PT1796698E - Estirpe de lactobacillus acidophilus com propriedades analgésicas no sistema gastrointestinal - Google Patents

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PT1796698E
PT1796698E PT05788495T PT05788495T PT1796698E PT 1796698 E PT1796698 E PT 1796698E PT 05788495 T PT05788495 T PT 05788495T PT 05788495 T PT05788495 T PT 05788495T PT 1796698 E PT1796698 E PT 1796698E
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lactobacillus
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acídophílus
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Didier Carcano
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Danisco
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Description

ΡΕ1796698 1 DESCRIÇÃO "ESTIRPE DE LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS COM PROPRIEDADES ANALGÉSICAS NO SISTEMA GASTROINTESTINAL"
Entre os microrganismos, em particular entre as bactérias, alguns possuem uma influência positiva no sistema imune, em particular as bactérias lácticas e as bifidobactérias e são descritas como bactérias ou estirpes "probióticas".
De um modo geral, através da bactéria ou estirpe probiótica pretende-se significar um microrganismo não patogénico que, ingerido vivo, exerce um efeito benéfico na saúde ou fisiologia do hospedeiro. Estas estirpes probióticas, de um modo geral, possuem capacidade de sobreviver a passagem através da parte superior do trato digestivo. Não são patogénicas, não são tóxicas e exercem os seus efeitos benéficos na saúde, por um lado através de interacções ecológicas com a flora residente no trato digestivo e por outro lado através da sua capacidade de influenciar o sistema imune de forma positiva através do "GALT" (tecido linfóide associado ao tubo digestivo). Dependendo da definição de probiótico, estas bactérias, quando administradas num número suficiente, possuem capacidade de progredirem vivas no intestino, no entanto não atravessam a barreira intestinal e os seus efeitos primários são pois sentidos no 2 ΡΕ1796698 lúmen e/ou na parede do trato gastrointestinal. Elas fazem asim parte da flora residente durante o período de administração. Esta colonização (ou colonização temporária) permite que as bactérias probióticas exerçam um efeito benéfico, como seja a repressão de microrganismos potencialmente patogénicos presentes na flora e interacções com o sistema imune do intestino.
As estirpes probióticas mais usadas, em particular nos produtos lácteos, são principalmente bactérias e leveduras dos seguintes géneros: Lactobacillus spp., Streptococcus spp., Bifidobacterium spp. e Sacharomyces spp. Entre os efeitos probióticos registados para estas bactérias, podem ser mencionados, por exemplo, a melhoria da tolerância à lactose, prevenção ou tratamento de infecções gastrointestinais e urogenitais, redução de cancros, redução do nível de colesterol no sangue. No entanto, deve ser mencionado que nem todas as estirpes do género atrás descrito, consideradas individualmente, possuem estes efeitos, mas apenas alguns deles, que devem ser seleccionados cuidadosamente.
De forma a preencher os requisitos industriais, torna-se necessário encontrar estirpes ou misturas de estirpes que sejam eficazes e tornem possível obter uma solução para a dor ao nível gastrointestinal e muitas vezes expressa como desconforto intestinal, em particular síndrome do intestino irritável (IBS) ou dor causada por inflamação ao nível gastrointestinal, em particular durante colite ou diarreia. 3 ΡΕ1796698 0 documento WO 03/013558 descreve um método de tratamento de dor e desconforto de colite actínica resultante da terapia com radiação, o referido método compreendendo a administração, a uma pessoa necessitada, da quantidade eficaz de uma composição dietética ou farmacêutica probiótica compreendendo estreptococos, lactobacilos e bifidobactérias protectores, seleccionados do grupo consistindo em Streptococcus thermophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbruecki, Bifidobacterium longum, Bifidobacte-rium infantis e Bifidobacterium bifidum, num quantidade diária entre pelo menos 100 x 109 e 3600 x 109 células bacterianas.
Assim, o problema que o presente invento propõe resolver é proporcionar uma estirpe de bactérias probió-ticas tendo propriedades analgésicas.
Para este fim, o presente invento propõe a utilização de pelo menos uma estirpe de Lactobacillus acidophilus para preparar um suporte administrado a humanos ou animais para fins analgésicos no sistema gastrointestinal . O presente invento é definido pelas reivindicações . O invento propõe igualmente um processo in vitro 4 ΡΕ1796698 para a selecção de um microorganismo para preparar um suporte, administrado a humanos ou animais, para fins analgésicos no sistema gastrointestinal compreendendo as seguintes fases: i) Colocação do microrganismo a ser testado em contacto com pelo menos uma célula epitelial; ii) detecção da expressão dos receptores de opióides e/ou receptores de canabinóides em pelo menos uma célula epitelial; 0 invento tem a vantagem de propor caraterísticas que são indiscutíveis e que expandirão a gama de estirpes disponíveis. 0 invento possui uma outra vantagem, a de poder ser usado para um fim terapêutico ou profiláctico no sistema gastrointestinal. 0 invento é particularmente vantajoso quando é administrado a humanos ou animais para um fim terapêutico ou profiláctico no sistema gastrointestinal, em particular na redução da dor no caso do síndrome do intestino irritável ou no caso de dor causada pelas reacções inflamatórias ou na regulação de inflamação intestinal. 0 invento é igualmente vantajoso uma vez que torna possível regular o trânsito intestinal através da modulação da secreção e motricidade digestiva, quando é 5 ΡΕ1796698 administrado aos seres humanos ou animais para fim terapêutico ou profiláctico. 0 presente invento também tem a vantagem de preservar todas as suas propriedades quando é incorporado num suporte farmacêuticamente aceitável ou num produto alimentar.
Outras vantagens e caracteristicas do invento surgirão mais claramente quando da leitura da descrição e exemplos que se seguem, dados apenas com fins ilustrativos e não limitantes.
Um objectivo do presente invento é a utilização de pelo menos uma estirpe de Lactobacillus acidophilus para preparar um suporte administrado a humanos ou animais para fins analgésicos no sistema gastrointestinal. 0 Lactobacillus acidophilus usado de acordo com o invento é uma estirpe gram-positiva. Vantajosamente, é uma estirpe catálase-negativa, com um metabolismo homofermen-tativo dando origem à produção de ácido láctico. 0 Lactobacillus acidophilus usado de acordo com o invento pode também produzir uma bacteriocina, como seja por exemplo, lactacina, activa contra outros microrganismos .
De preferência, é um Lactobacillus acidophilus 6 ΡΕ1796698 tendo uma boa resistência à pepsina, em condições de pH ácido, uma boa resistência a pancreatina e uma boa tolerância aos sais biliares.
De preferência, um Lactobacillus acidophilus descrito como "hidrofóbico" será usado, i.e., um tendo uma forte afinidade para solventes orgânicos polares ou não polares, tais como por exemplo n-decano, clorofórmio, hexadecano ou xileno.
As estirpes de Lactobacillus acidophilus preferidas de acordo com o invento são Lactobacillus acidophilus PTA-4797 e Lactobacillus acidophilus NCFM. A estirpe de Lactobacillus acidophilus PTA-4797 foi registada pela Rhodia Chimie, 26, quai Alphonse Le gallo, 92512 BOULOGNE-BILLANCOURT Cedex France, de acordo com o Tratado de Budapeste na American Type Culture Collectiom (ATCC) , onde está registado com o número de registo PTA-4797. Esta estirpe está descrita em W02004052462.
Dentro do contexto do presente uso de acordo com o invento, a analgesia no sistema gastrointestinal é vantajosamente mediada através dos receptores de opióides e/ou dos receptores de canabinóides.
Os receptores de opióides descritos são três em número: δ, κ e μ. Pertencem à superfamilia dos receptores acoplados às proteínas G que são compostos por sete hélices transmembranares. A parte intracelular do receptor está em 7 ΡΕ1796698 contacto com a proteína G, que está associado com ela, e que pode variar dependendo do tipo de agonistas usados, mas predominantemente as proteínas GaÍ3>GaÍ2>Gaii.
Os receptores de opióides, em particular o receptor μ, possuem várias funções. A principal é um papel analgésico demonstrado pelo uso de agonistas tipo β-endorfina ou morfina específicos deste receptor que passa a barreira hematomeníngica. A segunda função deste receptor no trato digestivo é reduzir o trânsito intestinal através da inibição da secreção e da motricidade digestiva. Finalmente, os receptores de opióides estão também envolvidos na regulação da inflamação intestinal. 0 receptor μ para os opióides está presente no sistema nervoso central mas também no periférico. A sua presença tem sido detectada na maioria dos órgãos vitais do corpo humano: baço, fígado, rins, intestino delgado e cólon em particular no sistema nervoso intestinal nos neurónios da submucosa e plexos mesentérico, mas também, in vitro nos linfócitos, monócitos/macrófagos e células epiteliais.
Os receptores de canabinóides, designados CB1 e CB2, pertencem à superfamília de receptores acoplados às proteínas G que são compostas por sete hélices transmembra-nares. Eles são expressos essencialmente pelo sistema nervosos central e periférico para CB1 e pelas células da resposta imune para CB2. Nos seres humanos, existem dois ligandos endógenos destes receptores de canabinóides, os quais são naturalmente produzidos pelas células do epitélio intestinal. 8 ΡΕ1796698
Os receptores canabinóides CB1 expressos pelo sistema nervoso entérico serão a causa de um abrandamento da peristalsia do estômago e intestino delgado e uma inibição da secreção gástrica. São presumidas outras funções anti-diarreicas e funções anti-cancro dos receptores de canabinóides. Dentro do contexto da presente utilização de acordo com o invento, a analgesia no sistema gastrointestinal é preferencialmente mediada através dos receptores μ para os opióides e/ou dos receptores CB1 e/ou receptores CB2 . 0 suporte empregue durante a utilização de acordo com o invento é, de preferência, um suporte farmaceutica-mente aceitável ou um produto alimentar.
Por suporte farmaceuticamente aceitável pretende-se significar, inter alia, suporte na forma de comprimidos prensados, comprimidos, cápsulas, pomadas, supositórios ou soluções bebíveis.
De preferência, o suporte empregue durante a utilização de acordo com o invento é um produto alimentar como seja uma suplemento alimentar, uma bebida ou um pó baseado em leite. De preferência, é um produto lácteo de origem animal ou vegetal.
Por produto lácteo pretende-se significar um meio compreendendo leite de origem animal e/ou vegetal. Como 9 ΡΕ1796698 leite de origem animal pode ser referido leite de vaca, ovelha, cabra ou búfalo. Como leite de origem vegetal pode-se mencionar qualquer substância fermentável de origem vegetável que possa ser usada de acordo com o invento, em particular derivado de soja, arroz ou cereais.
Ainda, mais de preferência, o suporte empregue de acordo com o invento é um leite fermentado ou leite humanizado. A estirpe de Lactobacillus acidophilus usada para preparar um suporte de acordo com o invento pode ser na forma de uma suspensão bacteriana, antes ou após congelação, na forma de concentrados, na forma seca liofilizada ou congelada. Qualquer que seja a forma usada, a estirpe pode ser congelada. A estirpe de Lactobacillus acidophilus usada de acordo com o invento pode compreender entre 106 e 1012 CFU de bactérias/g de suporte e, mais particularmente entre 108 a 1012 CFU de bactérias/g de suporte. CFU significa "unidades formadoras de colónias". Por grama de suporte significa, de preferência, o produto alimentar ou o suporte farmaceuticamente aceitável e, de preferência 109 a 1012 CFU/g para a forma liofilizada.
Um objectivo do invento é igualmente um processo in vitro para a selecção de um microrganismo para preparar um suporte, administrado a seres humanos ou animais, com 10 ΡΕ1796698 uma finalidade analgésica no sistema gastrointestinal compreendendo as seguintes fases: i) Colocação do microrganismo a ser testado em contacto com pelo menos uma célula epitelial; ii) detecção da expressão dos receptores opióides e/ou receptores canabinóides em pelo menos uma célula epitelial. A célula ou células epiteliais usadas durante as fases i) ou ii) , de preferência, derivam da linha celular ATCC HTB-38, normalmente designada linha HT-29 ou da linha celular Caco-2. Estas são linhas celulares de cancro do cólon. Podem também ser isoladas e purificadas células de biópsias de operações a seres humanos.
Fase i) é realizada, de preferência, usando entre 108 e 1012 CFU de microrganismos a serem testados com pelo menos uma célula epitelial. 0 período de contacto, durante a fase i) , pode variar entre as 0 horas e as 24 horas e, de preferência, é 3 horas.
De um modo geral, o contacto com as células de acordo com a fase i) foi realizado a temperatura convencional, atmosfera modificada e condições de esterilidade bem conhecidas dos familiarizados com a matéria, em particular em condições de cultura de células epiteliais in vitro. 11 ΡΕ1796698 A fase ii) do processo de selecção de acordo com o invento é realizada, de preferência, através da detecção da expressão dos receptores μ para os opióides (MOR) e/ou dos receptores CB1 e/ou dos receptores CB2. Tipicamente, a expressão de apenas um receptor pode ser detectada: MOR sozinho, o receptor CB1 sozinho ou o receptor CB2 sozinho. Como alternativa, pode ser detectada a expressão dos dois receptores: MOR e o receptor CB1; MOR e o receptor CB2; o receptor CB1 e o receptor CB2. Como alternativa, a expressão de três receptores pode ser detectada: MOR, o receptor CB1 e o receptor CB2. A fase ii) do processo de selecção de acordo com o invento é realizada, preferencialmente, pela detecção da expressão, e facultativamente nível, do RNA mensageiro dos receptores de opióides e/ou dos receptores de canabinóides, por exemplo por PCR, inter alia por PCR quantitativo, ou por imuno-histoquímica. Podem ser usadas outras técnicas conhecidas dos familiarizados com a área para a detecção de mRNA e sua medição. A Figura 1 representa, em função do tempo, a cinética de expressão do RNA mensageiro dos receptores μ dos opióides, expressos nas células epiteliais ATCC HTB-38 durante a estimulação por 4 microrganismos diferentes.
Figura 2 representa, em função do tempo, a cinética de expressão do RNA mensageiro dos receptores CB1, 12 ΡΕ1796698 expressos nas células epiteliais ATCC HTB-38 durante a estimulação por 3 microrganismos diferentes.
Figura 2 representa, em função do tempo, a cinética de expressão do RNA mensageiro dos receptores CB2, expressos nas células epiteliais ATCC HTB-38 durante a estimulação por 3 microrganismos diferentes.
Figura 4 representa a expressão de mRNA de MOR em diferentes condições.
Figura 5 representa a expressão de mRNA de TNF alfa do cólon em murganhos não tratados e em murganhos tratados com L. acidophilus.
Figura 6 representa a expressão de mRNA de KC do cólon em murganhos não tratados e em murganhos tratados com L. acidophilus.
Figura 7 representa a expressão de mRNA de IL-1 beta do cólon em murganhos não tratados e em murganhos tratados com L. acidophilus.
Figuras 8, 10 e 12 representam células epiteliais imunocoradas.
Figuras 9, 11 e 13 representam a percentagem de células epiteliais imunocoradas. 13 ΡΕ1796698
Os exemplos que se seguem ilustram o invento, sem limitar o seu âmbito. EXEMPLOS:
Exemplo 1 1/ Preparação das células epiteliais: A linha celular de cancro do cólon HT-29 (ATCC HTB-38) foi cultivada em meio DMEM com, respectivamente, 20 e 10% de soro fetal de vitela a 37°C em atmosfera contendo 5% CO2 · A linha celular ATCC HTB-38 foi colocada em contacto com as diferentes estirpes de microrganismos a serem testadas durante 1; 3; 4; 8; 18 ou 24 horas. As células epiteliais ATCC HTB-38 foram então recuperadas e imersas em azoto liquido de forma tornar possível quantificar o mRNA e a proteína dos receptores μ para os opióides e/ou receptores de canabinóides. 2/ Detecção e quantificação dos RNAs mensageiros dos receptores μ de opióides e /ou dos receptores de canabinóides: PCR em tempo real: O RNA total das linhas celulares epiteliais em cultura foi isolado através da utilização de um kit de extracção em coluna (Macherey-Nagel). Resumidamente, as células foram trituradas em tampão de lise contendo 1% de 14 ΡΕ1796698 β-mercaptoetanol, passaram então através de um primeiro tipo de coluna permitindo a eliminação da totalidade do desperdício. Após tratamento com DNAse, o RNA será retro-transcrito no DNA complementar amplificado por PCR em tempo real (ABPrism 7000, Perkin), a uma temperatura de hibrida-ção de 60°C, usando sequências iniciadoras específicas dos receptores μ para os opióides ou para os receptores de canabinóides: para os receptores μ dos opióides (MOR) (Directo: ATgCCAgTgCTCATCATTAC, Reverso: gATCCTTCgAAgATTCCTgTCCT) e para o gene de referência: β-actina (S: TCACCCACACTgTgCCC-ATCTACgA, AS: CAgCggAACCgCTCATTgCCAATg) ; - Para os receptores de canabinóides CB1, Directo CCT AGA TGG CCT TGC AGA TAC C; CB1 reverso TGT CAT TTG AGC CCA CGT ACA G; CB2 directo GCT AAG TGC CCT GGA GAA CGT; CB2 reverso TCA GCC CCA GCC AAG CT. 3/ Resultados:
Os resultados estão apresentados nas Figuras 1 a 3. Os resultados são expressos pela proporção entre o gene alvo (β-actina)/receptores μ para os opióides (MOR) e/ou receptores de canabinóides (CB1, CB2).
Os receptores μ para os opióides e/ou receptores dos canabinóides são expressos na linha de células epiteliais ATCC HTB-38 (Figuras 1 a 3). 15 ΡΕ1796698
Alguns microrganismos, tais como a estirpe de Lactobacíllus, são capazes de induzir a expressão do mRNA dos receptores μ para os opióides e/ou receptores de canabinóides.
Os resultados mostram uma indução significativa dos receptores μ para os receptores de opióides e/ou receptores de canabinóides pelas células epiteliais em cultura.
Esta indução é particularmente forte com a estirpe de Lactobacíllus acidophilus.
As Figuras 1 e 2 mostram que, após 3 horas de incubação das células epiteliais com Lactobacíllus acidophilus, foi observado um aumento de aproximadamente 1000 vezes no nivel de expressão basal do mRNA dos receptores μ para os opióides (Figura 1) e CB1 (Figura 2). A Figura 3 mostra que, após 3 horas de incubação das células epiteliais com Lactobacíllus acidophilus, foi observado um aumento de aproximadamente 100 vezes no nivel de expressão basal do mRNA dos receptores CB2 (Figura 3).
Pelo contrário, não foi detectada indução dos receptores μ para os opióides com uma estirpe comensal de E. coli (Figura 1) . A indução dos receptores de opióides e/ou receptores de canabinóides pela estirpe de Lactobacíllus acidophilus é da mesma ordem de grandeza da obtida pelo TNF-α numa dose de 10 ng/ml. 16 ΡΕ1796698
Exemplo 2 1/ Materiais & Métodos
Estirpe bacteriana. A estirpe de NCFM de Lactobacillus acidophílus de acordo com o presente invento foi crescida anaerobicamente no meio de Man, Rogosa, Sharpe (MRS) (Becton Dickinson) durante a noite a 37°C. Para as experiências in vitro, as bactérias foram usadas quando atingiram a fase exponencial. As culturas foram avaliadas relativamente á pureza por coloração de Gram antes da inoculação animal.
Animais e infecção experimental. As experiências animais foram realizadas em estabelecimentos acreditados no Instituto Pasteur da Lille de acordo com directivas governamentais. Os murganhos Balb/c foram alojados cinco por gaiola e tiveram acesso livre a ração convencional e a
água da torneira num ciclo de luz diurna de 12 h. Os animais receberam 109 CFU da estirpe de Lactobacillus acidophílus, os quais foram ressuspensos em 0,5% de CMC (carboximetilcelulose, Sigma), uma vez por dia por gavagem gástrica durante catorze dias. Os animais foram mortos por deslocamento cervical. Todos os cólones foram removidos dos animais e cortados em duas partes. Uma parte foi fixada durante a noite em 4% de paraformaldeido e embebida em parafina. A segunda parte do cólon foi usada para a quantificação do mRNA de receptor mu de opióides (MOR), 17 ΡΕ1796698 receptores de canabinóides (CB1 e CB2) e citocinas inflamatórias TNFa, KC e IL-Ιβ.
Indução de colite por TNBS e desenho do estudo.
Uma vez que a expressão de MOR é regulada pela inflamação (Philippe D et al., JCI 2003; Pol 0 et al., Mol Pharmacol 2001; Pol 0 et al., Curr Top Med Chem 2004), usámos colite induzida por TNBS como controlo positivo. As experiências animais foram realizadas em estabelecimentos acreditados no Instituto Pasteur de Lille de acordo com directivas governamentais. Os animais foram alojados cinco por gaiola e tiveram acesso livre a ração convencional e a água da torneira. Para a indução de colite, os murganhos foram anestesiados durante 90-120 minutos e receberam uma administração intra-rectal de TNBS (40 μΐ, 150 mg/Kg) dissolvido numa mistura de 1:1 de 0,9% de NaCl com etanol a 100%. Os murganhos controlo receberam uma mistura de 1:1 de 0,9% de NaCl com etanol a 100% ou uma solução de soro fisiológico usando a mesma técnica. Os animais foram sacrificados 4 dias após administração de TNBS. PCR em tempo real quantitativo
Isolou-se RNA total a partir de tecidos do cólon usando o kit RNeasy (Macherey Nagel, Hoerdt, França) de acordo com as instruções do fabricante. A quantificação do RNA foi realizada usando espectrofotometria. Após tratamento a 37°C, durante 30 minutos, com 20-50 unidade de DNase I sem RNase (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA), sequências iniciadoras de oligo-dT (Roche Diagnostics 18 ΡΕ1796698
Corporation, Indianapolis, USA) foram usadas para sintetizar cDNA de cadeia simples. Os mRNAs foram quantificados usando a mistura de SYBR green (SYBR green Master Mix; Applera, Courtaboeuf, França) com oligonucleótidos específicos de murganho (ver Tabela I), num GeneAmp Abiprism 70000 (Applera, Courtaboeuf, França). Em cada um dos ensaios, foram incluídos controlos calibrados e sem matriz. Cada amostra foi corrida em triplicado. A intensidade do corante SYBR green foi analisada usando o programa Abiprism 7000 SDS (Applera, Courtaboeuf, França). Todos os resultados foram normalizados relativamente ao gene de manutenção não afectado β-actina.
Tabela 1:
Genes Sequências iniciadoras (51 —»3 1) B-actina S: 5'-gggTCAgAAggATTCCTATg-3' AS: 5' ggTCTCAAACATgATCTggg-3' MOR S: 5' - CCG GCA GCC CTT CCA-3' AS: 5'- GAG GCC CAC TAC ACA CAC GAT -3' CB1 S: 5'.GCC CGC ATG GAC ATT AGG-3' AS: 5'AGG GCC CCA GCA GAT GA -3' CB2 S: 5' - CTC AAT TTT TCT GGT CCC TAT G-3' AS: 5-AGT CTG GCA CCG CTA AAC AAG-3' TNF alfa S:5'-T gggAgTAgACAAggTACAACCC-3’ AS: 5' CATCTTTCTCAAAATTCgAgTgACAA-3’ IL-1 beta S:5’-gATCCACACTCTCCAgCTgCA -3’ AS: 5'-CAACCAACAAgTgATATTCTCCATg-3’ KC S:5’-ggCgCCTATCgCCAATg -3' AS: 5'-CTggATgTTCTTgAggTgAATCC -3' 19 ΡΕ1796698
Imuno-histoquimica para M0R-CB1-CB2 A imuno-histoquimica foi efectuada em secções do cólon embebidas em parafina de murganhos que receberam a estirpe de Lactobacillus acidophilus. Os animais não tratados foram usados como controlos. Após permeabilização durante 5 minutos em PBS contendo 0,1% Triton X-100 a 4°C, as secções foram incubadas durante 15 minutos com 1,5% de soro normal de cabra e 15 minutos com tampão de bloqueio (1% BSA em leite), para minimizar a adsorção inespecifica dos anticorpos. Os tecidos foram subsequentemente incubados com o anticorpo primário policlonal de coelho dirigido contra CB1 (1:200, Cayman Chemical, Ann Arbor, USA) ou CB2 (1:10, Alpha Diagnostic, San Antonio, USA) ou MOR (1:500, Diasorin, Antony, França) durante 2 a 12 horas à temperatura ambiente. As secções foram então incubadas durante 1 hr à temperatura ambiente com anticorpos de cabra anti-IgG de coelho conjugado com o fluorocrómio FITC Alexa 488 (diluição 1:100, Dako Laboratories, Trappes, França). Entre cada fase, as secções foram lavadas duas vezes durante 5 min em PBS contendo 0,05% Triton X-100. Em seguida as lamelas foram contratadas com solução de Hoescht (0,125 mg/ml) e montadas para microscopia. Os controlos negativos consistiram na coloração com soro normal de coelho em vez de anticorpo especifico. A imunofluorescência foi revelada sob microscópio de fluorescência (Leica, Bensheim, Alemanha). O número de células epiteliais imuno- 20 ΡΕ1796698 reactivas para MOR, CB1 e CB2 foi contado em cinco campos diferentes de elevada potência (HPF) e expresso por 100 células epiteliais. 2/ Resultados:
Os resultados estão apresentados nas Figuras 4 a 13. 1) Lactobacillus acldophilus induz a expressão in vivo de mRNA de MOR no cólon dos murganhos (Figura 4).
Após duas semanas de administração de Lactobacillus acldophilus (109 CFU por dia), um aumento de 24 vezes na expressão de mRNA de MOR foi encontrado no cólon por comparação com animais não tratados (p<0,05). Esta indução de mRNA de MOR pela estirpe de Lactobacillus acldophilus foi mais importante comparativamente com a indução de duas vezes nos nossos controlos positivos correspondendo a colite induzida por TNBS (Figura 4). 2) Lactobacillus acidophilus induz a expressão in vivo de MOR, CB1 e CB2 em células epiteliais do cólon de murganhos (Figura 8-13) .
Para avaliar ao nível da tradução a indução de MOR, CB1 e CB2 especificamente em células epiteliais do cólon, foi realizada imuno-histoquímica usando anticorpos 21 ΡΕ1796698 dirigidos especificamente contra estes receptores. Em todas as secções, as células epiteliais coradas para MOR (60 ± 10 vs 5 ± 3%), CB1 (60 ± 8 vs 20 ± 4%) ou CB2 (40 ± 7 vs 20 ± 5%) eram significativamente mais numerosas em murganhos que receberam a estirpe de Lactobacillus acidophílus comparativamente com os murganhos controlo (Figuras 8-13). A coloração verde estava essencialmente localizada em células epiteliais situadas na superfície do epitélio, em contacto com bactérias luminais (Figuras 8-13). Os controlos sem o primeiro anticorpo ou usando um anticorpo irrelevante foram negativos. 3) A administração de Lactobacillus acidophilus está associada a um decréscimo da expressão de citocinas inflamatórias no cólon de murganhos (Figuras 5-7)
De forma a avaliar se a expressão induzida por Lactobacillus acidophilus de MOR, CB1 e CB2 por células epiteliais do cólon pode ter significado funcional em murganhos, comparámos os níveis de mRNA das diferentes citocinas inflamatórias em murganhos não tratados e em animais que receberam a estirpe de Lactobacillus acidophilus durante 14 dias. Foi observado um decréscimo de mais de 50% dos níveis de mRNA das citocinas inflamatórias TNFa, KC e IL-Ιβ em animais tratados com a estirpe de Lactobacillus acidophilus comparativamente com os controlos, sugerindo que a estirpe de Lactobacillus acidophilus reduz a expressão fisiológica de citocinas 22 ΡΕ1796698 inflamatórias no cólon de murganhos através, pelo menos em parte, de uma sobre-expressão de MOR, CB1 e CB2 pelas células epiteliais.
Exemplo 3 1/ Materiais e métodos
In vitro, as células epiteliais do cólon HT-29 ou Caco-2 foram incubadas durante 0 a 6 horas com diferentes probióticos ou bactérias (100 bactérias/célula): L. acidophillus (NCFM), L. salivarius (UCC118), L. paracasei (LPC37), E. coli comensal, E. coli aderente-invasiva (LF82) . 0 papel da via NFkappa na indução da expressão do receptor mu de opióides (MOR) e dos receptores canabinóides (CB1 e CB2) por probióticos foi testado através do tratamento das células HT-29 com um inibidor especifico, o éster feniletilico do ácido cafeico (CAPE). TNFalpha (10 ng/ml, 2 horas), o qual é um indutor da expressão das proteínas acopladas a G, foi usado como controlo positivo. Após a selecção do probiótico mais eficiente para a indução in vitro da expressão dos receptores (receptores MOR, CB1 e CB2), foi realizado um estudo in vivo com murganhos Balb/c (n=10) para administração oral de 109 CFU de probióticos durante 15 dias. A expressão de MOR, CB1 e CB2 foi avaliada nas células epiteliais e no cólon de murganhos por PCR em tempo real e por imuno-histoquímica. O mRNA de citocinas inflamatórias (TNF alfa, KC e IL-1 beta) foi avaliado por PCR em tempo real no cólon dos murganhos. 23 ΡΕ1796698 2/ Resultados
Apenas as estirpes de L. acidophilus e de L. salivarius, foram capazes de rapidamente induzir, logo desde a primeira hora de incubação, uma forte expressão de MOR nas células epiteliais. Esta indução da expressão foi semelhante à indução da expressão observada com as células induzidas por TNF alfa. Para CB1 (848 ± 180 vs 229155, p<0,05) e CB2 (1498 1 333 vs 341 1 163, p<0,01), apenas L. acidophilus induziu a expressão destes receptores. A inibição da via NFkappaB por CAPE não induziu modificações da expressão de MOR pelas células epiteliais estimuladas com L. acidophilus. In vivo, a administração de L. aciduophilus induziu fortemente a expressão de mRNA de MOR (24 ± 075, p< 0,01) ao nivel do cólon. O estudo por imuno-histoquímica confirmou, in vivo, a indução da expressão de MOR, CB1 e CB2 pelas células do cólon em animais que receberam L. acidophilus. A indução destes receptores está associada à diminuição ou a pelo menos 50% da expressão das citocinas inflamatórias do cólon. 3/Conclusão L. acidophilus é a estirpe mais eficiente para a indução da expressão de MOR, CB1 e CB2, in vitro, em linhas celulares epiteliais e in vivo no cólon. - 24 - ΡΕ1796698
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> DANISCO A/S <12 0> Estirpe de Lactobacillus acidophilus tendo propriedades analgésicas no sistema gastrointestinal <130> BCT050283 <150> <151> FR0409966 2004-09-21 <160> 22 <17 0> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <22 0> <223> oligonucleótido como sequência iniciadora <400> 1 atgccagtgc tcatcattac 20 <210> <211> 2 23 <212> <213> DNA artificial <22 0> <223> oligonucleótido como sequência iniciadora <400> 2 gatccttcga agattcctgt cct 23 <210> <211> 3 25 <212> <213> DNA artificial <22 0> <223> oligonucleótido como sequência iniciadora <400> 3 tcacccacac tgtgcccatc tacga 25 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <22 0> 25 ΡΕ1796698 <223> oligonucleótido como sequência iniciadora <400> 4 cagcggaacc gctcattgcc aatg 24 <210> 5 <211> 22 -<212> DNA <213> artificial <22 0> <223> oligonucleótido como sequência iniciadora <400> 5 cctagatggc cttgcagata cc 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <22 0> <223> oligonucleótido como sequência iniciadora <400> 6 tgtcatttga gcccacgtac ag 22 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <22 0> <223> oligonucleótido como sequência iniciadora <400> 7 gctaagtgcc ctggagaacg t 21 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> artificial <22 0> <223> oligonucleótido como sequência iniciadora <400> 8 tcagccccag ccaagct 17 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <22 0> 26 ΡΕ1796698 <223> oligonucleótido como sequência iniciadora <400> 9 gggtcagaag gattcctatg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <22 0> <223> oligonucleótido como sequência iniciadora <400> 10 ggtctcaaac atgatctggg 20 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <22 0> <223> oligonucleótido como sequência iniciadora <400> 11 ccggcagccc ttcca 15 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <22 0> <223> oligonucleótido como sequência iniciadora <400> 12 gaggcccact acacacacga t 21 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <22 0> <223> oligonucleótido como sequência iniciadora <400> 13 gcccgcatgg acattagg 18 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> artificial <22 0> 27 ΡΕ1796698 <223> oligonucleótido como sequência iniciadora <400> 14 agggccccag cagatga 17 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <22 0> <223> oligonucleótido como sequência iniciadora <400> 15 ctcaattttt ctggtcccta tg 22 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <22 0> <223> oligonucleótido como sequência iniciadora <400> 16 agtctggcac cgctaaacaa g 21 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <22 0> <223> oligonucleótido como sequência iniciadora <400> 17 tgggagtaga caaggtacaa ccc 23 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <22 0> <223> oligonucleótido como sequência iniciadora <400> 18 catctttctc aaaattcgag tgacaa 26 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <22 0> 28 ΡΕ1796698 <223> oligonucleótido como sequência iniciadora <400> 19 gatccacact ctccagctgc a 21 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <22 0> <223> oligonucleótido como sequência iniciadora <400> 20 caaccaacaa gtgatattct ccatg 25 <210> 21 <211> 17 <212> DNA <213> artificial <22 0> <223> oligonucleótido como sequência iniciadora <400> 21 ggcgcctatc gccaatg 17 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <22 0> <223> oligonucleótido como sequência iniciadora <400> 22 ctggatgttc ttgaggtgaa tcc 23
Lisboa, 27 de Janeiro de 2012

Claims (8)

  1. ΡΕ1796698 1 REIVINDICAÇÕES 1. Lactobacillus acídophílus para usar no tratamento analgésico do sistema gastrointestinal de humanos ou animais, em que o referido Lactobacillus acídophílus não está na forma de uma mistura com bactérias lácticas.
  2. 2. Lactobacillus acídophílus para usar no tratamento analgésico do sistema gastrointestinal de humanos ou animais, em que o referido Lactobacillus acídophílus é o único ingrediente activo
  3. 3. Lactobacillus acídophílus para usar no tratamento analgésico do sistema gastrointestinal de humanos ou animais de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o referido Lactobacillus acídophílus induz a expressão o receptor de opióide μ (MOR) e receptores de canabinóides CB1 e CB2 em células epiteliais de cólon.
  4. 4. Lactobacillus acídophílus para usar no tratamento analgésico do sistema gastrointestinal de humanos ou animais, em que o referido Lactobacillus acídophílus é a estirpe registada na ATCC com o número PTA-47 97 e também conhecidos como Lactobacillus acídophílus NCFM.
  5. 5. Processo in vitro para a selecção de um microrganismo para preparar um suporte, administrado a seres humanos ou animais, para um fim analgésico no sistema gastrointestinal compreendendo as fases que se seguem: 2 ΡΕ1796698 i) colocação do microrganismo a ser testado em contacto com pelo menos uma célula epitelial; ii) detecção da expressão dos receptores de opióides e/ou receptores de canabinóides em pelo menos uma célula epitelial; em que o microrganismo a ser testado é seleccionado se induzir a expressão do receptor de opióides μ (MOR) e dos receptores de canabinóides CB1 e CB2.
  6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 5 em que pelo menos uma célula epitelial da fase i) ou ii) provém da linha celular ATCC HTB-38 ou da linha celular Caco-2 .
  7. 7. Processo de acordo com uma das reivindicações 5 a 6 caracterizado por a fase ii) ser realizada através da detecção dos receptores μ para os de opióides e dos receptores CB1 e os receptores CB2.
  8. 8. Processo de acordo com uma das reivindicações 5 a 7 caracterizado por a fase ii) ser realizada através da detecção da expressão do RNA mensageiro dos receptores de opióides e dos receptores de canabinóides CB1 e CB2. Lisboa, 27 de Janeiro de 2012
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