CN111996147B - 一株具有降甘油三酯功能的副干酪乳杆菌及其应用 - Google Patents
一株具有降甘油三酯功能的副干酪乳杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株具有降甘油三酯功能的副干酪乳杆菌及其应用。所述副干酪乳杆菌，所述菌株命名为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)HCS17‑040，该菌株已于2020年04月27日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.19747。副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)HCS17‑040具有十分优异的降甘油三酯功能，显著优于现有菌株。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株具有降甘油三酯功能的副干酪乳杆菌及其应用。
背景技术
甘油三酯(TG)是3分子长链脂肪酸和甘油形成的脂肪分子，是人体内含量最多的脂类，大部分组织均可以利用甘油三酯分解产物供给能量，同时肝脏、脂肪等组织还可以进行甘油三酯的合成，在脂肪组织中贮存，是体内能量的主要来源。
然而随着生活水平的不断提高，出现高血脂的人的比例却越来越高，某项统计数据显示，我国成年人中，出现高血脂问题的比例大约在40％左右，而且这个比例仍然在不断扩大，不断的向低龄化的趋势发展。体内甘油三酯过高会引发人体许多疾病，如高血压、动脉粥样硬化、心血管疾病等。目前防治高脂血症的主要办法有合理饮食、适量运动、适当的理疗和药物治疗，但是对于严重的高脂血症进行长期的药物治疗会出现明显的副作用，包括睡眠问题、腹泻或便秘、记忆或精神问题等。服用安全有效的具有降解甘油三酯功效的菌制剂食品或药品，可以避免或降低现有药物的副作用，但根据现有研究关于菌制剂的甘油三酯降解率普遍较低，列举如表1。
表1列举现有研究公开的菌制剂甘油三酯降解率
本发明中的副干酪乳杆菌具有较强的降甘油三脂功能，为高脂血症的人群治疗提供更多的选择。
发明内容
针对现有问题，本发明目的在于提供一株耐酸耐胆盐能力强、耐胃肠液能力强、具有降甘油三酯功能的副干酪乳杆菌及其应用，尤其在食品或药品组合物中的应用。
一株具有降甘油三酯功能的副干酪乳杆菌，所述副干酪乳杆菌，所述菌株命名为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)HCS17-040，该菌株已于2020年04月27日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.19747。
上述的一株具有降甘油三酯功能的副干酪乳杆菌在制备治疗高血脂症食品或药品中的应用。
上述的一株具有降甘油三酯功能的副干酪乳杆菌在制备具有降甘油三酯功能的食品或药品中的应用。
上述的应用，所述的食品为菌剂或发酵食品。
一种发酵食品，是以上述的一株具有降甘油三酯功能的副干酪乳杆菌作为发酵剂生产的食品。
一种药物制剂，包括有效剂量的上述的一株具有降甘油三酯功能的副干酪乳杆菌和药学上可接受的辅料。
一种菌剂，是含有上述的具有降甘油三酯功能的副干酪乳杆菌的菌剂。
本发明所述的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)HCS17-040分离自顺产的健康2 月龄男婴粪便中，是一株耐消化道逆环境能力强的副干酪乳杆菌，具有乳杆菌的典型特征，革兰氏阳性，白色菌落，圆形凸起，表面光滑细密，边缘整齐，细胞呈细长杆状，单个或成对、成链排列。其理化特征是：接触酶阴性，氧化酶阴性，上述副干酪乳杆菌CGMCCNo.19747的细胞形态和理化实验结果详见表2。
表2副干酪乳杆菌CGMCC No.19747的细胞形态和理化实验结果
通过在美国生物工程信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI) 查阅国际相关的基因库，将本发明的副干酪乳杆菌CGMCC No.19747的16S rDNA序列与 GenBank提交菌株序列相似性比较，鉴定菌株HCS17-040为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，比较结果见表3。
表3副干酪乳杆菌CGMCC No.19747的16S rDNA序列与GenBank提交菌株序列相似性比较
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
1、本发明副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)HCS17-040具有降甘油三酯功能，降解率达42.8％；
2、本发明副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)HCS17-040具有优秀的耐消化道逆环境能力。当从口摄入进入人体时，能够耐受胃环境以较高的存活率到达肠道；
3、本发明副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)HCS17-040分离自健康的人源粪便中，应用时安全性高；
4、菌种纯化及发酵过程的培养基及中和剂采用的组分原料均为食品级，故菌株安全性高，可用于食品发酵或冻干菌粉等应用；
本发明提供副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)HCS17-040菌株或其培养液的组合物。
本发明提供副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)HCS17-040菌株或其培养液的食品组合物。
本发明提供副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)HCS17-040菌株或其培养液的药品组合物。
所述的食品组合物可以为保健食品组合物，儿童食品组合物，发酵食品组合物。
所述食品组合物或药品组合物的剂型不受限制，例如，可以被制成粉剂、片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液等。
本发明所述的具有降甘油三酯功能的副干酪乳杆菌，所述的副干酪乳杆菌，所述菌株命名为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)HCS17-040，该菌株已于2020年04月27日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，保藏编号为CGMCC No.19747。
具体实施方式
实施例1副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)HCS17-040CGMCC No.19747菌株的筛选
1、初筛
将500uL健康男婴粪便样品加入到4.5mL改良MRS(pH至5.5)液体培养基中稀释，以10倍稀释法稀释至10-6，从10-3-10-6稀释度分别取50uL样液涂布到改良MRS固体培养基平板上，每个梯度两个平行，将平板放入自封袋中于37℃条件下正常培养24～48h；
2、纯化
挑取具有目的菌株典型特征(观察形态、大小、色泽、及其透明度等)、菌落较大、活性较强的单菌落，于改良MRS固体培养基平板进行划线纯化培养，37℃培养24～48h，如此反复2～3次，直到划线平皿中菌落特征一致；
所述的改良MRS培养基：蛋白胨10g/L，牛肉粉3g/L，酵母粉4g/L，磷酸氢二钾 2g/L，柠檬酸2g/L，乙酸钠5g/L，葡萄糖20g/L，七水合硫酸镁0.58g/L，四水合硫酸锰 0.25g/L，吐温-80 0.6g/L，碳酸钙10g/L，中性红0.05g(1％浓度5mL)，番茄汁10mL/L (v/v)，琼脂粉20g/L，调pH至5.5；115℃，30min灭菌；
实施例2副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)HCS17-040菌株的鉴定
将实施例1中分离纯化后的纯培养物通过划线、涂片镜检，进一步确定其为纯培养物后进行菌种鉴定，包括革兰氏染色试验，接触酶试验及16S rDNA全序列测序鉴定。最终鉴定分离得到的菌株为一株副干酪乳杆菌，命名为副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei) HCS17-0140，已于2020年04月27日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.19747。
上述副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)HCS17-040菌株为革兰氏阳性，白色菌落，圆形凸起，表面光滑细密，边缘整齐，细胞呈细长杆状，单个或成对、成链排列。其理化特征是：接触酶阴性，氧化酶阴性，可利用D-核糖、阿东醇、D-半乳糖、D-葡萄糖、D- 果糖、D-甘露糖、甘露醇、山梨醇、α-甲基-D-葡萄糖甙、N-乙酰-葡糖胺、苦杏仁甙、熊果甙、七叶灵、水杨苷、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、菊糖、松三糖、龙胆二糖、D-松二糖、D-塔格糖。
实施例3副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)HCS17-040CGMCC No.19747菌株的耐消化道逆环境试验
副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)HCS17-040耐消化道的逆环境能力是其能够以较高存活率到达肠道并在肠道存活、定植生长及发挥功效的先决条件。
1、耐酸试验
将传代三次的菌液按照10％的接种量分别接种于空白对照培养基、pH3.0的基础MRS 培养基中。37℃静置培养，于17h取样，用灭菌的生理盐水进行10倍系列稀释，分别取适宜稀释度的菌液1000μL进行混菌计数操作，每个稀释度2次重复，37℃静置培养36～48h 后计数。
耐酸试验数据指标：
不同pH条件的培养基测得的活菌数(用N′表示)；空白对照试验测得的活菌数(用N0表示)，其耐酸性活菌数对数比率计算公式如下：
受试菌株耐酸存活率(％)＝lg cfu N′/lg cfu N0×100％；
培养17h后，受试菌株耐酸存活率如表4所示。
表4 HCS17-040耐酸试验数据表
由表4可知，HCS17-040菌株在pH 3.0的条件下经过17h后，存活率高达89.35％，表明该菌通过胃酸的抑制作用后仍可保持较高活性，从而发挥其益生作用。
2、耐胆盐试验
将传代三次的菌液按照10％的接种量分别接种于未含有牛胆盐(空白对照)、含有0.3％、0.5％、1.0％、1.5％浓度的MRS液体培养基中，37℃静置培养，于17h取样，测定活菌数。
耐胆盐试验数据指标：
测得空白对照的活菌数用N0表示，其他胆盐浓度条件下测得的活菌数用N″表示，其耐胆盐活菌数对数比率计算公式如下：
受试菌株耐胆盐试验存活率(％)＝lg cfu N″/lg cfu N0×100％；
表5 HCS17-040耐胆盐试验数据表
由表5可知，HCS17-040菌株具有非常好的耐胆盐能力，当胆盐浓度在1.5％时，菌株存活率仍达到89.8％，具有较高的活性。
3、模拟胃液试验
将传代三次的菌液震荡摇匀，取菌悬液10mL离心(5000×g，10min，5℃)获得菌泥，用PBS缓冲液冲洗2次，获得的菌泥重悬于10mL模拟胃液中，37℃条件下消化3h，分别于0h、3h取样测活菌数。
活化三代后的受试菌株在第三代培养液中的活菌数用N表示，经在模拟胃液培养基中消化3h后计数测得的活菌数用N#表示，受试菌株模拟胃液试验存活率计算公式如下：
受试菌株模拟胃液试验存活率(％)＝lg cfu N#/lg cfu N×100％；
表6 HCS17-040模拟胃液试验数据表
由表6可知，HCS17-040菌株在模拟胃液中的存活能力较强，经3h处理后，存活率高达94.62％，其在胃内停留较长时间仍保持高活性。
4、模拟肠液试验
将传代三次的菌液震荡摇匀，取菌悬液10mL离心(5000×g，10min，5℃)获得菌泥，用PBS缓冲液冲洗3次，获得的菌泥重悬于10mL的人工肠液中，37℃条件下培养，于 0h、2h、4h分别取样测活菌数。
活化三代后的受试菌株在第三代培养液中的活菌数用N表示，经在模拟肠液培养液中培养2h、4h后计数测得的活菌数用N*表示，受试菌株模拟肠液试验存活率计算公式如下：
受试菌株模拟肠液试验存活率(％)＝lg cfu N*/lg cfu N×100％；
表7 HCS17-040模拟肠液试验数据表
由表7可知，HCS17-040菌株在模拟肠液中的存活能力强，模拟肠液处理4h时后活菌数仍没有减少。
综上，说明该菌株具有较强的耐酸能力，且能够有效抵抗胃肠液的影响，从而能够在通过消化道后依然维持较高活性。
实施例4副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)HCS17-040CGMCC No.19747降甘油三酯体外试验
1、试验菌株制备
(1)一级培养：将保藏于-80℃的菌株冻存管取出，经手握解冻，混匀，取1环菌液于MRS固体培养基平板划线，37℃静置培养36-48h；
(2)二级培养：挑单菌落至5mL MRS培养基中，37℃培养20h；
(3)三级培养：5mL菌液接种至100mL MRS培养基中，37℃培养17h；
(4)四级培养：将三级培养的菌液以3％接种量接种于100mL甘油三酯培养基中，37℃培养24h。同时将未接种菌液的甘油三酯培养基37℃培养24h。
MRS培养基：酵母蛋白胨10g/L，牛肉粉3g/L，酵母粉4g/L，磷酸二氢钾2g/L，柠檬酸2g/L，乙酸钠5g/L，葡萄糖20g/L，七水合硫酸镁0.58g/L，四水合硫酸锰0.25g/L，吐温- 800.6g/L，番茄汁10mL/L，琼脂20g/L，调pH至6.5；115℃，30min灭菌。
甘油三酯培养基配方的制备：将2％的聚乙烯醇水溶液与植物油按体积比3：1混合，用超声波处理(控制参数每次超声5s，间隔时间5s，共超声70次)后混合均匀制成植物油乳化液，作为甘油三酯的来源。将上述制备的植物油乳化液按5％的比例加入到MRS培养基中，调pH至6.5±0.2，115℃，30min灭菌，制成甘油三酯培养基并于4℃冰箱贮存备用。
2、单试剂法甘油三酯含量测定试验(GPO-PAP法)
将四级培养后的菌液及未接种菌液的甘油三酯培养基分别取10mL用冷冻离心机，4℃，4000r/min离心10min，取上清液，按甘油三酯试剂盒(南京建成生物试剂公司A110- 1-1)说明用96孔板将无菌蒸馏水、校准品、样本各取2.5μL分别加入空白孔、校准孔及样本孔中，每孔再加250μL工作液混匀，37℃孵育10min，每组三个平行，用酶标仪测定其 510nm处的OD值。
3试验结果计算方法
以如下计算公式计算乳酸菌的TG降解率。
总TG含量——未接种菌液的甘油三酯培养基中甘油三酯(TG)含量；
残留TG含量——接种菌液四级培养后的甘油三酯培养基中甘油三酯(TG)含量。
副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)HCS17-040 TG降解率为42.8％。
实施例5对照菌株降甘油三酯体外试验
试验选取了现有部分商品菌株进行对照，采用相同的GPO-PAP法测定甘油三酯降解率。试验结果见表8，对照菌株中甘油三酯降解率最高的为丹麦科汉森的动物双歧杆菌乳亚种BB-12菌株，其TG降解率为39.3％；其次为丹麦科汉森的植物乳杆菌vegestar 2.0，其TG降解率为35.7％。根据实施例4测定结果，副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)HCS17-040的TG降解率为42.8％，高于表8所有对照菌株。
表8对照菌株甘油三酯降解率
实施例6副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)HCS17-040 CGMCC No.19747培养方法
1、冻存菌种复苏：取存于低温冰箱内的菌种冻存管，立即放入37℃水浴锅内进行菌种复苏，15～30s，至冻存管内的固体全部融化；
2、一级培养：将复苏好的1mL冻存管菌种接种至装有10mL培养基试管中，37℃培养箱恒温静置培养16±0.5h；
3、二级培养：将菌种活化所得菌悬液按5％接种量接种于100mL培养基中，装液量80％，37℃静置培养16±0.5h，测定菌悬液的pH值为4.00-4.20，OD值为6.05-6.25说明发酵正常；
4、三级培养：将二级培养的菌悬液按5％接种量接种到300mL培养基中，装液量80％，37℃静置培养12.5±0.5h，测定菌悬液的pH为4.25-4.45、收率为0.90-1.10％、活菌数为1.2×109cfu/mL以上，说明发酵正常。
所述的培养基配方：蛋白胨10g/L，牛肉粉3g/L，酵母粉4g/L，磷酸二氢钾2g/L，柠檬酸2g/L，乙酸钠5g/L，葡萄糖20g/L，七水合硫酸镁0.58g/L，四水合硫酸锰0.25g/L，吐温-80 0.6g/L，番茄汁10mL/L，调pH至6.5；115℃，30min灭菌。
上述副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)HCS17-040三级培养所得的菌悬液活菌数为1.5×109cfu/mL。
<110>汉臣氏（沈阳）儿童制品有限公司
<120>一株具有降甘油三酯功能的副干酪乳杆菌及其应用
<160>1
<170>SIPOSequenceListing 1.0
<210>1
<211>1434
<212>DNA
<213>副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）HCS17-040
<400>1
GACGGCTCGC TCCCTAAAAG GGTTACGCCA CCGGCTTCGG GTGTTACAAA CTCTCATGGT 60
GTGACGGGCG GTGTGTACAA GGCCCGGGAA CGTATTCACC GCGGCGTGCT GATCCGCGAT 120
TACTAGCGAT TCCGACTTCG TGTAGGCGAG TTGCAGCCTA CAGTCCGAAC TGAGAATGGC 180
TTTAAGAGAT TAGCTTGACC TCGCGGTCTC GCAACTCGTT GTACCATCCA TTGTAGCACG 240
TGTGTAGCCC AGGTCATAAG GGGCATGATG ATTTGACGTC ATCCCCACCT TCCTCCGGTT 300
TGTCACCGGC AGTCTTACTA GAGTGCCCAA CTAAATGCTG GCAACTAGTC ATAAGGGTTG 360
CGCTCGTTGC GGGACTTAAC CCAACATCTC ACGACACGAG CTGACGACAA CCATGCACCA 420
CCTGTCATTT TGCCCCCGAA GGGGAAACCT GATCTCTCAG GTGATCAAAA GATGTCAAGA 480
CCTGGTAAGG TTCTTCGCGT TGCTTCGAAT TAAACCACAT GCTCCACCGC TTGTGCGGGC 540
CCCCGTCAAT TCCTTTGAGT TTCAACCTTG CGGTCGTACT CCCCAGGCGG AATGCTTAAT 600
GCGTTAGCTG CGGCACTGAA GGGCGGAAAC CCTCCAACAC CTAGCATTCA TCGTTTACGG 660
CATGGACTAC CAGGGTATCT AATCCTGTTC GCTACCCATG CTTTCGAGCC TCAGCGTCAG 720
TTACAGACCA GACAGCCGCC TTCGCCACTG GTGTTCTTCC ATATATCTAC GCATTTCACC 780
GCTACACATG GAGTTCCACT GTCCTCTTCT GCACTCAAGT TTCCCAGTTT CCGATGCGCT 840
TCCTCGGTTA AGCCGAGGGC TTTCACATCA GACTTAAAAA ACCGCCTGCG CTCGCTTTAC 900
GCCCAATAAA TCCGGATAAC GCTTGCCACC TACGTATTAC CGCGGCTGCT GGCACGTAGT 960
TAGCCGTGGC TTTCTGGTTG GATACCGTCA CGCCGACAAC AGTTACTCTG CCGACCATTC 1020
TTCTCCAACA ACAGAGTTTT ACGACCCGAA AGCCTTCTTC ACTCACGCGG CGTTGCTCCA 1080
TCAGACTTGC GTCCATTGTG GAAGATTCCC TACTGCTGCC TCCCGTAGGA GTTTGGGCCG 1140
TGTCTCAGTC CCAATGTGGC CGATCAACCT CTCAGTTCGG CTACGTATCA TCGCCTTGGT 1200
GAGCCATTAC CTCACCAACT AGCTAATACG CCGCGGGTCC ATCCAAAAGC GATAGCTTAC 1260
GCCATCTTTC AGCCAAGAAC CATGCGGTTC TTGGATCTAT GCGGTATTAG CATCTGTTTC 1320
CAAATGTTAT CCCCCACTTA AGGGCAGGTT ACCCACGTGT TACTCACCCG TCCGCCACTC 1380
GTTCCATGTT GAATCTCGGT GCAAGCACCG ATCATCAACG AGAACTCGTT CGAC 1434
Claims (4)
1. 一株具有降甘油三酯功能的副干酪乳杆菌在制备治疗高血脂症药品中的应用，其特征在于，所述副干酪乳杆菌，所述菌株命名为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）HCS17-040，该菌株已于2020年04月27日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.19747。
2.权利要求1所述的一株具有降甘油三酯功能的副干酪乳杆菌在制备具有降甘油三酯功能的药品中的应用。
3.一种药物制剂，其特征在于，包括有效剂量的权利要求1所述的一株具有降甘油三酯功能的副干酪乳杆菌和药学上可接受的辅料。
4.一种菌剂，其特征在于，是含有权利要求1所述的具有降甘油三酯功能的副干酪乳杆菌的菌剂。
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