TWI404540B - 植物乳桿菌ｌｐ２３及其在抑制幽門螺旋桿菌的用途 - Google Patents

Description

植物乳桿菌LP23及其在抑制幽門螺旋桿菌的用途

本發明係關於一種乳酸菌，特別是一種具有抑制幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori )能力之植物乳桿菌。

幽門螺旋桿菌( Heli cobacter pylori )屬革蘭氏陰性菌，係近十年來臨床醫學發展上極重要的人類致病菌之一，幽門螺旋桿菌會感染宿主的胃組織、十二指腸等區域，導致胃黏膜發炎、引發一系列消化道疾病；目前已知多種臨床胃部疾病如胃炎(Gastritis)、胃潰瘍(Gastric Ulcer)、萎縮性胃炎(Atrophic Gastritis)、消化性潰瘍(Peptic Ulcer)、十二指腸潰瘍(Duodenal Ulcer)，甚至是胃癌(Gastric Cancer)都與胃幽門螺旋桿菌的感染有直接的關係，根據流行病學的調查及統計，全球約有5成人口受胃幽門螺旋桿菌的感染，在開發中國家之感染率更高達8成，且大多數人在成年前就已受胃幽門螺旋桿菌感染，可見胃幽門螺旋桿菌在臨床醫學上之影響力。

臨床治療胃幽門螺旋桿菌的方式多採用三重療法(Triple Therapy)，主要係合併兩種抗生素及一種質子孔道抑制劑(Proton-Pump Inhibitor)進行治療，舉例說明之，目前台灣地區成功大學附設醫院對於幽門螺旋桿菌所引發消化道疾病係採用抗生素安默西林(Amoxicillin)、克那每欣(Clarithromycin)，搭配制酸劑奧美拉唑(Omeprazol)之組合進行治療，然而該三重療法治療胃幽門螺旋桿菌之成功率僅為80-95%，且多數患者仍無法免除併發消化性潰瘍的危機，並且，該療法以抗生素為主，服用後會影響患者正常腸內菌株的分佈，導致腹痛、腹瀉或脹氣等副作用產生，再者，長期使用抗生素易引發細菌抗藥性的問題，使得該三重療法之治癒率更加不樂觀；另外，三重療法的花費較高，往往造成患者沉重的負擔卻無法有效治癒疾病。

近年來陸續有利用益生菌治療幽門螺旋桿菌感染的相關報導，經研究發現特定的乳酸菌(Lactic Acid Bacteria，簡稱LAB)具有抑制胃幽門螺旋桿菌生長的功能，包含嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus )、鼠李糖乳桿菌(L. rhamnosus )、約氏乳酸桿菌(L. johnsonii )、乾酪乳桿菌(L. casei )、加氏乳酸桿菌(L. gasseri )以及雷特氏B菌(Bifidobacterium lactis )等，而其抑制胃幽門螺旋桿菌生長的機制目前尚未完全明瞭，可能係透過細菌分泌的代謝產物、如乳酸、細菌素等物質、抗菌胜肽(Antimicrobial Peptides)，菌體內的蛋白質或是競爭在胃細胞上的吸附來抑制胃幽門螺旋桿菌的生長。臨床試驗中也發現乳酸菌有效提升胃幽門螺旋桿菌的清除率，降低三重療法所引起的副作用，具有提升胃幽門螺旋桿菌治癒率之成效。

目前已有多種習知乳酸菌用於製備具有預防或治療幽門螺旋桿菌相關疾病之商品，然而該習知乳酸菌之抑菌效果較差且多為厭氧菌，即在有氧環境下無法生長或者生長狀況極差之菌株，該習知乳酸菌之正常生長需處於無氧環境，因此，該習知乳酸菌於操作過程或各類抗菌商品製程中須增設微生物厭氧培養之設備及相關耗材，增加商品製造成本；此外，該習知乳酸菌係發酵於乳製飲品，使該習知乳酸菌分泌大量乳酸以達到抑制幽門螺旋桿菌生長之效果，如市售之發酵乳品等，然而，該習知乳酸菌僅能以所分泌之代謝產物或菌體蛋白質產生抑菌作用，而不具有對宿主消化道細胞之吸附能力，無法有效競爭幽門螺旋桿菌在胃細胞之生長空間，因而抑菌效果受限，特別是針對一些具有抗藥性的幽門螺旋桿菌菌株；再者，習知乳酸菌需培養於乳製品，經醱酵作用產生乳酸才具有抑制效果，但多數東方人口無法耐受乳糖(即乳糖不耐症)，對於乳製品之接受度較差，不適合藉由該習知乳酸菌所開發、生產之發酵乳品治療或預防幽門螺旋桿菌感染；由此，習知乳酸菌在抑制幽門螺旋桿菌之應用上仍有再改進的空間，宜開發新的乳酸菌菌株以克服習知乳酸菌在商品應用所需成本較高、抑菌效果不佳及應用商品化空間較狹窄之問題。

本發明之主要目的係提供一種抑制幽門螺旋桿菌之乳酸菌，具有較佳的環境適應力，可在厭氧、微需氧或大氣環境下生長。

本發明之次一目的係提供一種抑制幽門螺旋桿菌之乳酸菌，可用以製備非乳類培養基之商品。

本發明之又一目的係提供一種抑制幽門螺旋桿菌之乳酸菌，可針對幽門螺旋桿菌之臨床抗藥性菌株具有抑制效果。

本發明之再一目的係提供一種抑制幽門螺旋桿菌生長之乳酸菌，具有胃細胞之吸附特性以長時間限制幽門螺旋桿菌於宿主消化道之生長。

本發明之又一目的係提供一種乳酸菌及其代謝產物之用途，係將一抑制幽門螺旋桿菌之乳酸菌用以製備抑制幽門螺旋桿菌感染之食品組成物或藥物組成物。

為達到前述發明目的，本發明所運用之技術手段及藉由該技術手段所能達到之功效包含有：一種抑制幽門螺旋桿菌之乳酸菌，係屬植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum )，寄存編號為BCRC910466。

一種乳酸菌及其代謝產物之用途，係將寄存編號為BCRC910466之植物乳桿菌，用以製備抑制幽門螺旋桿菌感染之食品組成物或藥物組成物。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明一種抑制幽門螺旋桿菌之乳酸菌，係自一傳統醃製醬菜中選殖得一植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum )，命名為LP23；該植物乳桿菌LP23係具有環境耐受能力、非乳類培養環境之生存能力、幽門螺旋桿菌之殺菌能力及宿主細胞吸附特性，相較目前已應用於各種市售發酵乳品之習知乳酸菌具有較佳之抑菌能力及抑菌效果，可應用於製備治療或預防消化道潰瘍之商品。

本發明之植物乳桿菌LP23係經由以下各方式處理而獲得，包含：乳酸菌之培養、乳酸菌之篩選、乳酸菌之鑑定及乳酸菌之保存：

1.乳酸菌之培養

此部分係為分離傳統醃製醬菜中所含有之乳酸菌，進行培養。取樣自一醬菜樣品，置於一培養液增殖培養(Enrichment Culture)，待適當培養時間後將該培養液進行序列稀釋，另接種至一培養基，挑選可生長之菌株。本實施例之增殖培養係將該傳統醃製醬菜以1:50之體積比例接種於一液態MRS培養基(MRS Broth)，以37℃培養20小時，得一增殖培養菌液，再以不同比例稀釋該增殖培養菌液，將稀釋後之增殖培養菌液以塗抹法接種一固態MRS培養基(MRS Agar)，挑選可生長之菌株；該液態MRS培養基與固態MRS培養基之配方如下表所示。

2.乳酸菌之篩選

此部分係為自傳統醃製醬菜培養而得的數種乳酸菌中，篩選出對幽門螺旋桿菌具有較佳抑制效果之非厭氧乳酸菌菌株。由於多數習知乳酸菌為厭氧菌，即在有氧環境下無法生長或者生長狀況極差之菌株，使得應用該乳酸菌之商品製造成本較高，故本發明在篩選菌株時主要係針對非厭氧環境下得以生長，且具有抑制幽門螺旋桿菌效果之菌株做抑菌試驗，同時測試習知比菲德氏菌(Bifidobacterium spp .)a和b之抑菌效果以玆比較。

請參照第3表所示，本實施例係將所分離的數株乳酸菌及習知比菲德氏菌a和b以紙錠擴散試驗(Disk Diffusion)判別各乳酸菌抑制幽門螺旋桿菌效果，以3500 rpm之轉速將乳酸菌菌體沉澱且分離，所得之上清菌液再以0.22微米(μm)之濾膜過濾，以獲得完全不含菌體之培養液，該培養液以冷凍乾燥法濃縮至蛋白質濃度為2500奈克/微升(ng/μl)，滴入商用紙錠(BBL，Becton，Dickinson System)以製成數試驗紙錠。將該試驗紙錠貼於幽門螺旋桿菌之培養基，分別以適當供氧條件培養2天，觀察該試驗紙錠所呈現之抑制圈大小，以下所測量之數值皆包含紙錠直徑。

^* 本實施例所採用之幽門螺旋桿菌(No.1~3)係分別由台灣醫療院區所篩選之臨床致病菌株

由第3表結果，本發明之植物乳酸菌相較於其他習知乳酸菌，其對於幽門螺旋桿菌的抑制效果較佳，對不同臨床致病菌株所產生之抑制圈大小，於微需氧環境下約為14.33~16毫米(mm)，於大氣環境下約為14.67~16.33毫米；而習知比菲德氏菌a和b之抑制圈大小分別落於10.75~12.33毫米及8.25~11毫米；由此可證實，本發明之植物乳桿菌，不僅能在一般大氣環境下培養、生長，其抑制幽門螺旋桿菌之效果也較該習知乳酸菌佳，以該植物乳桿菌LP23進行商品化之成本開銷相對降低，同時具有較佳之抑菌效果。

3.乳酸菌之鑑定

此部分係依照該乳酸菌之物理型態、生理特性或分子特徵等判斷其菌種分類。本實施例將該乳酸菌進行革蘭氏染色、觸酶反應及16SrDNA之分子鑑定，由該乳酸菌之染色圖(結果為革蘭氏陽性菌)、16SrDNA部分序列[於美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology；NCBI)之序列比對資料庫(BLAST)所得相似度達99%之菌種為Lactobacillus plantarum ，編號為EU419598.1，序列長度為1945bp]及觸酶反應試驗(觸酶反應陰性)等鑑定結果確定本發明之乳酸菌係為一植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum )，寄存編號為BCRC910466，命名為植物乳桿菌LP23。

4.乳酸菌之保存

此部分係為使該植物乳桿菌LP23可以穩定於低溫環境下長久存放，以便後續使用。將本發明之植物乳桿菌接種至固態MRS培養基，以37℃培養48小時後挑選單一菌落轉殖至腦心萃取培養液(BHI broth，配方如第4表所示)，以進行冷凍保存；該BHI培養液中較佳係包含30%之抗凍劑(如甘油)，暫存於-80℃之恆溫保存室，待後續使用。

為證實本發明之植物乳桿菌LP23係具有較佳之抑菌能力及抑菌效果，係分別測試該植物乳桿菌LP23在不同培養環境下之抑菌能力，以及該植物乳桿菌LP23相較於其他習知乳酸菌對於臨床幽門螺旋桿菌致病菌之抑制性，觀察其對於幽門螺旋桿菌的殺菌結果。

請參照第1a及1b圖所示，係本發明之植物乳桿菌LP23分別培養於不同培養基上所表現之抑菌能力。將該植物乳桿菌LP23分別培養於一MRS培養基(1a圖)及一豆漿(1b圖)中，以紙錠擴散法的方式針對數株幽門螺旋桿菌(No.1~3)進行殺菌能力之比較(詳細情形如下方第5表)。本實施例係將保存於-80℃恆溫保存箱之植物乳桿菌LP23移至該固態MRS培養基中進行培養(37℃)，使該植物乳桿菌LP23之生長活性可以完全回復再進行增殖培養(液態MRS培養基，37℃，培養20~24小時)，將所增殖之植物乳桿菌LP23轉殖至該MRS培養基及豆漿中，培養16~18小時後取適量(如100 μl)之菌液直接添加至幽門螺旋桿菌培養基(Brucella Agar Plate)上，該幽門螺旋桿菌培養基已預先挖好直徑約為8毫米的孔洞，觀察其抑制圈的大小以評估各組菌液對於幽門螺旋桿菌殺菌能力之比較；其中，依下表所示共9組實驗組之控制組，分別係以等量(如100 μl)未接種菌株之各實驗組培養基取代菌液進行抑菌試驗，用以對照添加該植物乳桿菌LP23對於不同幽門螺旋桿菌菌株所表現之抑菌能力的差異。

^* 本實施例所採用之幽門螺旋桿菌(No.1~3)與上方第3表所示之幽門螺旋桿菌來源相同。

由第1a及1b圖顯示，不同培養環境且不同幽門螺旋桿菌之控制組，其抑制圈大小約為7~9毫米(mm)，以此對照添加該植物乳桿菌LP23對於不同幽門螺旋桿菌(No.1~3)菌株所表現之抑菌能力的差異；培養於MRS培養基(第1a圖)之植物乳桿菌LP23相較於控制組所呈現之抑制圈大小約為15~18毫米，證明該植物乳桿菌LP23在MRS培養基環境下，對於不同幽門螺旋桿菌菌株具顯著之抑菌能力(由1a-1，1a-2及1a-3結果)；而培養於豆漿(第1b圖)之植物乳桿菌LP23相較於對照組也具有較佳之幽門螺旋桿菌抑制力，所呈現之抑制圈大小約為14.5~18毫米，對於不同幽門螺旋桿菌菌株所表現之抑菌能力皆相近(由1b-1，1b-2及1b-3結果)；由此結果得知，該植物乳桿菌LP23係具有良好之抑菌能力，並且，即使培養於一未含乳品成分之培養環境仍具有良好之殺菌效果，因此，該植物乳桿菌LP23具有較廣泛之可應用空間。

請參照第6表所示，係該植物乳桿菌LP23施用於數幽門螺旋桿菌臨床致病菌株的抑菌效果；該幽門螺旋桿菌致病菌株係篩選自台灣醫療單位，挑選具有多重抗藥性或能引發胃癌等消化道疾病之致病菌株共13株以進行紙錠擴散試驗。本實施例係收集成大醫院所分離之數幽門螺旋桿菌，依照分離患者的病歷資料將該幽門螺旋桿菌予以分群，如胃炎(Gastritis)為G群，胃癌(Gastric Cancer)為GC群，而十二指腸潰瘍(Duodenal Ulcer)則歸為DU群；該幽門螺旋桿菌遵照標準操作流程(Clinical and Laboratory Standards Institute；CLSI)之程序進行抗生素抗藥性的試驗，分別測量該幽門螺旋桿菌對安默西林(Amoxicillin)、克那每欣(Clarithromycin)、弗滴浄(Metronidazole)與信諾隆(Ciprofloxacin)等抗生素的最小抑菌濃度，若其最小抑菌濃度超過抗生素的臨界濃度，則定義為抵抗型，舉例說明之，若該幽門螺旋桿菌對安默西林抗生素之最小抑菌濃度超過0.5微克/毫升(μg/ml)，則定義為安默西林抗生素抵抗型，而可以抵抗超過一種以上抗生素，則定義為多重性抗藥型(Multiple Drug-Resistant Strain)，該幽門螺旋桿菌之詳細分類結果如第6表。

^* R係指該幽門螺旋桿菌為多重性抗藥型菌株

由第6表結果，本發明之植物乳桿菌LP23對於13株幽門螺旋桿菌之臨床致病菌株具有良好的抑制效果，可呈現10~15毫米左右之抑制圈，其中，該植物乳桿菌LP23對於引起十二指腸潰瘍、胃炎及胃癌的幽門螺旋桿菌皆有良好的抑菌效果(由6-1~5，6-6及6-10等結果而知)；並且，對於具有多重抗藥性的幽門螺旋桿菌仍具有顯著的殺菌效果(由第6-6~6-13結果所示)；因此，再次證實本發明之植物乳桿菌LP23具有較佳的抑菌效果，即使是對於多重性抗藥型之幽門螺旋桿菌，或常見引起十二指腸潰瘍、胃癌之幽門螺旋桿菌皆具有良好的殺菌效果。

為了解本發明之植物乳桿菌LP23對胃组織細胞之吸附能力，將植物乳桿菌LP23進行螢光標定，使菌株可產生螢光，再將所標定之菌株對一胃細胞進行吸附試驗，觀察該胃細胞之螢光強度變化；本實施例係依照Sheu等人於2007年所發表之方式進行試驗，係利用一螢光處理套組(PKH2 Green Fluorescence Cell Linker Kit；Sigma,Missouri，USA)進行菌株之螢光標定，所標定的菌株可產生綠色螢光，將定量之菌株分別針對一胃上皮細胞進行吸附試驗，其較佳吸附濃度係MOI=100，即以5 x 10⁷ CFU之乳酸菌菌株吸附5 x 10⁵ 顆胃上皮細胞，本實施例所選用之胃上皮細胞係一人類胃上皮細胞腺腫瘤細胞株AGS與MKN45，分別係購自台灣食品工業發展研究所及日本HS研究資源銀行(Health Science Research Resources Bank)，本發明植物乳桿菌LP23之詳細吸附情形紀錄於下表：

請參照第2a及2b圖所示，係本發明之植物乳桿菌LP23吸附兩組胃上皮細胞後所顯示之螢光強度；其中，螢光標定之乳酸菌在吸附AGS細胞株後，該AGS細胞所表現之螢光強度明顯增強，其螢光強度(Gmean)最高峰約為15(第2a圖)，顯示該乳酸菌LP23具有吸附至AGS細胞株的能力，另外，該乳酸菌LP23在吸附MKN45細胞株後，該MKN45細胞所表現之螢光強度同樣有顯著的增強趨勢，其螢光強度(Gmean)最高峰約為13(第2b圖)，顯示該植物乳桿菌LP23具有吸附至MKN45細胞株的能力；由上可知本發明之植物乳桿菌LP23具有吸附到人類胃上皮細胞的能力，因幽門螺旋桿菌僅吸附宿主之胃部細胞，而本發明之乳酸菌LP23可以停留在胃組織細胞上，在體內發揮較佳之抑菌能力。

由上所述，本發明之植物乳桿菌LP23可以在厭氧、微需氧及大氣環境下生長，並且，該植物乳桿菌LP23具有優於市售發酵乳品的抑菌效果，可有效抑制臨床上多重性抗藥型之幽門螺旋桿菌，或其他常見引起消化道潰瘍之幽門螺旋桿菌；該植物乳桿菌LP23在不含乳品的培養環境下，同樣具有顯著的殺菌能力，可廣泛應用於商用治療或預防幽門螺旋桿菌感染之產品製備，如保健食品、醫用製劑或加工食品等；該植物乳桿菌LP23可以單獨或混合其他所需成分(如載劑、營養成分等)加工製成各種產品形式，如錠劑、膠囊、飲品、粉末或滴劑等，可以係由各種方式給予個體，以有效控制幽門螺旋桿菌之感染，及其所引發之消化道疾病；該植物乳桿菌LP23可以吸附於胃細胞組織，停留於宿主之胃部環境以產生較佳之抑菌能力。

本發明一種抑制幽門螺旋桿菌之植物乳桿菌LP23，係具有較佳的環境適應力，可在厭氧、微需氧或大氣環境下生長，並有效抑制幽門螺旋桿菌，具有降低生產成本之功效。

本發明一種抑制幽門螺旋桿菌之植物乳桿菌LP23於豆漿或多樣培養基等非乳類培養環境下，皆具有良好的殺菌效果，為本發明功效。

本發明一種抑制幽門螺旋桿菌之植物乳桿菌LP23，可有效抑制胃幽門螺旋桿菌之臨床抗藥性菌株，以及臨床上引發十二指腸潰瘍、胃癌之致病菌株，具有較佳抗菌效果之功效。

本發明一種抑制幽門螺旋桿菌之植物乳桿菌LP23，係具有宿主胃細胞之吸附能力，可限制幽門螺旋桿菌於宿主消化道之生長，具有較佳抑菌能力之功效。

本發明一種植物乳桿菌LP23之用途，係將如上所述之一種抑制幽門螺旋桿菌之植物乳桿菌LP23應用於商用抑菌產品的製備，以進一步控制幽門螺旋桿菌感染，為本發明之功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

第1a圖：本發明植物乳桿菌LP23於MRS培養基上所表現之抑菌能力示意圖。

第1b圖：本發明植物乳桿菌LP23於豆漿上所表現之抑菌能力再一示意圖。

第2a圖：本發明植物乳桿菌LP23之胃細胞吸附能力示意圖。

第2b圖：本發明植物乳桿菌LP23之胃細胞吸附能力又一示意圖。

Claims (2)

1. 一種抑制幽門螺旋桿菌之乳酸菌，係屬植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum )，寄存編號為BCRC910466，其中，該植物乳桿菌之16SrDNA部分序列與國家生物技術信息中心編號為EU419598.1之植物乳桿菌的16SrDNA相似度為99%，且該植物乳桿菌係培養於未含乳品之培養環境。
2. 一種乳酸菌及其代謝產物之用途，係將依申請專利範圍第1項所述之植物乳桿菌，用以製備抑制幽門螺旋桿菌感染之食品組成物或藥物組成物。