CN113453697B - 用于根除幽门螺旋杆菌感染的新颖的益生菌 - Google Patents
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Abstract
获得了新颖的对幽门螺旋杆菌感染具有增强的活性的益生菌克隆。新颖的克隆源自嗜酸乳杆菌和动物双歧杆菌乳酸种的选定菌株。它们有利地不易受到目前用于治疗螺旋杆菌感染的抗生素的影响，这使得它们对幽门螺旋杆菌感染的根除中与所述抗生素的共同治疗是理想的。本文报告了本益生菌之间的组合的协同作用及其对抗生素对幽门螺旋杆菌的活性的强佐剂作用。
Description
发明领域
本发明涉及益生菌微生物及其在医学，尤其是在细菌感染的治疗和预防中的用途的领域。本发明还涉及目的是改善治疗效果，尤其是在治疗和预防幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)感染的领域中的益生菌微生物的修饰。
现有技术
幽门螺旋杆菌是一种革兰氏阴性、耐酸和嗜二氧化碳的微生物，在人类胃中发现其龛影并且其与人一起进化。目前，该菌种感染超过50％的成年全球人口(Hooi)。胃黏膜的定植刺激强烈的局部和全身炎症和免疫应答，其与由细菌产生的有毒物质一起引起10％至20％感染个体的消化性溃疡和1％至3％感染个体的胃癌(Suerbaum S,Michetti P)。
能够通过使用与诸如阿莫西林、克拉霉素、硝基咪唑、氟喹诺酮和四环素的抗生素相关的质子泵抑制剂(PPI)的治疗来实现感染的根除，所述抗生素通常组合使用(Malfertheiner)。这些抗生素的长期使用以产生化学药抗性菌株而结束，并导致治愈率的持续降低。此外，给予抗生素通常产生在许多情况下可能导致治疗暂停的不利影响(Alba)。
除了经典的治疗方案，益生菌微生物(益生菌)的给予最近已确保关于根除百分比的增加和不期望的效果的减少的治疗成功的某些改善(Dang)。使用的益生菌更经常属于乳杆菌(Lactobacillus)属和双歧杆菌(Bifidobacterium)属。嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)和乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)是更通常使用的菌种，因为已经认为向人类给予它们是安全的(Dang,Borriello)。这些生物体是耐酸和耐胆汁的；它们在体外粘附于细胞，并且可以通过产生酸、细菌素等来对幽门螺旋杆菌(H.pylori)施加杀菌活性，参阅例如US2016/0279180。
出版物International Journal of Antimicrobial Agents(抗微生物剂的国际期刊),22,2003 p.360-366描述了嗜酸乳杆菌(菌株CRL639、LB、NAS、DDS-1)和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)(BB536)的特定菌株对幽门螺旋杆菌(H.pylori)的体外抑制活性；该活性被描述为菌株依赖的；该文献还综述了在使用抗生素的共同治疗中使用益生菌微生物的许多研究，其显示对幽门螺旋杆菌根除的不一致的效果：尤其是发现来自不同来源的乳杆菌益生菌是有效或无效的。在FEMS Immunology and Medical Microbiology(FEMS免疫学和医学微生物学),53(1),2008,p.107-113中公布的初步研究中，已经报道了乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)(Bi-07,Bl-04)、嗜酸乳杆菌(La-14,NCFM)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)(Lp-115)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)(Lpc-37)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivaris)(Ls-33)的某些菌株的部分免疫球蛋白增强效果；该效果被限制为IgG，而不是针对IgA或IgM；这些益生菌被描述为潜在地用于增加口服疫苗接种的效果(该研究限于霍乱疫苗接种的患者)，然而总的疫苗接种名称没有增加。专利申请EP2270133公开了两歧双歧杆菌的两个菌株(分别为CP5和LGG)，其对幽门螺旋杆菌具有抗菌性，并且对各种抗生素剂具有抗性；该文献将对幽门螺旋杆菌的抗菌活性归因于这些特定益生菌产生的特定肽代谢物，这些特定肽代谢物不是由相同菌种的其他菌株产生的。总之，甚至在相同益生菌菌种的不同菌株中，上述结果突显了抗菌效果的大的可变性，导致不同菌株对根除感染不可预测地有效或无效；还显示了在霍乱毒素的存在下由某些益生菌菌株引起的对免疫系统的复杂反应，以及从这些益生菌菌株导出具体有效的免疫刺激效用的困难，尤其在存在不同毒素时。
动物乳双歧杆菌(Bifidobacterium animalis lactis)(B94,Lallemand Health Solutions)的菌株也用于治疗除幽门螺旋杆菌感染之外的疾病，例如肠易激综合征。益生菌还可以改善对肠道病原体的免疫应答。能够通过抑制免疫细胞产生促炎和/或刺激免疫细胞分泌消炎细胞因子来获得免疫调节(Foligne)。然而，在该领域中获得的结果已经是不一致的，在某些研究中改善了幽门螺旋杆菌的根除，但在其他研究中没有显著影响(Cekin)。尤其是，已经在不同来源的嗜酸乳杆菌和动物乳双歧杆菌中报道了对幽门螺旋杆菌的活性的大变化，从而阻止了这些菌株中活性的普遍性(Dang)。益生菌对通常用于治疗幽门螺旋杆菌的抗生素的敏感性也是限制益生菌/抗生素组合治疗的实际有效性的因素；尤其是，包括嗜酸乳杆菌的乳杆菌菌种通常易受阿莫西林和克拉霉素的影响，所述阿莫西林是用于幽门螺旋杆菌根除的所有治疗方案的关键/>乳双歧杆菌也易受阿莫西林影响(Morovic)。对红霉素(代表大环内酯)的敏感性是中等的，即低；但是胃中大环内酯的含量(在给予治疗有效量之后)非常可能远高于它们对幽门螺旋杆菌的最小抑制浓度(MIC)。发现双歧杆菌的菌株易变地易受克拉霉素的影响，这可以视为其在治疗幽门螺旋杆菌感染中作为该抗生素的佐剂的有限的成功(Collado)。包括乳杆菌和双歧杆菌菌种的益生菌的组合被用作对幽门螺旋杆菌感染的抗生素治疗的佐剂，然而在这种情况下也具有不一致的结果(McFarland中的综述)。
因此，仍然亟需对涉及使用益生菌试剂的幽门螺旋杆菌感染进行可用的有效治疗。具体需要寻找持续有效的益生菌，即显示稳定和可再现水平的活性，特别是当与特定抗生素疗法组合使用时。其他需求是强烈改善已知抗生素混合物在幽门螺旋杆菌的治疗中的有效性，例如，通过整体幽门螺旋杆菌根除率的强增强和/或协同作用。其他需求是鉴别可靠地能够减少幽门螺旋杆菌感染的治疗方案中使用的抗生素的副作用的试剂，而不损害抗生素的活性水平。
概述
现在已经获得了对抗幽门螺旋杆菌感染具有特别高的活性的新颖的益生菌克隆。新颖的克隆衍生自嗜酸乳杆菌菌株La-14和动物乳双歧杆菌菌株BlI-04，两者都是天然抗左氧氟沙星和甲硝唑。本发明的新颖的克隆对幽门螺旋杆菌具有抗菌和生长抑制活性，并且对通常用于治疗幽门螺旋杆菌感染的抗生素阿莫西林和/或克拉霉素具有抗性：这使得它们对于单独治疗螺旋杆菌感染或与所述抗生素组合的螺旋杆菌感染是理想的。已经验证了新颖的克隆对特定抗生素的抗性水平的稳定性。本文还公开了新颖的益生菌的相互组合的协同作用，以及它们对诸如克拉霉素或阿莫西林的抗生素的幽门螺旋杆菌抑制作用的显著贡献。
附图说明
图1：使用96孔棋盒的肉汤稀释法(金标准法)。
图2：棋盘稀释方案：第一列：抗生素(阿莫西林或克拉霉素)的标量稀释液。第二列：混合上清液的标量稀释液(来自肉汤中过夜培养物的嗜酸乳杆菌或乳双歧杆菌(B.lactis))。从第三列至第12列：上清液和抗生素浓聚物的不同组合。A12孔：阳性对照
图3：用于抑菌协同作用的十字形接种
发明详述
本文中使用的术语“克隆”系指通过从微生物较宽的原始群体选择而衍生的微生物的一部分；与原始群体相比，克隆的微生物将显示更均匀的特征；术语“克隆”还涵盖通过从先前克隆进一步选择而获得的可能的“子克隆”；本文使用的术语“选择”不排除在选择过程期间发生的微生物的结构或基因修饰的可能性，使得最终克隆群体可以包括最初未存在于原始群体内的微生物。除非有不同说明，否则术语“克隆”在本文中无异地指本发明的任何新颖的克隆；本发明的克隆也可以在本文中被称为“本克隆”、“本发明的克隆”、“本发明的益生菌”、“本发明的益生菌微生物”、“本益生菌”、“本发明的益生菌微生物”，在本文中将所有这些用作同义词。
每当在本文中使用时，术语“联合”意味着相关项目的共存和/或共同使用。
术语“共同治疗”或“组合治疗”在本文中是同义的，并且系指使用上下文中指定的两种或更多种活性剂的治疗。
术语“共配制”或“共配制的”是指同一产品中两种或更多种成分的配制。
当参考本克隆使用时，术语“抗生素抗性”系指克隆对抗生素的生长抑制活性的抗性；该性质也被表示为“非敏感性”或“化学药抗性”，它们在本文中用作同义词。
本发明的第一目的是特定益生菌微生物菌株的新颖的克隆，所述克隆由本申请人首次选择和分离。益生菌微生物菌株，本克隆的来源是嗜酸乳杆菌菌株La-14和动物乳双歧杆菌菌株Bl-04。本发明的目的，新颖的克隆如下：
-嗜酸乳杆菌La-14，克隆LAA8，具有保藏编号：DPS RE RSCIC 5；
-嗜酸乳杆菌La-14，克隆LAC6，具有保藏编号：DPS RE RSCIC 6；
-动物乳双歧杆菌Bl-04，克隆BLAC86，具有保藏编号：DPS RE RSCIC 7；
-动物乳双歧杆菌Bl-04，克隆BLA8，具有保藏编号：DPS RE RSCIC 8；以及
-动物如双歧杆菌Bl-04，克隆BLC6，具有保藏编号：DPS RE RSCIC 9。
本发明的五个克隆主要通过其保藏编号来表征。其特征还在于它们的分类起源，是从菌株具体衍生的：嗜酸乳杆菌La-14或乳酸动物双歧杆菌Bl-04。这些菌株是可商购获得的，并且能够从例如Probiotics,Dupont Nabisco(乳酸动物双歧杆菌(B.animalis lactis)Bl-04(ATCC:SD5219)和嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)La-14(ATCC:SD5212)或从/>Vis,Zeta Farmaceutici获得。术语LAA8、LACC6、BLAC86、BLA8和BLC6是新的，并且由申请人在本文中使用以表示本发明的每一不同克隆。上述保藏的克隆还可以由如实验部分中详述的其基因排序表征。
本发明的克隆还可以由其药理学活性表征。它们实际上具有许多有趣的性质，即：(a)对幽门螺旋杆菌的显著活性；(b)当以相互组合使用时，对幽门螺旋杆菌预料不到的协同活性；(c)对通常用于幽门螺旋杆菌根除的抗生素(尤其是克拉霉素和/或阿莫西林)的显著高抗性(即不敏感性)，这使得抗生素在与所述抗生素相关的幽门螺旋杆菌感染的组合治疗中最有用；(d)当与所述抗生素联合使用时，抑制幽门螺旋杆菌感染生长的预料不到的高佐剂效应。
能够通过常规方法来评估本克隆抑制幽门螺旋杆菌生长的活性，例如，通过在幽门螺旋杆菌的固体培养物上接种相关克隆并验证与接种部位对应的生长抑制区的形成/延伸；作为替代示例，可以通过“琼脂孔扩散方法”来评估克隆活性，其中将益生菌混悬物嵌入其上培养幽门螺旋杆菌的琼脂板中挖出的孔中。孵育后，抑制区是可检测的。
能够通过引起超过组合相对于单独克隆的累加效果来评估抑制幽门螺旋杆菌生长的两个或更多本克隆之间的协同作用；可以通过常规方法进行该评估，例如通过在幽门螺旋杆菌的固体培养物的部分重叠区域中单独接种有关的克隆(参阅例如，十字形接种)，并比较重叠和非重叠区域中与接种部位对应的生长抑制区的形成/延伸。本新颖的克隆的所有组合都是本发明的一部分；优选的组合包括：
(i)嗜酸乳杆菌La-14克隆LAA8(保藏号：DPS RE RSCIC 5)和嗜酸乳杆菌La-14克隆LAC6(保藏号：DPS RE RSCIC 6)中的一种或多种；以及
(ii)动物乳双歧杆菌Bl-04克隆BLAC86(保藏号：DPS RE RSCIC 7)；动物乳双歧杆菌Bl-04克隆BLA8(保藏号：DPS RE RSCIC 8)；和动物乳双歧杆菌Bl-04克隆BLC6(保藏号：DPS RE RSCIC 9)中的一种或多种。
能够将本克隆对给定抗生素的抗性水平(非敏感性)评估为抗生素对相关克隆生长的最小抑制浓度(MIC)：高MIC表示相关克隆的高抗性。通过本克隆所示的对抗生素的抗性是特别有利的，因为它涉及目前用于根除幽门螺旋杆菌感染的抗生素，尤其是阿莫西林、克拉霉素及其类似物；考虑到乳杆菌种和双歧杆菌种通常对此类抗生素敏感，该结果的达成甚至更显著。与其他医学治疗中的实践相反，本益生菌克隆典型的抗生素抗性是期望的，因为允许在与抗生素共同治疗中使用益生菌克隆而不被抑制；甚至在根除幽门螺旋杆菌感染后，本益生菌的获得的的抗生素抗性仍然有益于患者，因为所讨论的品种(乳杆菌、双歧杆菌)是肠道菌群的天然组分并且易于以抵抗形式集成在其中，因此也在未来抗生素治疗的情况下保护患者的肠道功能。如实验部分中所支持的，所有本克隆由对阿莫西林和/或克拉霉素以及它们的类似物的高抗性表征；本发明的克隆显示了高于5μM/mL的抗生素抗性水平(表示为相应抗生素对相关克隆生长的MIC)，其通常被认为是高水平的抗生素抗性。具体地，发现克隆LAA8和BL8对阿莫西林具有高抗性；发现克隆LAC6和BLC6对克拉霉素具有高抗性；发现克隆BLAC86对阿莫西林和阿奇霉素均具有高抗性。由于其抗生素抗性更宽的谱，克隆BLAC86在本发明中是特别优选的。
能够通过标准方式评估幽门螺旋杆菌生长的抑制中本克隆对抗生素活性的佐剂效应，通常通过比较存在和不存在相关克隆下抗生素对幽门螺旋杆菌的MIC，其中MIC的降低对应于杀菌活性的增加；具体地，在幽门螺旋杆菌培养物上的体外条件下，能够引起本克隆的佐剂效应：这是特别重要的，因为其支持本益生菌对幽门螺旋杆菌生长的强“直接”抑制效果，即不仅仅是由宿主上的间接免疫刺激效果介导的。如实验部分所支持的，本克隆导致所测试抗生素的杀菌活性显著增加，即相应MIC的100到1000倍降低。该效果也是重要的，因为其允许在益生菌-抗生素组合治疗中实质减少给予抗生素的量，而不会导致幽门螺旋杆菌根除率中功效的降低；较少量地给予抗生素在降低对患者抗生素的累积/副作用的风险上，以及在降低幽门螺旋杆菌的抗生素抗性菌株的形成的风险上具有有利于患者和环境的明显的优点。
本发明的另一目的是提供医用的之前从未分离和/或表征的本发明的益生菌微生物。本发明的另一目的是提供用于治疗或预防需要给予益生菌微生物的任何疾病状态的本发明的益生菌微生物，其中使用本克隆涉及在对未来的或伴随的抗生素治疗的抗性稳定性和高水平方面的特殊优点。本发明还关注治疗或预防需要给予益生菌微生物的疾病状态的方法，其包括向需要所述方法的人或动物患者给予上述益生菌微生物。需要益生菌治疗的疾病状态的实例是：肠道菌群改变和相关的胃肠功能障碍、在影响胃肠系统的疾病之后的虚弱状态、涉及食物同化的降低或不平衡的病症、对食物成分的超敏性或不耐受等。
本发明的另一目的是提供用于治疗或预防幽门螺旋杆菌感染的本益生菌微生物。本发明同样关注治疗或预防幽门螺旋杆菌感染的方法，其包括向需要所述方法的患者给予上述益生菌微生物。本发明同样包括本益生菌微生物在制造用于治疗或预防幽门螺旋杆菌感染的药物中的用途。
如本文所报道的，当使用本发明的新颖的益生菌克隆时，或者当与彼此组合使用时，或者当与对幽门螺旋杆菌感染的抗生素治疗组合使用时，本发明的新颖的益生菌克隆有效抑制幽门螺旋杆菌的生长。
关于给予本益生菌微生物的剂量和方案，没有预见具体限制；这些能够根据患者的具体需求(疾病的程度/过程、患者的通常状态等)而容易地适用。作为非限制性实例，本益生菌微生物的日剂量将包括109至5×1011菌落形成单位(CFU)/天，优选5×109至2.5×1011CFU/天，更优选8×109至1.5×1011CFU/天的，例如，能够提及大约1010；当组合使用一种或多种益生菌微生物时，上述剂量区间意味着涉及使用的所有微生物。
当用于使用抗生素剂的幽门螺旋杆菌感染的共同治疗时，本发明的方法具有特殊优势：益生菌微生物对幽门螺旋杆菌直接有效，并且对常用于对抗该病原体的抗生素，通常为克拉霉素、阿莫西林以及它们的类似物是高度抗性的。关于制剂、剂量和方案没有预见特定的限制：例如，抗生素能够以相同剂型与益生菌共配制，或者通过独立的剂型单独配制：在后一种情况下，能够通过以任何顺序并且以彼此的任何时间间隔形成单独的剂型来实施治疗，条件是能够获得两种试剂的至少部分重叠的血浆浓度。同样在组合治疗的情况下，关于可能的剂量/方案没有预见特定限制：它们能够根据疾病过程/严重性和患者状态而广泛变化。每日剂量的非限制性范例是上面提出的那些。
本发明的另一目的由包含本益生菌微生物表征的并且适于向人或动物患者给予的组合物和相关剂型表示。为了制备组合物和剂型，能够通常以液体或固体形式提供本益生菌微生物，例如悬浮在水性介质中或吸附在诸如颗粒等的合适的载体上。最终组合物可以是药物组合物、食物整合剂或整合食料的形式，均含有本领域中公知的相应的药物/消化可接受的赋形剂和/或成分。当为药物组合物或食物整合剂的形式时，所述组合物可以通过任何给予途径无限制地给予；然而，考虑到当前益生菌作用的肠道部位，优选的给予途径是口服。在后一种情况下，本发明关注了适于口服给予的所有已知剂型；示例性剂型是但不限于：片剂、胶囊、微囊、丸剂、锭剂、糖锭剂(dragées)、粉末、颗粒、微粒、丸粒、生物粘附膜剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、微乳剂、凝胶剂、糖浆、酏剂、咀嚼胶、滴剂、喷雾剂、气雾剂等。当为整合食料的形式时，根据所选择的食料，在常规消化成分的存在下，将以任何可能的形式通过口服途径给予组合物；可能的食料的实例包括饮料、果汁、酸奶、奶油、涂抹酱、奶酪、小吃、棒等。
为了实施组合的益生菌-抗生素治疗，除了本发明的益生菌微生物和引用的赋形剂/成分/食料之外，所有上述组合物可以包含与治疗幽门螺旋杆菌感染有关的一种或多种抗生素；所述抗生素优选选自克拉霉素、阿莫西林以及它们的类似物，后者在本文中被称为“克拉霉素抗生素”(即具有大环内酯结构的抗生素)或“阿莫西林抗生素”(即具有青霉素结构的抗生素)。
对于组合的益生菌-抗生素治疗，本组合物还能够以成套试剂盒的形式提供给使用者，其中所述试剂盒包括本益生菌微生物的供应品和针对幽门螺旋杆菌的抗生素的单独供应品。能够提供上述供应品用于单独或联合给予。对于单独给予，所述试剂盒可以是例如包含含有本发明益生菌的一个或多个剂量单位的泡罩的形式，并且包含抗生素的一个或多个剂量单位是让使用者可以确认的不同剂型；所述试剂盒可以包括一个或多个泡罩，其中不同剂型能够不同地分布。对于联合给予，所述试剂盒可以例如包括允许使用者在给予之前临时地将益生菌和抗生素混合到同一载体中的装置，从而实现两种试剂的简化同时给予。
现在通过以下实施例以非限制性方式进一步公开本发明。
实验
1.抗阿莫西林和克拉霉素的新颖的克隆的分离
将野生型嗜酸乳杆菌La-14和动物乳双歧杆菌Bl-04(益生菌,DupontDanisco)用作起始材料。
对阿莫西林的抗性(MIC)相对较低，即0.5μg/ml嗜酸乳杆菌和0.25μg/ml乳双歧杆菌。对克拉霉素的抗性MIC也低，即0.125μg/ml嗜酸乳杆菌和0.016μg/ml乳双歧杆菌。在重复冷冻/解冻之后和冻干之后，抗性状态是稳定的。
通过琼脂孔扩散法检测对幽门螺旋杆菌的抑菌活性；通过时间-杀菌曲线法检测杀菌活性。
我们在具有增加的抗生素浓度的MRS(Deman Rogosa Sharpe)琼脂中传代培养两种野生型生物体之后分离五种抗生素抗性克隆，从原始MIC的1/4开始，对于阿莫西林高达8μg/ml并且对于克拉霉素高达6μg/ml。将具有最高可能抗性水平的菌株传代培养几次，在甘油肉汤中冷冻或冻干。在冷冻/冻干之后，进行化学药敏感性测试以确认抗性水平的稳定性。对于嗜酸乳杆菌La-14和动物乳双歧杆菌Bl-04，我们能够鉴别并分离对克拉霉素或阿莫西林具有高抗性的克隆；此外，对于动物乳双歧杆菌Bl-04，我们可以鉴别并分离对两种抗生素均具有高抗性的克隆。下面列出了五个分离的克隆，具有抗生素抗性的标记(CLA＝克拉霉素；AMO＝阿莫西林)和根据布达佩斯条约的保藏编号：
-嗜酸乳杆菌La-14克隆LAA8(抗AMO)-保藏编号：DPS RE RSCIC 5
-嗜酸乳杆菌La-14克隆LAC6(抗CLA)-保藏编号：DPS RE RSCIC 6
-动物乳双歧杆菌Bl-04克隆BLAC86(抗AMO和CLA)-保藏编号：DPS RE RSCIC 7
-动物乳双歧杆菌Bl-04克隆BLA8(抗AMO)-保藏编号：DPS RE RSCIC 8
-动物乳双歧杆菌Bl-04克隆BLC6(抗CLA)-保藏编号：DPS RE RSCIC 9。
2.DNA测序
对原始野生型菌株和五个分离的克隆进行DNA测序。原始菌株的DNA和新颖的化学药抗性益生菌的DNA由Dr.Greta Immobile Muraro,Polo d’Innovazione di Genomica,Genetica e Biologia Società Consortile R.L.,Siena，使用MiSeq Reagent Micro Kit在Illumina MiSeq仪器上通过“微生物全基因组测序2x150 PE”进行测序(包括通过高达100倍的生物分析器覆盖率的文库制备、清理和定量)。也将序列与在基因组文库BLAST/NCBI中保藏的野生菌株的那些进行比较，以证明在突变的化学药抗性菌株中完全不存在外源DNA。
与野生嗜酸乳杆菌La-14的DNA序列相比，抗阿莫西林的嗜酸乳杆菌克隆包含了能够导致112种可能的表型变体的11个突变位点。抗克拉霉素的嗜酸乳杆菌克隆包含能够导致205种表型变体的18个突变位点，其。
与野生乳双歧杆菌Bl-04的DNA序列相比，抗阿莫西林和克拉霉素的乳双歧杆菌克隆包含能够导致199种可能的表型变体的19个突变位点，其。抗克拉霉素的乳双歧杆菌克隆包含能够导致199种表型变体的19个突变位点。抗阿莫西林的乳双歧杆菌克隆包含能够导致109种表型变体的11个突变位点。
在原始和抗生素抗性菌株中没有检测到质粒。
以上提及的突变在以下表格中详细描述：
3.抗生素敏感性测试
使用96孔的棋盒，用肉汤稀释法(金标准法)进行对幽门螺旋杆菌和益生菌菌株的抗生素敏感性测试(图1)。所获得的结果表明克隆LAA8和BLA8的8μg/mL阿莫西林抗性(MIC)、克隆LAC6和BLC6的6μg/mL克拉霉素抗性(MIC)以及克隆BLAC86的分别为8μg/mL和6μg/mL的双阿莫西林/克拉霉素抗性(MICs)；所有这些值表明高水平的抗生素抗性。
4.协同作用的评价
为了研究在本发明的框架中选择的嗜酸乳杆菌和乳双歧杆菌菌株之间的生长抑制的可能的协同作用，我们执行了十字形接种。
在微有氧条件下，于37℃，将幽门螺旋杆菌菌株在选择性琼脂中培养72小时，然后以对应于3McFarland浊度标准的密度悬浮在无菌盐溶液中，并且用棉签在三个方向上向MHF(Mueller Hinton Fastidious)琼脂板上划线。在每一琼脂板中，沿着两条垂直线接种嗜酸乳杆菌La-14和乳酸动物双歧杆菌Bl-04；在每一线中接种1010个细胞。然后，将板在37℃下孵育48至72小时。之后，检查板是否存在抑制生长的芦荟(参见图3)。
将La-14菌株和克隆与Bl-04菌株和克隆共同接种以确定协同作用的存在。在阴性对照中，在垂直接种线(La-La或Bl-Bl)中使用相同的菌株/克隆。在板的边缘处和板半径的1/2处(我们的板中2cm)用毫米尺测量抑制区。
在板边缘处的抑制区源自单个菌株的抑菌活性，靠近板中部的抑制区源自两个菌株的活性(图3)。如果抑制区倾向于朝向板的中部增大(虚线)，则抑菌效果是协同的。具体地，我们确定板的1/2半径是距接种的交点的合理的距离，使得在此测量的抑制不源自仅添加相应的抑制区，突出真正的协同作用。我们确实观察到抑制区从板的边缘向中心的增加，当La菌株或克隆与Bl菌株或克隆共同接种时，在观察区(板半径的中间，距中心2cm处)中变得完全明显。这在阴性对照中不发生(接种于两条垂直线的相同菌株/克隆)。在不存在或存在抗生素(阿莫西林和/或克拉霉素，仅用于克隆)的情况下，在不同培养基(Muller HiltonFastidious或Agar Pylori)中进行的独立实验中一致地观察到该协同作用。在以下表格中报告所获得的数据：
/>
*已减去接种的厚度
**2cm
以上报告的测试证实在本发明菌株(或相应克隆)之间抑制幽门螺旋杆菌生长的协同作用，因为它们的组合接种将抑制区从边缘增加到读取点(半径的1/2)，而源自阴性对照(菌株或对其自身的克隆)的抑制区在相同的读数点保持稳定。这些数据进一步确认观察到的增加不取决于较高浓度的细胞(事实上，阴性对照含有与阳性对照相同量的细胞)。
也将板的边缘处抑制区的存在考虑为每个菌株“本身”对幽门螺旋杆菌的抗菌活性的重要指标，即不考虑与共同给予的抗生素试剂的可能效果和/或对生物体可能的通用免疫刺激效果。在“琼脂孔扩散”实验中进一步证实了该活性。即使在体外观察到杀菌活性，也实施“时间杀菌曲线”。La-14和Bl-04在3小时内引起三个对数(从108cfu/ml到105cfu/ml)的幽门螺旋杆菌活计数的减少，并且在72小时内引起幽门螺旋杆菌的全部杀灭。这里重要的是，注意到仅免疫刺激活性(对某些益生菌偶尔在文献中报告)通常不足以根除感染，特别是在幽门螺旋杆菌的情况下；事实上，该细菌导致免疫应答的弱激活，其本身负责该感染的致病性的一部分。相反地，本发明菌株对幽门螺旋杆菌的直接抑制活性的存在使得它们不仅用作佐剂，而且用作针对幽门螺旋杆菌感染的主要治疗剂。此外，当在与抗生素的组合治疗中使用时，本益生菌不具有仅作为辅助免疫刺激剂的资格，因为这些益生菌施加直接的抗菌活性，该抗菌活性增强共同给予的抗生素试剂的抗菌活性，从而为有效的组合治疗提供了基础。
5.益生菌上清液对抗生素活性的佐剂效应
为了研究嗜酸乳杆菌La-14和动物乳双歧杆菌Bl-04对阿莫西林和克拉霉素的抗螺旋杆菌活性的可能的佐剂或有利效应，将棋盘法用在96孔板上。将MRS肉汤中培养的200μl益生菌上清液倒入第一列的第一个孔(H1，起始浓度，1:2)中，并将200μl的抗生素倒入第一列的其他孔(H2-H12)中；将含有10％的灭活胎牛血清的100μl布鲁杆菌(Brucella)肉汤添加到剩余的孔中。在水平方向上将所有物质双倍稀释后，将100μl益生菌上清液添加到含有不同浓度的抗生素的第三列的每一孔(H3-A3)中；然后，在垂直方向上进行萃取物的稀释。A12孔是阴性对照(没有任何物质，图2)。以这种方式，从第三列向下的每一不同孔包含不同浓度的两种物质。将来自48小时板培养物的细菌以每ml 108个生物体悬浮在布鲁杆菌肉汤中。将2微升的细菌混悬液滴加至含有不同浓度的待检查物质的96个孔中的每一孔中。37℃下在微氧环境中将微板孵育24小时。确定肉汤稀释液的MIC(首先不是浑浊的孔)。然后将3μl混合物从每一孔传代培养到含有幽门琼脂的Petri培养皿上；37℃下在微有氧环境中将培养皿孵育3天。MBC被认为是抗生素的最低浓度，抗生素在琼脂上的传代培养物显示了完全不存在细菌生长。结果是两次测定的平均值。所有测试一式二份进行并重复三次。
所获得的结果如下：
针对幽门螺旋杆菌菌株，克拉霉素MIC为12μg/ml(MBC:24μg/ml)。阿莫西林的MIC为0.25μg/ml(MBC:0.5μg/ml)。当将益生菌上清液添加到抗生素时，我们观察到MIC值和MBC值两者的强烈降低：
-克拉霉素MIC变成0.125μg/ml，几乎是原始MIC的1/100(以相同的方式，MBC变成0.25μg/ml)。
-阿莫西林MIC变成0.00025μg/ml，是原始MIC的1/1000(以相同的方式，MBC变成0.0005μg/ml)。
因此，针对幽门螺旋杆菌的抗生素活性增加了100倍(克拉霉素)和1000倍(阿莫西林)。
以上数据系指嗜酸乳杆菌La-14；对乳双歧杆菌Bl-04发现相同的结果。
总之，本嗜酸乳杆菌和乳双歧杆菌菌株证明以巨大的方式增加针对幽门螺旋杆菌的抗微生物活性。此外，当在体外一起测试时，它们表现出针对幽门螺旋杆菌的强抗菌协同作用。DNA测序证明质粒完全不存在。两个化学药抗性菌种的核苷酸突变的数目将其配置为与原始克隆完全不同的新变体。
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/>
/>
/>
Claims (12)
1.益生菌微生物，其选自：
-嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)La-14克隆LAA8，具有保藏编号：DPS RERSCIC 5；
-嗜酸乳杆菌La-14克隆LAC6，具有保藏编号：DPS RERSCIC 6；
-动物乳双歧杆菌(Bifidobacterium animalis lactis)Bl-04克隆BLAC86，具有保藏编号：DPS RE RSCIC 7；
-动物乳双歧杆菌Bl-04克隆BLA8，具有保藏编号：
DPS RE RSCIC 8；和
-动物乳双歧杆菌Bl-04克隆BLC6，具有保藏编号：
DPS RE RSCIC 9，
以及它们的组合。
2.如权利要求1所述的组合的益生菌微生物，其包含：
-嗜酸乳杆菌La-14克隆LAA8，具有保藏编号：DPS RE RSCIC 5和嗜酸乳杆菌La-14克隆LAC6，具有保藏编号：DPS RE RSCIC 6中的一种或多种；以及
-动物乳双歧杆菌Bl-04克隆BLAC86，具有保藏编号：DPS RE RSCIC 7，动物乳双歧杆菌Bl-04克隆BLA8，具有保藏编号：DPS RE RSCIC 8和动物乳双歧杆菌Bl-04克隆BLC6，具有保藏编号：DPS RE RSCIC 9中的一种或多个种。
3.益生菌微生物在制备用于治疗或预防幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori)感染的药物中的用途，所述益生菌微生物选自：
-嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)La-14克隆LAA8，具有保藏编号：DPS RERSCIC 5；
-嗜酸乳杆菌La-14克隆LAC6，具有保藏编号：DPS RERSCIC 6；
-动物乳双歧杆菌(Bifidobacterium animalis lactis)Bl-04克隆BLAC86，具有保藏编号：DPS RE RSCIC 7；
-动物乳双歧杆菌Bl-04克隆BLA8，具有保藏编号：
DPS RE RSCIC 8；和
-动物乳双歧杆菌Bl-04克隆BLC6，具有保藏编号：
DPS RE RSCIC 9。
4.如权利要求3所述的用途，其中所述药物包括针对幽门螺旋杆菌感染的抗生素。
5.如权利要求4所述的用途，其中所述抗生素包含阿莫西林和/或克拉霉素。
6.组合物，其包含权利要求1或2所述的一种或多种益生菌微生物，药物可接受的赋形剂和/或用于消化用途的成分。
7.如权利要求6所述的组合物，其还包含针对幽门螺旋杆菌感染的一种或多种抗生素。
8.如权利要求7所述的组合物，其中所述抗生素包含阿莫西林和/或克拉霉素。
9.如权利要求6至8中任一权利要求所述的组合物，其为适于口服给药的形式。
10.如权利要求9所述的组合物，其为选自片剂、胶囊、微囊、丸剂、锭剂、糖锭剂、粘附膜剂、粉末、颗粒、溶液剂、混悬剂、乳剂、微乳剂、脂质体、凝胶剂、糖浆、酏剂、咀嚼胶、滴剂、喷雾剂、气雾剂的形式。
11.成套试剂盒，其包含权利要求1或2所述的益生菌微生物和针对幽门螺旋杆菌的抗生素。
12.如权利要求11所述的成套试剂盒，其为包含权利要求1或2所述的益生菌微生物的一种或多种剂型和包含针对幽门螺旋杆菌的所述抗生素的一种或多种剂型的泡罩形式。
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