фецес на бебета на възраст до една година дават обективна информация за метаболитните процеси осъществявани и с участието на съпътстващата микробиота. Наличиети на късоверижни мастни киселини е пряко потвърдение за функционалната активност на бифидобактериите и лактобацилите. Съотношението между отделните групи микроорганизми, описани в първа точка на предлагания метод и количеството на късоверижните мастни киселини предоставя съществена информация за баланса на микробиотата и за нейното функционално състояние. Освен това за целите на предлагания метод могат да се изчислят съотношенията между ензимните активности на ензимите от втора точка (вторият етап на анализа) и количеството на късоверижните мастни киселини. Диапазонът на съотношенията на стойностите на ензимните активност е описан в таблица 6.
4. Изчисляване корелационните зависимости между съотнишенията на отделните компоненти за дефиниране на статуса на микробиома при деца от един до дванадесет месеца. Предлаганият от нас ин витро модел за определяне на чревната дисбиоза при деца от един до дванадест месеца като състояние на специфичната екологична ниша в интестиналния тракт, корелиращо с намаляване на риска от остри и хронични заболявания. Освен това моделът може да предоставя рамка за за оценка ефективността на стратегии за превенция и лечение на чревни дисбиози.
IV. ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Пример 1. Ин витро изследване на 12 показателя по оценка на баланса на микробиотата при бебета от един до дванадесет месеца:
1. Протокол за количествен анализ на човешка микробиота чрез в реално времев реално време qPCR
Представеният протокол може да се прилага за установяване на отклонения за анализ на дисбиоза при новородени от един до дванадесет месеца и да бъде включен към алгоритъм за идентифициране на състояние, отклонения и правила за възстановяване баланса на микробиотата.
А. Праймери и флуоресцентно белязани сонди за в реално времев реално време PCR детекция на бактериални групи и видове в проби от таргетните групи
Праймерните двойки и флуоресцентно белязани сонди за провеждане на в реално време qPCR детекция на бактериални видове и съобщества в проби от различни таргетни групи са представени в Таблица 2.
Таблица 2. Праймери и флуоресцентно белязани сонди за в реално време qPCR детекция на бактериални групи и видове, използвани в представеното изследване.
Таргетна . бактериална група j или вид Праймери и сонди Секвенция __ -2 . I:1**“: - Източник
Bifidobacterium sp. Bif-F Bif-R TCGCGTCYGGTGTGAAAG CCACATCCAGCRTCCAC Rinttila et al., 2004
Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas BPP-F BPP-R GGTGTCGGCTTAAGTGCCAT CGGAYGTAAGGGCCGTGC Rinttila et al., 2004
Lactobacillus Lacb-F Lacb-R AGCAGTAGGGAATCTTCCA CACCGCTACACACATGGAG Walter et al., 2001 Heilig et al., 2001
Bifidobacteri um F_Bifid 09c RBifid 06 CGGGTGAGTAATGCGTGACC TGATAGGACGCGACCCCA Furet et al., 2009
Bacteroides, Prevotella FBacter 11 RBacter 08 CCTWCGATGGATAGGGGTT CACGCTACTTGGCTGGTTCAG Furet et al., 2009
Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus F_Lacto 05 R Lacto 04 AGCAGTAGGGAATCTTCCA CGCCACTGGTGTTCYTCCATATA Furet et al., 2009
Тотална чревна бактериална микрофлора FBact 1369 R_Prokl492 CGGTGAATACGTTCCCGG TACGGCTACCTTGTTACGACTT Suzuki et al., 2000
Clostridium leptum FClept 09 RClept 08 CCTTCCGTGCCGSAGTTA GAATTAAACCACATACTCCACTGCTT Furet et al., 2009
Clostridium coccoides F_Ccoc 07 R_Ccoc 14 GACGCCGCGTGAAGGA AGCCCCAGCCTTTCACATC Furet et al., 2009
Bifidobacterium сонда PBifid 6FAM-CTCCTGGAAACGGGTG-BHQ-1 Furet et al., 2009
Bacteroides, Prevotella сонда РВасЗОЗ HEX-AAGGTCCCCCACATTG- BHQ-1 Manz et al., 1996
Тотална чревна бактериална микрофлора Сонда PTM1389F 6FAM-CTTGTACACACCGCCCGTC- BHQ-1 Suzuki et al., 2000
Clostridium leptum Сонда Pclep 01 6FAM- CACAATAAGTAATCCACC- BHQ-1 Furet et al., 2009
Clostridium coccoides Сонда P_Erec482 HEX- CGGTACCTGACTAAGAAGBHQ-1 Franks et al., 1998
2. Контролни бактериални щамове
Бактериални щамове, използвани за контрол на специфичността на използваните праймери и белязани сонди, както и за количествена оценка на отделни бактериални видове и съобщества са представени в Таблица 3. Използваните щамове са закупени от Националната банка за промишлени микроорганизми и клетъчни култури (НБПМК) и German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ). Щамовете се култивират аеробно или анаеробно в селективни хранителни среди, съгласно препоръките на DSMZ и НБПМК. От развитите култури за всеки щам се правят серия от разреждания, които се посяват върху съответната агарова среда в петрита, за да се определи общ брой бактерии - колоно-образуващи единици (CFU). Допълнително, от направните разреждания се вземат проби от по 1,0 ml, които се центрофугират при следните условия: 12000rpm/3min. Получените утайки от бактериални клетки се съхраняват при -80°С до използването им за анализ.
Таблица 3. Контролни бактериални щамове, използвани в изследването.
Източник Приложение на геномна ДНК при в [teaлно време PCR
Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus 1132 T НБПМКК детекция на Lactobacillus, без изполаване на флуоресцентни сонди
Lactobacillus acidophilus 8896 T НБПМКК детекция на Lactobacillus, без изполаване на флуоресцентни сонди
Lactobacillus rhamnosus 1010 T НБПМКК детекция на Lactobacillus, без изполаване на флуоресцентни сонди
Bifidobacterium longum subsp. longum DSM-20219 DSMZ детекция на Bifidobacterium, без използване на флуоресцентни сонди
Bacteroides fragilis DSM-2151 DSMZ детекция на Bacteroides, без изполаване на флуоресцентни сонди
Bifidobacterium adolescentis DSM-20083 DSMZ детекция на Bifidobacterium, с флуоресцентно белязани сонди
Bifidobacterium longum subsp. infantis DSM-20088 DSMZ детекция на Bifidobacterium, с флуоресцентно белязани сонди
Bifidobacterium breve DSM-20213 DSMZ детекция на Bifidobacterium, с флуоресцентно белязани сонди
Clostridium leptum DSM-753 DSMZ детекция на Clostridium с флуоресцентно белязани сонди
Clostridium coccoides (Blautia coccoides) DSM-935 DSMZ детекция на Clostridium с флуоресцентно белязани сонди
3. Изолиране на ДНК от бактериални култури и проби от таргетните групи
Бактериална геномна ДНК от контролните щамове и изолати от проби на таргетните групи се екстахира чрез използване на Blood and Tissue kit DNeasy (Qiagen, Hilden, Germany)..
Микробиална ДНК от фекални проби и от кърма се изолира чрез използване на QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Първоначално 200 mg фекалната проба/кърма се разрежда в 1,8 ml стерилен PBS буфер. Към 200 μΐ разредена фекална проба се добавят 20 μΐ лизозим (150 mg/ml) и 130 μΐ лизиращ буфер (2,0 mM Na2EDTA; 20 mM Tris-HCl; 1,2% Triton Х-100). Сместа се инкубира при 37°С за 30 минути, след което се изолира ДНК.
4. Количествено определяне на ДНК
Количеството и чистотата на бактериалната геномна ДНК излорана от щамовете стандарти и от изследваните проби се определят спектофотометрично. За целта се определя абсорбцията на подходящо разререните проби ДНК при дължини на вълните 260 nm и 280 nm. Измерванията се извършват на спектофотометър Shimadzu UV-2600 при светлинен път 8,5 mm, след нулиране на апарата срещу кювета с елуираш буфер. Еднородността на геномната ДНК се определи чрез визуализиране на изолираната ДНК в 1 % (w/v) агарозен тел чрез електрофореза и оцветяване с етидиев бромид. Пробите с изолираната ДНК се съхраняват при -20°С.
5. Провеждане на В реално време qPCR
В В реално време qPCR реакциите за детекция и количествено определяне на бактерии без използване на флуорсцентни сонди се използва SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Реакциите се залагат в 96-ямкови плаки с краен обем на всяка реакция 25 pL. Реакциите се провеждат на В реално време PCR CFX96 Touch (BIO-RAD) с версия на софтуера 3.0.1224 при условия за всяка от целевите групи бактерии, посочени в Таблица 4.
Таблица 4. Праймери и реакционни услоловия за провеждане на В реално време qPCR за количествено определяне на бактерии във фекални проби.
5? Целева група
Bif-F и Bif-R Bifidobacteri ит Праймери - 0,5 μΜ всеки; Преденатурация - 5 min/95 °C; Денатурация - 15 sec/95 °C; Свързване на праймерите — 20 sec/58 °C; Удължаване - 30 sec/72 °C; Детекция — 30 sec/80 °C; Брой цикли —35.
BPP-F и BPP-R Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas Праймери — 0,5 μΜ всеки; Преденатурация - 5 min/95 °C; Денатурация - 15 sec/95 °C; Свързване на праймерите — 20 sec/68 °C; Удължаване - 30 sec/72 °C; Детекция - 30 sec/80 °C; Брой цикли-35.
Lacb-F и Lacb-R Lactobacillus Праймери - 0,5 μΜ всеки; Преденатурация — 5 min/95 °C; Денатурация - 15 sec/95 °C; Свързване на праймерите — 20 sec/58 °C; Удължаване - 30 sec/72 °C; Детекция - 30 sec/80 °C; Брой цикли - 35.
F_Lacto 05 и R_Lacto 04 Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus Праймери - 0,2 μΜ всеки; Преденатурация - 10 min/95 °C; Денатурация — 30 sec/95 °C; Свързване на праймерите - 30 sec/60 °C; Удължаване - 1 min/72 °C; Детекция - 30 sec/80 °C; Брой цикли — 40.
В реално време qPCR реакциите за детекция и количествено определяне на бактерии с използване на флуоресцентно белязани сонди се използва TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Реакциите се залагат в 96-ямкови плаки с краен обем на всяка реакция 25 pL. Условия за провеждане на всеки от анализите за определяне на целевите групи бактерии са посочени в Таблица 5.
Таблица 5. Праймери, флуоресцентни сонди и реакционни условия за провеждане на В реално време qPCR за количествено определяне на бактерии във фекални проби.
Праймерна двойка и флуоресцентно белязана сонда ' π —:5, Целева група Реакционни условия и .7 детекция
FBifid 09c, RBifid 06, сонда PBifid Bifidobacterium Праймери - 0,2 μΜ всеки; Сонда - 0,2 μΜ: Преденатурация - 10 min/95 °C; Денатурация - 30 sec/95 °C; Удължаване на праймерите и детекция - 1 min/60 °C; Брой цикли - 40.
F_Bacter 11, R Bacter 08, сонда Р_ВасЗОЗ Bacteroides, Prevotella
F_Bact 1369, R_1492, сонда PTM1389F Определяне на общо количество бактерии
F Clept 09, R Clept 08, сонда P-Clep01 Clostridium leptum
F Ccoc 07, R Ccoc 14, сонда P_Erec482 Clostridium coccoides
Всички В реално време qPCR анализи на количествено определяне на бактерии във фекални проби и кърма се провеждат с минимум двукратно повторение от различни анализи.
6. Електрофоретичен анализ на ДНК фрагменти, получени след провеждане на В реално време qPCR
За проверка на размера и интегритета на амплимерите, получени след провеждане на В реално време qPCR, се провежда агарозна гел-електрофореза на реакционните продукти. Разделянето на фрагмените ДНК се извършва в 2% агарозен гел, при напрежение 35V и 25 mA сила на тока. Разделените фрагменти се визуализрат флуоресцентно - чрез обработка на гела с етидиев бромид и осветяване е УВ светлина. Приблизителните размери на ДНК фрагментите се определят чрез съпоставка със стандар, съдържащ малки ДНК фрагменти с известни размери - SmartLadder SF (Eurogentec, Belgium).
7. Статистическа обработка на данните
Статистическата обработка на данните и тяхното графично представяне се извършват със със софтуер SYSTAT версия 13.2 и SigmaPlot версия 12.0 (Systat Software Inc., USA).
IL Анализ на ензими в проби от майчина кърма и фецес от новородено
1. Определяне на ензимна активност на β-галактозидаза (ЕС 3.2.1.23)
Ензимната реакция се проведе при условия: 100 тМ натриево ацетатен буфер, pH 6.0, съдържащ 2 тМ разтвор на о-нитрофенил-В-О-галактопиранозид (ONP-Gal) и подходящо разредени клетки или надутаечна течност след дезинтегриране на клетките при 37оС . Реакцията се спира с 1 М натриев карбонат. Една единица активност на ензима катализира получаването на 1.0 gmol о-нитрофенол за една минута при pH 4.0 и 37°С. Съдържанието на о- нитрофенол се определя спектрофотометрично при 410nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800.
Всички експерименти за определяне на ензимната активност са проведени с трикратна повтаряемост.
2. Определяне активността на α-галактозидаза (ЕС 3.2.1.22)
Ензимната реакция се проведе при условия: 400 тМ цитратен буфер, pH 4.0, съдържащ 9.9 тМ разтвор на р-нитрофенил a-D-галактопиранозид (PNP-Gal) (приготвя се в дестилирана вода чрез разтваряне на р-нитрофенил a-D-галактопиранозид, Sigma кат. № N-0877) и подходящо разредени клетки или надутаечна течност след дезинтегриране на клетките при 37оС . Реакцията се спира с 200 тМ боратен буфер, pH 9.8. Една единица активност превръща 1.0 gmole от р-нитрофенил a-D-галактопиранозид в о-нитрофенол и D-галактоза за една минута при pH 4.0 и 37°С.
Съдържанието на р-нитрофенол се определя спектрофотометрично при 405 nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800.
Всички експерименти за определяне на ензимната активност са проведени с трикратна повтаряемост.
3. Определяне активността на α-L - фукозидаза (ЕС 3.2.1.51)
Ензимната реакция се проведе при условия: 100 тМ цитратен буфер, pH 6.5, съдържащ 10 тМ разтвор на р-нитрофенил a-L-фукопиранозид (PNP-FUC) (приготвя си посредством разреждане на р-нитрофенил a-L-фукопиранозид (Sigma кат. № N3628) с дестилирана вода и подходящо разредени клетки при 37оС . Реакцията се спира с 200 тМ боратен буфер, pH 9.8. Една единица активност превръща 1.0 pmole от р-нитрофенил a-L-фукопиранозид в рнитрофенол и L-фукопиранозид за една минута при pH 4.0 и 37°С. Съдържанието на рнитрофенол се определя спектрофотометрично при 405 nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800.
Всички експерименти за определяне на ензимна активност са проведени с трикратна повтаряемост.
4. Определяне активността на α-глюкозидаза (ЕС 3.2.1.20)
Ензимната реакция се проведе при условия: 100 тМ ацетатен буфер, pH 6,0, съдържащ 1.25 тМ разтвор на р-нитрофенил a-D-глюкопиранозид (приготвя си посредством разреждане на р-нитрофенил a-D-глюкопиранозид (Sigma кат. № N3628) с дестилирана вода, и подходящо разредени клетки при 37оС . Реакцията се спира с 0.5 М натриев карбонат. Една единица активност превръща 1.0 pmole от р-нитрофенол a-D-глюкопиранозид в рнитрофенол и D-глюкопиранозид за една минута при pH 6.0 и 37°С. Съдържанието на рнитрофенол се определя спектрофотометрично при 405 nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU800.
Всички експерименти за определяне на ензимна активност са проведени с трикратна повтаряемост.
5. Определяне активността на β-глюкозидаза (ЕС 3.2.1.28)
Ензимната реакция се проведе при условия: 0.1 М ацетатен буфер, pH 5.0, съдържащ 20 тМ разтвор на р-нитрофенил-В-О- глюкопиранозид (ONP-Glu) и подходящо разредени клетки при 37оС . Реакцията се спира с 0.2 М натриев карбонат. Една еденица активност превръща 1.0 pmole от р-нитрофенил a-D-глюкопиранозид в р-нитрофенол и Dглюкопиранозид за една минута при pH 5.0 и 37°С. Съдържанието на р-нитрофенол се определя спектрофотометрично при 405 nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800.
Всички експерименти за определяне на ензимна активност са проведени с трикратна повтаряемост.
6. Определяне активността на протеаза
Протеазната активност на клетките и надутаечната течност (НУТ) се изследва в присъствие на казеин (Fluka) като субстрат. Една единица (U) активност на протеазата се дефинира като количеството ензим, което хидролизира казеина до Ipmol тирозин за 1 минута, при pH 7,5 и 37°С.
Ензимната реакция се провежда при следните условия: в 50 тМ фосфатен буфер, pH 7,5 се разтвяря 0,65% (w/v) казеин и 1,0 ml подходящо разредена проба (клетки или НУТ). Реакцията протича за 10 мин. при 37°С на водна баня. Реакцията се спира с добавяне на 110 тМ трихлорооцетна киселина (ТХО) (Merck) при 37°С. Пробите се инкубират с ТХО за 30 минути при същата температура. За отделяне на неразградения казеин, пробите се центрофугират при 9000об./15 мин., 4°С. Надутаечната течност се анализира за количество освободен тирозин, от разграждането на казеина, в присъствие на 500 тМ №2СОз и 0,5 М разтвор на Фолин реагент (Merck) при 37°С за 30 минути. Измерва се абсорбцията при λ=660 nm (АббОпт) на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800, спрямо контрола, съдържаща вместо проба дестилирана вода. От измерената АббОпт по стандартна права се определя концентрацията на тирозина (pmol). За построяването на стандартна права се използва като стандарт L-тирозин (Sigma-Aldrich).
Всички експерименти за определяне на протеазна активност са проведени минимум с трикратна повторяемост.
7. Определяне активността на липаза (ЕС 3.1.1.3)
Ензимната реакция се проведе при условия: 0.1 М ацетатен буфер, pH 7,6, съдържащ 0,8 тМ разтвор на р-нитрофенил-палмитат и подходящо разредени клетки при 37оС . Реакцията се спира с 0.2 М оловен ацетат1еаб (II). Една единица активност превръща 1.0 pmole от р-нитрофенил палмитат в р-нитрофенол и палмитат за една минута при pH 7,6 и 37°С. Съдържанието на р-нитрофенол се определя спектрофотометрично при 405 nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800.
Всички експерименти за определяне на ензимна активност са проведени с трикратна повтаряемост.
III. Анализ на късоверижни мастни киселини в проби от кърма и фецес на бебета от един до дванадесет месеца.
За доказването на късоверижните масни киселни в пробите от екскременти е разработен следният протокол:
1. Изолиране на късоверижни мастни киселини от екскременти.
Към 100 mg прясна фекална проба или майчина кърма се добавя 2% НзРОд или 0,05% H2SO4 в съотношение 1:10. Пробите се хомогенизират много добре на вортекс 2 пъти по 2 min. Полученият хомогенизат се центрофугира 10 min, 13 000 rpm, след което се отделя супернатанта. От супернтанта се вземат 200 pL, които се екстрахират с 200 pL органичен разтворител (CH2CI2, AcCN, EtOH, EtOAc). Пробите се хомогензират, след което се центрофугира 5 min, 13 000 rpm. Полученият органичен слой се отделя и подлага на HPLC анализ.
2. HPLC метод за анализ на късоверижни мастни киселини.
Използвана е HPLC ситема Konik-Tech (Испания) снабдена е колона Aminex НРХ-87Н Ion Exclusion Column (7.8 mm i.d. x 30 cm, Biorad, Richmond, СА) и предколона Micro-Guard Cation-H (4.6 mm i.d. x 30 mm, Biorad). Определянето на пробите е осъществено с UV детектор при дължина на вълната 210 nm, при подвижна фаза 0,005М H2SO4, скорост на потока 0,6 ml/min и температура на колоната Т=40°С.
Идентифицирането на пиковете е осъществено по времената на задържане спрямо стандарти на късоверижни мастни киселини: млечна киселина, ацетна киселиан, пропионова киселина и бутенова киселина. За количественото определяне на късоверижните мастни киселини са изготвени стандартни прави в концентрации 25 - 1,56 mmol/L. Изведени са корелационни уравнения, описващи площта на пика (у) и концентрацията на късоверижните мастни киселини (х, mmol/L). Стандартните прави са с линейни участъци между 25 - 1,65 mmol/L и с коефициент на корелация г2 > 0,9999.
Параметри Кърма Фецес
Видове микроорганизми
1. Бифидобактерии 103-105 10М08
2. Лактобацили 104-106 10М08
3. Клостридии - 104-106
4. Bacteroidetes - 105-107
5. Ентерококи 1Q5-107 104-106
6. Е.коли — типични - 104-106
Ί. Дрождоподобни гъбички от род Candida - ЮЗ-105
Ензими
1. Алфа-галактозидаза (U/mg протеин) 0,1-0,3 0,1-0,2
2. Бета-галактозидаза (U/mg протеин) 0,4-2,0 0,2-1,0
3. Алфа-глюкозидаза (U/mg протеин) 0,2-1,2 0,1-0,5
4. Бета-глюкозидаза (U/mg протеин) 0,3-0,8 0,3-0,8
5. А +лфа-фукозидаза (U/mg протеин) 0,1-0,8 0,05-0,3
6. Липаза (U/mg протеин)
7. Протеаза (U/mg протеин) 0,5-3,0 0,2-1,5
Метаболити
1. Млечна киселина (mmol/g) 0,5-1,2 0,2-0,8
2. Оцетна киселина (mmol/g) 0,2-0,6 0,3-0,7
3. Пропионова киселина (mmol/g) 0,1-0,3 0,05-0,3
4. Маслена киселина (mmol/g) 0,05-02 0,02-0,13
Таблица 6. Диапазон на стойностите на измерваните показатели при здрави деца на възраст от един до дванадесет месеца.
В резултат на проведените анализи на тестуваните майчина кърма и фецес от новородено на възраст между един и дванадесет месеца се изчисляват следните коефициенти:
1. Съотношение на количеството Бифидобактерии/Бактероиди
2. Съотношението на количеството Бифидобактерии/Лактобацили
3. Съотношението на количеството (Бифидобактерии+Лактобацили)/Бактероиди
4. Съотношението на количеството (Бифидобактерии+Лактобацили)/Дрожди
5. Съотношението на количеството Бактероиди/Дрожди
6. Съотношението на количеството (Бифидобактерии+Лактобацили)/Е. коли
7. Съотношението на количеството (Бифидобактерии+Лактобацили)/активност на бетагалактозидаза
8. Съотношението на количеството (Бифидобактерии+Лактобацили)/активност на алфафукозидаза
9. Съотношението на ензимните активности бета-галактозидаза/алфа-галактозидаза
10. Съотношението на ензимните активности бета-галактозидаза/алфа-фукозидаза
11. Съотношението на ензимните активности бета-галактозидаза/липаза
12. Съотношението на ензимните активности бета-галактозидаза/протеаза
13. Съотношението на ензимните активности (бета-галактозидаза+алфа-галактозидаза)/ алфа-фукозидаза
14. Съотношение на метаболитите млечнакиселина/оцетна киселина/маслена киселина Изчислява се като съотношение между числеността на съответните бактерии (ензими, метаболити), където като мярка за численост на бактериите (ензимите, метаболитите) се използва относителната стойност на числеността спрямо средата на интервала от нормалните и стойности.
' W .ШсГ
Където:
1. С — съотношение между числеността на бактерии (ензими, метаболити) А и В;
2. А - численост на бактерии (ензими, метаболити) А;
3. A nom.min. - долната граница на нормата за численост на бактерии (ензими, метаболити)А;
A nom.max. - горна граница на нормата за численост на бактерии (ензими, метаболити) А;
В - численост на бактерии (ензими, метаболити) В;
В nom.min. - долната граница на нормата за численост на бактерии (ензими, метаболити) В;
В nom.max. - горна граница на нормата за численост на бактерии (ензими, метаболити) В.
Тенденциите при отчитане на съотношениеята са изразени в таблица 7, които се получават при съответното съотношение на показателя от колоната на таблицата към показателя от реда на таблицата.
Таблица 7. Тенденции на съотношенията между отделните показатели, с червена стрелка се отбелязва положителен ефект върху микробиотата, а със синя отрицателен ефект върху микробиотата.
1-Бифидо
1-Бифидо _____
.....................♦fSKS
3-Bacteroides _______
Б-едиде«МК6
6- Е. coll
7- A-galactosidasa ф (7/1)φ
8-8-galactosldase φ (8/1)4
9-A-fucosidasa φ (9/1)Φ
ЩЦрам φ (10/1)4
U-Protease φ (11/1)4
2-LAB 3-Bacteroid«
4-Доожди t (1/6) f (2/6)
12-Метаболити ♦ σ/а»4 t ¢/2)4 t (9/2)4 t (10/2)4 * (11/2)4
f (5/6) ♦ (6/5)4 ♦ ¢/5)4 + (8/S)4 + (9/S)4 t (10/5)4 t (11/5)4
7-A-placto$ldase 8-B*galactosidase 9-A-fuco$idase 10-LipaseT 11-Protease 12-Метаболити + (3/10) 4 + ¢/11)4 ______________________________________«ΛΦ 4 T (4/11)4 t (7/12)4 t (8/12)4 f (9/12)4 t (10/12) 4
........ ......... * (11/12) 4
Пример 2. Ин витро изследване на 6 показателя по оценка на баланса на микробиотата при бебета от един до дванадесет месеца:
1. Протокол за количествен анализ на човешка микробиота чрез в реално времев реално време qPCR
Представеният протокол може да се прилага за установяване на отклонения за анализ на дисбиоза при новородени от един до дванадесет месеца и да бъде включен към алгоритъм за идентифициране на състояние, отклонения и правила за възстановяване баланса на микробиотата.
А. Праймери и флуоресцентно белязани сонди за в реално времев реално време PCR детекция на бактериални групи и видове в проби от таргетните групи
Праймерните двойки и флуоресцентно белязани сонди за провеждане на в реално време qPCR детекция на бактериални видове и съобщества в проби от различни таргетни групи са представени в Таблица 8.
Таблица 8. Праймери и флуоресцентно белязани сонди за в реално време qPCR детекция на бактериални групи и видове, използвани в представеното изследване.
- .............,JV 1 I руна или вид Праймери и « сонди Секвенция 5-3 Източник
Bifidobacterium sp. Bif-F Bif-R TCGCGTCYGGTGTGAAAG CCACATCCAGCRTCCAC Rinttila et al., 2004
Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas BPP-F BPP-R GGTGTCGGCTTAAGTGCCAT CGGAYGTAAGGGCCGTGC Rinttila et al., 2004
Lactobacillus Lacb-F Lacb-R AGCAGTAGGGAATCTTCCA CACCGCTACACACATGGAG Walter et al., 2001 Heilig et al., 2001
Bifidobacterium F_Bifid 09c R_Bifid 06 CGGGTGAGTAATGCGTGACC TGATAGGACGCGACCCCA Furet et al., 2009
Bacteroides, Prevotella FBacter 11 R_Bacter 08 CCTWCGATGGATAGGGGTT CACGCTACTTGGCTGGTTCAG Furet et al., 2009
Lactobacillus, L е u c ο η o s t o c, Pediococcus F Lacto 05 RLacto 04 AGCAGTAGGGAATCTTCCA CGCCACTGGTGTTCYTCCATATA Furet et al., 2009
2. Контролни бактериални щамове
Бактериални щамове, използвани за контрол на специфичността на използваните праймери и белязани сонди, както и за количествена оценка на отделни бактериални видове и съобщества са представени в Таблица 2. Използваните щамове са закупени от Националната банка за промишлени микроорганизми и клетъчни култури (НБПМК) и German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ). Щамовете се култивират аеробно или анаеробно в селективни хранителни среди, съгласно препоръките на DSMZ и НБПМК. От развитите култури за всеки щам се правят серия от разреждания, които се посяват върху съответната агарова среда в петрита, за да се определи общ брой бактерии - колоно-образуващи единици (CFU). Допълнително, от направните разреждания се вземат проби от по 1,0 ml, които се центрофугират при следните условия: 12000rpm/3min. Получените утайки от бактериални клетки се съхраняват при -80°С до използването им за анализ.
Таблица 9. Контролни бактериални щамове, използвани в изследването.
Щам Източник · ..· - assM··.· ..... Приложение на геномна ДНК при real- 1 time PCR
Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus 1132 T НБПМКК детекция на Lactobacillus, без използване на флуоресцентни сонди
Lactobacillus acidophilus 8896 T НБПМКК детекция на Lactobacillus, без използване на флуоресцентни сонди
Lactobacillus rhamnosus 1010 T НБПМКК детекция на Lactobacillus, без използване на флуоресцентни сонди
Bifidobacterium longum subsp. longum DSM-20219 DSMZ детекция на Bifidobacterium, без използване на флуоресцентни сонди
Bacteroides fragilis DSM-2151 DSMZ детекция на Bacteroides, без изполаване на флуоресцентни сонди
Bifidobacterium adolescentis DSM-20083 DSMZ детекция на Bifidob acterium, с флуоресцентно белязани сонди
Bifidobacterium longum subsp. infantis DSM-20088 DSMZ детекция на Bifidobacterium, с флуоресцентно белязани сонди
Bifidobacterium breve DSM-20213 DSMZ детекция на Bifidobacterium, с флуоресцентно белязани сонди
Clostridium leptum DSM-753 DSMZ детекция на Clostridium с флуоресцентно белязани сонди
Clostridium coccoides (Blautia coccoides) DSM-935 DSMZ детекция на Clostridium с флуоресцентно белязани сонди
3. Изолиране на ДНК от бактериални култури и проби от таргетните групи
Бактериална геномна ДНК от контролните щамове и изолати от проби на таргетните групи се екстахира чрез използване на Blood and Tissue kit DNeasy (Qiagen, Hilden, Germany).. Микробиална ДНК от фекални проби и от кърма се изолира чрез използване на QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Първоначално 200 mg фекалната проба/кърма се разрежда в 1,8 ml стерилен PBS буфер. Към 200 μΐ разредена фекална проба се добавят 20 μΐ лизозим (150 mg/ml) и 130 μΐ лизиращ буфер (2,0 mM NazEDTA; 20 тМ Tris-HCl; 1,2% Triton Х-100). Сместа се инкубира при 37°С за 30 минути, след което се изолира ДНК.
4. Количествено определяне на ДНК
Количеството и чистотата на бактериалната геномна ДНК излорана от щамовете стандарти и от изследваните проби се определят спектофотометрично. За целта се определя абсорбцията на подходящо разререните проби ДНК при дължини на вълните 260 nm и 280 nm. Измерванията се извършват на спектофотометър Shimadzu UV-2600 при светлинен път 8,5 mm, след нулиране на апарата срещу кювета с елуираш буфер. Еднородността на геномната ДНК се определи чрез визуализиране на изолираната ДНК в 1% (w/v) агарозен гел чрез електрофореза и оцветяване с етидиев бромид. Пробите с изолираната ДНК се съхраняват при -20°С.
5. Провеждане на В реално време qPCR
В В реално време qPCR реакциите за детекция и количествено определяне на бактерии без използване на флуорсцентни сонди се използва SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Реакциите се залагат в 96-ямкови плаки с краен обем на всяка реакция 25 μΕ. Реакциите се провеждат на В реално време PCR CFX96 Touch (BIO-RAD) с версия на софтуера 3.0.1224 при условия за всяка от целевите групи бактерии, посочени в Таблица 10.
Таблица 10. Праймери и реакционни услоловия за провеждане на В реално време qPCR за количествено определяне на бактерии във фекални проби.
Праймерна двойка Целева група s Реакционни условия и детекция
Bif-F и Bif-R Bifidobacterium Праймери - 0,5 μΜ всеки; Преденатурация - 5 min/95 °C; Денатурация- 15 sec/95 °C; Свързване на праймерите — 20 sec/58 °C; Удължаване - 30 sec/72 °C; Детекция - 30 sec/80 °C; Брой цикли - 35.
BPP-F и BPP-R Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas Праймери - 0,5 μΜ всеки; Преденатурация - 5 min/95 °C; Денатурация - 15 sec/95 °C; Свързване на праймерите - 20 sec/68 °C; Удължаване - 30 sec/72 °C; Детекция - 30 sec/80 °C; Брой цикли-35.
Lacb-F и Lacb-R Lactobacillus Праймери — 0,5 μΜ всеки; Преденатурация - 5 min/95 °C; Денатурация - 15 sec/95 °C; Свързване на праймерите - 20 sec/58 °C; Удължаване - 30 sec/72 °C; Детекция - 30 sec/80 °C; Брой цикли — 35.
F Lacto 05 и RLacto 04 Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus Праймери - 0,2 μΜ всеки; Преденатурация — 10 min/95 °C; Денатурация - 30 sec/95 °C; Свързване на праймерите - 30 sec/60 °C; Удължаване - 1 min/72 °C; Детекция - 30 sec/80 °C; Брой цикли - 40.
В реално време qPCR реакциите за детекция и количествено определяне на бактерии с използване на флуоресцентно белязани сонди се използва TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Реакциите се залагат в 96-ямкови плаки с краен обем на всяка реакция 25 pL. Условия за провеждане на всеки от анализите за определяне на целевите групи бактерии са посочени в Таблица 11.
Таблица 11. Праймери, флуоресцентни сонди и реакционни условия за провеждане на В реално време qPCR за количествено определяне на бактерии във фекални проби.
Праймерна двойка и флуоресцентно белязана сонда Целева група Реакционни условия и детекция
F_Bifid 09c, R Bifid 06, сонда P_Bifid Bifidobacterium Праймери - 0,2 μΜ всеки; Сонда - 0,2 μΜ: Преденатурация - 10 min/95 °C; Денатурация - 30 sec/95 °C; Удължаване на праймерите и детекция - 1 min/60 °C;
F Bacter 11, R Bacter 08, сонда РВасЗОЗ Bacteroides, Prevotella
F Bact 1369, R 1492, сонда PTM1389F Определяне на общо количество бактерии
Всички В реално време qPCR анализи на количествено определяне на бактерии във фекални проби и кърма се провеждат с минимум двукратно повторение от различни анализи.
6. Електрофоретичен анализ на ДНК фрагменти, получени след провеждане на В реално време qPCR
За проверка на размера и интегритета на амплимерите, получени след провеждане на В реално време qPCR, се провежда агарозна гел-електрофореза на реакционните продукти. Разделянето на фрагмените ДНК се извършва в 2% агарозен гел, при напрежение 35V и 25 mA сила на тока. Разделените фрагменти се визуализрат флуоресцентно - чрез обработка на гела с етидиев бромид и осветяване с VB светлина. Приблизителните размери на ДНК фрагментите се определят чрез съпоставка със стандар, съдържащ малки ДНК фрагменти с известни размери - SmartLadder SF (Eurogentec, Belgium).
7. Статистическа обработка на данните
Статистическата обработка на данните и тяхното графично представяне се извършват със със софтуер SYSTAT версия 13.2 и SigmaPlot версия 12.0 (Systat Software Inc., USA).
II. Анализ на ензими в проби от майчина кърма и фецес от новородено
1. Определяне на ензимна активност на β-галактозидаза (ЕС 3.2.1.23)
Ензимната реакция се проведе при условия: 100 тМ натриево ацетатен буфер, pH 6.0, съдържащ 2 тМ разтвор на о-нитрофенил-В-О-галактопиранозид (ONP-Gal) и подходящо разредени клетки или надутаечна течност след дезинтегриране на клетките при 37оС . Реакцията се спира с 1 М натриев карбонат. Една единица активност на ензима катализира получаването на 1.0 pmol о-нитрофенол за една минута при pH 4.0 и 37°С. Съдържанието на о- нитрофенол се определя спектрофотометрично при 410nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800.
Всички експерименти за определяне на ензимната активност са проведени с трикратна повтаряемост.
2. Определяне активността на α-L- фукозидаза (ЕС 3.2.1.51)
Ензимната реакция се проведе при условия: 100 тМ цитратен буфер, pH 6.5, съдържащ 10 тМ разтвор на р-нитрофенил a-L-фукопиранозид (PNP-FUC) (приготвя си посредством разреждане на р-нитрофенил a-L-фукопиранозид (Sigma кат. № N3628) с дестилирана вода и подходящо разредени клетки при 37оС . Реакцията се спира с 200 тМ боратен буфер, pH 9.8. Една единица активност превръща 1.0 pmole от р-нитрофенил a-L-фукопиранозид в рнитрофенол и L-фукопиранозид за една минута при pH 4.0 и 37°С. Съдържанието на рнитрофенол се определя спектрофотометрично при 405 nm дължина на вълната на спектрофотометър Beckman Coulter DU 800.
Всички експерименти за определяне на ензимна активност са проведени с трикратна повтаряемост.
III. Анализ на късоверижни мастни киселини в проби от кърма и фецес на бебета от един до дванадесет месеца.
За доказването на късоверижните масни киселни в пробите от екскременти е разработен следният протокол:
3. Изолиране на късоверижни мастни киселини от екскременти.
Към 100 mg прясна фекална проба или майчина кърма се добавя 2% НЗРО4 или 0,05% H2SO4 в съотношение 1:10. Пробите се хомогенизират много добре на вортекс 2 пъти по 2 min. Полученият хомогенизат се центрофугира 10 min, 13 000 rpm, след което се отделя супернатанта. От супернтанта се вземат 200 pL, които се екстрахират с 200 pL органичен разтворител (СН2С12 , AcCN, EtOH, EtOAc). Пробите се хомогензират, след което се центрофугира 5 min, 13 000 rpm. Полученият органичен слой се отделя и подлага на HPLC анализ.
4. HPLC метод за анализ на късоверижни мастни киселини.
Използвана е HPLC ситема Konik-Tech (Испания) снабдена с колона Aminex НРХ-87Н Ion Exclusion Column (7.8 mm i.d. x 30 cm, Biorad, Richmond, СА) и предколона Micro-Guard Cation-H (4.6 mm i.d. x 30 mm, Biorad). Определянето на пробите е осъществено с UV детектор при дължина на вълната 210 nm, при подвижна фаза 0,005М H2SO4, скорост на потока 0,6 ml/min и температура на колоната Т=40°С.
Идентифицирането на пиковете е осъществено по времената на задържане спрямо стандарти на късоверижни мастни киселини: млечна киселина, ацетна киселиан, пропионова киселина и бутенова киселина. За количественото определяне на късоверижните мастни киселини са изготвени стандартни прави в концентрации 25 - 1,56 mmol/L. Изведени са корелационни уравнения, описващи площта на пика (у) и концентрацията на късоверижните мастни киселини (х, mmol/L). Стандартните прави са с линейни участъци между 25 - 1,65 mmol/L и с коефициент на корелация г2 > 0,9999.
Таблица 12. Диапазон на параметри, изследвани при деца от един до дванадесет месеца.
Параметри Кърма Фецес
Видове микроорганизми
1. Бифидобактерии 10М05 10*-10«
2. Лактобацили 104-106 10б-10«
3. Bacteroidetes - 105-10’
Ензими
4. Бета-галактозидаза (U/mg протеин) 0,4-2,0 0,2-1,0
5. А лфа-фукозидаза (U/mg протеин) 0,1-0,8 0,05-0,3
Метаболити
6. Млечна киселина (mmol/g) 0,5-1,2 0,2-0,8
7. Оцетна киселина (mmol/g) 0,2-0,6 0,3-0,7
8. Пропионова киселина (mmol/g) 0,1-0,3 0,05-0,3
9. Маслена киселина (mmol/g) 0,05-02 0,02-0,13
В резултат на проведените анализи на тестуваните майчина кърма и фецес от новородено на възраст между един и дванадесет месеца се изчисляват следните коефициенти:
1. Съотношение на количеството Бифидобактерии/Бактероиди
2. Съотношението на количеството Бифидобактерии/Лактобацили
3. Съотношението на количеството (Бифидобактерии+Лактобацили)/Бактероиди
4. Съотношението на количеството (Бифидобактерии+Лактобацили)/активност на бета-галактозидаза
5. Съотношението на количеството (Бифидобактерии+Лактобацили)/активност на алфа-фукозидаза
6. Съотношението на ензимните активности бета-галактозидаза/алфа-фукозидаза
7. Съотношението на ензимните активности бета-галактозидаза/протеаза
8. Съотношение на метаболитите млечнакиселина/оцетна киселина/маслена киселина
Изчисленията се правят по посочената формула.
Таблица 13. Тенденции на съотношенията между отделните показатели, с червена стрелка се отбелязва положителен ефект върху микробиотата, а със синя отрицателен ефект върху микробиотата.
................ _ 1-Бифидо 2-LAB З-Bacterotdes 4-Бифидо+МКБ
1-Бифидо
2-LAB .......... ___________________
[3-Bacteroides 1ИЯИВНИ
4-Бифидо+МКБ
5-B-galactosidase(5/1) ф ф (5/2) ф ф (5/4) ф б-А-fucosidase ф (6/1) ф Ф (5/1) ф ф (6/4) ф
7-Метаболити
5-B-galactosidase б-А-fucosidase 7-Метаболити
(5/7) Ψ (6/7) ф
Литература:
1. Albesharat, R., Ehrmann, M.A., Korakli, M., Yazaji, S., Vogel, R.F., 2011. Phenotypic and genotypic analyses of lactic acid bacteria in local fermented food, breast milk and faeces of mothers and their babies. Systematic and Applied Microbiology 34, 148-155.
2. Ballard, O., Morrow, A.L., 2013. Human milk composition: nutrients and bioactive factors. Pediatric Clinics of North America 60 (1), 49-74.
3. Bartick, M., Reinhold, A., 2010. The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis. Pediatrics 125 (5), el048-el056.
4. Bhutta, Z.A., Das, J.K., Walker, N., et al., 2013. Interventions to address deaths from childhood pneumonia and diarrhoea equitably: what works and at what cost? Lancet 381 (9875), 1417-1429.
5. Bode, L., Jantscher-Krenn, E., 2012. Structure-function relationships of human milk oligosaccharides. Advances in Nutrition 3 (3), 383S-391S.
6. Cabrera-Rubio, R., Collado, M.C., Laitinen, K., Salminen, S., Isolauri, E., Mira, A., 2012. The human milk microbiome changes over lactation and is shaped by maternal weight and mode of delivery. American Journal of Clinical Nutrition 96 (3), 544-551.
7. Cephas, K.D., Kim, J., Mathai, R.A., Barry, K.A., Dowd, S.E., Meline, B.S., Swanson, K.S., 2011. Comparative analysis of salivary bacterial microbiome diversity in edentulous infants and their mothers or primary care givers using pyrosequencing. PLoS ONE 6, e23503.
8. Dieterich, C.M., Felice, J.P., O’Sullivan, E., Rasmussen, K.M., 2013. Breastfeeding and health outcomes for the mother-infant dyad. Pediatric Clinics of North America 60 (1), 3148.
9. Jimenez, E., de Andres, J., Manrique, M., Pareja-Tobes, P, Tobes, R., Martinez-Blanch, J.F., Codoner, F.M., Ramon, D., Fernandez, L., Rodriguez, J.M., 2015. Metagenomic analysis of milk of healthy and mastitis-suffering women. Journal of Human Lactation 31, 406-415.
10. Jimenez, E., de Andres, J., Manrique, M., Pareja-Tobes, P., Tobes, R., Martinez-Blanch, J.F., Codoner, F.M., Ramon, D., Fernandez, L., Rodriguez, J.M., 2015. Metagenomic analysis of milk of healthy and mastitis-suffering women. Journal of Human Lactation 31, 406-415.
11. Johnson, P., Watkins, W., 1982. Separation of an alpha-3-L-fucosyltransferase from the blood-group-Legene-specified alpha-3/4-L-fucosyltransferase in human milk. Biochemical Society Transactions., 10:445—446.
12. Katayama, T., et al., 2004. Molecular cloning and characterization of Bifidobacterium bifidum 1,2-alpha-L-fucosidase (AfcA), a novel inverting glycosidase (glycoside hydrolase family 95). Journal of Bacteriology 186 (15), 4885-4893.
13. Kobata, A., 2010. Structures and application of oligosaccharides in human milk. Proceedings of Japan Academy, Series B, Physical and Biological Sciences 86, 1-17.
14. Koenig, J.E., et al., 2011. Succession of microbial consortia in the developing infant gut microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108 (Suppl. 1), 4578^1585.
15. Kramer, M.S., Matush, L., Bogdanovich, N., et al., 2009. Health and development outcomes in 6.5-y-old children breastfed exclusively for 3 or 6 mo. The American Journal of Clinical Nutrition 90 (4), 1070-1074.
16. Law, V., Scow, W.K., Townsend, G., 2007. Factors influencing oral colonization of mutans streptococci in young children. Australian Dental Journal 52, 93-100.
17. LoCascio, R.G., et aL, 2009. A versatile and scalable strategy for glycoprofiling bifidobacterial consumption of human milk oligosaccharides. Microbial Biotechnology 2 (3), 333-342.
18. Macfarlane, G.T., Cummings, J.H., 1999. Probiotics and prebiotics: can regulating the activities of intestinal bacteria benefit health? BMJ 318 (7189), 999-1003.
19. Martin, R., Langa, S., Reviriego, C., Jiminez, E., Marin, M.L., Xaus, J., Fernandez, L., Rodriguez, J.M., 2012. Human milk is a source of lactic acid bacteria for the infant gut. Journal of Pediatrics 143, 754-758.
20. McGuire, M.K., McGuire, M.A., 2015. Human milk: mother nature’s prototypical probiotic food? Advances in Nutrition 6, 112-123.
21. Moro, G., et al., 2006. A mixture of prebiotic oligosaccharides reduces the incidence of atopic dermatitis during the first six months of age. Archives of Disease in Childhood 91 (10), 814-819.
22. Nagae, M., et al., 2007. Structural basis of the catalytic reaction mechanism of novel 1,2alpha-L-fucosidase from Bifidobacterium bifidum . Journal of Biological Chemistry 282 (25), 18497-18509.
23. Nasidze, 1., Li, J., Quinque, D., Tang, K., Stoneking, M., 2009. Global diversity in the human salivary microbiome. Genome Research 19, 636-643.
24. Newburg, D.S., Naubauer, S.H., 1995. Carbohydrates in milks: analysis, quantities and significance. In: Jensen, R.G. (Ed.), Handbook of Milk Composition. Academic Press, San Diego, pp. 273-349.
25. Palmer, C., et al., 2007. Development of the human infant intestinal microbiota. PLoS Biology 5 (7), el77.
26. Urashima, T., Fujita, S., Fukuda, K., Nakamura, T., Saito, T., Cowan, P., Messer, M., 2012. Chemical characterization of milk oligosaccharides of the common brushtail possum (Trichosurus vulpecula). Glycoconjugate Journal 31, 387-399.
27. Urashima, T., Messer, M., Oftedal, O.T., 2011. Comparative biochemistry and evolution of milk oligosaccharides of monotremes, marsupials, and eutherians. In: Pontarotti, P. (Ed.), Evolutionary Biology: Genome Evolution, Speciation, Coevolution and Origin of Life. Springer, Switzerland, pp. 1-33.
28. Wada, J., et al., 2007. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the galacto-N-biose-/lacto-N-biose I-binding protein (GL-BP) of the ABC transporter from Bifidobacterium longum JCM1217. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization 63 (Pt 9), 751-753.
29. Wall, R., Ross, R. P., Shanahan, F., O ’ Mahony, L., O ’ Mahony, C., Coakley, M., et al., 2009. Metabolic activity of the enteric microbiota in fl uences the fatty acid composition of murine and porcine liver and adipose tissues. The American Journal of Clinical Nutrition, 89, 1393- 1401.
30. Ward, T.L., Hosid, S., loshikhes, 1., Altosaar, I., 2013. Human milk metagenome: a functional capacity analysis. BMC Microbiology 13, 116.
31. Yang, F., Zeng, X., Ning, K., Liu, K.L., Lo, C.C., Wang, W., Chen, J., Wang, D., Huang, R., Chang, X., Chain, P.S., Xie, G., Ling, J., Xu, J., 2012. Saliva microbiomes distinguish caries-active from healthy human populations. ISME Journal 6, 1-10.
32. Zaura, E., Nicu, E.A., Krom, B.P., Keijser, B.J., 2014. Acquiring and maintaining a normal oral microbiome: current perspective. Frontiers in Cell Infection and Microbiology 24, 85.
33. Newburg, D.S., Naubauer, S.H., 2005. Carbohydrates in milks: analysis, quantities and significance. In: Jensen, R.G. (Ed.), Handbook of Milk Composition. Academic Press, San Diego, pp. 273-349.
34. Wada, J., et al., 2008. Bifidobacterium bifidum lacto-N-biosidase, a critical enzyme for the degradation of human milk oligosaccharides with a type 1 structure. Applied and Environmental Microbiology 74 (13), 3996^1004.
35. Suzuki, R., et al., 2008. Structural and thermodynamic analyses of solute-binding protein from Bifidobacterium longum specific for core 1 disaccharide and lacto-N-biose I. Journal of Biological Chemistry 283 (19), 13165-13173.
36. Fujita, K., et al., 2005. Identification and molecular cloning of a novel glycoside hydrolase family of core 1 type O-glycan-specific endo-alpha-N-acetylgalactosaminidase from Bifidobacterium longum . Journal of Biological Chemistry 280 (45), 37415-37422.
37. Ruas-Madiedo, P., et al., 2008. Mucin degradation by Bifidobacterium strains isolated from the human intestinal microbiota. Applied and Environmental Microbiology 74 (6), 1936-1940.
38. Cabrera-Rubio, R., Collado, M.C., Laitinen, K., Salminen, S., Isolauri, E., Mira, A., 2012. The human milk microbiome changes over lactation and is shaped by maternal weight and mode of delivery. American Journal of Clinical Nutrition 96 (3), 544-551.
39. Fernandez, L., Langa, S., Martin, V., Maldonado, A., Jimenez, E., Martin, R., Rodriguez, J.M., 2013. The human milk microbiota: origin and potential roles in health and disease. Pharmacological Research 69, 1-10.
40. Jost, T., Lacroix, C., Braegger, C., Rochat, F., Chassard, C., 2014. Vertical mother-neonate transfer of maternal gut bacteria via breastfeeding. Environmental Microbiology 16 (9), 2891-2904.
41. Ward, T.L., Hosid, S., loshikhes, I., Altosaar, I., 2013. Human milk metagenome: a functional capacity analysis. BMC Microbiology 13, 116.

Claims (6)

1. Метод за количествена оценка за бързо прогнозиране на дисбиози при кърмачета до 1 година и за мултифакторни заболявания чрез оценка на количествен и качествен състав на микробиота, вид и количество на ензими и метаболити, характеризиращ се с това, че включва етапите на:
а) провеждане на in vitro анализи на разнообразието и съотношението на микроорганизми в интестиналния тракт и телесни течности от майка и дете, количество на метаболити, използвани като биомаркери и отчитане на ниво на ензимна активност на ензими, използвани като биомаркери.
Ь) обработване по математически модел на данните от предходния етап който като резутат извежда:
с) корелация между състав и количество на микроорганизмите в телесните течности на майката и на детето;
d) корелация между ензимен профил и активност на ензимите, отговорни за усвояването и метаболизирането на компонентите на телесната течност в пробите от телесната течност на маката и детето;
е) корелация между количеството на метаболитите, получени от метаболизирането на основните компоненти на телесната течност от микробиотата в телесните течности на майката и детето.
2. Метод, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че другите телесни течности са избрани от групата на слюнка, кърма, фецес.
3. Метод, съгласно претенции 1 или 2, характеризиращ се с това, че микроорганизмите са избрани от групата на бифидобактерии, лактобацили bacteroidetes клостридии, ентерококи, е.коли
4. Метод, съгласно претенции 1 до 3, характеризиращ се е това, че ензимите са избрани от групата на алфа-галактозидаза, бета-галактозидаза, алфа-глюкозидаза бетаглюкозидаза, бета-глюкозидаза, алфа-фукозидаза, липаза, протеаза.
5. Метод, съгласно претенции 1 до 4, характеризиращ се с това, че метаболитите са избрани от групата на млечна киселина, оцетна киселина, пропионова киселина, маслена киселина.
6. Метод, съгласно всяка една от претенции 1 до 5, характеризиращ се с това, че корелацията е едно или повече от:
корелацията е количество бифидобактерии/бактероиди корелацията на количеството (бифидобактерии+лактобацили)/бактероиди корелацията на количеството (бифидобактерии+лактобацили)/дрождикорелацията на количеството бактероиди/дрожди корелация на количеството (бифидобактерии+лактобацили)/е. коли корелация на количеството (бифидобактерии+лактобацили)/активност на бетагалактозидазакорелация на количеството (бифидобактерии+лактобацили)/активност на алфафукозидаза корелация на ензимните активности бета-галактозидаза/алфа-галактозидаза корелация на ензимните активности бета-галактозидаза/алфа-фукозидаза корелация на ензимните активности бета-галактозидаза/липаза корелация на ензимните активности бета-галактозидаза/протеаза корелация на ензимните активности (бета-галактозидаза+алфа-галактозидаза)/алфафукозидазакорелация на метаболитите млечнакиселина/оцетна киселина/маслена киселина.
BG113148A 2020-05-27 2020-05-27 Метод за количествена оценка за бързо прогнозиране и контрол на дисбиози при кърмачета на възраст от един месец до една година BG67567B1 (bg)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BG113148A BG67567B1 (bg) 2020-05-27 2020-05-27 Метод за количествена оценка за бързо прогнозиране и контрол на дисбиози при кърмачета на възраст от един месец до една година
PCT/BG2020/050001 WO2021237312A1 (en) 2020-05-27 2020-05-28 Method for quantitative evaluation (mqe both for rapid prognosis of disbiosis in infants -up to 1 year of age(mqe/rpdi-1y), and for multi-factural diseases (mqe/mfd)
EP20742153.8A EP4162081A1 (en) 2020-05-27 2020-05-28 Method for quantitative evaluation (mqe both for rapid prognosis of disbiosis in infants -up to 1 year of age(mqe/rpdi-1y), and for multi-factural diseases (mqe/mfd)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BG113148A BG67567B1 (bg) 2020-05-27 2020-05-27 Метод за количествена оценка за бързо прогнозиране и контрол на дисбиози при кърмачета на възраст от един месец до една година

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG113148A true BG113148A (bg) 2021-12-15
BG67567B1 BG67567B1 (bg) 2023-09-15

Family

ID=71661600

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG113148A BG67567B1 (bg) 2020-05-27 2020-05-27 Метод за количествена оценка за бързо прогнозиране и контрол на дисбиози при кърмачета на възраст от един месец до една година

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP4162081A1 (bg)
BG (1) BG67567B1 (bg)
WO (1) WO2021237312A1 (bg)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT202200008705A1 (it) * 2022-04-29 2023-10-29 Wellmicro S R L Metodo per determinare una funzionalita’ metabolica di una popolazione batterica e apparato per eseguire detto metodo

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160243138A1 (en) * 2014-10-29 2016-08-25 Glycom A/S Composition comprising HMSs/HMOs and use thereof
EP3478093A4 (en) * 2016-07-01 2020-03-04 Evolve Biosystems, Inc. METHOD FOR FACILITATING MATURATION OF THE MAMMALIAN IMMUNE SYSTEM
ES2967947T3 (es) * 2016-12-06 2024-05-06 Dsm Nutritional Products Llc Polímeros de glicano y métodos relacionados de los mismos
WO2019118510A1 (en) * 2017-12-11 2019-06-20 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Defined therapeutic microbiota and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021237312A1 (en) 2021-12-02
BG67567B1 (bg) 2023-09-15
EP4162081A1 (en) 2023-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rigsbee et al. Quantitative profiling of gut microbiota of children with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome
Moles et al. Bacterial diversity in meconium of preterm neonates and evolution of their fecal microbiota during the first month of life
Ignacio et al. Correlation between body mass index and faecal microbiota from children
Cecchini et al. Functional metagenomics reveals novel pathways of prebiotic breakdown by human gut bacteria
US9669059B2 (en) Butyrogenic bacteria as probiotics to treat clostridium difficile
Pärtty et al. Compositional development of Bifidobacterium and Lactobacillus microbiota is linked with crying and fussing in early infancy
Bridgman et al. Gut microbiota and allergic disease in children
Kassinen et al. The fecal microbiota of irritable bowel syndrome patients differs significantly from that of healthy subjects
Koga et al. Age-associated effect of kestose on Faecalibacterium prausnitzii and symptoms in the atopic dermatitis infants
US20150104423A1 (en) Use of blood group status iii
Mao et al. In vitro fermentation of fructooligosaccharides with human gut bacteria
Qi et al. Lactation-dependent vertical transmission of natural probiotics from the mother to the infant gut through breast milk
Sirilun et al. Impact of maternal bifidobacteria and the mode of delivery on Bifidobacterium microbiota in infants
Korpela et al. Microbiome of the first stool after birth and infantile colic
Mroczynska et al. Beta-glucuronidase and beta-glucosidase activity of Lactobacillus and Enterococcus isolated from human feces
Rubio-del-Campo et al. Human milk and mucosa-associated disaccharides impact on cultured infant fecal microbiota
Gold et al. Effects of an amino acid-based formula supplemented with two human milk oligosaccharides on growth, tolerability, safety, and gut microbiome in infants with cow’s milk protein allergy
BG113148A (bg) Метод за количествена оценка за бързо прогнозиране и контрол на дисбиози на стомашно-чревния тракт при кърмачета на възраст до една година и за многофакторни заболявания
Hiraku et al. Early probiotic supplementation of healthy term infants with bifidobacterium longum subsp. infantis M-63 is safe and leads to the development of bifidobacterium-predominant gut microbiota: a double-blind, placebo-controlled trial
Selma-Royo et al. Human milk microbiota: what did we learn in the last 20 years?
Song et al. An investigation into the correlation of intestinal flora with obesity and gestational diabetes mellitus
Yazdi et al. Long-term daily high-protein, drained yoghurt consumption alters abundance of selected functional groups of the human gut microbiota and fecal short-chain fatty acid profiles in a cohort of overweight and obese women
Fijan et al. Probiotic microorganisms and their benefit to human health
Liang et al. Taxonomic and functional shifts of gut microbiome in immunoglobulin A vasculitis children and their mothers
Mollova et al. In vitro Digestion: Exploring the probiotic abilities and metabolization of human milk oligosaccharides by two strains of Limosilactobacillus fermentum isolated from breast milk