CN116731937B

CN116731937B - 一种凝结魏茨曼氏菌iob502发酵菌粉的制备方法及应用

Info

Publication number: CN116731937B
Application number: CN202311021294.1A
Authority: CN
Inventors: 梁武; 韩雪梅; 那洪军; 孙韵琪; 付田民; 刘晴晴
Original assignee: Tianjin Inncorigin Biological Technology Co ltd
Current assignee: Tianjin Inncorigin Biological Technology Co ltd
Priority date: 2023-08-15
Filing date: 2023-08-15
Publication date: 2023-11-10
Anticipated expiration: 2043-08-15
Also published as: CN116731937A

Abstract

本发明提供凝结魏茨曼氏菌IOB502发酵菌粉的制备方法，依据该方法中的最佳制备条件所得到的菌粉制剂，及其在制备防治胃食管反流相关药物中的应用，通过实验条件摸索和控制，得到最佳的发酵条件，所得菌粉制剂活性可达到2.68±0.11×10¹⁰CFU/g以上，具有较高的菌株活性。依据该方法所得到凝结魏茨曼氏菌IOB502发酵菌粉制剂，具有较好的耐酸性，凝结魏茨曼氏菌IOB502在胆盐浓度0.5%条件下可存放4h，存活率达91.6%，具有较强的耐受酸和胆盐的能力，即具有较强的通过胃肠道能力，保持较高的存活率，能够减少其对黏膜的损伤、平衡胃酸分泌、缓解胃灼热、反酸等症状，具有较大工业生产应用价值。

Description

一种凝结魏茨曼氏菌IOB502发酵菌粉的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是保藏号为CGMCC No.16025的凝结魏茨曼氏菌（Weizmannia coagulans）IOB502及其制备方法，以及其在平衡胃酸分泌方面的用途。

背景技术

凝结魏茨曼氏菌(Weizmanniacoagulans)又名凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)。凝结魏茨曼氏菌不仅与传统乳酸菌具有相同的益生作用，同时其菌剂一般以芽孢为主，正常情况下处于休眠状态，不会进行新陈代谢等生理性活动，因此具有抗逆性强、耐高温和易贮藏等优点，能够适用于多种加工环境，在保健和食品行业被广泛应用。

胃食管反流病（Gastroesophageal reflux disease，GERD）是指胃、十二指肠内容物反流入食管，引起不适症状和并发症的一种疾病，临床常见的消化系统问题，临床常见症状主要为胃灼热、反酸、吞咽疼痛、困难等，严重时导致食管炎和食管黏膜损伤及咽、喉、气道等食管以外的组织损伤，甚至引起上消化道出血等并发症。随着人们生活水平的提高，生活方式和饮食结构的改变，胃食管反流病的发病率逐年上升，目前胃食管反流病的治疗手段主要存在治疗时间长，复发率高、需要长期维持治疗，有耐药性和依赖性，长期抑酸治疗对身体伤害大且副作用多等问题。

因此针对胃食管反流病现有治疗技术的缺点，亟需寻找并开发一种能够减少其对黏膜的损伤、平衡胃酸分泌、缓解胃灼热、反酸等症状，具有更高安全性和更小副作用的新方法，而益生菌和益生菌制剂以其温和、安全、高效等特性已成为一种有效途径和选择。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种凝结魏茨曼氏菌IOB502发酵菌粉的制备方法，依据该方法所得到的菌粉制剂，及其在制备防治胃食管反流相关药物中的应用。

本发明使用的凝结魏茨曼氏菌（Weizmannia coagulans）IOB502是自主筛选自天津市居民家中天然发酵大豆酱，此菌株已经进行了菌株保藏和理化指标的检测，已于2020年1月8日在中国食品发酵工业研究院有限公司进行了细菌鉴定检测，菌落为黄色，圆形，表面湿润，不透明，边缘整齐的菌落，已于2018年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为CGMCC No.16025。

本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种凝结魏茨曼氏菌IOB502发酵菌粉的制备方法，具体步骤为：

（1）菌株活化：将凝结魏茨曼氏菌IOB502接种至活化培养基中进行菌株活化培养，活化好的菌种即为种子液。

（2）发酵：将活化好的种子液接种到灭菌后的发酵液中，发酵罐搅拌转速100r/min，培养后得发酵液；

（3）菌粉制备：将获得的发酵液进行离心，分别获得上清液和菌泥，将获得的菌泥进行真空冷冻干燥，即可获得高活凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉。

优选地，步骤（1）中按照体积比为1：30进行接种，步骤（2）中按照体积比为1：70进行接种；

优选地，步骤（1）和（2）中的培养温度36±2℃，培养时间48±2h；

优选地，步骤（1）活化培养基为TAS培养基，其配方为胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，pH=7.3±0.2，加水量为1L，121℃，灭菌20min；步骤（2）中发酵液培养基为胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，pH=7.3±0.2，加水量为1L，121℃，灭菌20min；

优选地，还包括步骤（4）：进行凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉的耐酸耐胆盐实验；

优选地，步骤（4）中耐酸实验方法为将所得的凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉，在pH=2的条件下，存放2h后检测菌活性；

优选地，步骤（4）中耐胆盐实验方法为将所得的凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉，在pH=2的条件下，存放2h后检测菌活性；

优选地，还包括步骤（5）：进行凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉对胃食管反流病的调节作用验证；

优选地，步骤（5）中以SPF级雄性 SD 大鼠为实验动物建立反流性食管炎大鼠模型，以凝结魏茨曼氏菌IOB502发酵后菌粉进行灌胃验证；

第二方面，本发明提供一种依据凝结魏茨曼氏菌IOB502发酵菌粉的制备方法，得到的生物发酵菌粉制剂产品。

第三方面，本发明提供上述依据凝结魏茨曼氏菌IOB502发酵菌粉的制备方法得到的生物发酵菌粉制剂产品，在制备防治胃食管反流相关药物中的应用。

有益效果：

（1）本发明提供凝结魏茨曼氏菌IOB502发酵菌粉的制备方法，通过实验条件摸索和控制，得到最佳的发酵条件，得到的菌粉制剂采用GB 4789.35 -2016食品安全国家标准，食品微生物学检验，乳酸菌检验来检测，冻干粉活性可达到2.68±0.11×10¹⁰CFU/g以上，具有较高的菌株活性。

（2）依据该方法所得到凝结魏茨曼氏菌IOB502发酵菌粉制剂，在pH=2的条件下，存放2h，存活率可达89.5%，在胆盐浓度0.5%的条件下，存放4h，存活率可达91.6%，凝结魏茨曼氏菌IOB502具有较强的耐受酸和胆盐的能力，具有较强的通过胃肠道能力，保持较高的存活率，能够减少胃食管反流对黏膜的损伤、平衡胃酸分泌、缓解胃灼热、反酸等症状，具有较大的商业开发和生产应用价值。

附图说明

图1：不同组别大鼠体重变化；

图2：不同组别大鼠食管组织pH值变化；

图3：不同组别大鼠食管组织炎症因子IL-17、IL-8表达水平变化；

图4：不同组别大鼠血浆胃动素含量变化。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉的制备实验方法

（1）菌株活化：将凝结魏茨曼氏菌IOB502从菌株冻存管中取出，按体积比为1:20的比例接种至活化培养基中，进行菌株活化培养，培养温度36±2℃，培养时间48±2h，活化好的菌种即为种子液。

所述活化培养基为TAS培养基，其配方为胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，pH=7.3±0.2，加水量为1L，121℃，灭菌20min。

（2）发酵：将活化好的种子液，按照体积比为1：50的接种量，接种到灭好菌的发酵液中，发酵罐搅拌转速100r/min，培养温度36±2℃，培养时间48±2h，即得发酵液；

所述发酵液培养基为胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，pH=7.3±0.2，加水量为1L，121℃，灭菌20min。

（3）菌粉：将获得的发酵液进行离心，分别获得上清液和菌泥，将获得的菌泥进行真空冷冻干燥，即可获得高活凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉。

实施例2：凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉的制备实验方法

（2）发酵：将活化好的种子液，按照体积比为1：60的接种量，接种到灭好菌的发酵液中，发酵罐搅拌转速100r/min，培养温度36±2℃，培养时间48±2h，即得发酵液；

实施例3：凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉的制备

（2）发酵：将活化好的种子液，按照体积比为1：70的接种量，接种到灭好菌的发酵液中，发酵罐搅拌转速100r/min，培养温度36±2℃，培养时间48±2h，即得发酵液；

实施例4：凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉的制备

（1）菌株活化：将凝结魏茨曼氏菌IOB502从菌株冻存管中取出，按体积比为1:30的比例接种至活化培养基中，进行菌株活化培养，培养温度36±2℃，培养时间48±2h，活化好的菌种即为种子液。

实施例5：凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉的制备

实施例6：凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉的制备

实验结果：

将实施例1—实施例6获得的菌粉进行活性检测，检测方法采用GB 4789.35 -2016食品安全国家标准，食品微生物学检验，乳酸菌检验。检测结果如下表所示：

表1 凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉检测结果（CFU/g）

由表1结果可知，凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉发酵制备的最佳条件是：活化接种体积比为1:30，发酵接种体积比为1：70，发酵罐搅拌转速100r/min，培养温度36℃，培养时间48h。

实施例7：制备所得的凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉的耐酸耐胆盐实验

胃酸和胆盐具有抗菌性，只有极少数具有较强耐酸能力的乳酸菌才能在胃中大量存活并达到肠道内发挥益生作用。本实验选择的是pH=2的条件，进行存活率的测试。

表2 凝结魏茨曼氏菌IOB502对酸的耐受性

通过文献检索分析，乳酸菌在pH=2的条件下，存放2h，存活率在50%左右，由表2结果可知，本方法制备得到的凝结魏茨曼氏菌IOB502在pH=2的条件下，存放2h，存活率可达89.5%，由此可知，本方法制备得到的凝结魏茨曼氏菌IOB502具有较好的耐酸性。

乳酸菌通过胃液后存活的菌株将在小肠的上部遇到胆盐，耐胆盐使其能够在肠道中生长、存活并发挥益生功效的一个重要指标。本实验选择在胆盐浓度0.5%的条件，进行4h存活测试。

表3 凝结魏茨曼氏菌IOB502对胆盐的耐受性

由表3结果可知，本方法制备得到的凝结魏茨曼氏菌IOB502在胆盐浓度0.5%的条件下，存放4h，存活率可达91.6%。

由表2和表3的结果可知，本方法制备得到的凝结魏茨曼氏菌IOB502具有较强的耐受酸和胆盐的能力，具有较强的通过胃肠道能力，保持较高的存活率。

实施例8：凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉对胃食管反流病的调节作用

1 实验材料

实验动物：SPF级雄性 SD 大鼠

实验材料：凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉

2 饲养环境

12 h光照/12 h黑夜循环，温度 (22±2) ℃，湿度40%-60%，自由饮水饮食。

3 大鼠建模与分组

3.1 大鼠建模

采用半幽门结扎术和贲门部分肌层切开术建立反流性食管炎大鼠模型。随机选取10只大鼠作为假手术组，其余建模组每组15只，大鼠术前24 h 禁食不禁水，腹腔注射2.5%戊巴比妥钠溶液（30mg/kg）麻醉大鼠，切开大鼠皮肤及皮下组织并进入腹腔，游离食管及胃组织，切开食管下段贲门及食管下段肌层，剥离并显露出黏膜层，在距离幽门1 cm的胃壁处切开小孔，将外径为3.5 mm的内支架从小孔处置入并通过幽门，然后用2-1号丝线结扎幽门环，并用5-1号丝线将结扎线缝合固定于浆肌层，抽出内支架，缝合胃切开处。用0.9%氯化钠注射液冲洗腹腔，并用无菌纱布吸尽腹腔内液体，缝合关闭腹腔，让大鼠从麻醉中醒来，术后24 h内禁食不禁水。假手术组（10只）麻醉后剖腹并翻动胃2～4次，用0.9%氯化钠注射液冲洗腹腔，用无菌纱布吸尽腹腔内液体后，缝合关闭腹腔，术后24 h内禁食不禁水。术后每日观察大鼠变化，测量大鼠体质量，术后1周，大鼠成活，饮食活动正常，则造模成功。

术后第2周随机取出2只大鼠制备食管组织石蜡切片，进行革兰氏染色，利用光学显微镜观察食管组织病理学变化，当食管有明显的组织病理学改变时确认造模成功。

3.2 大鼠分组

建模成功后将其随机分为模型组和实验组。空白组、模型组灌胃生理盐水，2 mL/只，1次/d，连续灌胃4周；实验组灌胃凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉，1.05×10⁸CFU/kg，1次/d，连续灌胃4周；实验对照组灌胃未发酵样品，2 mL/只，1次/d，连续灌胃4周。

4 检测指标

4.1 大鼠形态观察

观察并记录大鼠的体重、毛色、粪便、精神及运动状态，分别记录0天、7天、14天、28天的情况。

4.2 大鼠组织收集方法

所有大鼠均于末次给药后，禁食不禁水24 h麻醉后处死，取腹主动脉血，剖开腹腔，将所有大鼠的食道从咽部到贲门部取出，取出后纵切，肉眼观察整体病理学变化；迅速取食管下端1 cm组织，分为两部分，其中一部分置入组织固定液中用于革兰氏染色，一部分取出后放入超低温冰箱。

4.3 食管组织pH值测定及食管黏膜损伤形态学观察

取食管组织，纵向切开食管组织，将pH自动记录仪pH电极端置于胃食管交界点以上1 cm食管黏膜处，1 min后读取并记录pH值。

将食管和胃充分暴露，用冰生理盐水冲洗后，将食管剖开，观察食管黏膜组织形态变化。

4.4 食管黏膜病理学观察

经过革兰氏染色制备的组织切片置于光镜下观察及RE病理分级。

4.5 炎症因子测定

取食管组织，冰上研磨后取组织匀浆液，按ELISA试剂盒说明书方法检测IL-17及IL-8表达水平变化。

4.6 血浆胃动素含量测定

大鼠麻醉处死后抽取腹主动脉血液5 ml，离心(3000转/min，20 min，4℃) 取上清液。用酶联免疫吸附法按照试剂盒说明书测定血清MTL的含量。

5 实验结果

5.1 大鼠形态

通过观察大鼠的活动和精神情况，空白组、实验组的大鼠活动正常，精神状态良好，模型组毛发仍有晦暗且疏松。表明大鼠食用凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉后，大鼠精神状态较好。

5.2 大鼠体重

实验期间大鼠的死亡率为零，各组大鼠在实验期间均有所增加。如图1所示，与模型组相比，经凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉干预后，胃食管反流病大鼠体重增加明显，说明凝结魏茨曼氏菌IOB502能够缓解胃食管反流病大鼠的反流病症，保护食管黏膜。

5.3 大鼠食管组织pH值变化

如图2所示，对比不同组别大鼠食管组织pH值的变化发现，与模型组相比，经凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉灌胃后，大鼠食管组织pH值明显上升。表明凝结魏茨曼氏菌IOB502能有效平衡大鼠胃酸分泌，减少胃食管反流对黏膜的损伤，对大鼠胃食管反流病有一定的缓解作用。

5.4 大鼠食管组织炎症因子IL-17、IL-8表达水平变化

如图3所示，对比不同组别大鼠食管组织炎症因子IL-17、IL-8表达水平变化发现，与模型组相比，经凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉灌胃后，大鼠食管组织炎症因子IL-17、IL-8表达水平明显下降，说明凝结魏茨曼氏菌IOB502可以降低大鼠食管组织炎症，减少食管黏膜损伤。

5.5 大鼠血浆胃动素含量变化

如图4所示，对比不同组别大鼠血浆胃动素含量变化发现，与模型组相比，经凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉干预后，大鼠血浆胃动素含量明显增加，与空白组的含量基本一致，表明凝结魏茨曼氏菌IOB502能够调节胃肠道运动，改善胃肠动力，缓解大鼠胃食管反流病的症状。

综上所述，本发明研究了凝结魏茨曼氏菌IOB502对平衡胃酸分泌，减少胃食管反流对黏膜损伤的功效，结果表明凝结魏茨曼氏菌IOB502能够有效平衡胃食管反流病大鼠的胃酸分泌，缓解胃灼热、反酸，减少胃食管反流对黏膜的损伤。根据本发明记载的方法得到的凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉及其制剂，以及对该菌粉和制剂的功能验证，能够为辅助治疗胃食管反流病提供一定的药理学依据，从而为开拓治疗胃食管反流病的新方法提供依据。

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明的权利要求中。

Claims

1. 凝结魏茨曼氏菌IOB502 CGMCC No.16025发酵菌粉在制备防治胃食管反流药物中的应用，其特征在于该菌制备方法为：

（1）菌株活化：将凝结魏茨曼氏菌IOB502，CGMCC No.16025，接种至活化培养基中进行菌株活化培养，活化好的菌种即为种子液；

（3）菌粉制备：将获得的发酵液进行离心，分别获得上清液和菌泥，将获得的菌泥进行真空冷冻干燥，即可获得高活凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉;

（4）进行凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉的耐酸耐胆盐实验;将所得的凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉，在pH=2的条件下，存放2h后,在胆盐浓度0.5%的条件下进行4h存活测试;

（5）进行凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉对胃食管反流病的调节作用验证，以SPF级雄性SD 大鼠为实验动物建立反流性食管炎大鼠模型，以凝结魏茨曼氏菌IOB502发酵后菌粉进行灌胃验证;

其中步骤（1）中按照体积比为1：30进行接种，步骤（2）中按照体积比为1：70进行接种;

步骤（1）和（2）中的培养温度36±2℃，培养时间48±2h;

步骤（1）活化培养基为TAS培养基，其配方为胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，pH=7.3±0.2，加水量为1L，121℃，灭菌20min；步骤（2）中发酵液培养基为胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，pH=7.3±0.2，加水量为1L，121℃，灭菌20min。