JP2009542245A

JP2009542245A - システイン顆粒およびビフィドバクテリウムアニマリスラクティスの成長刺激剤としてのその使用

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Abstract

本出願は、乳製品基質に少なくとも1つの株のビフィドバクテリウムアニマリス ssp ラクティスを直接植菌し、前記乳製品基質を発酵乳製品へと変えるために特に適切な種菌に関する。この種菌は、混合物または集合体の形態で、L-システイン塩基と少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスとを含む。前記システインおよび前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスとは、各々が凍結および/または凍結乾燥顆粒の中の形態に含まれるか、または各々が凍結および/または凍結乾燥顆粒の形態にある。有利には、前記システインはB.アニマリスラクティスの細胞と同じ顆粒または同じ凍結乾燥体に組込まれる。

Description

発明の分野

本発明はシステイン顆粒およびビフィドバクテリウムアニマリス ssp ラクティス(Bifidobacterium animalis ssp lactis)のための成長刺激剤としてのその使用に関する。

発明の先行技術
乳製品の分野において、プロバイオティクス市場は急成長している。

有利な感覚受容性の質を提供すると同時にで、高レベルのプロバイオティクス株を含む製品を提案するためには、乳製品製造の専門家は、技術的(technical)または科学技術的(technological)発酵体、並びにプロバイオティック発光体の両方を用いた混合発酵の問題に直面している。

プロバイオティクス株と呼ばれる株は乳製品基質上で緩徐に成長する(ビフィドバクテリウムについては1時間ないし2時間の世代時間) 種に代表されるが、科学技術的発酵体はむしろより速く成長するヨーグルト発酵体に由来する(S.サーモフィルス(S. thermophilus)およびL.ブルガリクス(L. bulgaricus)については15分ないし30分の世代時間)。

科学技術的な発酵体の成長とプロバイオティクスの成長との間で良好な折衷案を達成することは難しい；産業界で専門家の大部分は、プロバイオティクスの量よりも感覚受容性(organoleptic)の側面を好む：一般的に、プロバイオティクスの個体群は、発酵製品中で10⁶ないし10⁷ cfu/gである。

現在、最少で10⁸ cfu/gのプロバイオティクス株を含む製品を用いて、このようなプロバイオティクスについて多くの健康調査が実施されている。

プロバイオティクスの成長を刺激し得る化合物の探索は、その栄養学的要求およびそれらを満足する乳製品基質の能力に関する株についての深い知識に基づく。

さらに、このような化合物は負の効果を及ぼさず、かつ、技術的株と呼ばれる株の成長を刺激しないこと、それらは食物の品質であること、およびそれらは製品の感覚受容特性を落とさないことが証明されなければならない。

さらに、刺激を与えるために使用される必要があり、かつ上記の制約を満足する活性化化合物の量は、一般に乳製品基質に対して非常に小さな割合である。

このような用量(一般に100 mg/L未満)、許容される耐容は乳製品基質の製造に使用される測定システムおよび組込みの様式に適合しないので、このような基質を工業スケールで使用することには問題がある。

使用される技術的株がいくつかの乳酸菌株の共生のの状況において機能しなければならない場合は、プロバイオティクスによって生じる乳酸発酵に加えてS.サーモフィルスとL.ブルガリクスとの共生発酵を用いる発酵乳の場合と同様に、問題はさらに複雑である。

プロバイオティクスの成長に好適な条件を決定するために種々の試験が先行技術において実施されてきている。しかしながら、このような試験の大部分は、工業的環境における製品の製造の間の他の乳酸菌株の存在および活性の可能性を考慮に入れずに、プロバイオティクス菌の純粋培養で実施されている。

1つの解決策が、2005年7月15日にCompagnie Gervais Danoneの名義の仏国特許出願第FR-05 07529号に記載されており、それは、ビフィズス菌のための活性剤としての硫黄含有アミノ酸の使用を提案する。

本出願は、ビフィドバクテリウムアニマリス ssp ラクティスの株に特に適応する改良策を提案する。したがって、本出願は先行技術の不都合を被らない、ヒトの消費を意図したプロバイオティックな価値を有する発酵乳製品、より具体的にはプロバイオティクスB.アニマリスラクティスによって行われる発酵に加えてS.サーモフィルス-L.ブルガリクスの共生発酵を伴う発酵乳製品の工業的製造の間に、B.アニマリスラクティスの単純、安全かつ効果的な活性化および/または刺激の問題を克服する種菌を提案する。

発明の概要
本発明は、ビフィドバクテリウムアニマリス ssp ラクティスの改良された種菌、前記種菌の使用、および前記種菌を使用して得られた発酵乳製品に関する。

本発明の種菌は、乳製品基質への少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスの直接植菌に特に適合し、前記乳製品基質をヒトの消費に適切な発酵乳製品へと、より具体的には少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスを含むプロバイオティックな価値を有する発酵乳製品へと変える。

当該種菌は、混合物として、または集合体もしくは「複数の部分からなるキット(kit of parts)」の形態、凍結顆粒および/または単数または複数の凍結乾燥体において構成され、それらの中には特にL-システインおよび少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスが存在する
本発明者らは、システインの特定の形態、即ち(一旦、解凍および/または再溶解された)前記システインから製造された顆粒および/または単数または複数の凍結乾燥体が最低でも４のpHを持つような形態にあるL-システインを選択している。適切なL-システインの1つの例は、通常、システイン塩基(その還元体の式はHSCH₂CH(NH₂)CO₂Hである)として知られるL-システインである。

このシステインの特定の形態は、一般にシステイン塩酸塩一水和物の形態で使用される他のシステインの形態(一般には、システイン-HCl)よりも効果的である。

本発明者らによって選択された特定のL-システインの低い溶解性にも拘らず、本発明者らは、B.アニマリスラクティスの生理学的条件および/または代謝を全く害することなく、B.アニマリスラクティスの細胞と、この特定の形態のL-システインとを組合わせるかまたは一体化する凍結顆粒および/または単数または複数の凍結乾燥体の形態にある種菌を製造することに成功した。

本発明の「一体化された」様式の種菌においては、当該種菌の少なくとも1つの顆粒または凍結乾燥体は、B.アニマリスラクティスとこの特定の形態のL-システインとの両方を含む。本発明の「組合された」様式の種菌においては、顆粒の或る部分または一方の凍結乾燥体は本発明の特定のL-システインを含み、顆粒の他の部分または他方の凍結乾燥体はB.アニマリスラクティスの細胞を含む。

したがって本発明は、システイン活性化剤と組合された、または一体化されたB.アニマリスラクティスの種菌を提案する。

顕著には、本発明の種菌は、4℃ないし11℃の範囲の温度での前記発酵製品を少なくとも20日、好ましくは少なくとも30日保存した後で、発酵製品１グラムあたり5 × 10⁷ cfu未満には減少しない、好ましくは10⁸未満には減少しない、少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス(または、もし存在するのであれば、前記複数の株のB.アニマリスラクティス)の個体群を産生できる(図８および９を参照されたい)。

本発明の種菌は、高いプロバイオティックな価値を有する発酵乳の製造に特に好適である。なぜならば、それは冷蔵環境中での製品の保存の間、B.アニマリスラクティスを非常に高いレベルで維持することができ、かつ、使用されるL-システイン活性化剤は、S.サーモフィルス + L.ブルガリクス共生体も、発酵乳の感覚受容特性も負の影響を受けないような用量で存在するからである。

本出願において、以下の図が参照されるであろう。
図１は、単数または複数のプロバイオティクス発酵体の顆粒およびシステインの顆粒の製造をもくろむ組合された溶液(前記２つのタイプの顆粒は引続いて一緒に混合され得る)と、単数または複数のプロバイオティクス発酵体とシステインとの両方を含む顆粒の製造をもくろむ一体化された溶液とについての流れ図である。一体化された顆粒(システイン-HCl + 単数または複数のプロバイオティクス発酵体)の製造についての流れ図：ビフィドバクテリウムアニマリスラクティス I-2494株またはBB12株(登録商標)発酵体が、プロバイオティクス発酵体とシステイン-HClであるシステインとの両方を含む一体化された顆粒に配合された。ビフィドバクテリウムアニマリスラクティス I-2494株の顆粒(底部の参照曲線)、またはビフィドバクテリウムアニマリスラクティス I-2494株とシステイン-HClとの両方を含む一体化された顆粒(上部の曲線)を植菌された乳製品混合物についての時間に対するpHの変化；同じ顆粒中にシステイン-HClを配合された場合(システイン-HClと一体化された配合)、プロバイオティックなビフィドバクテリウムアニマリスラクティスが受ける生理学的条件の悪化を示す。プロバイオティクス発酵体とシステインとの両方を含む一体化された顆粒(システイン塩基 + プロバイオティクス発酵体：一体化された顆粒中に配合されたビフィドバクテリウムアニマリスラクティス I-2494株またはBB12株(登録商標)発酵体、ここでシステインはシステイン塩基である) の製造についての流れ図である。ビフィドバクテリウムアニマリスラクティス I-2494株の顆粒(最上部の参照曲線)、またはビフィドバクテリウムアニマリスラクティス I-2494株とシステイン塩基との両方を含む一体化された顆粒(下部の曲線)を植菌された乳製品混合物についての、時間に対するpHの変化；(ビフィドバクテリウムアニマリスラクティス + システイン)の一体化された顆粒の配合のためのシステイン塩基の選択は、このプロバイオティクスの生理学的条件が悪化していないことを意味するという事実を示す。図６ないし９：乳製品混合物の比較：・乳製品混合物は、技術的発酵体(S.サーモフィルス I-1630、L.ブルガリクス I-1632およびL.ブルガリクス I-1519の顆粒の混合物)の凍結顆粒およびプロバイオティクス発酵体ビフィドバクテリウムアニマリスラクティス(BB12株(登録商標)、またはI-2494株))の凍結顆粒を用いて0.5 g/Lまで植菌され、・システイン塩基がプロバイオティクス発酵体の顆粒とは別個のシステインの顆粒の形態(組合された溶液G4)で、またはプロバイオティクス発酵体の顆粒が一体化された形態(一体化された溶液G4I)で添加されており、一体化されたシステインの代わりにかつそれと置換えて水が添加されている参照混合物と比較している。図６および図７：時間に対するpHの変化である(単位は時)。図８はおよび図９；発酵乳製品の10℃での保存の間の、時間に対する(単位は日)生物体量の変化(cfu/mL)。

図６および８:ビフィドバクテリウムアニマリスラクティス BB12 (登録商標)プロバイオティクス発酵体:
・乳製品混合物BB12 (登録商標)T = 技術的発酵体の顆粒とビフィドバクテリウム BB12 (登録商標)発酵体の参照顆粒(システインの代わりにかつそれと置換えて水を含む顆粒)との混合物用いて0.5 g/Lまで植菌された乳製品混合物。

・乳製品混合物BB12 (登録商標)G4 = BB12 (登録商標)Tのように、即ち、特に技術的発酵体の顆粒とビフィドバクテリウム BB12 (登録商標)の参照顆粒との混合物を用いて0.5 g/Lまで植菌された乳製品混合物であるが、濃度7.5 mg/Lのシステインが当該混合物に添加されるように、プロバイオティックな顆粒とは別個の凍結顆粒の形態でシステイン塩基が添加されている。

・乳製品混合物BB12 (登録商標) G4I = 技術的発酵体の顆粒とビフィドバクテリウムBB12 (登録商標)発酵体の参照顆粒との混合物を用いて0.5 g/Lまで植菌された乳製品混合物であり、当該混合物に7.5 mg/Lのシステイン塩基を添加するために、前記プロバイオティクスの一体化された顆粒はシステイン塩基を含む。
図７および９:ビフィドバクテリウムアニマリスラクティス I-2494プロバイオティクス発酵体: ・乳製品混合物I-2494 T = 技術的発酵体の顆粒とビフィドバクテリウムI-2494発酵体の参照顆粒(顆粒はシステインの代わりにかつそれと置換えて水を含む)との混合物を用いて0.5 g/Lまで植菌された乳製品混合物。

・乳製品混合物I-2494 G4 = I-2494 T乳製品混合物のように、即ち技術的発酵体の顆粒とビフィドバクテリウムI-2494発酵体の参照顆粒との混合物を用いて0.5 g/Lまで植菌された乳製品混合物であるが、濃度7.5 mg/Lのシステインが当該混合物に添加されるように、プロバイオティクスの顆粒とは別個の凍結顆粒の形態でシステイン塩基が添加されている。

・乳製品混合物I-2494 G4I = 技術的発酵体の顆粒とビフィドバクテリウムI-2494発酵体の参照顆粒の混合物とを用いて0.5 g/Lまで植菌された乳製品混合物であり、当該混合物に7.5 mg/Lのシステイン塩基を添加するために前記プロバイオティクスの一体化された顆粒はシステイン塩基を含む。

詳細な説明
諸定義
本出願中で使用される全ての用語は、乳製品産業および/または食品産業の分野に通常適用される範囲および意味を持つ。

したがって、「乳酸発酵」について参照がなされた場合は、これは、酸化的な乳酸発酵に関係し、他の酸、二酸化炭素およびエキソポリサッカリド(EPS)または芳香族物質のような種々の物質、例えばジアセチルおよびアセトアルデヒドの産生を伴い得る乳酸の産生に続く酸化を意味する。

同様に、用語「乳酸発酵体」は、乳製品基質にこのような酸化的な乳酸発酵をもたらすことができる微生物または生存している、もしくは生存可能な微生物を意味する。

用語「発酵乳」は、乳製品産業において通常適用される意味、すなわち動物体内での消費、より具体的にはヒトの消費を意図し、かつ乳製品基質の酸化的な乳酸発酵に由来する製品の意味を持つ。このような製品は果実、野菜、砂糖、香料などの二次成分を含んでもよい。

呼称「発酵乳」は、厳格な公的規格を満足する。これに関する参照は、コーデックス規格 (FAOおよびWHOの指導の下、コーデックス規格委員会によって提供され、FAOの情報局によって発行され、http://codexalimentarius.netからオンラインで利用可能である。特に、コーデックス規格の第12巻、「乳および乳製品についてのコーデックス標準規格」、および標準規格「コーデックス標準規格A-11(a)-1975」を参照のこと。この内容は、これにより参照によって本出願に組入れられる) についてなされ得る。

具体的な参照は、発酵乳およびヨーグルトに関する1988年12月30日付けの仏国法n°88-1203、または1988年12月31日付けで出版されたフランス共和国の公的文献中のヨーグルトについてなされ得る。この法の内容は、これによって参照により本出願に組入れられる。

したがって用語「発酵乳」は本出願において、少なくとも低温殺菌と同等の処理を受けており、特徴的な菌種または各製品の特徴的な菌種に属する微生物を植菌された乳製品基質によって調製される乳製品のために使用される。「発酵乳」の凝固は、使用された微生物の活性に起因するものとは異なるいかなる手段によっても為されてはならない。

「発酵乳」は、使用された乳基質の構成要素を除去し得るいかなる処理をも受けておらず、具体的には、凝塊が除去されていない。

「発酵乳」は、最終製品の1つ以上の香味抽出物、1つ以上の天然香味料、ならびに重量100あたり30の限度で特定の風味を与える1つ以上の砂糖および他の食品添加物、または穀物すら添加され得る。

基質としての乳製品起源ではない脂肪および/またはタンパク質の組入れは許容されない。

発酵乳に含まれる遊離乳酸の量は消費者への販売時点で100グラムあたり0.6グラム未満であってはならず、乳部分についてのタンパク質の量は普通の乳のもの未満であってはならない。

本出願で用いられる用語「乳製品基質」は、乳製品産業において理解される用語としての「乳」、すなわちS.サーモフィルスおよび/またはL.ブルガリクスのような乳酸菌の単数または複数の株による前記乳製品基質の乳酸発酵が、ヒトの食用が予定されている製品、より具体的には発酵乳を示し得る製品をもたらすような組成を有する、本質的に乳および/または乳成分を含む基質を意味する。

したがって用語「乳製品基質」は、任意の形態、および任意の組成のバリエーションの動物起源の乳:脱脂乳または未脱脂乳、濃縮乳または未濃縮乳、限外濾過乳または未限外濾過乳、生乳またはその他、粉末乳または非粉末乳、再構成乳(reconstituted milk)または非再構成乳(non-reconstituted milk)、組替え乳(recombined milk)または非組替え乳(non-recombined milk)、乳成分を富化させた乳またはその他の状態、加工剤または風味剤、香味料、砂糖などのような最終製品の品質を向上させる薬剤を補充された乳または補充されていない乳を包含する例として、発酵乳の製造を意図した乳製品基質は脱脂乳、クリームおよび脱脂粉乳を含み得る(以下の例１を参照されたい)。

しかしながら、用語「乳製品基質」は、その範囲に呼称「培地」を含まない。用語「培地」は、乳酸菌の成長を促進および/または刺激し、したがって乳酸菌の種菌を製造することを意図した媒体を思わせる一方で、用語「乳製品基質」は、発酵による変換を受けることを意図し、ヒトの消費を意図した食品を製造するための媒体を思わせる。したがって、乳酸菌の成長を刺激および/または促進させるために培地に添加され得る多くの化合物は、発酵乳またはヨーグルトを得るために乳製品基質には添加されなくてもよい。

これは特に、以下の場合である：
・ポリオキシエチレン-ソルビタン-20-モノオレート(ポリソルベート 80またはツイーン(Tween) 80としても知られる)のような多くの界面活性剤および/または乳化剤および/または可溶化剤および/または洗浄剤、
・クエン酸または酢酸型の酸のような酸、
・肉抽出物、
・植物ペプトン、
・グリセロリン酸。

最も頻繁に使用される乳酸発酵体は、以下の乳酸菌を含む:
・ストレプトコッカスサーモフィルス(Streptococcus thermophilus)、例えば、CNCMから入手可能なI-1630株など、
・ラクトバチルスデルブルッキー ssp ブルガリクス (Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus)、またはラクトバチルスブルガリクス (例えば、CNCMから入手可能なI-1519株およびI-1362株)、
・ペディオコッカスアシディラクティ (Pediococcus acidilacti)、
・ロイコノストックス (Leuconostocs)、例えば、
- ロイコノストックスクレモリス (Leuconostoc cremoris)、
- ロイコノストックスデキストラニカム (Leuconostoc dextranicum)、
- ロイコノストックスラクティス (Leuconostoc lactis)など、
・ラクトバチルス、例えば、
- ラクトバチルスアシドフィルス (Lactobacillus acidophilus) (例えば、CNCMから入手可能なI-0967株)、
- ラクトバチルスカセイ (Lactobacillus casei) (例えば、CNCMから入手可能なI-518株)、
- ラクトバチルスヘルベチカス (Lactobacillus helveticus)、
- ラクトバチルスデルブルッキー ssp ラクティス (Lactobacillus delbrueckii ssp lactis) (例えば、CNCMから入手可能なI-2843株)など、
・ラクトコッカス (Lactococcus)、例えば、
- ラクトコッカスクレモリス (Lactococcus cremoris)、
- ラクトコッカスラクティス ssp ラクティス (Lactococcus lactis ssp lactis) (例えば、CNCMから入手可能なI-1631株)、
- ラクトコッカスラクティス ssp ラクティス次亜種ジアセチルラクティス (Lactococcus lactis ssp lactis biovar diacetylactis) (例えば、CNCMから入手可能なI-2806株)など、
・ビフィドバクテリウム、例えば、
- ビフィドバクテリウムアニマリスラクティス (Bifidobacterium animalis lactis) (例えば、CNCMから入手可能なI-2494株、またはChr. Hansenにより販売されているBB12 (登録商標)に関する株)、
- ビィフィドバクテリウムブレブ (Bifidobacterium breve)、
- ビフィドバクテリウムビフィダム (Bifidobacterium bifidum)、
- ビフィドバクテリウムロンガム (Bifidobacterium longum)、
- ビフィドバクテリウムインファンティス (Bifidobacterium infantis)など。

乳酸菌は、十分な量で消費された場合に標準的な栄養学値(世界保健機関からの公式基準)を超えた健康に対する有益な効果を持つ生きた乳酸菌として定義される。

プロバイオティクス乳酸菌は、特に以下の乳酸菌を含む:
・ラクトバチルス、例えば、
- ラクトバチルスアシドフィルス (例えば、CNCMから入手可能なI-0967株)、
- ラクトバチルスカセイ (例えば、CNCMから入手可能なI-518株)、
- ラクトバチルスヘルベチカス、
- ラクトバチルスデルブルッキー ssp ラクティス (例えば、CNCMから入手可能なI-2843株)など、
・ビフィドバクテリウム、例えば、
- ビフィドバクテリウムアニマリスラクティス (例えば、CNCMから入手可能なI-2494株、Chr. Hansenにより販売されているBB12 (登録商標)に関する株)、
- ビフィドバクテリウムブレブ、
- ビフィドバクテリウムビフィダム、
- ビフィドバクテリウムロンガム、
- ビフィドバクテリウムインファンティスなど。

プロバイオティクス乳酸菌は、乳製品にバルクな状態で簡単に添加し得るような単純な食品添加物ではない。それらは酸化的な発酵を引き起こす生きた細菌であり、それらの代謝は、それらが発酵乳製品の製造の間、引続いての賞味期限(EBD)までの発酵乳製品の保存の間に置かれる条件によって影響を受ける。

賞味期限は、施行されている法律によって定められた、法的に要求される保存期間に従う。発酵乳のような生鮮な発酵乳製品について、EBDは、一般に製造日から30日である。

細菌性株または技術的株のいずれでも、ここで使用される用語「発酵体」は、本質的にプロバイオティクス機能を有する発酵体、細菌または株に対して、発酵乳製品の構造および/または構成中に関係する発酵体、細菌または株を意味する。

例として、プロバイオティックな株として少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスをさらに用いて、L.ブルガリクスS.サーモフィルスの共生発酵により発酵乳を製造することが可能である。この場合、技術的株として知られる株は、S.サーモフィルス株およびL.ブルガリクス株である。

発明の実施および側面
本発明は、乳製品基質にビフィドバクテリウムアニマリス ssp ラクティスの少なくとも1つの株を直接植菌すること、前記乳製品基質をヒトの消費に適応し、かつプロバイオティックな価値を有する発酵乳製品に変えること、並びにそのような乳製品の製品と関連する前記種菌の使用に特に適応する種菌に関する。

本発明の種菌は、より具体的にはプロバイオティックなB.アニマリスラクティスによって、およびS.サーモフィルス-L.ブルガリクス共生によって乳製品基質の発酵により得られる発酵乳製品の製造に適合する。したがって、このような製品は、生きた形の少なくとも1つの株のS.サーモフィルス、少なくとも1つの株のL.ブルガリクスおよび少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスを含む。

本発明の種菌は、少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスを含む。

本発明の種菌は、特定のシステイン、即ち、この形態のL-システインを用いて得られた顆粒および/または単数または複数の凍結乾燥体が、
・前記単数または複数の顆粒を解凍すること、および/または、
・ 8ないし10 mLのH₂Oあたり1ないし2 gの割合で前記単数または複数の凍結乾燥体を再溶解すること
の後に得られた溶液のpHが最低でも４であるような形態にあるL-システインを含む。

好ましくは、このpHはpH 8を超えない。

このため、溶液中に置かれた場合に4を超えるpHを持つような形態にあるL-システインを選択することが好ましい。例として、50 mLのH₂Oあたり1.25 gのこの形態のシステインを含む溶液は、4.5ないし5.5のpHを持つ。

このような形態のシステインの１つの例は、通常、システイン塩基(または塩基の形態にあるL-システイン)と呼ばれるL-システインである。

その還元された形態において、L-システイン塩基は式HSCH₂CH(NH₂)CO₂Hを持つ。

L-システイン塩基はシステイン-HClではない:したがって、それはシステインの塩酸塩でもシステイン塩酸塩一水和物でもない。

この特定のシステインの選択は、種々の利用可能なシステインの形態の中からなされる選択に由来する。

この特定のシステインは、B.アニマリスラクティスによって同化され得、かつ乳製品基質上でのB.アニマリスラクティスの成長のための活性剤である。

この特定のシステインは、ヒトの消費に適切である。それは、ヒトの消費を意図した発酵乳製品についての法規を満足する。

この特定のシステインは、他の非プロバイオティクス乳酸菌の代謝を混乱させることなく、かつ特にS.サーモフィルスおよびL.ブルガリクスによって実行される共生乳酸発酵を混乱させることなく、B.アニマリスラクティスの成長または少なくとも代謝を刺激することもできる。

これら全ての特性に加えて、この特定のシステインは、同じ物理的単位の中に前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスとシステインとの両方を含み、このB.アニマリスラクティス株の成長および少なくとも代謝に負の影響を与えることのない、「一体化された」と呼ばれる種菌を製造し得る。

高度に好ましくは、本発明の種菌は、システイン-HCl(式がHSCH₂CH(NH₂)CO₂H・HClであるL-システイン塩酸塩)のような酸の形態にあるシステインを含まない。

本発明の種菌は、特定の物理的形態にある。それは凍結顆粒および/または単数または複数の凍結乾燥体の形態にある。

この種菌の特定の形態は、直接植菌に特に適切である。

先述した特定のシステインの選択は、種菌がこれら全ての特徴を具備して製造され得、かつ特に活性のある種菌が得られ得ることを意味する。

本発明の特定のL-システインの選択は、前記B.アニマリスラクティスの株の成長または少なくとも代謝が負の影響を受けること無く、同一の顆粒および/または同一の凍結乾燥体中に前記B.アニマリスラクティス株と前記システインとの両方を含む凍結顆粒および/または単数または複数の凍結乾燥体を製造するために、前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスと前記システインとが一緒に混合できることを意味する。

このような結果は、L-システイン塩基の代わりにかつそれと置換えてシステイン-HCl(式がHSCH₂CH(NH₂)CO₂H・HClであるL-システインの塩酸塩)のような酸の形態にあるシステインを用いては達成され得ない。

したがって、本発明者は前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスの細胞と、前記特定のL-システインとの両方を、その中に認める凍結顆粒または凍結乾燥体を提案する。この凍結顆粒または凍結乾燥体は、一体化された活性剤を具備したB.アニマリスラクティスの種菌として適当であり得る。この凍結顆粒または凍結乾燥体は、本発明の好ましい態様である。

活性剤を一体化する経路の代替物は、当該活性剤を同じ顆粒または凍結乾燥体の中でB.アニマリスラクティス株と組合わせずに、別個の凍結顆粒または凍結乾燥体を製造することからなってもよい。

例として、それは例えば、混合物または複数の部分からなるキットの形態で、
・前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスの細胞含む凍結顆粒および前記特定のL-システインを含む別個の凍結顆粒( = 一体化されずに、組合されている顆粒)、または、
・前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスの細胞を含む凍結乾燥体および前記特定のL-システインを含む凍結乾燥体( = 一体化されずに、組合されている凍結乾燥体)、または、
・前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスの細胞を含む凍結顆粒および前記特定のL-システインを含む凍結乾燥体、またはその逆 ( = 顆粒と凍結乾燥体との組み合わせ)、
・これらの代替物の混合物
を製造することができる。

それらは本発明の手段を一緒に組合わせることからなるが、別個の物理的形態にあるという点において、これらの種菌は一体化された凍結顆粒または凍結乾燥体についての直接代替物である。

これらの種菌は、ここでは「組合されている」とみなされ、かつ本出願の範囲内に包含される。

図１は、本発明による一体化された顆粒の製造様式、および本発明による組合された顆粒の製造様式を示す。

したがって、本発明は特定のシステイン(好ましくはL-システイン塩基)の選択と、直接植菌に特に適応する特定の物理的形態(凍結顆粒および/または単数または複数の凍結乾燥体)の開発との組合せに由来する。

本発明の種菌は、B.アニマリスラクティス株の成長の刺激に対しても、特に適応する。それは他のプロバイオティックな細菌の種または属の刺激に適応し得ない。

B.アニマリスラクティス株の成長を刺激するためには、得られた発酵乳製品の構成にも構造にも、健康供与性および味覚特性にも負の影響または有害な影響をも全く生じさせることなく、B.アニマリスラクティスの成長または少なくとも代謝にプラスの効果を生じさせる成長促進剤が有用である。

この問題は、B.アニマリスラクティスに加えて他の乳酸菌の使用を要する発酵乳製品が製造される場合に特に困難である。

使用される各乳酸菌は、必ずしも同じ代謝を有する必要はなく、或る種または属に対して好適な条件は、その他の種または属に対して必ずしも好適ではない。

したがって、使用される全ての株について適切な乳酸発酵条件を見つけることは難しいかもしれない。

この要素は、乳酸発酵が良質、安全な発酵乳を製造し得るために特定の酸化動態/動力学を強いられるという事実によって補完される。

種々の汚染リスクを制限するために、5.5のpHを可及的速やかに得ることが望ましい。しかしながら、迅速な酸化動態はB.アニマリスラクティスの良好な成長および/または良好な代謝と相反する。

B.アニマリスラクティスの発酵に加えて、少なくとも１つの株のストレプトコッカスサーモフィルスおよび少なくとも１つの株のラクトバチルスデルブルッキー ssp ブルガリクスが関与する共生乳酸発酵が行われなくてはならないので、S.サーモフィルスおよびL.ブルガリクスの発酵によって、およびプロバイオティックなB.アニマリスラクティスの発酵によっても得られる発酵乳の場合は特に困難である。

しかしながら、B.アニマリスラクティスは、乳製品基質上で緩徐に成長する菌種(1ないし2時間の世代時間)であるが、技術的発酵体S.サーモフィルスおよびL.ブルガリクスは迅速に成長する(15ないし30分の世代時間)。

これらの状況の下では、これら全てのパラメータを制御することは特に難しい。

したがって、本発明の種菌は、技術的株と呼ばれる乳酸菌株によって行われ得る発酵に、特にストレプトコッカスサーモフィルスとラクトバチルスデルブルッキー ssp ブルガリクスとの共生発酵において負の影響を生じさせないように特別に設計される。

したがって、本発明の種菌は、プロバイオティックな株としての少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスを含み、かつB.アニマリスラクティスによって行われる発酵に加えて少なくとも1つの株のストレプトコッカスサーモフィルスと少なくとも1つの株のラクトバチルスデルブルッキー ssp ブルガリクスとによる乳製品基質の発酵によって得られる発酵乳の製造の環境における使用に特に適応する。

本発明の種菌は種々の基準を満足し、かつ高いプロバイオティックな価値を具備し、かつ優良品質の発酵乳製品を製造し得る。

しかしながら、本発明の種菌が、B.アニマリスラクティスの発酵の存在のもとでの、S.サーモフィルスラクティスとL.ブルガリクスとの共生発酵によって引き起こされる特に複雑な問題について最適化されるという事実は、より複雑でない状況、例えば前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスに加えてただ1つのB.アニマリスラクティス以外の乳酸菌の属または種のみを用いるか、またはB.アニマリスラクティス株しか使用しない乳製品基質の発酵のような状況における使用を妨げない。

本発明の種菌の1つの利点は、同じ条件下で得られるが、成長促進剤無しで同様のB.アニマリスラクティス株の一般的な種菌を用いる場合よりも実質的に多くの、かつ同じ条件下で得られるが、同じB.アニマリスラクティス株と成長剤としてのシステイン-HClとからなる種菌を使用する場合よりをも実質的に多くの前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス(または、いくつか存在する場合は、前記複数の株のB.アニマリスラクティス)の個体群を得ることができるということである。

したがって本発明の種菌は、発酵の終了時で発酵製品１グラムあたり少なくとも5×10⁷ cfu、好ましくは発酵の終了時で発酵製品１グラムあたり少なくとも10⁸ cfuである前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス(または、いくつか存在する場合は、前記複数の株のB.アニマリスラクティス)の個体群を発生させることができる。

顕著には、本発明の種菌は、4℃ないし11℃の範囲の温度での、好ましくは4℃ないし10℃の範囲の温度での、高度に好ましくは4℃ないし9℃の範囲の温度での、前記発酵製品の少なくとも20日、好ましくは少なくとも30日の保存の後に、発酵製品１グラムあたり5×10⁷ cfu未満に減少することのない前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス(または、いくつか存在する場合は、前記複数の株のB.アニマリスラクティス)の個体群の発生に適切であるという利点を持つ。

特に顕著には、本発明の種菌は、4℃ないし11℃の範囲の温度での、好ましくは4℃ないし10℃の範囲の温度での、高度に好ましくは4℃ないし9℃の範囲の温度での、前記発酵製品の少なくとも20日、好ましくは少なくとも30日の保存の後に、発酵製品１グラムあたり10⁸ cfu未満に減少することのない前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス(または、いくつか存在する場合は、前記複数の株のB.アニマリスラクティス)の個体群の発生させることができるという利点を持つ(B.アニマリスラクティスの個体群が21日目から急速に減少した参照発酵乳と比べて、10℃での少なくとも30日の保存の間、本発明に従う種菌を用いて製造された発酵乳中のB.アニマリスラクティスの個体群(S.サーモフィルス-L.ブルガリクス + B.アニマリスラクティス)が維持されたことを示す図８および９を参照)。

本発明の種菌の他の利点は、それが工業的な環境中での使用に適切な形態にあるということである。

事実、本発明の種菌は、発酵乳製品の工業的製造の環境において、特に安全かつ容易な仕方で使用され得ることを意味する改良された形態にある。

成長活性剤の用量および許容された耐容は、時折、工業的環境で発酵乳製品を製造するために使用される測定および組入れ系については制御が困難となり得る。例として、過剰な活性剤はプロバイオティクス株に有益ではあるが、得られる発酵乳製品の品質に対して極めて有害である:それは風味に乏しく(例えばシステインを過剰に添加されたために)なり得るか、または技術的株の発酵に負の、または有害な影響(例えば、これはS.サーモフィルスに過剰なシステインが使用されたときのの場合である)を及ぼし得る。添加される活性剤の量の制御は、この制御が人手の介入を制限し、清浄さが絶対に保障されなければならない工業ラインに対する変更および工業ラインの調整の程度を制限するので、衛生的な理由のためにも重要である。添加される活性剤の量の制御は、経済的意義からも明らかである。

したがってそれは、当業者は、適切な成長活性剤を利用可能にしているが、添加される活性剤の量の制御がこの環境において難しくみえるので、それを工業スケールで使用する場合に直面する困難を知っているという状況であろう。

他方で、本発明の種菌は工業的環境で極めて容易に使用でき、かつ使用される活性剤の量は安全かつ容易に制御できる。したがって、本発明の種菌は使用が容易であり、かつ優れた構成、構造および風味品質を具備した発酵乳製品が工業的環境で効率的かつ確実に製造され、かつプロバイオティックなB.アニマリスラクティスを極めて高用量で含む手段である。

本発明の種菌は、
・消費者のために発酵乳製品の優良な品質を保つ要求(構造、構成、健康供与品質、味覚特性)と、
・製品のプロバイオティックな効果を強調するためにB.アニマリスラクティス含有量をさらに増やす要望と、
・直接植菌に特に適切であり、かつ添加される活性剤の量を完全に安全かつ簡単に制御し得る、改良された形態にある種菌を提供する要望と
の間の微妙な調整の賜物である。

本発明の種菌はこれら種々の目的を満足する。

本発明の種菌は、混合物または複数の部分からなるキットの形態として、
・少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスと、
・遊離の形態にある前記L-システイン(すなわち、ペプチド結合によって他のアミノ酸に結合していないL-システイン)、前記遊離の形態にあるL-システインは、
- 前記単数または複数の顆粒を解凍すること、およびまたは、
- 8ないし10 mLのH₂Oあたり1ないし2グラムの単数または複数の凍結顆粒の割合で、前記単数または複数の凍結乾燥体を再溶解すること
の後に得られた溶液のpHが最低でも４であるような顆粒および/または単数または複数の凍結乾燥体を製造できるような形態にもある、
を含む。

好ましくは、このpHはpH 8を超えない。

この目標のために、好ましくは、溶液中に置かれた場合に4を超えるpHを持つような形態にある遊離のL-システインが選択される。例として、50 mLのH₂Oあたりこの形態のシステインを1.25グラム含む溶液は、4.5ないし5.5のpHを持つ。

このような形態のシステインの好ましい例はL-システインであり、システイン塩基(または塩基の形態にあるL-システイン)としても知られている。還元された形態において、L-システイン塩基の式はHSCH₂CH(NH₂)CO₂Hである。

特定の量の本発明に関するL-システインおよび本発明の種菌中に含まれるB.アニマリスラクティスの細胞は、固形の物理的構造体、特に凍結顆粒および/または単数または複数の凍結乾燥体中に分布する。

前記システインおよび前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスは、同じ固形の構造体中に一緒に含まれ得るか、またはそれらは別個の固形の構造中に存在し得る。これらの別個の固形の構造体は、それら自体は別々にではあるが、複数の部分からなるキットの中にパッケージ化されるか、またはそれらは混合物としてパッケージ化される。

明らかに、本発明の特定のL-システインおよびB.アニマリスラクティスの細胞との両方を含む一般的な固形の構造体の混合物および別個の固形の構造物が製造され得る。

したがって前記システインおよび前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスは、
・同じ凍結顆粒および/または同じ凍結乾燥体中に一緒に、および/または、
・別個の凍結顆粒および/または別個の単数または複数の凍結乾燥体に分離されているが、複数の部分からなるキットの中
に存在し得る。

したがって、本発明の有利な実施に関して、前記特定のL-システインおよびB.アニマリスラクティス細胞の全部または一部は、同じ凍結顆粒中または同じ凍結乾燥体中に一緒に存在し得る。それから、本発明の種菌は、本発明の特定のL-システインとB.アニマリスラクティス細胞との両方を含む少なくとも1つの凍結顆粒および/または凍結乾燥体を含む。

好ましくは、種菌中に含まれる特定のL-システインおよびB.アニマリスラクティスの全部は、同じ凍結顆粒中または同じ凍結乾燥体中に一緒に存在する。

前記本発明の特定のL-システインおよびB.アニマリスラクティス細胞の全部または一部は、別個の凍結顆粒および/または別個の凍結乾燥体へと物理的に分離されているが、複数の部分からなるキットの中に集められる。そこで、本発明の種菌は、
・少なくとも2つの凍結顆粒、または、
・少なくとも2つの別個の凍結乾燥体、または、
・少なくとも1つの凍結顆粒および少なくとも1つの凍結乾燥体
を含み、各物理的要素の対(顆粒 + 顆粒、または凍結乾燥体 + 別個の凍結乾燥体、または顆粒 + 凍結乾燥体)について、
・ 2つの物体の一方が、B.アニマリスラクティス細胞を含まずに、前記特定のL-システインの全部または一部を含み、
・ 2つの物体の他方が、前記特定のL-システインを含まずに、Bアニマリスラクティスの細胞を含む
ように、各種菌は本発明の特定のシステインか、B.アニマリスラクティスの細胞のいずれかを含む。

明らかに、種菌に含まれる本発明の特定のL-システインの全部および種菌に含まれるB.アニマリスラクティス細胞の全部は、したがって別個の単数または複数の顆粒および/または別個の単数または複数の凍結乾燥体に含まれ得るか、またはそのような形態にある。

本発明の種菌は、したがって以下の要素:
a) 本発明による特定のL-システインとB.アニマリスラクティスの細胞とを含む凍結顆粒、
b) 本発明による特定のL-システインとB.アニマリスラクティスの細胞とを含む凍結乾燥体、
c) 本発明の特定のL-システインを含むがB.アニマリスラクティスの細胞を含まない凍結顆粒およびB.アニマリスラクティスの細胞を含むが本発明の特定のL-システインを含まない凍結顆粒、
d) 本発明の特定のL-システインを含むがB.アニマリスラクティスを含まない凍結乾燥体およびB.アニマリスラクティスの細胞を含むが本発明に関する特定のL-システインを含まない凍結乾燥体、
e) 本発明の特定のL-システインを含むがB.アニマリスラクティスの細胞を含まない凍結顆粒およびB.アニマリスラクティスの細胞を含むが本発明の特定のL-システインを含まない凍結乾燥体、
f) 本発明の特定のL-システインを含むがB.アニマリスラクティスの細胞を含まない凍結乾燥体およびB.アニマリスラクティスの細胞を含むが本発明の特定のL-システインを含まない凍結顆粒、または
g) 上記a)ないしf)に表された配合のうちの少なくとも2つの混合物
を含むか、これらの要素から構成され得る。

本発明の種菌は、発明者によって為された特定の選択に起因する前記遊離の形態にあるシステイン(すなわち、ペプチド結合を介して他のアミノ酸と結合していない)を含む。

前記遊離の形態にあるシステインは、さらに、
前記単数または複数の顆粒を解凍(例えば、顆粒を37℃の水浴中に手動攪拌しながら3分間置くことによってすること、および/または、
8ないし10 mLのH₂Oに対して1ないし2グラムの単数または複数の凍結乾燥体の割合で、前記単数または複数の凍結乾燥体を再溶解(例えば、25℃で磁気攪拌しながら30分間再水和させることによって)すること
の後に得られた溶液のpHが最低でも４であるような顆粒および/または単数または複数の凍結乾燥体を製造できるような形態にある遊離のL-システインである。

このために、好ましくは50ないし100 mLのH₂O中に1ないし1.5グラムの前記システインから構成される溶液のpHが最低でも４であるような形態にあるL-システインが選択される。

適切なシステインの1つの例はL-システインであり、L-システイン塩基としても知られており、還元された形態にあるその式はHSCH₂CH(NH₂)CO₂Hである。

不適切なシステインの1つの例はシステイン-HCl(システイン塩酸塩、またはシステイン塩酸塩一水和物)である。

好ましくは、本発明の種菌の製造に使用される化合物は塩酸塩の形態にない。

本発明の種菌に含まれる本発明の特定のL-システインは、L-システイン塩酸塩(HSCH₂CH(NH₂)CO₂H・HCl)または、L-システイン塩酸塩一水和物(HSCH₂CH(NH₂)CO₂H・HCl・H₂O)のようなシステインの酸ではない。

100 mLのH₂O中に1.0 gのL-システイン塩酸塩一水和物から構成される溶液は1.5ないし2.0のpHを持つので、L-システイン塩酸塩一水和物は本発明関する特定のシステインではない。

したがって、本発明による特定のシステインではないシステインから製造されている凍結顆粒を解凍することまたは凍結乾燥体を再溶解することは、高度に酸性のpH、より具体的には4未満、一般に3.5未満のpHを有する溶液をもたらすであろう。

高度に酸性の形態にあるシステインの大部分は、L-システイン塩酸塩またはL-システイン塩酸塩一水和物のような塩の形態にあるシステインである。この塩の中の単数または複数のイオンは、凍結顆粒または凍結乾燥体中には存在しない。この単数または複数のイオンの存在は、したがって時折、酸性物体(一般にシステインの溶解性を向上させるように働く)と組合されたシステインの使用についての指標となる。これは例えば、L-システイン塩酸塩またはL-システイン塩酸塩一水和物に含まれる塩素イオンについての場合である。事実、L-システイン塩酸塩またはL-システイン塩酸塩一水和物からなる酸性のシステインが使用された場合は、L-システイン塩酸塩一水和物が19％超の塩化物を含むので、顆粒または凍結顆粒は大量の塩化物(Cl)を含んでいたこと、およびL-システイン塩基は一般に0.05％未満、より好ましくは0.040%未満しか塩化物を含まないということが観察されるであろう。したがって顆粒または凍結乾燥体中に大量の塩化物が存在することは、システイン塩基ではないシステインの使用の間接的な指標となり得る。したがって、本発明の種菌中に使用されるシステインの形態は、一般に16〜17％の乾燥含量率(drymatter content)を有する顆粒の１グラムあたり60マイクログラム未満の塩素イオンを与え得る。

しかしながら、適用される最初の判定基準はそのpHである。事実、pHの測定は、本発明の特定のシステインの存在を検出するための直接の判定基準となる:解凍された顆粒または再溶解された凍結乾燥体のpHは最低でも４である。それは少なくとも5、例えば5ないし6.5の範囲にある。好ましくは、前記pHはpH 8を超えない。

最低でも４かつ最高で8であるpHは、B.アニマリスラクティスにとってストレスにならない。したがって、B.アニマリスラクティスは、ストレスに晒されることなくシステイン溶液に混合され得、かつ固形の物理的構造体内にシステインとB.アニマリスラクティス細胞とを一体化する凍結顆粒または凍結乾燥体の中に配合され得る。そこで、得られたB.アニマリスラクティスの種菌は、良好な生物学的および/または代謝条件にあり、かつシステインによってもたらされる活性化に迅速に反応するB.アニマリスラクティスの細胞を含む。

B.アニマリスラクティスの細胞と、本発明の特定のL-システインとを含む本発明の「一体化された」本発明の凍結顆粒または凍結乾燥体は、したがって、B.アニマリスラクティス細胞の生理学的および/または代謝状態を何ら変えることなく、B.アニマリスラクティスの活性剤をその構造と一体化することに成功しているという点において、特に改良されたB.アニマリスラクティスの種菌である。

本発明の特定のL-システインの選択は、あたかもL-システイン塩酸塩のような高度に酸性の形態にあるL-システインから調合された顆粒および/または凍結乾燥体よりも効果的な顆粒および/または凍結乾燥体が得られ得ることを意味する。

さらに、この選択は、システインを同じ凍結顆粒または同じ凍結乾燥体の中に効果的な仕方で一体化することができる。システイン-HClとB.アニマリスラクティス細胞との両方を含む凍結顆粒または凍結乾燥体を調合するために、システインがL-システイン塩酸塩のような高度に酸性の形態で使用された場合、得られた一体化された顆粒または一体化された凍結乾燥体は、本発明の特定のL-システインから出発して得られた同じ顆粒または凍結乾燥体と比較して効果的が劣るB.アニマリスラクティスの種菌となる。

本発明の好ましい実施によれば、本発明の種菌は、したがって高度に酸性のシステインを含まない、より具体的にはL-システイン塩酸塩を含まない、および/またはこのようなシステインからは製造されない。

本発明の種菌は、シスチンを含むことを意図しないものでもある。ここでは、好ましくは本発明の種菌にはシスチンが添加されない。しかしながら、痕跡量のシスチンは確認され得るが、それらは例えば種菌中に含まれていたシステインの酸化の結果であろう。

有利には、前記本発明の特定のL-システインは、
・1×10¹⁴ cfuの前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス(または、いくつか存在する場合は、前記複数の株のB.アニマリスラクティス)あたり1グラム；ないし
・ 3.5×10¹⁰ cfuの前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス(または、いくつか存在する場合は、前記複数の株のB.アニマリスラクティス)あたり1グラム；
および/または、
・ 10⁹ cfuの前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス(または、いくつか存在する場合は、前記複数の株のB.アニマリスラクティス)あたり0.01ミリグラム；ないし
・ 10⁹ cfuの前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス(または、いくつか存在する場合は、前記複数の株のB.アニマリスラクティス)あたり30グラム；
の量で種菌中に存在する。

本出願において、全てのシステインの質量は式がHSCH₂CH(NH₂)CO₂Hであるシステインに基づいて計算される。

好ましくは、前記本発明の特定のL-システインは、
・ 0.2×10¹⁴ cfuの前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス(または、いくつか存在する場合は、前記複数の株のB.アニマリスラクティス)あたり1グラムないし
・ 3.5×10¹⁰ cfuの前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス(または、いくつか存在する場合は、前記複数の株のB.アニマリスラクティス)あたり1グラム
および/または、
・ 10⁹ cfuの前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス(または、いくつか存在する場合は、前記複数の株のB.アニマリスラクティス)あたり0.05ミリグラムないし
・ 10⁹ cfuの前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス(または、いくつか存在する場合は、前記複数の株のB.アニマリスラクティス)あたり10グラム
の量で種菌中に存在する。

本発明の具体的な実施によれば、前記本発明の特定のL-システインは、前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス5×10⁹ないし5×10¹¹ cfuあたり4.90 mgないし144 mgの量で前記種菌中に存在する。

好ましくは、前記本発明の特定のL-システインは、前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスを5×10⁹ないし5×10¹¹ cfuあたり25ないし50 mg、より好ましくは30ないし40 mg、なおより好ましくは31ないし39 mg例えばおよそ31、32、33、34、35、36、37、38、39 mg、高度に好ましくは35ないし37 mg例えばおよそ35、36、37 mg、特に好ましくは36.9 mgの量で前記種菌中に存在する。

好ましくは、B.アニマリスラクティスのcfu数は5×10⁹ないし5×10¹¹ cfu、より好ましくは2×10¹⁰ないし5×10¹¹ cfuのB.アニマリスラクティス、高度に好ましくは2×10¹⁰ないし1×10¹¹のB.アニマリスラクティス、なおより好ましくは2×10¹⁰ないし7×10¹⁰ cfuのB.アニマリスラクティスである。

有利には16〜17 %の乾燥物含量率のもの(105℃で少なくとも40 minでの乾物含量率)を含み得る本発明による顆粒１グラムは、少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスを5×10⁹ないし5×10¹¹ cfu含む。

有利には16〜17 %の乾燥体(105℃で少なくとも40 minの乾燥体)を含み得る本発明に関する1グラムの顆粒は、前記本発明の特定のＬ-システイン、好ましくはL-システイン塩基を4.90 mgないし144 mg含む。

有利には、160ないし170ミリグラムの量の本発明の凍結乾燥体は、前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスを5×10⁹ないし5×10¹¹ cfu含む。

有利には、160ないし170ミリグラムの量の本発明の凍結乾燥体は、前記本発明の特定のL-システインを4.90 mgないし144 mg含む。

B.アニマリスラクティスのコロニー形成単位(cfu)を算出するために、当業者が適切であるとみなす任意の技術、例えば2003年にGrandらによりEur Food Res Technol 217, 90-92に記載されたビフィドバクテリウム算出方法を使用することができる。好ましくは、当該方法は、2005年にS N Thitaram、G R SiragusaおよびA HintonによってJr Letters in Applied Microbiology, volume 41, page 355 − October 2005 “Bifidobacterium-selective isolation and enumeration from chicken caeca by a modified oligosaccharide antibiotic-selective agar medium” に記載されたものである。

溶液中に含まれるシステインを分析するために、当業者が適切であるとみなす任意の技術、例えば質量分光器と組合わされたガスクロマトグラフィー、または蛍光定量検出器と組合わされた高速液体クロマトグラフィーを使用することができる。L-8800高速アミノ酸分析器(Hitachi High Technologies)のようなアミノ酸分析器を使用してシステインを分析することもできる。

好ましくは、本発明の種菌は0.5 % (w/w)を超える酵母、酵母抽出物または酵母自己分解物質を含まない。

好ましくは、本発明の種菌は0.5 % (w/w)を超える酵母、酵母抽出物または酵母自己分解物質を含まない。高度に好ましくは、前記種菌は、酵母、酵母抽出物または酵母自己分解物質のいずれも含まない。

有利には、本発明は、高活性であり、かつ種菌中に保存剤を使用する必要なく、かつ乳基質に対してまたは発酵乳製品に対して保存剤を添加する必要なく、長期間(冷蔵温度での発酵乳製品の保存の間)維持されるB.アニマリスラクティスの個体群を発生させるB.アニマリスラクティスの種菌を可能にする。

本発明により、B.アニマリスラクティスの個体群は、それが高レベルに維持され得ることを意味する特に健康な生理学的および/または代謝条件で発酵乳製品中に存在する。

本発明の種菌は少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス、例えばChr. HansenからのI-2494株またはBB12株(登録商標)を含む。

本発明の種菌は、明らかにいくつかのB.アニマリスラクティス株、例えばChr. HansenからのI-2494株またはBB12株(登録商標)を含み得る。

本発明の種菌は、B.アニマリスラクティス以外に少なくとも1つの乳酸菌株も含み得る。

前記少なくとも1つの他の乳酸菌株は、B.アニマリスラクティスの細胞および/または本発明の特定のL-システインを含む顆粒または単数または複数の凍結乾燥体中に存在し得る。

前記少なくとも1つの他の乳酸菌株は、B.アニマリスラクティスの細胞を含むものとは別個の物理的構造体中に存在し得る。この別個の物理的構造体は、例えばB.アニマリスラクティスおよび本発明の特定のL-システインの顆粒および/または単数または複数の凍結乾燥体と混合されているか、または分離されてはいるが、複数の部分からなるキット中に存在する凍結顆粒または凍結乾燥体のような固形の構造体であり得る。この少なくとも1つの他の乳酸菌株は、例えばB.アニマリスラクティスおよび本発明の特定のシステインの顆粒または単数もしくは複数の凍結乾燥体とは別個の形態の凍結顆粒または凍結乾燥体の中に存在し得る。

この少なくとも1つの他の乳酸菌は、ビフィドバクテリウム株または他の属の株であり得る。

この異なる属の株は、プロバイオティックの機能を有する株、例えばラクトバチルスアシドフィルス、ラクトバチルスラムノスス (Mactobacillus thamnosus)、ラクトバチルスカセイ (Lactobacillus casei)から選択される少なくとも1つの株であり得る。

この異なる属の株は、S.サーモフィルスおよび/またはL.ブルガリクスのような技術的機能を有する株であり得る。

有利には、前記本発明の種菌は、B.アニマリスラクティスおよび特定のL-システインの単数または複数の顆粒および/または単数または複数の凍結乾燥体に加えて、例えば直接植菌に適合する単数または複数の凍結顆粒および/または単数または複数の凍結乾燥体の形態にあるS.サーモフィルスおよびL.ブルガリクスの種菌を含む。

好ましくは、本発明の種菌はB.アニマリスラクティス以外に、例えばB.アニマリスラクティス以外の少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つの複数個の株を含む。

有利には、前記他の株は、少なくとも1つの株のS.サーモフィルス(例えば、CNCMから入手できるI-1630株)、および少なくとも2つの株のL.ブルガリクス(例えば、CNCMから入手できるI-1632株およびI-1519株)である。このような種菌は、B.アニマリスラクティスおよび本発明の特定のL-システインを含む凍結顆粒および/または単数または複数の凍結乾燥体の混合物またはパーツ集合体のキットの形態にあり得、凍結顆粒および/または単数または複数の凍結乾燥体はS.サーモフィルスおよび/またはL.ブルガリクスを含む。したがって、集合体は、高プロバイオティックな価値を持ち、かつ冷蔵手段中に保存されている間に高いプロバイオティックな価値を維持する発酵乳を形成するために、酸化的なS.サーモフィルスL.ブルガリクス共生発酵による、およびB.アニマリスラクティスの発酵によるその変性を目的とした乳製品基質への直接植菌に特に適切である。

本出願は本発明自体の一体化された顆粒、および本発明自体の一体化された凍結乾燥体にも関する。

先に表示および記載したように、および/または以下の例の欄において表および記載したように、本発明による一体化された顆粒または凍結乾燥体は、示された用量および/または割合の中に、少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスおよび本発明の特定のL-システインを含む。好ましくは、前記顆粒または凍結乾燥体は、L-システイン一塩素酸塩のような高度に酸性の形態にあるシステインを含まない。

. したがって、本出願は少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスを含む凍結顆粒、およびペプチド結合によって他のアミノ酸に結合していないL-システインに関し、前記L-システインは前記単数または複数の顆粒を解凍した後に得られた溶液のpHが最低でも４、一般的には5を超えるような形態にある。

したがって本出願は、少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスおよびペプチド結合によって他のアミノ酸と結合していないL-システインを含む凍結乾燥体に関し、前記L-システインは、8ないし10 mLのH₂Oあたり1ないし2グラムの単数または複数の凍結乾燥体割合で前記単数または複数の凍結乾燥体を溶解した後に得られた溶液のpHが最低でも４、一般的には5を超えるような形態にあるシステインである。

好ましくは、顆粒または凍結乾燥体のpHは8未満である(顆粒を解凍するか、または凍結乾燥体を再溶解した後に得られる溶液のpH)。

本発明は、本発明の種菌の使用にも関する。

より具体的には、本発明は酸化的な乳酸発酵の環境でのその使用に関し、さらに具体的には、ヒトの消費を意図した発酵乳製品の製造の環境におけるその使用に関する。

したがって、本発明は、本発明による少なくとも1つの種菌および/または少なくとも1つの顆粒または凍結乾燥体を使用する任意の方法に関する。

より具体的には、本発明は、本発明による少なくとも1つの種菌および/または少なくとも1つの顆粒および/または少なくとも1つの凍結乾燥体を用いて、乳製品基質上でB.アニマリスラクティスの成長および/または代謝を刺激するための方法を想定している。

この刺激方法はB.アニマリスラクティスを高度に効率的な仕方で刺激する利点を持つ。先に示したように、また以下で示すように、本発明の刺激方法は、B.アニマリスラクティスの個体群を発生させることができ、その代謝および/または成長はB.アニマリスラクティス細胞を長期間生きたままにすることができる。

この方法を実行するために、前記種菌は、先に示されたか、および/または以下の例および図に記載された用量および/または割合で添加される。

有利には、乳製品基質に供給される前記本発明の種菌および/または顆粒および/または凍結乾燥体は、
・乳製品基質１リットルあたり5ないし20 mg、好ましくは6ないし15 mg/L、より好ましくは7ないし11 mg/Lのシステイン、
・乳製品基質１リットルあたり10⁹ないし10¹¹ cfuのB.アニマリスラクティス、好ましくは0.4×10¹⁰ないし1×10¹¹ cfuのB.アニマリスラクティス、より好ましくは0.4×10¹⁰ないし1.2×10¹⁰ cfuのB.アニマリスラクティス、高度に好ましくは0.4×10¹⁰ないし1×10¹⁰ cfuのB.アニマリスラクティス
の量で添加される。

植菌された基質は、好ましくはB.アニマリスラクティスの代謝に好適な温度および雰囲気条件、例えば密閉容器中で37℃ないし42℃の温度下に維持される。

本発明は、発酵乳製品、好ましくは乳酸発酵体がB.アニマリスラクティスによって行われる発酵に加えて少なくともS.サーモフィルス-L.ブルガリクス共生発酵を含む、乳酸発酵によって得られる乳製品を製造するため方法も想定している。

本発明の方法は、本発明による少なくとも1つの種菌および/または少なくとも1つの顆粒および/または少なくとも1つの凍結乾燥体の使用を含む。多量のB.アニマリスラクティスを含み、かつ冷蔵雰囲気中での保存の間にも高い含有率であるので、得られた発酵乳製品は、高いプロバイオティックな価値の発酵乳製品となる。

この製造方法は、B.アニマリスラクティスを高度に効果的な仕方で活性化および/または刺激する利点を持つ。また、S.サーモフィルスとL.ブルガリクスとの共生に負の影響を及ぼすことがないという利点を持つ。

先述したように、また以下で示されるように、本発明の製造方法は、その代謝および/または成長がB.アニマリスラクティスの生きた細胞を長時間維持することができるB.アニマリスラクティスの個体群を製造することができる。

この方法を実行するために、前記種菌は、先に示されたような、および/または以下の例および図に記載されたような用量および/または割合で添加される。

有利には、本発明の種菌および/または顆粒および/または凍結乾燥体は、
・乳製品基質１リットルあたり5ないし20 mg、好ましくは6ないし15 mg/L、より好ましくは7ないし11 mg/Lのシステイン、
・乳製品基質１リットルあたり10⁹ないし10¹¹ cfuのB.アニマリスラクティス、好ましくは0.4×10¹⁰ないし1×10¹¹ cfuのB.アニマリスラクティス、より好ましくは0.4×10¹⁰ないし1.2×10¹⁰ cfuのB.アニマリスラクティス、高度に好ましくは0.4×10¹⁰ないし1×10¹⁰ cfuのB.アニマリスラクティス
の量で添加される。

本発明による一体化された顆粒の用量0.05ないし1グラム、例えば本発明による一体化された顆粒およそ0.2 gは、例えば乳製品基質1リットルに対して適切な用量である。

前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスはプロバイオティクス株として活動する。しかしながら、前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスは乳製品基質上で酸化的な発酵を実行することも可能なものでなくてはならない。したがって、前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスは、あたかも単純な添加剤のように酸化的な発酵を実行させることなく、単純に基質または乳製品に添加されるわけではない。

有利には、発酵された並列な製品(fermented parallel product)を製造するための方法は、前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス以外に少なくとも1つの株の使用を含み得る。

前記他の株は、好ましくは乳酸菌の株である。

前記少なくとも1つの他の乳酸菌の株は、酸化的な乳酸発酵を行う機能を持つ。したがって、それは酸化的な乳酸発酵を行うような仕方で、すなわち酸化的な乳酸発酵を効率的に行うことができる時間かつ量で乳製品基質中に植菌される。

したがって、本発明の発酵方法は、前記少なくとも1つの乳酸菌の株によって、および前記少なくとも1つのB.アニマリスラクティスによって行われる混合発酵に関するが、任意の検出可能な発酵活動の無いB.アニマリスラクティスが単純な添加剤として添加され得る単純な乳酸発酵方法に関するものではない。

したがって、前記少なくとも1つの乳酸菌の株および前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスは、乳製品基質中で一緒に存在する。

したがって本発明の有利な側面に関しては、製造方法は2工程方法にはなり得ない(他の単数または複数の株の添加を決定するために待機する必要も、株の1つによって実行された発酵が特定の工程で発生していることを検査する必要もなく、前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスおよびその他の任意の乳酸菌株の添加が同時、または方法のうちの少なくとも実質的に同じ工程にて、即ち、当該方法の最初に行われ得る)。

乳製品基質の発酵は、使用される株について適切な温度で行われ、一般に36℃ないし42℃の範囲の温度で行われる。

前記発酵は、一般にpHが4.8ないし4.2に達するまで行われる。

本発明の発酵乳製品の製造のための方法は、1つ以上の他の工程、例えば当該発酵乳製品を製造するための通常の工程から選択される1つ以上の工程も含み得る。

例えば、それは、
・乳製品基質を用意する工程、
・乳製品基質を熱処理する工程(少なくとも低温殺菌と同等な熱処理、例えば95℃で5分間)、
・乳製品基質に1つ以上植菌する工程、
・植菌された株に適合する条件下(一般にpHが4.8ないし4.2)で、植菌された基質の少なくとも1つの乳酸発酵を実行する工程、
・任意で、香味料、果実、甘味料、着色料、保存料を添加する工程、
・任意で、発酵製品をなめらかにするまたは攪拌する工程、
・発酵製品を、例えば密封容器に包装する工程、
・冷蔵雰囲気中に発酵乳製品を貯蔵する工程
からの1つ以上を含み得る。

したがって、本発明の種菌は、発酵の終了時に発酵製品１グラムあたり少なくとも5×10⁷ cfu、好ましくは発酵の終了時に発酵製品１グラムあたり少なくとも10⁸ cfuの前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス(または、いくつか存在する場合は、前記複数の株のB.アニマリスラクティス)の個体群を発生させることができる。

顕著には、本発明の種菌は、4℃ないし11℃の温度範囲での、好ましくは4℃ないし10℃の温度範囲での、高度に好ましくは4℃ないし9℃の温度範囲での、前記発酵製品の少なくとも20日好ましくは少なくとも30日の保存の後に、発酵製品１グラムあたり5×10⁷ cfu未満に減少することのない前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス(または、いくつか存在する場合は、前記複数の株のB.アニマリスラクティス)の個体群の発生に適切であるという利点を持つ。

特に顕著には、本発明の種菌は、4℃ないし11℃の温度範囲のでの、好ましくは4℃ないし10℃の温度範囲での、高度に好ましくは4℃ないし9℃の温度範囲での前記発酵製品の少なくとも20日好ましくは少なくとも30日の保存の後に、発酵製品のグラムあたり10⁸ cfu未満に低下することのない前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス(または、いくつか存在する場合は、前記複数の株のB.アニマリスラクティス)の個体群の発生に適切であるという利点を持つ(B.アニマリスラクティスの個体群が21日目から急速に減少した参照発酵乳と比べて、10℃での少なくとも30日の保存の間、本発明に関する種菌を用いて製造された発酵乳中のB.アニマリスラクティスの個体群(S.サーモフィルス-L.ブルガリクス + B.アニマリスラクティス)が維持されたことを示す図８および９を参照)。

本出願中で、用語「発酵乳製品の質量」は、発酵乳製品の乳分の質量を意味する。

本出願は発酵乳製品それ自体にも関連する。

このような製品は、4℃ないし11℃の温度範囲での、好ましくは4℃ないし10℃の温度範囲での、高度に好ましくは4℃ないし9℃の温度範囲での、前記発酵製品の少なくとも20日好ましくは少なくとも30日の保存の後でさえも、先行技術の製品で観察されるものを上回る個体群を維持するB.アニマリスラクティスの個体群を持つ。

したがって、その構成は先行技術の製品とは必然的に異なる。

したがって、本出願は、本発明による少なくとも1つの種菌による乳製品基質の乳酸発酵によって得ることができ、pHが一般に4.8ないし4.2の範囲にある発酵乳製品に関する。好ましくは、前記種菌は、本発明の一体化された凍結顆粒および/または一体化された凍結乾燥体(特定のL-システインがB.アニマリスラクティス発酵体と一体化されている種菌)の形態にある。有利には、前記種菌は少なくとも1つの株のS.サーモフィルスおよび/または少なくとも1つの株のL.ブルガリクスも含み得る。

本出願において、頭文字CNCMは、コレクションナシオナールデカルチャーデマイクロオルガニズムズ (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) [国立微生物培養機関] (Institut Pasteur; 25, rue du Docteur Roux; F-75724 PARIS CEDEX 15)を意味する。CNCMに寄託された株は、「I」で始まる番号、例えば「I-2494」(B.アニマリスラクティス株)、「I-1630」(S.サーモフィルス株)、「I-1632」または「I-1519」(L.ブルガリクス株)を持つ。

「含有する(comprising)」と同義語である用語「含む(including)」は、非限定の(open-ended)用語であり、明確に示されない1つ以上のさらなる要素、材料または工程の存在を排除しないが、用語「からなる(consisting)」または「からなる(constituted)」は、明確に示されない任意のさらなる要素、工程または材料を排除する限定的な用語である。用語「本質的に〜からなる(essentially consisting)」または「本質的に〜からなる(essentially constituted)」は、1つ以上のさらなる要素、材料または工程の存在を排除しないが、これらのさらなる要素、材料または工程は発明の基本的な特性に実質的に影響を与えないという、或る程度限定されていない(partially open-ended)用語である。

結果として、用語「含む」は、用語「含有する」および用語「本質的に〜からなる」を含む。

本出願に引用された各文献、研究または出版物の内容は、ここで参照によって組入れられる。

以下の例は、説明の目的で複数与えられ、本発明を全く限定しない。

例
例１:システイン-HClの使用は、システインとB.アニマリスラクティスとの両方を含む用語「一体化された」と呼ばれる顆粒の製造に不適切である
方法および装置
この例において、図２に示された顆粒製造の原理は以下の通りである。

この例において、
・ Chr Hansen A/S(Hoersholm, Denmark)によって販売されるビフィドバクテリウムアニマリスラクティスBB12株(登録商標)、
・ CNCMから入手できるビフィドバクテリウムアニマリスラクティスI-2494株(2000年6月20日にCNCMに寄託された; 2001年7月4日にCompagnie Gervais Danoneの名で出願された国際特許出願WO-02/02800、およびこの国際出願の国内および地域内出願を参照のこと;より具体的には、この国際出願のUS出願に関する特許US-B2-7 008 785を参照のこと)
といったプロバイオティックな株を使用した。

必要ならば、株を使用前に解凍した。

使用したシステインは、その非常に良好な溶解性(20℃で100 gのH₂Oあたりおよそ110 g)の理由により、システインを提供するために通常使用されるシステイン-HClであった。

システイン-HClは、L-システイン塩酸塩一水和物(または、(R)-2-アミノ-3-メルカプトプロピオン酸の塩酸塩一水和物)である。その式はC₃H₇NO₂S・HCl・H₂O (またはL-システイン・HCl・H₂O)である。そのCAS番号は7048-04-6であり、分子量は175.63である。

システイン-塩酸塩は、例えば味の素アミノサイエンスLLC(ローリー(Raleigh) NC 27610, USA)から市販されている。

顆粒の製造の方法(図２を参照):
50グラムの各B.アニマリスラクティス株を、
・ 325 g/Lにて、15グラムのシステイン-HCl (G4I システイン-HClが一体化された顆粒)と、または、
・ 15グラムの水(参照顆粒I-2494 T およびBB12 T)と
混合した。

混合は、システイン-HCl溶液を程よく組入れるために攪拌することによって実行した。

混合物を液体窒素に滴下することによって凍結顆粒を製造した。チューブを介して蠕動ポンプに接続された複数のシリンジ針を含むデバイスに混合物を供給し、針の端部にて形成された液滴が、液体窒素を充填された恒温容器に落ちるようにした。

G4I システイン-HClプロバイオティクス発酵体の凍結顆粒(システイン-HClを含有するB.アニマリスラクティスI-2494またはBB12(登録商標)の顆粒)および、システイン-HClの代わりにかつそれと置換えて水を含有する参照顆粒を得た。

乳製品混合物( = 乳製品基質)の調製:
乳製品混合物を以下の原料:脂肪0 %の脱脂乳、脂肪40 %を含有するクリームおよび33 %のタンパク質を含有する脱脂粉乳(SMP)から構成した。

第１に、乳を4.4 %のタンパク質含有量(PC)、3.5 %の脂肪含有量(FC)および15.8 %の乾物含有率のものに規格化するために、全ての原料を一緒に混ぜ合わせ、タンパク質を再水和するためにHEIDOLPH(登録商標)攪拌器によっておよそ750 rpmで60分間、材料を攪拌した。

規格化は、FOSS(登録商標)からのMILKOSCAN FT 120(登録商標)赤外検出器を用いて検査した。

目標とする特徴の乳を得るために要求される各原料の量の例を以下に示す。

次に脂肪球を程よく溶融するために、乳を50℃ないし60℃の温度まで加熱した。一旦その温度に達してから、10リットルをMICROFLUIDIZER(登録商標)中でホモジナイズした。これは、スクリーンを通して、かつ350 barの圧力で乳をキャピラリーに通すことによって脂肪球を破壊する。

MEMMERT(登録商標)水浴を用意し、103℃に調節した。各瓶に入れられる量を正確に計量して、乳を8本の１リットル瓶に移した。

瓶を首の付け根まで103℃で35分間、水浴に浸漬し、次に95℃で10分間、同じ水浴に浸漬した。

瓶を、冷流水浴中で冷却し、次に冷蔵庫中で4℃にて12ないし24時間、使用するまで保存した。

乳製品混合物の植菌:
乳の瓶を発酵体の植菌の45分前に冷蔵庫から取り出し、発酵温度(37℃)の水浴中においた。

4つの別個の乳製品基質の植菌を実行した:
・ I-2494 G4I システイン-HCl顆粒、
・ I-2494 T参照顆粒、
・ BB12 G4I システイン-HCl顆粒、
・ BB12 T 参照顆粒。

各植菌を、1リットルの乳製品混合物あたり0.2グラムの顆粒の量で実施した。

瓶を水浴(37℃)に再び浸漬し、pHの変化を随時モニターした(YSEBAERT(登録商標)からのCINAC(登録商標)装置)。

結果:
B.アニマリスラクティスI-2494、およびB.アニマリスラクティス BB12(登録商標)について、顆粒中にシステイン-HClが存在することに起因したプロバイオティクスの生理学的条件の悪化が観察された(生理学的時間 = 細菌がpHを0.08の pH単位だけ減少させるのに必要な時間;これは、これらの細菌の代謝活性の回復の指標を与える)。

これらの結果を図３に示す(I-2494 Tと比較したI-2494 G4I)。

B.アニマリスラクティスの活性は、プロバイオティクスの顆粒にシステイン-HClを加えることによって大きく影響を受ける(Taの増加)。

システイン-HClは、B.アニマリスラクティスおよびシステインを同じ顆粒中に含み、かつ高プロバイオティックな価値の発酵乳製品の製造を意図した、一体化された顆粒の製造のためのシステイン源としては不十分である。

システイン-HClはプロバイオティクス発酵体の代謝活性を不適切に変えてしまうので、一体化された溶液(B.アニマリスラクティス + システイン)にはシステイン-HClを使用できない。

これらの結果を考慮すると、システイン-HCl溶液のpHは3.5未満であり、より具体的には、100 mLのH₂O中に1 gの濃度にあるシステイン-HClのpHは1.5ないし2.0であること、およびプロバイオティクスB.アニマリスラクティスは、接触時間が短い場合でさえも、低いpHに特に敏感であることが観察されるであろう。

したがって、B.アニマリスラクティスによって同化され得、ヒトの消費に適切であり、かつB.アニマリスラクティスにストレスを与えない溶液のpHを持つシステイン源を特定する必要がある。

例２:この形態のシステインの低い溶解性に関連した問題に拘らず、高度に効果的な「一体化された」顆粒の製造に適切なL-システイン塩基の選択
手順は上記の例１に記載したものと同じであるが、L-システイン塩基(L-システイン;C₃H₇NO₂S;CAS番号:52-90-4;分子量:121.16)をシステイン-HClの代わりにかつそれと置き換えて選択した。

L-システイン塩基は、味の素アミノサイエンスLLC(ローリー(Raleigh) NC 27610, USA)から入手できる。

前記システイン塩基の溶解性は、20℃で100 gのH₂Oあたり16 gである。

50 mLのH₂Oあたり1.15 gのシステインを含有する溶液のpHは4.5ないし5.5である。

160 g/Lのシステイン塩基を含有するストック溶液を調製し、このストック溶液3 gを、上記例１に記載したように凍結顆粒(I-2494 G4I システイン塩基;およびBB12 G4I システイン塩基)に配合された10グラムのB.アニマリスラクティス発酵体(B.アニマリスラクティス株I-2494またはBB12株(登録商標))と混合した。

3グラムの水をシステイン塩基の代わりにかつそれと置き換えて、参照顆粒I-2494 TおよびBB12 Tを調製した。

これらの顆粒の製造図を図４に示す。

上記例１に記載したように、4つの別個の乳製品混合物の0.2 g/Lの植菌を実行した。

したがって、この場合G4I顆粒に含まれるシステイン塩基の量は、
凍結G4I顆粒1グラムあたりシステイン塩基(160×3)/(3×10) = 36.92ミリグラムであった。

この試験において、B.アニマリスラクティスの量は、凍結G4IまたはG4顆粒(I-2494 or BB12)1グラムあたりおよそ2×10¹⁰ cfuであった。

したがって、この場合、B.アニマリスラクティス発酵体10⁹ cfuあたり1.85 mgのシステイン(C₃H₇NO₂S)を添加した。

0.2 g/Lの濃度で植菌されたG4I顆粒によって乳製品混合物に添加されるシステイン塩基の量は、乳製品混合物1リットルあたりシステイン0.2×36.92 = 7.384 mgである。

37℃で混合物を培養した結果は、システイン塩基の選択は、プロバイオティクス発酵体の生理学的条件の高い程度の悪化を防止できることを示す。

結果を図５に示す(I-2494株)。

L-システイン塩基によりB.アニマリスラクティスがその適切な代謝活性を保持するので、「一体化されたシステイン顆粒」方法(B.アニマリスラクティス + システイン顆粒)はL-システイン塩基によって実行され得る。

例３:第１に、組合されたG4系(プロバイオティクス発酵体とは別個のシステイン顆粒)と比較して、第２に、参照系(システイン無しのT顆粒)と比較しての、一体化されたG4I システイン塩基系の性能
この例において、例２に記載されたように製造されたB.アニマリスラクティス発酵体の顆粒、特に、
・ BB12 T顆粒(B.アニマリスラクティス BB12株(登録商標) + 水を含有する参照顆粒)、
・ BB12 G4I顆粒(10⁹ cfuのプロバイオティックな発酵体あたりおよそ1.85 mgのL-システイン(C₃H₇NO₂S)の濃度にある、B.アニマリスラクティス BB12(登録商標) + L-システイン塩基)、
・ I-2494 T顆粒(B.アニマリスラクティス I-2494 + 水を含有する参照顆粒)、および
・ I-2494 G4I顆粒(10⁹ cfuのプロバイオティックな発酵体あたりおよそ1.85 mgのL-システイン(C₃H₇NO₂S)の量にある、B.アニマリスラクティス I-2494 + L-システイン塩基)
を使用した。

この例においては、技術的発酵体と呼ばれる発酵体も使用した;それらは、S.サーモフィルスおよびラクトバチルスデルブルッキー ssp ブルガリクス発酵体であった。

ここで使用した技術的発酵体は、3つの技術的株の混合物、特にS.サーモフィルスのI-1630株ならびにL.ブルガリクスのI-1632およびI-1519株に相当する(これらの株はCNCMから入手できる)。

技術的発酵体を凍結顆粒の形態で供給した。

技術的発酵体を、乳製品基質1グラムあたりおよそ1×10⁶ cfuのS.サーモフィルスI-1630株の量で、かつおよそ2.7×10⁵ cfu のL.ブルガリクスの量(I-1632株が5 %とI-1519株95 %)で乳製品混合物に植菌した。

6つの乳製品混合物を例１に記載したように調製し、
・混合物BB12 Tおよび混合物I-2494 T(技術的発酵体の顆粒とBB12 TまたはI-2494 T顆粒それぞれとの混合物によって植菌された参照混合物)、
・混合物BB12 G4および混合物I-2494 G4(参照混合物として植菌され、かつ凍結システイン顆粒も添加された、組合された方法のための混合物)、
・混合物BB12 G4Iおよび混合物I-2494 G4I(技術的発酵体の顆粒とBB12 G4IまたはI-2494 G4I顆粒(一体化された形態でシステインを含有するB.アニマリスラクティスの顆粒) それぞれとの混合物によって植菌される「一体化された」方法混合物)
のように植菌される。

混合物を、顆粒の混合物0.5 g/Lの量で植菌した(技術的株0.3 g/Lと、プロバイオティックな発酵体B.アニマリスラクティスの顆粒0.2 g/L)。

G4混合物のシステイン顆粒を、混合物に対して7.5 mg/Lのシステイン、すなわちG4I顆粒によって与えられるものに相当するシステインの量(計算値はシステイン7.384 mg/L;上記の例２を参照)を添加するように添加した。

6つの植菌された混合物を、例１に記載したように37℃で培養した。

瓶を冷却し、20℃で貯蔵した。次に、瓶の「ブレーキング」を手作業で実行した。

125 mL容器へのパッケージングを手作業で実施し、FESTO(登録商標)からのDNV-100-25 PPV-A(登録商標)ヒートシール機によって封をヒートシールした。試験の継続中を通して製品を低温室に10℃で保存した。

10℃での乳製品の貯蔵の間の生物体量(日数の関数としてのcfu/mL)と同様に、発酵期間中のpHを測定した。

結果を図６ないし９に示す。

B.アニマリスラクティスのBB12株は、I-2494株によるものと全く同程度の結果をもたらした。

図６および７(時間(時)の関数としてのpHの変化)において、システインの存在は、参照混合物と比較してVmaxに差異をもたらすことが観察された。したがってシステインの効果は、B.アニマリスラクティスの酸化動態から明らかである。

G4I混合物(B.アニマリスラクティス株の顆粒と一体化されたL-システイン塩基)が、G4混合物(B.アニマリスラクティスの顆粒とは別のL-システイン塩基の顆粒)のものと全く同等である動態を与えることも観察された。したがって、成長因子の一体化は完全に成功した。

以下の表２および３は、図６および７に示された酸化動態のいくつかのパラメータについての値を示す。

図８および９は、図８においてプロバイオティクス発酵体B.アニマリスラクティスBB12、図９においてB.アニマリスラクティスプロバイオティクスI-2494株の、10℃の温度での発酵乳製品(B.アニマリスラクティスに加えてのS.サーモフィルス L.ブルガリクス共生)の貯蔵の間の、細胞個体群数の変化を示す。

これらの細胞個体群数のグラフは、図６および７に示された酸化動態で観察された結果を裏付ける。

L-システインの存在は、明らかにプロバイオティクスの細胞個体群を刺激し、L-システイン塩基の一体化は、示された2つの各B.アニマリスラクティス株に対して完全に成功した。

したがって、「組合された」G4系(B.アニマリスラクティスプロバイオティックな発酵体の顆粒 + 別個のL-システイン塩基の顆粒)と比較して、「一体化された」L-システイン塩基のG4I顆粒も効果的である:それらは、全く同じ程度のサイズのB.アニマリスラクティスプロバイオティクス発酵体の細胞個体群を発生させることができ、かつ発酵乳の貯蔵の間、同じ時間だけ維持される少なくとも良質な共生乳酸発酵(S.サーモフィルス + L.ブルガリクス)を導くことができた。

したがって、L-システイン塩基の選択は、B.アニマリスラクティスの特定の成長促進剤の好結果の一体化をもたらし得る。

B.アニマリスラクティスプロバイオティックな発酵体とL-システイン塩基とを含有する「一体化された」G4I顆粒、および「組合された」G4顆粒(プロバイオティックの顆粒とは別個のL-システインの顆粒)は、システインを含まない参照系(T顆粒)よりもはるかに効果的であった:それらは少なくとも同等の品質であるが、はるかに多くの、かつ発酵乳の貯蔵の間はるかに長い期間維持されるプロバイオティクスB.アニマリスラクティス発酵体の細胞個体群を発生させる共生乳酸発酵(S.サーモフィルス + L.ブルガリクス)を導いた。

Claims

乳製品基質への少なくとも1つのビフィドバクテリウムアニマリス ssp ラクティス株の直接植菌に特に適合し、前記乳製品基質をヒトの消費に適切な発酵乳製品へと変えるための種菌であって、前記種菌は、
・ペプチド結合を介して他のアミノ酸と結合していないシステイン、および
・少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス
を混合物として、または複数の部分からなるキットの形態で含み、
前記システインおよび前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスの各々は凍結顆粒および/または単数または複数の凍結乾燥体の形態に含まれているか、または各々が凍結顆粒および/または単数または複数の凍結乾燥体の形態にあり、
前記システインは、還元された形態においてその式がHSCH₂CH(NH₂)CO₂HであるL-システイン塩基でもあり、
・前記単数または複数の顆粒を解凍すること、および/または、
・前記単数または複数の凍結乾燥体を、8ないし10 mLのH₂Oあたり1ないし2グラムの単数または複数の凍結乾燥体の割合で再溶解すること
の後に得られた溶液のpHが最低でも４であり、
を含み、
前記システインは前記種菌中に、
・ 1×10⁴ cfuの前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス (または、いくつか存在する場合は、前記複数の株のB.アニマリスラクティス)あたり1グラム；ないし
・ 3.5×10¹⁰ cfuの前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス (または、いくつか存在する場合は、前記複数の株のB.アニマリスラクティス株)あたり1グラム；
の量で存在することを特徴とする種菌。
前記システインが、溶液中にある場合に4を超えるpHを持つL-システインであることを特徴とする請求項１による種菌。
前記システインが、システイン塩酸塩でもシステイン塩酸塩一水和物でもないことを特徴とする、請求項１または請求項２による種菌。
システイン塩酸塩を含まないことを特徴とする、先行する請求項のいずれか1項による種菌。
・前記システインの全部または一部と、
・前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスの細胞と
の両方を含む少なくとも1つの凍結顆粒および/または凍結乾燥体を含むことを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか1項による種菌。
・少なくとも2つの凍結顆粒、または、
・少なくとも2つの別個の凍結乾燥体、または、
・少なくとも1つの凍結顆粒および少なくとも1つの凍結乾燥体
を含むことを特徴とし、これらの各物理的要素の対について、
・前記2つの物理的要素の一方はB.アニマリスラクティスの細胞を含まずに前記システインの全部または一部を含み、
・前記2つの物理的要素の他方は前記システインを含まずにB.アニマリスラクティスの細胞を含む
ことを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項による種菌。
前記システインが前記種菌中に、
・ 10⁹ cfuの前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス(または、いくつか存在する場合は、前記複数の株のB.アニマリスラクティス)あたり0.01ミリグラム；ないし
・ 10⁹ cfuの前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス(または、いくつか存在する場合は、前記複数の株のB.アニマリスラクティス)あたり30ミリグラム；
の量で存在することを特徴とする先行する請求項のいずれか1項による種菌。
前記システインが前記種菌中に、
・ 0.2×10¹⁴ cfuの前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス(または、いくつか存在する場合は、前記複数の株のB.アニマリスラクティス)あたり１グラム；ないし
・ 10×10¹⁰ cfuの前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス(または、いくつか存在する場合は、前記複数の株のB.アニマリスラクティス)あたり１グラム；
の量で存在することを特徴とする先行する請求項のいずれか1項による種菌。
前記システインが前記種菌中に、
・ 10⁹ cfuの前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス(または、いくつか存在する場合は、前記複数の株のB.アニマリスラクティス)あたり0.05ミリグラムないし；
・ 10⁹ cfuの前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス(または、いくつか存在する場合は、前記複数の株のB.アニマリスラクティス)あたり１0ミリグラム；
の量で存在することを特徴とする先行する請求項のいずれか1項による種菌。
前記システインが前記種菌中に、前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティス5×10⁹ないし5×10¹¹ cfuあたり4.90 mgないし144 mgの量で存在することを特徴とする先行する請求項のいずれか1項による種菌。
16〜17 %の乾燥物含有率を持つ前記顆粒1 gが、前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスを5×10⁹ないし5×10¹¹ cfu含むことを特徴とする先行する請求項のいずれか1項による種菌。
16〜17 %の乾燥物含有率を持つ前記顆粒1 gが4.90 mgないし144 mgの前記システインを含むことを特徴とする、先行する請求項のいずれか1項による種菌。
酵母、酵母抽出物または酵母自己分解物を0.5 % (重量/重量)以下で含んでいることを特徴とする、先行する請求項のいずれか1項による種菌。
前記少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスがI-2494株であることを特徴とする、先行する請求項のいずれか1項による種菌。
さらに、B.アニマリスラクティス以外に少なくとも1つの株の乳酸菌を含むことを特徴とする、先行する請求項のいずれか1項による種菌。
前記少なくとも1つの他の乳酸菌株が、B.アニマリスラクティスの細胞を含むものと別個の形態である物理的構造体中に存在することを特徴とする先行する請求項のいずれか1項による種菌。
前記少なくとも1つの他の株の乳酸菌が、少なくとも1つの株のS.サーモフィルスと、少なくとも1つの株のL.ブルガリクスとを含むことを特徴とする請求項１４または請求項１５による種菌。
少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスと、ペプチド結合によって他のアミノ酸と結合していないL-システインとを含み、前記L-システインは、前記単数または複数の顆粒を解凍した後に得られた溶液のpHが最低でも４であるような形態にあるシステインであることを特徴とする請求項１ないし１７のいずれか１項による種菌から誘導され得る凍結顆粒。
少なくとも1つの株のB.アニマリスラクティスと、ペプチド結合を介して他のアミノ酸と結合していないL-システインとを含み、前記L-システインが、前記単数または複数の凍結乾燥体を8ないし10 mLのH₂Oあたり1ないし2グラムの割合で再溶解した後に得られた溶液のpHが最低でも４であるような形態にあることを特徴とする、請求項１ないし１７のいずれか1項による種菌にすることができるか、または前記種菌から誘導され得る凍結乾燥体。
・乳製品基質に、請求項１ないし１７のいずれか１項による少なくとも１つの株の種菌、および/または請求項１８による少なくとも1つの顆粒、および/または請求項１９による少なくとも1つの凍結乾燥体を植菌すること、および
・前記植菌された基質を、B.アニマリスラクティスの代謝に好適な温度および雰囲気の条件下で維持すること
を含む、乳製品基質上でのB.アニマリスラクティスの成長および/または代謝を刺激するための方法。
・乳製品基質に、請求項１ないし１７のいずれか１項による少なくとも１つの種菌、および/または請求項１８による少なくとも1つの顆粒、および/または請求項１９による少なくとも1つの凍結乾燥体を植菌すること、および
・前記基質を前記少なくとも1つの種菌によって発酵させること
を含む、高プロバイオティックな価値を有する発酵乳製品基質を製造するための方法。
・乳製品基質に、請求項１ないし１７のいずれか１項による少なくとも１つの種菌、および/または請求項１８による少なくとも1つの顆粒、および/または請求項１９による少なくとも1つの凍結乾燥体を植菌すること、
・前記乳製品基質に、少なくとも1つの株のS.サーモフィルスおよび少なくとも1つの株のL.ブルガリクスを植菌すること、および
・前記少なくとも1つの種菌ならびに前記株のS.サーモフィルスおよびL.ブルガリクスによって前記基質を発酵させること
を含む、請求項２１による方法。
乳製品基質1リットルあたり10⁹ないし10¹¹ cfuのB.アニマリスラクティスの細胞に対して乳製品基質1リットルあたり7ないし11 mgのL-システインの量でL-システインとB.アニマリスラクティスの細胞を添加する量にて、前記種菌を前記乳製品基質に添加することを特徴とする、請求項２０ないし２２のいずれか1項による方法。