CN114806958B - 胃源性凝结芽孢杆菌bcf-01及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF‑01及其应用，所述胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF‑01的保藏编号为GDMCC62386。本发明的发明人从健康人群的胃黏膜组织中筛选到一株胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF‑01，该菌株具有很强的耐酸能力和胃内高度增殖能力，对胃上皮细胞GSE‑1细胞具有较强的黏附特性，能有效应用于抑制幽门螺杆菌生长，预防和/或有效抑制幽门螺杆菌相关性胃炎，且无明显副作用。

Description

胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，更具体地，本发明涉及一株胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01及其应用。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种革兰氏阴性螺杆状、微需氧的营养苛求细菌。1983年，由马歇尔医生首次从一位慢性活动性胃炎患者的胃黏膜组织中分离培养得到。2017年10月27日，幽门螺杆菌在世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单中被列为一类致癌物。幽门螺杆菌多通过宿主进食摄入，借助其鞭毛运动穿过黏液层，定植于胃黏膜基层和十二指肠部位。随后，幽门螺杆菌带有的多个毒力基因和致病岛可以产生影响胃部炎症的毒力因子，并可以产生尿素酶中和胃酸，这使其成为胃肠道最主要的流行性致病菌之一，我国的幽门感染率已达55.8％。
幽门螺杆菌感染可以引起多种系统的疾病，甚至包括帕金森、慢性支气管炎、缺铁性贫血、白血病等。其中，消化系统的疾病是最为主要的，如消化性溃疡、慢性胃炎、胃癌等。幽门螺杆菌在胃部的感染进程后期还会引起胃肠上皮化生，肠型上皮细胞将会替代胃粘膜上皮细胞。这主要由胆汁酸反流和幽门螺杆菌相关炎症所驱动。幽门螺杆菌相关胃炎的进程是从正常胃粘膜发展成慢性浅表性胃炎，然后发展为慢性萎缩性胃炎，进一步进行肠化生、异型增生，最后发展为胃癌。在萎缩性胃炎前的阶段，这种疾病进程是可以扭转和恢复的，但进展到萎缩性胃炎后，就难以再逆转疾病的进一步恶化了。
治疗幽门螺杆菌的常见疗法是三联或四联法：铋剂+质子泵抑制剂+一到两种抗生素。该种疗法对大部分初次感染的非耐药菌株多数有效，但也有明显的副作用和局限性，如抗生素的耐受性、胃肠道的不良反应如恶心腹痛腹泻及菌群的紊乱等，这也会进一步导致幽门螺杆菌耐药株的增加。幽门螺杆菌在生长条件和环境因素不利时，会减缓甚至停止代谢并形成球形体。在患者体内，它可以在抗生素和体内不利因素的诱导下可形成球形体，该形态的幽门螺杆菌进入休眠期，且具有耐药性，这导致了常规抗生素难以彻底清除幽门螺杆菌。这也是幽门螺杆菌感染易复发的原因之一，随之导致的多次诊治也使患者依从性下降。因此，有必要寻求一种比以往疗法更可靠的、天然、副作用少、疗程短而高效的治疗方式。
近年来的研究希望通过益生菌、益生元、植物提取物、生物活性蛋白、多糖等非抗生素物质来对抗幽门螺杆菌感染。但是目前为止，现有菌株主要以粪便或乳制品为来源，且这些菌株大多用于饲料、食品添加剂，存在在胃部定植能力差且抑制幽门螺杆菌效果不强等问题。
发明内容
基于此，本发明的目的之一是提供一株人胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmanniacoagulans)BCF-01，该胃源性凝结芽孢杆菌能够预防和/或治疗幽门螺杆菌引起的胃肠道疾病。
实现上述发明目的的具体技术方案包括如下：
一株胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01，所述胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01的保藏编号为GDMCC No.62386。
本发明还提供了一种胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01的培养物或代谢产物，所述胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01的保藏编号为GDMCC No.62386。
本发明还提供了上述胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01、或胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01的培养物或代谢产物在制备预防和/或治疗幽门螺杆菌感染引起的胃肠道疾病的产品中的应用。
在其中一些实施例中，所述胃肠道疾病为胃溃疡、胃炎、功能性消化不良或胃癌。
本发明还提供了一种预防和/或治疗幽门螺杆菌感染引起的胃肠道疾病的产品，所述产品的活性成分包括上述胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01、或所述产品的活性成分包括上述胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01的培养物或代谢产物。
在其中一些实施例中，所述活性成分的有效剂量为106CFU/g～1010CFU/g。
在其中一些实施例中，所述活性成分的有效剂量为108CFU/g～1010CFU/g。
在其中一些实施例中，所述产品为药品、食品或保健品。
本发明还提供了上述胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01、或胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01的培养物或代谢产物在非诊断、非治疗目的地抑制幽门螺杆菌中的应用。
本发明还提供了一种非诊断、非治疗目的地抑制幽门螺杆菌生长的方法，所述方法包括：向幽门螺杆菌施用上述胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01；或所述方法包括：向幽门螺杆菌施用上述胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01的培养物或代谢产物。
本发明所述的胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01已于2022年4月14日保藏于国家知识产权局指定的保藏单位广东省微生物菌种保藏中心(简称：GDMCC，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)，保藏日期：2022年4月14日，保藏编号：GDMCC No.62386。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的发明人筛选到一株胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01，在对该胃源性凝结芽孢杆菌进行进一步研究时发现：其具有很强的耐酸能力和胃内高度增殖能力，解决了目前研究中的菌株多不能耐受极端环境，在胃部定植能力差的难题；且胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01能有效应用于抑制幽门螺杆菌生长，预防和/或能有效抑制幽门螺杆菌相关性胃炎，且无明显副作用，并能长期定植于胃内，对胃上皮细胞GSE-1细胞具有较强的黏附特性。利用本发明的胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01可以制备成药品、食品或保健品的形式，用于预防和/或治疗幽门螺杆菌感染引起的胃肠道疾病，具有重大应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01的系统进化树。
图2为本发明实施例2中胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01、BC523、BC1.5、BC42、BC226及凝结芽孢杆菌标准菌株ATCC7050粘附GES-1细胞的粘附情况图。
图3为本发明实施例2中胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01、BC523、BC1.5、BC42、BC226及凝结芽孢杆菌标准菌株ATCC7050粘附GES-1细胞的粘附率。
图4为本发明实施例2中胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01、BC523、BC1.5、BC42、BC226及凝结芽孢杆菌标准菌株ATCC7050粘附GES-1细胞的粘附指数。
图5为本发明实施例3中胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01及凝结芽孢杆菌标准菌株ATCC7050在小鼠胃内的定植能力的离体成像测定。
图6为本发明实施例3中胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01及凝结芽孢杆菌标准菌株ATCC7050在小鼠胃内的定植能力的活体成像测定。
图7为本发明实施例4中胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01、BC523、BC1.5、BC42、BC226及凝结芽孢杆菌标准菌株ATCC7050的菌液、上清、菌体对幽门螺杆菌的抑菌圈。
图8为本发明实施例5中经胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01干预后小鼠胃粘膜快速尿素酶检测及粪便幽门螺杆菌抗原检测(胶体金法)结果。
图9为本发明实施例5中经胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01干预后小鼠胃粘膜幽门螺杆菌毒力基因CagA表达情况。
图10为本发明实施例5中经胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01干预后小鼠胃粘膜组织HE染色结果。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明提供了一株人胃来源的凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01，本发明的胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01能够抑制幽门螺杆菌，具体体现在：
(1)、胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01菌液对幽门螺杆菌的抑菌圈直径可达15.60±0.80mm；
(2)、胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01上清液对幽门螺杆菌的抑菌圈直径可达16.33±0.58mm；
(3)、胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01对胃上皮细胞GSE-1细胞具有较强的黏附特性；
(4)、通过活体成像检测，胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01能够在C57小鼠胃内定植24h以上；
(5)、相比传统三联疗法，胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01可以更有效地阻止幽门螺杆菌定植于胃部及阻止幽门螺杆菌进一步表达CagA毒力因子。
(6)、胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01可以缓解幽门螺杆菌感染相关性胃炎。
本发明的胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01来源于人的胃黏膜组织，由于人胃黏膜来源的菌株已定植于人胃黏膜，具有极强胃内定植繁殖能力。胃源性凝结芽孢杆菌的产芽孢特性使其具有良好耐受极端环境能力，解决了目前益生菌防治幽门螺杆菌感染的研究中的菌株多不能耐受极端环境，在胃部定植能力差，且抑制幽门螺杆菌效果欠佳的难题。
凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)作为益生菌的一种，具有安全、无副作用等特点，已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，可见，本发明的有效成分为胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01的产品不会使得幽门螺杆菌产生耐药性，同时，在治疗过程中不会导致患者产生不良反应。
下述实施例中涉及的幽门螺杆菌为来源于NTCC国家典型培养物保藏中心的幽门螺杆菌SS1；下述实施例中涉及的凝结芽孢杆菌标准株ATCC 7050，来源于美国模式培养物集存库(ATCC)，保藏编号为ATCC 7050。下述实施例中涉及的培养基如下：
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS固体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO40.05 g/L、吐温801mL/L、琼脂20g/L。
MRS液体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO40.05 g/L、吐温801mL/L。
TPY固体培养基(g/L)：水解酪蛋白10g/L、大豆胨5g/L、酵母粉2g/L、葡萄糖5g/L、L-半胱氨酸0.5g/L、磷酸氢二钾2g/l、氯化镁0.5g/L、硫酸锌0.25g/L、氯化钙0.15g/L、氯化铁0.0001g/L、琼脂20g/L、吐温801g/L、pH值6.5±0.1。
TPY液体培养基(g/L)：水解酪蛋白10g/L、大豆胨5g/L、酵母粉2g/L、葡萄糖5g/L、L-半胱氨酸0.5g/L、磷酸氢二钾2g/l、氯化镁0.5g/L、硫酸锌0.25g/L、氯化钙0.15g/L、氯化铁0.0001g/L、吐温801g/L、pH值6.5±0.1。
幽门螺杆菌培养基(g/L)：无菌脱纤维羊血70ml/L、酵母浸粉3g/L、酪胨12g/L、动物组织消化物5g/L、牛肉浸粉3g/L、玉米淀粉1g/L、氯化钠5g/L、琼脂13.5g/L、pH7.3±0.2(25℃)。
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
实施例1胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01的分离与鉴定
包括以下步骤：
1、分离
(1)以胃镜下活检钳取得的健康人群的胃黏膜组织为样本，研磨棒研碎后涂布于TPY固体培养基，置于37℃恒温厌氧或好氧培养箱中培养24h。
(2)培养后根据菌落的颜色、大小、边缘形状等，用接种环挑取菌落划线纯化。筛选得到五株杆菌，分别命名为BCF-01、BC1.5、BC523、BC42、BC226。用30％甘油将菌株保藏于-80℃冰箱。
2、分子生物学鉴定
以菌株BCF-01的基因组DNA为模板，利用27F(5'-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3')和1492R(5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3')为引物，进行16S rDNA片段扩增和测序(反应体系20μ：通用引物27F 1μL、通用引物1492R 1μL、Taq酶10μL、模板2μL、ddH2O，6μL；反应程序：95℃5min；95℃10s、55℃30s、72℃30s，30×循环；72℃5min；12℃2min)，PCR产物经测序分析，将得到的测序结果在美国国家生物技术信息中心(national center forbiotechnologyinformation，NCBI)利用BLAST在GenBank中进行搜索和相似性比对，并利用MAGE7.0软件制作16S rDNA发育树(图1)，该菌株的16S rDNA序列为胃源性凝结芽孢杆菌的16S rDNA序列，将该菌株命名为胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01，16S rDNA序列包括SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。BC1.5、BC523、BC42、BC226也均为凝结芽孢杆菌。
其中，基因组DNA的提取方法如下：
a.将菌株BCF-01接种于MRS液体培养基培养过夜；
b.取培养过夜的菌悬液1mL于1.5mL离心管，10000r/min离心2min，弃上清，得菌体沉淀；
c.加入110μl缓冲液(20mM Tris，pH 8.0；2mM Na2-EDTA；1.2％Triton)，和70μl溶菌酶溶液，37℃处理30min以上；
d.向管中加入20μl Proteinase K溶液，混匀；
e.加入220μl缓冲液GB，振荡15sec，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
f.加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
g.将步骤(f)所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
h.向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
i.向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中；
j.重复操作步骤(i)；
k.吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
l.吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。
SEQ ID No.1
AAGGGTCCCTTCGGCGGCTGGCTCCGTAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGGCTTCATGCAGGCGGGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGGGAATGGTTTTCTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTCTCGCAGCCCTTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTCAATGCTGGCAACTAAGGTCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGGGGAAGGCCCTGTCTCCAGGGAGGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGCCTCCCAGTTTCCAATGACCGCTTGCGGTTGAGCCGCAAGATTTCACATCAGACTTAAGAAGCCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGGCCGGGTACCGTCAGCGCCGCCCTGTTCGAACGGCACTTGTTCTTCCCCGGCAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGGCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCT
SEQ ID No.2
AAGGCAGCGACGTGCTATGATGCAGTCGTGCGGACCTTTTGGAGCTTGCTTTTAAAAGGTTAGCGGCGGACGGGGGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACGCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAGTTTTTTCCTCCGCATGGAGGAAAAAGGAAAGGCGGCTTCGGCTGCCACTTACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGGGGGGTAACGGCCCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGCCGGGGAAGAACAAGTGCCGTTCGAACAGGGCGGCGCCTTGACGGTACCCGGCCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTTCTTAAGTCTGATGTGAAATCTTGCGGCTCAACCGCAAGCGGTCATTGGAAACTGGGAGGCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCTAAGCAACGCGAAGAGCCTTACCACGTCTTGACATCCTCTGACCTCCCTGGAGACAGGGCTTCTCCTTCTGGGGACAGAGTGACAGGTGGTTGCATGGTTGTTCGTCAGCTCGTTGTTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTTCCTCGCAACGAGCGC
实施例2胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01对GES-1细胞(人胃粘膜上皮细胞)具有良好的黏附能力
(1)、将-80℃保存的胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01、BC523、BC1.5、BC42、BC226和凝结芽孢杆菌标准株ATCC7050分别接种于MRS液体培养基中，在50℃有氧环境培养24h，将复苏得到的菌液按同样方法传代2-3次。
(2)、将GES-1消化后计数，以1-2x104个/ml为浓度，铺种24孔板，1ml/well，在24孔细胞培养皿中放置细胞爬片，将液氮冻存的GES-1细胞复苏于放置了细胞爬片、含有DMEM高糖培养基及10％FBS的24孔板中，长至单层。
(3)、取1ml胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01、BC523、BC1.5、BC42、BC226和凝结芽孢杆菌标准株ATCC7050混悬液分别于1.5ml离心管，5500rpm/min离心2min，弃上清，得到菌体沉淀，用1mLPBS重悬菌体，吹打清洗，5500rpm/min离心2min，弃上清，重复清洗三次后，用DMEM高糖培养基重悬，调整OD600值为1。
(4)、分别取100μL步骤(3)所得重悬液分别加到含有900μL含DMED高糖培养基及10％FBS的24孔细胞皿，37℃有氧培养4h。
(5)、将24孔培养皿内上清吸尽，用PBS清洗细胞3次，弃去上清，加入4％多聚甲醇固定，弃去上清，用眼科镊夹取细胞爬片，革兰氏染色，油镜下每张爬片随机取5处视野，计数粘附于GES-1细胞的胃源性凝结芽孢杆菌。
粘附率(％)以粘附于GES-1细胞的胃源性凝结芽孢杆菌数与加入培养皿的胃源性凝结芽孢杆菌数之比计算，粘附指数以粘附于GES-1细胞的胃源性凝结芽孢杆菌数与培养皿内的GES-1细胞数之比计算。
胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01、BC523、BC1.5、BC42、BC226及凝结芽孢杆菌标准株ATCC7050对GES-1细胞的粘附情况、粘附率及粘附指数结果如图2～图4所示，结果显示与凝结芽孢杆菌标准株ATCC7050及其它从正常人胃粘膜分离得到的凝结芽孢杆菌分离株相比，胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01表现出了对GES-1细胞更强的黏附能力。说明胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01比凝结芽孢杆菌标准株ATCC-7050及其他从正常人胃粘膜分离得到的胃源性凝结芽孢杆菌分离株更容易粘附于胃上皮细胞。
实施例3胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01能够在C57小鼠胃内长时间定植
(1)、母液配制
clickA偶联剂+500ul DMSO即为clickA母液
click B燃料DIBO+100ulDMSO即为clickB母液
(2)、使用液配制
clickA：取10ul母液加DMSO配至1ml得到稀释液，再取100ul配至480ul即得到使用浓度50uM的clickA使用液；
clickB：取2ul母液加DMSO配至1ml得到使用浓度50uM的click B使用液。
(3)、菌与使用液共培养
a、培养50ml菌液：100ul实施例2所述调整至OD600＝1的胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01或凝结芽孢杆菌标准株ATCC7050活化液+50mlMRS肉汤培养基培养24h。
b、每次加入200ul clickA使用液后，再避光培养24h后取1ml重悬，之后PBS洗一遍，再用1ml PBS重悬。
c、每管加入5ul clickB使用液后，再37℃避光培养1h即可用于灌胃。
d、将灌胃后的小鼠分别在第24、48、72小时利用多模式小动物活体成像系统(FXPro)进行成像。
胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01在小鼠胃内的定植能力的活体成像测定结果如图5所示，胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01在小鼠胃内的定植能力的离体成像测定结果如图6所示，由图5和图6可知，在胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01进入小鼠体内72小时后，胃部仍有大量定植，相较于凝结芽孢杆菌标准株ATCC 7050显示出极强的定植能力，保障了其对幽门螺杆菌起到抑制作用。
实施例4胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01对幽门螺杆菌的抑制能力
包括以下步骤：
(1)、将胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01及其它从正常人胃粘膜分离得到的胃源性凝结芽孢杆菌分离株分别五区划线于TPY固体培养基上，50℃培养24h，得到单菌落；挑取单菌落接种于TPY液体培养基中，50℃条件下培养24h进行活化，连续活化两代，得到活化液；
(2)、将活化液调整至OD600＝1后按2％(v/v)的接种量接种于TPY液体培养基中，50℃条件下培养24h，得到菌液；菌液经8000g离心2min，得到上清液和菌体，取上清液备用；并分别用PBS和剩余上清液将菌体调整至OD600＝1备用；
(3)、用牛津杯法分别测定步骤(2)中获得的上清液、PBS重悬的菌体、上清液重悬的菌体抑制幽门螺杆菌生长的效果。
凝结芽孢杆菌胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01、BC523、BC1.5、BC42、BC226及凝结芽孢杆菌标准株ATCC7050的菌液和上清液的抑菌圈如图7所示，胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01及凝结芽孢杆菌标准株ATCC7050的菌液和上清液出现明显的抑菌圈，BCF-01的抑制幽门螺杆菌效果明显优于其它分离株。
抑菌圈测定的具体结果如表1所示。
表1胃源性凝结芽孢杆菌对幽门螺杆菌的抑菌圈直径
Figure GDA0003643698800000151
从表1可知，胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01菌液对幽门螺杆菌的抑菌圈大小可达15.67±0.58mm，胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01上清液对幽门螺杆菌的抑菌圈大小可达16.33±0.58mm，菌体无抑菌圈，表明胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01或其代谢产物具有抑制幽门螺杆菌生长的作用，其抑菌作用不弱于凝结芽孢杆菌标准菌株ATCC7050，且明显强于其它分离株。
实施例5胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01有效缓解幽门螺杆菌相关胃炎
方法如下：
(1)、4周龄C57BL/6小鼠25只，正常饲养一周后随机分成四组：
control组(n＝4)
HP(H.pylori)组(n＝6)
BCF-01组(n＝9)
三联疗法组(n＝9)
(2)、第1至3天，各组小鼠于晨8时禁食，4小时后三联混合抗生素(氨苄青霉素2.75mg+阿奇霉素2.75mg+庆大霉素0.3mg)0.25ml灌胃，间隔2小时再次三联混合抗生素0.25ml灌胃。
(3)、第4～11天，各组小鼠于晨8时禁食，control组、HP组和三联疗法组均灌胃空白MRS肉汤0.3ml，BCF-01组灌胃OD600＝1的BCF-01肉汤0.3ml。
(4)、第12天，各组小鼠于晨8时禁食，2小时后予0.08ml 50％乙醇灌胃，间隔2小时，control组灌胃空白幽门螺杆菌培养基0.3ml，其他组均灌胃OD600＝1新鲜HP混悬液0.3ml；6小时后，control组、HP组和三联疗法组灌胃空白MRS肉汤0.3ml，BCF-01组灌胃OD600＝1的BCF-01肉汤0.3ml，解除禁水禁食。
(5)、第13～39天，各组小鼠于晨8时禁食，间隔2小时，control组灌胃空白幽门螺杆菌培养基0.3ml，其他组均灌胃OD600＝1新鲜HP混悬液0.3ml；6小时后，control组、HP组和三联疗法组灌胃空白MRS肉汤0.3ml，BCF-01组灌胃OD600＝1的BCF-01肉汤0.3ml，解除禁水禁食。
(6)、第40～53天，各组小鼠于晨8时禁食，2小时后予0.08ml 50％乙醇灌胃，间隔2小时，control组灌胃空白幽门螺杆菌培养基0.3ml，其他组均灌胃OD600＝1新鲜HP混悬液0.3ml；6小时后，control组和HP组灌胃空白MRS肉汤0.3ml，BCF-01组灌胃OD600＝1的BCF-01肉汤0.3ml，三联疗法组灌胃0.3ml治疗剂量浓度的奥美拉唑+克拉霉素+阿莫西林，解除禁水禁食。
(7)、第56天解剖检测各项指标。
各组小鼠胃黏膜组织快速尿素酶检测及粪便抗原检测(胶体金法)结果如图8所示，从图8可知，HP组的快速尿素酶检测及粪便抗原检测均为阳性，BCF-01干预组结果多数为阴性，而三联疗法组呈现阳性(推测三联疗法清除幽门螺杆菌的速度比较慢，残存的死菌依然有抗原活性，从而粪便抗原检测会呈现抗原反应阳性)。
各组小鼠胃黏膜qPCR检测CagA基因水平的结果如图9所示，从图9可知，HP组CagA表达量显著高于control组，说明幽门螺杆菌已在小鼠体内定植，造模成功；HP组表达水平也显著高于BCF-01组，说明BCF-01在小鼠体内能够显著抑制幽门螺杆菌，且效果优于三联疗法。
各组小鼠胃黏膜组织HE染色结果如图10所示，从图10可知，HP组提示黏膜基层出现炎性浸润，而BCF-01组和三联疗法组胃黏膜组织均未见明显异常。
综上所述，该实施例的结果表明：胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01能够抑制幽门螺杆菌，从而减轻幽门螺杆菌相关胃炎。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州维生君生物科技有限公司
<120> 胃源性凝结芽孢杆菌BCF-01及其应用
<130> 1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1089
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagggtccct tcggcggctg gctccgtaag gttacctcac cgacttcggg tgttacaaac 60
tctcgtggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg 120
atccgcgatt actagcgatt ccggcttcat gcaggcgggt tgcagcctgc aatccgaact 180
gggaatggtt ttctgggatt ggcttaacct cgcggtctcg cagccctttg taccatccat 240
tgtagcacgt gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt 300
cctccggttt gtcaccggca gtcaccttag agtgcccaac tcaatgctgg caactaaggt 360
caagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac 420
catgcaccac ctgtcactct gtcccccgaa ggggaaggcc ctgtctccag ggaggtcaga 480
ggatgtcaag acctggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg 540
cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag tttcagcctt gcggccgtac tccccaggcg 600
gagtgcttaa tgcgttagct gcagcactaa agggcggaaa ccctctaaca cttagcactc 660
atcgtttacg gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt tgctccccac gctttcgcgc 720
ctcagcgtca gttacagacc agagagccgc cttcgccact ggtgttcctc cacatctcta 780
cgcatttcac cgctacacgt ggaattccac tctcctcttc tgcactcaag cctcccagtt 840
tccaatgacc gcttgcggtt gagccgcaag atttcacatc agacttaaga agccgcctgc 900
gcgcgcttta cgcccaataa ttccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc 960
tggcacgtag ttagccgtgg ctttctgggc cgggtaccgt cagcgccgcc ctgttcgaac 1020
ggcacttgtt cttccccggc aacagagttt tacgacccga aaggccttct tcactcacgc 1080
ggcgttgct 1089
<210> 2
<211> 1089
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaggcagcga cgtgctatga tgcagtcgtg cggacctttt ggagcttgct tttaaaaggt 60
tagcggcgga cgggggagta acacgtgggc aacctgcctg taagactggg ataacgccgg 120
gaaaccgggg ctaataccgg atagtttttt cctccgcatg gaggaaaaag gaaaggcggc 180
ttcggctgcc acttacagat gggcccgcgg cgcattagct agttgggggg gtaacggccc 240
accaaggcaa cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacattgg gactgagaca 300
cggcccaaac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga 360
cggagcaacg ccgcgtgagt gaagaaggcc ttcgggtcgt aaaactctgt tgccggggaa 420
gaacaagtgc cgttcgaaca gggcggcgcc ttgacggtac ccggccagaa agccacggct 480
aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg 540
cgtaaagcgc gcgcaggcgg cttcttaagt ctgatgtgaa atcttgcggc tcaaccgcaa 600
gcggtcattg gaaactggga ggcttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag 660
cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcggctct ctggtctgta 720
actgacgctg aggcgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac 780
gccgtaaacg atgagtgcta agtgttagag ggtttccgcc ctttagtgct gcagctaacg 840
cattaagcac tccgcctggg gagtacggcc gcaaggctga aactcaaagg aattgacggg 900
ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattctaagc aacgcgaaga gccttaccac 960
gtcttgacat cctctgacct ccctggagac agggcttctc cttctgggga cagagtgaca 1020
ggtggttgca tggttgttcg tcagctcgtt gttcgtgaga tgttgggtta agttcctcgc 1080
aacgagcgc 1089
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (9)

1.一株胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01，所述胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01的保藏编号为GDMCC No.62386。
2.一株胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01的培养物，所述胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01的保藏编号为GDMCC No.62386。
3.权利要求1所述的胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01、或权利要求2所述的胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01的培养物在制备预防和/或治疗幽门螺杆菌感染引起的胃肠道疾病的药品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述胃肠道疾病为胃溃疡、胃炎、功能性消化不良或胃癌。
5.一种预防和/或治疗幽门螺杆菌感染引起的胃肠道疾病的药品，其特征在于，所述产品的活性成分包括权利要求1所述的胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01、或所述产品的活性成分包括权利要求2所述的胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01的培养物。
6.根据权利要求5所述的预防和/或治疗幽门螺杆菌感染引起的胃肠道疾病的药品，其特征在于，所述活性成分的有效剂量为106CFU/g～1010CFU/g。
7.根据权利要求6所述的预防和/或治疗幽门螺杆菌感染引起的胃肠道疾病的药品，其特征在于，所述活性成分的有效剂量为108CFU/g～1010CFU/g。
8.权利要求1所述的胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01、或权利要求2所述的胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01的培养物在非诊断、非治疗目的地抑制幽门螺杆菌中的应用。
9.一种非诊断、非治疗目的地抑制幽门螺杆菌生长的方法，其特征在于，所述方法包括：向幽门螺杆菌施用权利要求1所述的胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01；或所述方法包括：向幽门螺杆菌施用权利要求2所述的胃源性凝结芽孢杆菌(Weizmannia coagulans)BCF-01的培养物。
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