CN101489400B - 半胱氨酸颗粒及其作为动物乳酸双歧杆菌生长刺激物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及特别适于在乳制品底物中直接接种至少一种动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis ssp lactis)的菌株的接种体，以将所述乳制品底物转化成发酵乳制品。该接种体包含混合物或成套形式的L-半胱氨酸碱和至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株。所述半胱氨酸和所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株分别包含在一种或多种冷冻颗粒和/或一种或多种冻干粉中或者为一种或多种冷冻颗粒和/或一种或多种冻干粉的形式。有利地，所述半胱氨酸被包含在与动物乳酸双歧杆菌的细胞相同的颗粒或相同的冻干粉中。
Description
发明领域
本发明涉及半胱氨酸颗粒以及它们作为动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis ssp lactis)生长刺激物的用途。
发明的现有技术
在乳制品领域中，益生菌剂市场正在萌发。
为了提出含有高水平益生菌菌株同时具有良好器官感觉属性的产品，乳制品专业人员面临混合发酵的问题，所述混合发酵采用工业酵素或专门酵素和益生菌酵素。
被称为益生菌菌株的菌株以在乳制品底物中生长缓慢的菌种(对于双歧杆菌，世代时间为1h至2h)为代表，而工业酵素源自生长较快的酸乳酪酵素(对于嗜热链球菌(S.thermophilus)和保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)，世代时间为15min至30min)。
难以在工业酵素生长与益生菌剂生长之间实现良好折衷；大多数工业专业人员偏向器官感觉方面多于益生菌的质量：通常，益生菌个数为106至107cfu/g发酵产品。
目前，大多数对这样的益生菌剂的健康研究已经用含有最少108cfu/g益生菌菌株的产品进行。
对能够刺激益生菌生长的化合物的研究以对菌株的营养要求和乳制品底物满足这些要求的能力方面的深入了解为基础。
另外，必须证实这样的化合物不产生负面影响并且不刺激被称为工业菌株的菌株的生长，它们为食品级并且它们不降低产品的器官感觉属性。
此外，必须用来提供刺激而且满足以上限制的激活剂化合物的量相对于乳制品底物的比例通常很小。
这样的剂量(通常小于100mg/L)和允许的公差与用来生产乳制品底物的测量系统和并入模式不相容，因此以工业规模使用这样的物质是有问题的。
当所采用的工业菌株必须在若干乳酸菌菌株共生的背景下起作用时，问题更加复杂，这是除了用益生菌产生乳酸发酵外使用嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌共生发酵的发酵乳的情形。
现有技术中已经进行了多种试验来确定有利于益生菌剂生长的条件。然而，多数这样的试验用益生菌的纯培养物进行，不考虑在工业环境中生产产品期间其它乳酸菌的可能存在和活性。
热尔韦·达诺尼公司于2005年7月15日提交的法国专利申请FR-05 07529中描述了一解决方案：它提出将含硫氨基酸用作双歧杆菌的激活剂。
本发明提出尤其适于动物双歧杆菌乳酸亚种的菌株的改进。本发明因此提出接种体，其不具有现有技术的劣势，而且克服在用于人类消费的具有益生菌价值的发酵乳制品的工业生产期间简单、安全而且有效地激活和/或刺激动物乳酸双歧杆菌(B.animalis lactis)的问题，并且更具体地涉及发酵乳制品，其除了益生菌动物乳酸双歧杆菌进行的发酵以外，还包含嗜热链球菌-保加利亚乳杆菌的共生发酵。
发明概述
本发明涉及改进的动物双歧杆菌乳酸亚种接种体，涉及所述接种体的用途，并涉及用所述接种体获得的发酵乳制品。
本发明的接种体尤其适于向乳制品底物中直接接种至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株以将所述乳制品底物转化成适于人类消费的发酵乳制品，并且更具体地转化成含有至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株的具有益生菌价值的发酵乳制品。
接种体作为混合物或以成套的形式包括冷冻颗粒和/或一种或多种冻干粉，其中含有特殊的L-半胱氨酸和至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株。
本发明人已经选择了特殊形式的半胱氨酸，即L-半胱氨酸，其形式使得由所述半胱氨酸生产的颗粒和/或一种或多种冻干粉(一旦解冻和/或再溶解)的pH至少为4。适当的L-半胱氨酸的一实例是通常被称为半胱氨酸碱的L-半胱氨酸(其简化形式的通式为HSCH2CH(NH2)CO2H)。
这种特殊形式的半胱氨酸比通常使用的其它形式(通常为半胱氨酸-HCl，盐酸半胱氨酸一水合物的形式)的半胱氨酸有效。
尽管本发明人选择的特殊的L-半胱氨酸溶解度低，但是本发明人已经成功地制造冷冻颗粒和/或一种或多种冻干粉形式的接种体，所述冷冻颗粒和/或一种或多种冻干粉使动物乳酸双歧杆菌的细胞和这种特殊形式的L-半胱氨酸结合或整合，而不以任何方式损伤动物乳酸双歧杆菌的生理状态和/或代谢。
在本发明的接种体的“整合”形式中，至少一种接种体的颗粒或冻干粉同时含有动物乳酸双歧杆菌的细胞和这种特殊形式的L-半胱氨酸。本发明的接种体的“结合”形式中，部分颗粒或冻干粉含有本发明的特殊的L-半胱氨酸，另一部分颗粒或另一冻干粉含有动物乳酸双歧杆菌的细胞。
本发明因此提出与半胱氨酸激活剂结合或整合的动物乳酸双歧杆菌的接种体。
显然，本发明的接种体能够生产所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株(或者，如果有多种的话，所述多种动物乳酸双歧杆菌的菌株)的种群，在将发酵产品于4℃至11℃储存至少20天后，优选至少30天后，所述种群不低于每克所述发酵产品5×107cfu，优选不低于108cfu(见图8和9)。
本发明的接种体尤其适于生产具有高益生菌价值的发酵乳，因为它能够使产品在冷冻环境下的储存期间维持很高水平的动物乳酸双歧杆菌，并且因为所用的L-半胱氨酸激活剂的量使得发酵乳的嗜热链球菌+保加利亚乳杆菌共生和器官感觉属性都不受到负面影响。
附图简述
本申请引用下述附图：
图1：以下的流程图：
-结合溶液，其计划生产一种或多种益生菌酵素颗粒和半胱氨酸颗粒，所述两种类型的颗粒能够在后来被混合在一起；和
-整合溶液，其计划生产同时含有一种或多种益生菌酵素和半胱氨酸的颗粒。
图2：生产整合颗粒(半胱氨酸-HCl+一种或多种益生菌酵素)的流程图：将动物乳酸双歧杆菌菌株I-2494或菌株
酵素配制成同时含有益生菌酵素和半胱氨酸的整合颗粒，在这里半胱氨酸是半胱氨酸-HCl。
图3：用如下接种的乳制品混合物的pH随时间的变化：
-动物乳酸双歧杆菌菌株I-2494颗粒(参考曲线，下面)；或
-同时含有动物乳酸双歧杆菌菌株I-2494和半胱氨酸-HCl的整合颗粒(上面的曲线)；
说明当与半胱氨酸-HCl配制在相同颗粒(与半胱氨酸-HCl整合的制剂)中时益生菌动物乳酸双歧杆菌在生理状态下经历的降解。
图4：生产整合颗粒(半胱氨酸碱+一种或多种益生菌酵素)的流程图：将动物乳酸双歧杆菌菌株I-2494或菌株
酵素配制成同时含有益生菌酵素和半胱氨酸的整合颗粒，在这里半胱氨酸是半胱氨酸碱。
图5：用如下接种的乳制品混合物的pH随时间的变化：
-动物乳酸双歧杆菌菌株I-2494颗粒(参考曲线，上面)；或
-同时含有动物乳酸双歧杆菌菌株I-2494和半胱氨酸碱的整合颗粒(下面的曲线)；
说明选择半胱氨酸碱配制的整合颗粒(动物乳酸双歧杆菌+半胱氨酸)意味着这种益生菌的生理状态没有恶化。
图6至9：乳制品混合物的比较；
-用工业酵素(嗜热链球菌I-1630、保加利亚乳杆菌-I-1632和保加利亚乳杆菌I-1519颗粒的混合物)的冷冻颗粒和益生菌酵素动物乳酸双歧杆菌(菌株或菌株I-2494)的冷冻颗粒将所述乳制品混合物接种至0.5g/L；和
-与已经向其中添加水而不是整合半胱氨酸的参考混合物相比，已经以不同于益生菌酵素颗粒的半胱氨酸颗粒形式(结合溶液G4)或与益生菌酵素颗粒的整合形式(整合溶液G4I)向所述乳制品混合物中添加半胱氨酸碱。
图6和7：pH随时间(小时)的变化；
图8和9：在10℃下储存发酵乳制品期间生物量(cfu/mL)随时间(天)的变化；
图6和8：动物乳酸双歧杆菌菌株
益生菌酵素：
-乳制品混合物
T＝用工业酵素颗粒和双歧杆菌
酵素参考颗粒(含有水而不是半胱氨酸的颗粒)的混合物接种至0.5g/L的乳制品混合物；
-乳制品混合物G4＝如对
T乳制品混合物进行接种的乳制品混合物，即用工业酵素颗粒和双歧杆菌
酵素参考颗粒的混合物接种至0.5g/L，但是已经向所述乳制品混合物中添加了不同于益生菌颗粒的冷冻颗粒形式的半胱氨酸碱，使得7.5mg/L浓度的半胱氨酸被添加至混合物中；
-乳制品混合物
G4I＝用工业酵素颗粒和双歧杆菌
酵素参考颗粒的混合物接种至0.5g/L的乳制品混合物，所述益生菌的整合颗粒含有半胱氨酸碱，以便向混合物中添加7.5mg/L的半胱氨酸碱；
图7和9：动物乳酸双歧杆菌I-2494益生菌酵素：
-乳制品混合物I-2494T＝用工业酵素颗粒和双歧杆菌I-2494酵素参考颗粒(含有水而不是半胱氨酸的颗粒)的混合物接种至0.5g/L的乳制品混合物；
-乳制品混合物I-2494G4＝如对I-2494T乳制品混合物进行接种的乳制品混合物，即用工业酵素颗粒和双歧杆菌I-2494酵素参考颗粒的混合物接种至0.5g/L，但是已经向所述乳制品混合物中添加了不同于益生菌颗粒的冷冻颗粒形式的半胱氨酸碱，使得7.5mg/L浓度的半胱氨酸被添加至混合物中；
-乳制品混合物I-2494 G4I＝用工业酵素颗粒和双歧杆菌I-2494酵素参考颗粒的混合物接种至0.5g/L的乳制品混合物，所述益生菌的整合颗粒含有半胱氨酸碱，以便向混合物中添加7.5mg/L的半胱氨酸碱；
详细描述
某些定义：
本申请中使用的所有术语具有在乳制品工业和/或食品工业领域中通常应用的范围和含义。
因此，当提到“乳酸发酵”时，这与酸化乳酸发酵有关，指的是伴随乳酸生产的酸化，所述生产可能伴随着其它酸、二氧化碳和诸如外泌多糖(EPS)或芳香物质如丁二酮和乙醛的多种物质的产生。
同样地，术语“乳酸酵素”是指能够使得在乳制品底物上发生这样的酸化乳酸发酵的微生物或者活的或能养活的微生物的菌株。
术语“发酵乳”具有在乳制品工业中通常应用的含义，即用于动物消费，更具体地用于人类消费，并且来源于乳制品底物的酸化乳酸发酵的产品。这样的产品可以含有次要成分如水果、蔬菜、糖、调味剂等。
名称“发酵乳”满足严格的法定标准。在这方面可以参考食品标准(Codex Alimentarius)(在FAO和WHO支持下由食品标准委员会制定并由FAO的信息部门出版，可在http://codexalimentarius.net上在线获得；具体参见食品标准的卷12，“Normes Codes pour le lait et lesproduits laitiers(乳和乳制品的法典标准)”，和标准“CODEX STANA-11(a)-1975”，其内容因此通过引用并入本申请)。
可以具体参考1988年12月30日关于发酵乳和酸乳酪的reporterau Décret francais n°88-1203或1988年12月31日在Journal Officiel dela République Francaise中公开的酸乳酪。该法的内容据此通过引用并入本申请。
术语“发酵乳”因此被保留在本申请中用于用乳制品底物制备的乳制品，所述乳制品底物已经经过至少与巴斯德消毒法相当的处理，用属于特有种或每一产品的特有种的微生物接种。除了由所采用的微生物的活性引起，任何其它手段都必须不能实现“发酵乳”的凝固。
“发酵乳”尚未经过能够除去所采用的乳底物的组成成分的任何处理，并且尤其是尚未除去凝固物。
“发酵乳”可以被补充一种或多种香味提取物、一种或多种天然香料，以及限度为最终产品的30％重量比的一种或多种糖和提供特别味道的其它食品添加剂，或者甚至谷类。
不允许并入非乳制品来源的脂肪和/或蛋白作为替代品。
在销售给消费者时每100克发酵乳中所含游离乳酸的量必须不低于0.6克，并且所述乳部分的蛋白量必须不低于正常乳的蛋白量。
本申请使用的术语“乳制品底物”是指如该术语在乳制品工业中被理解的“乳”，即基本上含有乳和/或乳组分的底物，其组成使得诸如嗜热链球菌和/或保加利亚乳杆菌乳酸菌菌株对所述乳制品底物的乳酸发酵得到可以被指定为人类食品并且能够更具体地被叫做发酵乳的产品。
术语“乳制品底物”因此包括任何形式及有任何组成差异的动物来源的乳：全脂或脱脂乳，浓缩或未浓缩的乳，超滤或未超滤的乳，新鲜乳或不新鲜的乳，粉末状或非粉末状乳，复原或非复原乳，再制或非再制乳，富含乳成分或其他的乳，补充或未补充加工助剂或增强最终产品质量的试剂如风味剂、调味剂、糖等的乳。例如，用于生产发酵乳的乳制品底物可以包含脱脂乳、奶油和脱脂乳粉(见下文实施例1)。
然而，术语“乳制品底物”在其范围中不包括名称“培养基”。术语“培养基”是指旨在促进和/或刺激乳酸菌生长并因此产生乳酸菌接种体的介质，而术语“乳制品底物”是指用来经过发酵转化以产生适于人类消费的食物的介质。因此，可以被添加至培养基以刺激和/或促进乳酸菌生长的许多化合物不能被添加至乳制品底物以获得发酵乳或酸乳酪。
这种情形具体是：
-许多表面活性剂和/或乳化剂和/或增溶剂和/或去垢剂，如聚氧乙烯-山梨糖醇酐-20-单油酸酯(也被称为聚山梨酯80或吐温80)；
-酸，如柠檬酸或乙酸类酸；
-肉提取物；
-植物蛋白胨；
-甘油磷酸。
最频繁地使用的乳酸酵素包括以下乳酸菌：
-嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)(例如，可得自CNCM的菌株I-1630)；和
-德尔布吕克氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii ssp bulgaricus)，或保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)(例如，可得自CNCM的菌株I-1519和I-1362)；
-乳酸片球菌(Pediococcus acidilacti)；
-明串珠菌属(Leuconostocs)，如：
■乳脂明串珠菌(Leuconostoc cremoris)；
■葡萄聚糖明串珠菌(Leuconostoc dextranicum)；
■乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)；
-乳杆菌属(Lactobacillus)，如：
■嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)(例如，可得自CNCM的菌株I-0967)；
■干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)(例如，可得自CNCM的菌株I-518)；
■瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)；
■德尔布吕克氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillusdelbrueckii ssp lactis)(例如，可得自CNCM的菌株I-2843)；
-乳球菌属(Lactococcus)，如：
■乳脂链球菌(Lactococcus cremoris)；
■乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis ssp lactis)(例如，可得自CNCM的菌株I-1631)；
■乳酸乳球菌乳酸亚种二乙酰基乳酸生物变种(例如，可得自CNCM的菌株I-2806)；
-双歧杆菌属(Bifidobacterium)，如：
■动物乳酸双歧杆菌(例如，可得自CNCM的菌株I-2494，或由Chr.Hansen以标准
销售的菌株)；
■短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)；
■两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)；
■长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)；
■婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)。
乳酸菌被定义为在以足够的量被摄取时对健康具有超出它们的基本营养价值的有益效果的活乳酸菌(来自世界卫生组织的官方定义)。
益生菌乳酸菌尤其包括如下乳酸菌：
-乳杆菌属，如：
■嗜酸乳杆菌(例如，可得自CNCM的菌株I-0967)；
■干酪乳杆菌(例如，可得自CNCM的菌株I-518)；
■瑞士乳杆菌；
■德尔布吕克氏乳杆菌乳酸亚种(例如，可得自CNCM的菌株I-2843)；
-双歧杆菌属，如：
■动物乳酸双歧杆菌(例如，可得自CNCM的菌株I-2494，或由Chr.Hansen以标准销售的菌株)；
■短双歧杆菌；
■两歧双歧杆菌；
■长双歧杆菌；
■婴儿双歧杆菌。
益生菌乳酸菌不是能够简单地被大量添加至乳制品的简单食品添加剂。它们是使酸化发酵发生的活菌，其代谢受到在发酵乳制品生产期间和随后直至保质期(EBD)的储存发酵乳制品期间其所经受的条件的影响。
保质期取决于通过有效法规确定的法律上必需的储存期。对于新鲜的发酵乳制品如发酵乳，EBD通常为自生产日期起30天。
在此使用的术语“酵素”，或者为细菌或者为工业菌株，是指参与发酵乳制品的结构和/或质地的细菌或菌株酵素，与基本具有益生菌功能的细菌或菌株酵素相对。
例如，可以另外使用至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株作为益生菌菌株，通过共生的保加利亚乳杆菌-嗜热链球菌发酵来生产发酵乳。在这种情况下，被称为工业菌株的菌株是嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的菌株。
本发明的实施和方面
本发明涉及特别适于向乳制品底物中直接接种至少一种动物双歧杆菌乳酸亚种的菌株以将所述乳制品底物转化成适合人类消费并且具有益生菌价值的发酵乳制品的接种体，还涉及所述接种体在生产这样的乳制品的领域中的用途。
本发明的接种体更具体地适于生产由通过益生菌动物乳酸双歧杆菌和通过嗜热链球菌-保加利亚乳杆菌共生使乳制品底物发酵而获得的发酵乳制品。这样的产品因此含有活体形式的至少一种嗜热链球菌的菌株、至少一种保加利亚乳杆菌的菌株和至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株。
本发明的接种体包含至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株。
本发明的接种体包含特殊的半胱氨酸，即L-半胱氨酸，其形式使得用这种形式的L-半胱氨酸获得的颗粒和/或一种或多种冻干粉使得在：
-使所述一种或多种颗粒解冻；和/或
-使所述一种或多种冻干粉以1至2克一种或多种冻干粉每8至10mL H2O的比例再溶解；
之后所得溶液的pH至少为4。
优选地，该pH不超过8。
为了这一目的，优选选择L-半胱氨酸，其形式使得在被置于溶液中时pH大于4。例如，每50mL H2O含1.25克这种形式的半胱氨酸的溶液的pH为4.5至5.5。
这样的形式的半胱氨酸的一实例是通常被称为L-半胱氨酸碱(或碱式L-半胱氨酸)的L-半胱氨酸。L-半胱氨酸碱简化形式的通式为HSCH2CH(NH2)CO2H。
L-半胱氨酸碱不是半胱氨酸-HCl：因此它既不是半胱氨酸的盐酸盐也不是盐酸半胱氨酸一水合物。
选择这种特殊的半胱氨酸是在多种可获得的半胱氨酸形式中进行选择的结果。
这种特殊的半胱氨酸能够被动物乳酸双歧杆菌吸收并且是乳制品底物上的动物乳酸双歧杆菌生长的激活剂。
这种特殊的半胱氨酸适合人类消费。它满足关于用于人类消费的发酵乳制品法规。
这种特殊的半胱氨酸还能够刺激动物乳酸双歧杆菌的生长或至少代谢，而不干扰其它非益生菌乳酸菌的代谢，尤其是不干扰由嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌进行的共生乳酸发酵。
除了所有这些性质，这种特殊的半胱氨酸能够产生接种体，其被称为整合的，其在相同物理单元中同时包括所述至少一种动物乳酸双歧杆菌菌株和半胱氨酸，这种动物乳酸双歧杆菌菌株的生长或至少代谢不受到负面影响。
高度优选地，本发明的接种体不包括酸形式的半胱氨酸如半胱氨酸-HCl(具有通式HSCH2CH(NH2)CO2H·HCl的盐酸L-半胱氨酸)。
本发明的接种体为特殊的物理形式。它是一种或多种冷冻颗粒和/或一种或多种冻干粉的形式。
这种具体形式的接种体特别适合直接接种。
选择上述特殊的半胱氨酸意味着能够生产具有所有这些特征的接种体，并且能够获得特别有效的接种体。
选择本发明的特殊L-半胱氨酸意味着能够将所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株和所述半胱氨酸一起混合来生产冷冻颗粒和/或一种或多种冻干粉，其在相同的颗粒和/或相同的一种或多种冻干粉中同时包含所述动物乳酸双歧杆菌的菌株和所述半胱氨酸，所述动物乳酸双歧杆菌的菌株的生长或至少代谢不受负面影响。
使用酸形式的半胱氨酸如半胱氨酸-HCl(具有通式HSCH2CH(NH2)CO2H·HCl的盐酸L-半胱氨酸)而不是L-半胱氨酸碱不能获得这样的结果。
本发明人因此提出在其中同时发现所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株的细胞和所述特殊的L-半胱氨酸的冷冻颗粒或冻干粉。这种冷冻颗粒或冻干粉可以作为具有整合激活剂的动物乳酸双歧杆菌接种体。这种冷冻颗粒或冻干粉是本发明的优选实施方案。
整合激活剂的可选途径可以是不使激活剂与动物乳酸双歧杆菌的菌株在相同颗粒或冻干粉中结合，而是生产不同的冷冻颗粒或冻干粉。
例如，可以以例如混合物或成套的形式生产：
-含有所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株的细胞的冷冻颗粒和含有所述特殊L-半胱氨酸的不同的冷冻颗粒(＝不是整合的而是结合的颗粒)；或
-含有所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株的细胞的冻干粉和含有所述特殊L-半胱氨酸的冻干粉(＝不是整合的而是结合的冻干粉)；或
-含有所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株的细胞的冷冻颗粒和含有所述特殊L-半胱氨酸的冻干粉，或者反过来(＝颗粒和一种或多种冻干粉的结合)或者
-这些选项的混合。
这些接种体是整合冷冻颗粒或冻干粉的直接备选项，因为它们是将本发明的手段结合在一起，但是物理形式不同。
这些接种体在此可作为“结合的”并且包括在本发明的范围之内。
图1显示本发明的整合颗粒的生产方式和本发明的结合颗粒的生产方式的说明。
本发明因此是选择特殊半胱氨酸(优选L-半胱氨酸碱)和开发尤其适于直接接种的特殊物理形式(冷冻颗粒和/或一种或多种冻干粉)的结合。
本发明的接种体还尤其适于刺激动物乳酸双歧杆菌的菌株的生长。它不能适于刺激其它种或属的益生菌。
为了刺激动物乳酸双歧杆菌菌株的生长，生长激活剂必须是可获得的，其对动物乳酸双歧杆菌的生长或者至少代谢产生正面影响，而不以任何方式对所得发酵乳制品的质地或结构或有益健康和味觉品质产生负面或有害影响。
在生产除了动物乳酸双歧杆菌以外还需要使用其它乳酸菌的发酵乳制品时，该问题尤其困难。
所采用的每一乳酸菌不一定具有相同的代谢，而且有利于一种或一属的的条件不一定有利于另一种或另一属。
因此，可能难以寻找适合于所有有关菌株的乳酸发酵条件。
该要素被乳酸发酵受特殊的酸化动力学的限制以便能够生产品质优良、安全的发酵乳制品的事实补充。
为了限制多种污染风险，尽快获得5.5的pH是理想的。然而，快速的酸化动力学与动物乳酸双歧杆菌的良好生长和/或良好代谢相冲突。
通过嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌发酵并且还通过益生菌动物乳酸双歧杆菌发酵获得的发酵乳的情形特别困难，因为除了动物乳酸双歧杆菌的发酵，必须进行包括至少一种嗜热链球菌的菌株和至少一种德尔布吕克氏乳杆菌保加利亚亚种的菌株的共生乳酸发酵。
然而，动物乳酸双歧杆菌是在乳制品底物上生长缓慢的菌种(世代时间量级为1至2小时)，而工业酵素嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌生长迅速(世代时间量级为15至30min)。
在这些情况下，控制所有这些参数特别困难。
因此，本发明的接种体尤其被设计为对能够通过被称为工业菌株的乳酸菌菌株进行的发酵，尤其是对嗜热链球菌和德尔布吕克氏乳杆菌保加利亚亚种的共生发酵不产生负面影响。
因此，本发明的接种体尤其适合在生产发酵乳的情形中使用，所述发酵乳包括至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株作为益生菌菌株，并且通过除了由动物乳酸双歧杆菌进行的发酵，还由至少一种嗜热链球菌的菌株和至少一种德尔布吕克氏乳杆菌保加利亚亚种的菌株对乳制品底物的发酵获得。
本发明的接种体满足各种标准，并能够生产具有高益生菌价值且品质优良的发酵乳制品。
然而，针对动物乳酸双歧杆菌发酵存在下的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌共生发酵造成的特别复杂的问题而最优化本发明的接种体的事实，显然没有阻止它在较简单情形中的应用，例如乳制品底物的发酵除了所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株以外仅使用动物乳酸双歧杆菌之外的一种或一属乳酸菌乳制品，或乳制品底物的发酵仅使用动物乳酸双歧杆菌菌株乳制品。
本发明的接种体的一优势为它能够产生所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株(或者如果有多种的话，所述多种动物乳酸双歧杆菌的菌株)的种群，所述种群基本上高于会在除了使用无生长激活剂的动物乳酸双歧杆菌的相同菌株的常规接种体的相同条件下会获得的种群，并且还基本上高于会在除了使用来自动物乳酸双歧杆菌的相同菌株和半胱氨酸-HCl作为生长激活剂的接种体的相同条件下会获得的种群。
本发明的接种体因此能够产生所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株(或者如果有多种的话，所述多种动物乳酸双歧杆菌的菌株)的种群，所述种群在发酵结束时为每克发酵产品至少5×107cfu，优选在发酵结束时为每克发酵产品至少108cfu。
明显地，本发明的接种体具有适合产生所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株(或者如果有多种的话，所述多种动物乳酸双歧杆菌的菌株)的种群的优势，所述种群在4℃至11℃，优选4℃至10℃，高度优选4℃至9℃的温度下储存所述发酵产品至少20天，优选至少30天后不低于每克发酵产品5×107cfu。
特别明显地，本发明的接种体具有能够产生所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株(或者如果有多种的话，所述多种动物乳酸双歧杆菌的菌株)的种群的的优势，所述菌株的种群在4℃至11℃，优选4℃至10℃，高度优选4℃至9℃的温度下储存所述发酵产品至少20天，优选至少30天后不低于每克发酵产品108cfu：见图8和9，表明与动物乳酸双歧杆菌的种群从第21天开始迅速下降的参考发酵乳相比，使用本发明接种体生产的发酵乳(嗜热链球菌-保加利亚乳杆菌+动物乳酸双歧杆菌)中动物乳酸双歧杆菌的种群能够维持在10℃下储存至少30天。
本发明的接种体的另一优势为其形式适合在工业领域中应用。
事实上，本发明的接种体是改进的形式，这意味着它能够以特别安全和容易的方式在发酵乳制品的工业生产领域中应用。
关于用于在工业环境中生产发酵乳制品的测量和结合系统，生长激活剂的剂量和可接受的公差有时可能难以控制。例如，过量激活剂虽然有益于益生菌菌株，但通常对所得发酵乳制品的品质高度有害：它可能引起味道差(例如过量添加的半胱氨酸的硫磺味)，或者它可能对工业菌株的发酵产生负面或有害影响(这是例如使用过量半胱氨酸时嗜热链球菌的情况)。对所添加的激活剂的量的控制还由于卫生原因而很重要，因为这种控制限制人类干预和对必须绝对保证清洁的工业线的改进和适应量。控制激活剂的量还显然具有经济上的重要性。
因此，事实可能是技术人员可以获得适当的生长激活剂但是知道在以工业规模使用它时面临的困难，因为控制激活剂的量在该领域中看起来比较困难。
在另一方面，本发明的接种体很容易在工业领域中使用而且能够安全容易地控制激活剂用量。本发明的接种体因此较易使用，并且意味着具有优良质地、结构和味觉品质的发酵乳制品能够在工业环境中有效可靠地生产并且含有很高剂量的益生菌动物乳酸双歧杆菌。
本发明的接种体是在以下各者之间巧妙折衷的结果：
-为消费者保持发酵乳制品优良品质的要求(结构、质地、有益健康的品质、味觉品质)；
-进一步增加动物乳酸双歧杆菌含量以加强产品的益生菌效应的期望；和
-提供特别适合直接接种并且能够十分安全简单地控制所添加的激活剂的量的改进形式的接种体的期望。
本发明的接种体满足这些不同的目标。
本发明的接种体以混合物或成套的形式包含：
-至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株；和
-称为其游离形式的L-半胱氨酸(即不通过肽键与其它氨基酸连接的L-半胱氨酸)，所述游离形式的L-半胱氨酸的形式还使得其能够生产颗粒和/或一种或多种冻干粉，所述颗粒和/或一种或多种冻干粉在：
○使所述一种或多种颗粒解冻；和/或
○使所述一种或多种冻干粉以1至2克一种或多种冻干粉每8至10mL H2O的比例再溶解；
之后所得溶液的pH至少为4。
优选地，该pH不超过8。
为了这一目的，优选选择游离L-半胱氨酸，其形式使得在被置于溶液中时pH大于4。例如，每50mL H2O含1.25克这种形式的半胱氨酸的溶液的pH为4.5至5.5。
这样的形式的半胱氨酸的优选实例是也被称为L-半胱氨酸碱(或碱式L-半胱氨酸)的L-半胱氨酸。L-半胱氨酸碱简化形式的通式为HSCH2CH(NH2)CO2H。
本发明的L-半胱氨酸和本发明的接种体中所含的动物乳酸双歧杆菌的细胞的具体量分布在固体物理结构即冷冻颗粒和/或一种或多种冻干粉中。
所述半胱氨酸和所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株可以一起包含在相同的固体结构中，或者它们可以存在于不同的固体结构中。这些不同的固体结构本身可以在成套部件中分开包装，或者它们可以作为混合物。
显然，可以生产同时含有本发明的特殊L-半胱氨酸和动物乳酸双歧杆菌的细胞的共同固体结构与不同固体结构的混合物。
所述半胱氨酸和所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株因此可以：
-一起在相同的冷冻颗粒和/或相同的冻干粉中；和/或
-在不同的冷冻颗粒和/或不同的冻干粉中分开，但在成套部件中。
因此，并且根据本发明的有利实施，所述特殊L-半胱氨酸和动物乳酸双歧杆菌细胞的全部或部分可以一起在相同的冷冻颗粒或在相同的冻干粉中。于是，本发明的接种体包含至少一种同时含有本发明的特殊L-半胱氨酸和动物乳酸双歧杆菌细胞的冷冻颗粒和/或冻干粉。
优选地，接种体中含有的全部特殊L-半胱氨酸和动物乳酸双歧杆菌细胞一起在相同的冷冻颗粒或在相同的冻干粉中。
全部或部分本发明的所述特殊L-半胱氨酸和动物乳酸双歧杆菌细胞可以在不同的冷冻颗粒和/或冻干粉中物理地分开但是收集在成套部件中。于是，本发明的接种体包含：
-至少两种冷冻颗粒；或
-至少两种不同的冻干粉；或
-至少一种冷冻颗粒和至少一种冻干粉；
每一种所述接种体都含有本发明的特殊半胱氨酸或动物乳酸双歧杆菌的细胞，使得每一种所述物理实体对(颗粒+颗粒；或冻干粉+不同的冻干粉；或颗粒+冻干粉)：
-两种物理实体中的一种含有全部或部分所述特殊L-半胱氨酸而不含有动物乳酸双歧杆菌的细胞；以及
-两种物理实体中的另一种含有动物乳酸双歧杆菌的细胞而不含有所述特殊L-半胱氨酸。
显然，接种体中含有的全部本发明的特殊L-半胱氨酸和全部动物乳酸双歧杆菌细胞因此可以包含在不同的一种或多种颗粒和/或不同的一种或多种冻干粉中或者为不同的一种或多种颗粒和/或不同的一种或多种冻干粉的形式。
本发明的接种体因此可以包含以下成分或者由以下成分组成：
a)含有本发明的特殊L-半胱氨酸和动物乳酸双歧杆菌的细胞的冷冻颗粒；
b)含有本发明的特殊L-半胱氨酸和动物乳酸双歧杆菌的细胞的冻干粉；
c)含有本发明的特殊L-半胱氨酸但不含动物乳酸双歧杆菌的细胞的冷冻颗粒，和含有动物乳酸双歧杆菌的细胞但不含本发明的特殊L-半胱氨酸的冷冻颗粒；
d)含有本发明的特殊L-半胱氨酸但不含动物乳酸双歧杆菌的细胞的冻干粉，和含有动物乳酸双歧杆菌的细胞但不含本发明的特殊L-半胱氨酸的冻干粉；
e)含有本发明的特殊L-半胱氨酸但不含动物乳酸双歧杆菌的细胞的冷冻颗粒，和含有动物乳酸双歧杆菌的细胞但不含本发明的特殊L-半胱氨酸的冻干粉；
f)含有本发明的特殊L-半胱氨酸但不含动物乳酸双歧杆菌的细胞的冻干粉，和含有动物乳酸双歧杆菌的细胞但不含本发明的特殊L-半胱氨酸的冷冻颗粒；
g)或在以上a)至f)中列出的制剂中至少两种的混合物。
本发明的接种体含有称为游离形式的半胱氨酸(即不通过肽键与其它氨基酸连接)，这是本发明人进行特别选择的结果。
所述游离形式的半胱氨酸是游离的L-半胱氨酸，其形式还使得它能够生产颗粒和/或一种或多种冻干粉，所述颗粒和/或一种或多种冻干粉使得：
-使所述一种或多种颗粒解冻(例如通过在手动搅拌下将颗粒放置在37℃水浴中3min)；和/或
-使所述一种或多种冻干粉以1至2克一种或多种冻干粉对8至10mL H2O的比例再溶解(例如在磁搅拌下于25℃再水合30分钟)；
之后所得溶液的pH至少为4。
为了这一目的，优选选择L-半胱氨酸，其形式使得由50mL至100mL H2O中的1克至1.5克所述半胱氨酸组成的溶液的pH至少为4。
适当的半胱氨酸的一实例是L-半胱氨酸，也称为L-半胱氨酸碱，其简化形式的通式为HSCH2CH(NH2)CO2H。
不适当的半胱氨酸的一实例是半胱氨酸-HCl(盐酸半胱氨酸，或盐酸半胱氨酸一水合物)。
优选地，用来生产本发明的接种体的化合物都不是盐酸盐形式。
本发明的接种体中所含的本发明的特殊L-半胱氨酸不是半胱氨酸酸如盐酸L-半胱氨酸(HSCH2CH(NH2)CO2H·HCl)或盐酸L-半胱氨酸一水合物(HSCH2CH(NH2)CO2H·HCl·H2O)。
盐酸L-半胱氨酸一水合物不是本发明的特殊半胱氨酸，因为由100mL H2O中的1.0g盐酸L-半胱氨酸一水合物组成的溶液的pH为1.5至2.0。
因此，使由不是本发明的特殊半胱氨酸的半胱氨酸制得的冷冻颗粒或冻干粉解冻或再溶解所得到的溶液会具有强酸性pH，更具体地具有小于4，通常小于3.5的pH。
多数强酸形式的半胱氨酸是盐形式的半胱氨酸，如盐酸L-半胱氨酸或盐酸L-半胱氨酸一水合物。该盐中的一种或多种离子在冷冻颗粒或冻干粉中不存在。因此，这一种或多种离子的存在有时候可以作为使用与酸性实体(其通常起增加半胱氨酸溶解度的作用)结合的半胱氨酸的标志物。这样的情形是例如盐酸L-半胱氨酸或盐酸L-半胱氨酸一水合物中含有的氯离子。事实上，如果使用盐酸L-半胱氨酸或盐酸L-半胱氨酸一水合物的酸性半胱氨酸，会观察到颗粒或冻干粉含有大量的氯(Cl)，因为盐酸L-半胱氨酸一水合物含有19％以上的氯，而L-半胱氨酸碱通常所含的氯通常少于0.05％，更优选少于0.040％。因此，颗粒或冻干粉中大量氯的存在可以作为使用不是半胱氨酸碱的半胱氨酸的间接标志物。因此，本发明的接种体中使用的半胱氨酸的形式通常会在每克干物质含量为16％至17％的颗粒中提供少于60微克氯离子。
然而，可应用的第一标准是pH标准。测量pH实际上构成检测本发明的特殊半胱氨酸的存在的直接标准：解冻的颗粒或再溶解的冻干粉的pH至少为4。它通常至少为5，例如5至6.5。优选地，所述pH不超过8。
至少为4且至多为8的pH对动物乳酸双歧杆菌没有压力。动物乳酸双歧杆菌因此可以被混合进入半胱氨酸溶液而不受压力，并被配制成在固体物理结构中整合半胱氨酸和动物乳酸双歧杆菌细胞的冷冻颗粒或冻干粉。所得动物乳酸双歧杆菌接种体于是含有处于良好生理和/或代谢状态并且迅速响应半胱氨酸施加的激活的动物乳酸双歧杆菌的细胞。
同时含有动物乳酸双歧杆菌的细胞和本发明特殊L-半胱氨酸的本发明的“整合”冷冻颗粒或冻干粉因此是特别地改进的动物乳酸双歧杆菌接种体，因为它成功地将动物乳酸双歧杆菌激活剂整合进入其结构中而不以任何方式改变动物乳酸双歧杆菌细胞的生理和/或代谢状态。
选择本发明的特殊L-半胱氨酸意味着能够获得比由强酸形式的L-半胱氨酸如盐酸L-半胱氨酸配制的颗粒和/或冻干粉更有效的颗粒和/或冻干粉。
另外，这种选择能够以有效的方式将半胱氨酸整合进入相同的冷冻颗粒或进入相同的冻干粉中。当使用强酸形式的半胱氨酸如盐酸L-半胱氨酸来配制同时包含半胱氨酸-HCl和动物乳酸双歧杆菌细胞的冷冻颗粒或冻干粉时，所得整合颗粒或整合冻干粉是效果比从本发明的特殊L-半胱氨酸开始获得的相同颗粒或冻干粉差的动物乳酸双歧杆菌接种体。
根据本发明的优选实施，本发明的接种体因此不包括强酸性半胱氨酸并且更具体地不包括盐酸L-半胱氨酸和/或不由这样的半胱氨酸生产。
本发明的接种体还不包括胱氨酸。于是，优选地，不向本发明的接种体添加胱氨酸。然而，可能发现痕量的胱氨酸，但是它们会是例如接种体中所含半胱氨酸的氧化的结果。
有利地，接种体中所述本发明的特殊L-半胱氨酸的量为：
-每1×1014cfu所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株(或者，如果有多种的话，所述多种动物乳酸双歧杆菌的菌株)1克；
-至每3.5×1010cfu所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株(或者，如果有多种的话，所述多种动物乳酸双歧杆菌的菌株)1克；和/或量为：
-每十亿cfu所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株(或者，如果有多种的话，所述多种动物乳酸双歧杆菌的菌株)0.01毫克；
-至每十亿cfu所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株(或者，如果有多种的话，所述多种动物乳酸双歧杆菌的菌株)30毫克。
在本申请中，所有的半胱氨酸质量根据通式为HSCH2CH(NH2)CO2H的半胱氨酸计算。
优选地，所述接种体中所述本发明的特殊L-半胱氨酸的量为：
-每0.2×1014cfu所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株(或者，如果有多种的话，所述多种动物乳酸双歧杆菌的菌株)1克；
-至每3.5×1010cfu所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株(或者，如果有多种的话，所述多种动物乳酸双歧杆菌的菌株)1克；
和/或量为：
-每十亿cfu所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株(或者，如果有多种的话，所述多种动物乳酸双歧杆菌的菌株)0.05毫克；
-至每十亿cfu所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株(或者，如果有多种的话，所述多种动物乳酸双歧杆菌的菌株)10毫克。
根据本发明的具体实施方案，所述本发明的特殊L-半胱氨酸在所述接种体中的量为每5×109至5×1011cfu所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株4.90mg至144mg。
优选地，所述本发明的特殊L-半胱氨酸在所述接种体中的量为25mg至50mg，更优选30mg至40mg，更优选31mg至39mg，例如大约31mg、32mg、33mg、34mg、35mg、36mg、37mg、38mg、39mg，高度优选35mg至37mg，例如大约35mg、36mg、37mg，并且特别优选每5×109至5×1011cfu所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株大约36.9mg。
优选地，动物乳酸双歧杆菌的cfu数为5×109cfu至5×1011cfu，更优选2×1010cfu至5×1011cfu动物乳酸双歧杆菌，高度优选2×1010cfu至1×1011cfu动物乳酸双歧杆菌，更优选2×1010cfu至7×1010cfu动物乳酸双歧杆菌。
有利地，会包含16％至17％干物质的1克本发明的颗粒(将物质在105℃下干燥至少40min)，包含5×109cfu至5×1011cfu至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株。
有利地，会包含16％至17％干物质的1克本发明的颗粒(将物质在105℃下干燥至少40min)包含4.90mg至144mg所述本发明的特殊L-半胱氨酸，优选L-半胱氨酸碱。
有利地，160毫克至170毫克的本发明的冻干粉包含5×109cfu至5×1011cfu所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株。
有利地，160毫克至170毫克的本发明的冻干粉包含4.90mg至144mg所述本发明的特殊L-半胱氨酸。
为了计数动物乳酸双歧杆菌的菌落形成单位(cfu)，可以使用技术人员认为适当的任何技术，例如Grand et al，2003(Eur.Food Res.Technol.217：90-92)描述的双歧杆菌计数方法。优选地，S.N.Thitaram，G.R.Siragusa和A.Hinton，2005(Jr Letters in Applied Microbiology，volume 41，page 355-October 2005；“Bifidobacterium-selective isolationand enumeration from chicken caeca by a modified oligosaccharideantibiotic-selective agar medium(通过改进的寡糖抗生素选择性琼脂培养基从鸡盲肠中进行双歧杆菌选择性分离和计数)”描述的方法。
为了分析液体中含有的半胱氨酸，可以使用技术人员认为适当的任何技术，例如与质谱联用的气相色谱，或者与荧光检测联用的液相色谱。还可以使用氨基酸分析仪如L-8800高速氨基酸分析仪(HitachiHigh Technologies)分析半胱氨酸。
优选地，本发明的接种体不包括多于0.5％(w/w)的酵母、酵母提取物或酵母自溶产物。
优选地，本发明的接种体不包括多于0.5％(w/w)的酵母、酵母提取物或酵母自溶产物。高度优选地，所述接种体不含酵母、酵母提取物或酵母自溶产物。
有利地，本发明允许配制高活性的动物乳酸双歧杆菌的接种体，所述接种体产生长时间维持(发酵乳制品在冷藏温度下储存期间)的动物乳酸双歧杆菌种群，无需在接种体中使用防腐剂且无需向所述乳底物或发酵乳制品添加防腐剂。
由于本发明，动物乳酸双歧杆菌的种群在发酵乳制品中处于特别健康的生理和/或代谢状态，这意味着它能够维持在高水平。
本发明的接种体包含至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株，例如，来自Chr.Hansen的菌株I-2494或菌株
本发明的接种体显然可以包含若干动物乳酸双歧杆菌的菌株，例如来自Chr.Hansen的菌株I-2494或菌株
本发明的接种体还可以包含至少一种动物乳酸双歧杆菌以外的乳酸菌菌株。
所述至少一种其它乳酸菌菌株可以存在于含有动物乳酸双歧杆菌的细胞和/或本发明的特殊L-半胱氨酸的颗粒或一种或多种冻干粉中。
所述至少一种其它乳酸菌菌株可以以不同于含有动物乳酸双歧杆菌的细胞的物理结构存在。这种不同的物理结构可以是例如固体结构，如与动物乳酸双歧杆菌和本发明的特殊L-半胱氨酸的颗粒和/或一种或多种冻干粉混合的冷冻颗粒或冻干粉，或分开但成套的冷冻颗粒或冻干粉。这种至少一种其它乳酸菌菌株可以以例如不同于动物乳酸双歧杆菌和本发明的特殊半胱氨酸的颗粒或一种或多种冻干粉的冷冻颗粒或冻干粉的形式存在。
这种至少一种其它乳酸菌菌株可以是双歧杆菌属的菌株或另一属的菌株。
这种不同属的菌株可以是具有益生菌功能的菌株，例如选自嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌(Mactobacillus thamnosus)、干酪乳杆菌的至少一种菌株。
这种不同属的菌株可以是具有工业功能的菌株，如嗜热链球菌和/或保加利亚乳杆菌。
有利地，本发明的所述接种体除了动物乳酸双歧杆菌和特殊L-半胱氨酸的一种或多种颗粒和/或一种或多种冻干粉以外，包含例如适合直接接种的一种或多种冷冻颗粒和/或一种或多种冻干粉形式的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的接种体。
优选地，本发明的接种体包含动物乳酸双歧杆菌以外的多种菌株，例如至少两种，至少三种，或至少四种动物乳酸双歧杆菌以外的菌株。
有利地，所述其它菌株是至少一种嗜热链球菌的菌株(例如，可得自CNCM的菌株I-1630)和至少两种保加利亚乳杆菌的菌株(例如，可得自CNCM的菌株I-1632和I-1519)。这样的接种体的形式可以是含有动物乳酸双歧杆菌和本发明的特殊L-半胱氨酸的冷冻颗粒和/或一种或多种冻干粉和含有嗜热链球菌和/或保加利亚乳杆菌的冷冻颗粒和/或一种或多种冻干粉的混合物或成套集体。该整体因而特别适合乳制品底物的直接接种，以便通过酸化共生嗜热链球菌-保加利亚乳杆菌乳酸发酵和通过动物乳酸双歧杆菌发酵将其转化，形成具有高益生菌价值并且在制冷剂中储存期间保持其高益生菌价值的发酵乳。
本申请还涉及本发明的整合颗粒本身以及本发明的冻干粉本身。
如上文和/或以下的实施例部分指出和描述的那样，本发明的整合颗粒或冻干粉包含所指出的剂量和/或比例的至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株和本发明的特殊L-半胱氨酸。优选地，所述颗粒或冻干粉不包含强酸形式的半胱氨酸如L-半胱氨酸一氯化物。
本申请因此涉及包含至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株和不通过肽键与其它氨基酸相连的L-半胱氨酸的冷冻颗粒，所述L-半胱氨酸的形式使得在使所述一种或多种颗粒解冻后获得的溶液的pH至少为4，通常大于5。
本申请因此涉及包含至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株和不通过肽键与其它氨基酸连接的L-半胱氨酸的冻干粉，所述L-半胱氨酸的形式使得在使所述一种或多种冻干粉以1至2克一种或多种冻干粉每8至10mL H2O的比例再溶解后获得的溶液的pH至少为4，通常大于5。
优选地，颗粒或冻干粉的pH小于8(使颗粒解冻或使冻干粉再溶解后所得溶液的pH)。
本发明还涉及本发明的接种体的用途。
更具体地，本发明涉及它在酸化乳酸发酵方面的用途，并且更具体地涉及它在生产适合人类消费的发酵乳制品方面的用途。
本发明因此涉及使用本发明的至少一种接种体和/或至少一种颗粒或冻干粉的任何方法。
更具体地，本发明涉及在乳制品底物上刺激动物乳酸双歧杆菌的生长和/或代谢的方法，所述方法使用本发明的至少一种接种体和/或至少一种颗粒和/或至少一种冻干粉。
这种刺激方法具有以高度有效的方式刺激动物乳酸双歧杆菌的优势。如上显示并如下说明的那样，本发明的刺激方法能够生产动物乳酸双歧杆菌的种群，所述种群的代谢和/或生长能够使动物乳酸双歧杆菌细胞长时间保持存活。
为了实施这种方法，以如上指出和/或在实施例和如下的图中描述的剂量和/或比例添加所述接种体。
有利地，向乳制品底物提供的本发明的所述接种体和/或颗粒和/或冻干粉的添加量为：
-每升乳制品底物5mg至20mg半胱氨酸，优选6至15mg/L，更优选7至11mg/L；以及
-每升底物109至1011cfu动物乳酸双歧杆菌，优选0.4×1010至1×1011cfu动物乳酸双歧杆菌，更优选0.4×1010至1.2×1010cfu动物乳酸双歧杆菌，高度优选0.4×1010至1×1010cfu动物乳酸双歧杆菌。
接种的底物优选维持在有利于动物乳酸双歧杆菌代谢的温度和大气条件下，例如在37℃至42℃的封闭容器中。
本发明还涉及生产发酵乳制品，优选通过乳酸发酵获得的乳制品的方法，所述乳酸发酵除动物乳酸双歧杆菌进行的发酵以外，包含至少共生嗜热链球菌-保加利亚乳杆菌发酵。
本发明的方法包括使用本发明的至少一种接种体和/或至少一种颗粒和/或至少一种冻干粉。所得发酵乳制品是具有高益生菌价值的发酵乳制品，因为它含有大量动物乳酸双歧杆菌而且在冷冻气氛中储存期间含量高。
这种生产方法具有以高度有效的方式激活和/或刺激动物乳酸双歧杆菌的优势。它还具有对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的共生不产生负面影响的优势。
如上所述和如下说明的那样，本发明的生产方法能够生产动物乳酸双歧杆菌的种群，所述种群的代谢和/或生长允许动物乳酸双歧杆菌的细胞长时间存活。
为了实施这种方法，以如上指出和/或在如下实施例和图中描述的剂量和/或比例添加所述接种体。
有利地，向乳制品底物添加的本发明的所述接种体和/或颗粒和/或冻干粉的添加量为：
-每升乳制品底物5mg至20mg半胱氨酸，优选6至15mg/L，更优选7至11mg/L；以及
-每升底物109至1011cfu动物乳酸双歧杆菌，优选0.4×1010至1×1011cfu动物乳酸双歧杆菌，更优选0.4×1010至1.2×1010cfu动物乳酸双歧杆菌，高度优选0.4×1010至1×1010cfu动物乳酸双歧杆菌。
0.05g至1克本发明的整合颗粒的剂量，例如大约0.2g本发明的整合颗粒，是1升乳制品底物的适当剂量的实例。
接种的底物优选维持在有利于动物乳酸双歧杆菌代谢的温度和大气条件下，例如在37℃至42℃的封闭容器中。
所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株作为益生菌菌株起作用。然而，所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株还必须能够进行乳制品底物的酸化发酵。因此，所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株不是简单地被添加至底物或乳制品，其不允许它像简单的添加剂那样进行酸化发酵。
有利地，生产发酵平行产品的方法可以包括使用所述至少一种动物乳酸双歧杆菌以外的菌株。
所述其它菌株优选乳酸菌菌株。
所述至少一种其它乳酸菌菌株具有进行酸化乳酸发酵的功能。因此，将它以进行酸化乳酸发酵的方式接种入乳制品底物中，即在以允许它有效地进行酸化乳酸发酵的时刻和以允许它有效地进行酸化乳酸发酵的量接种。
本发明的发酵方法因此对应于所述至少一种乳酸菌的菌株和所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株进行的混合发酵，并且不对应于无任何可检测的发酵作用、作为简单添加剂添加动物乳酸双歧杆菌的简单乳酸发酵方法。
因此，所述至少一种乳酸菌菌株和所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株一起存在于乳制品底物中。
根据本发明的有利方面，该生产方法因而可以不是两步法：添加所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株和任何其它乳酸菌菌株可以同时进行，或者至少基本上在该方法的相同步骤中，即在方法的开始，不必等待并核实一种菌株进行的发酵已经在特定阶段发生以便决定添加其它一种或多种菌株。
乳制品底物的发酵在适合于所采用的菌株的温度下进行，并且通常在36℃至42℃的温度下进行。
所述发酵通常一直进行到pH达到4.8至4.2。
生产本发明的发酵乳制品的方法还可以包括一种或多种其它步骤，例如选自生产相关发酵乳制品的传统步骤的一种或多种其它步骤。
它可以是例如如下步骤中的一种或多种步骤：
-制备乳制品底物；
-加热处理乳制品底物(至少与巴斯德消毒法相当的加热处理，例如95℃5min)；
-乳制品底物的一次或多次接种；
-在适合于所接种菌株的条件下进行所接种底物的至少一种乳酸发酵(通常至pH为4.8至4.2)；
-任选地添加香料、水果、甜味剂、着色剂、防腐剂；
-任选地，平滑或搅拌发酵产品；
-包装发酵产品，例如装入密封容器中；
-在冷冻环境中储存发酵乳制品。
本发明的接种体因此能够生产所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株(或者，如果有多种的话，所述多种动物乳酸双歧杆菌的菌株)的种群，所述种群在发酵结束时至少为每克发酵产品5×107cfu，优选在发酵结束时至少为每克发酵产品108cfu。
明显地，本发明的接种体具有适于生产所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株(或者，如果有多种的话，所述多种动物乳酸双歧杆菌的菌株)的种群的优势，所述种群在4℃至11℃，优选4℃至10℃，高度优选4℃至9℃的温度下储存所述发酵产品至少20天，优选至少30天后不低于每克发酵产品5×107cfu。
特别明显地，本发明的接种体具有适于生产所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株(或者，如果有多种的话，所述多种动物乳酸双歧杆菌的菌株)的种群的优势，所述种群在4℃至11℃，优选4℃至10℃，高度优选4℃至9℃的温度下储存所述发酵产品至少20天，优选至少30天后不低于每克发酵产品108cfu：见图8和9，表明与动物乳酸双歧杆菌的种群从第21天开始迅速下降的参考发酵乳相比，使用本发明接种体(嗜热链球菌-保加利亚乳杆菌+动物乳酸双歧杆菌)生产的发酵乳中动物乳酸双歧杆菌的种群能够维持在10℃下储存多达至少30天。
在本申请中，术语“发酵乳制品的质量”是指发酵乳制品的乳酸部分的质量。
本发明还涉及发酵乳制品本身。
在4℃至11℃，优选4℃至10℃，高度优选4℃至9℃的温度下储存所述发酵产品甚至至少20天，优选至少30天后，这样的产品的动物乳酸双歧杆菌种群维持其自身高于现有技术产品中观察到的种群。
因此，它的组成必然不同于现有技术产品。
因此，本申请涉及发酵乳制品，其能够通过由至少一种本发明的接种体对乳制品底物乳酸发酵至pH通常为4.8至4.2来获得。优选地，所述接种体为本发明的整合冷冻颗粒和/或整合冻干粉(其中特殊L-半胱氨酸与动物乳酸双歧杆菌酵素整合的接种体)的形式。有利地，所述接种体还可以包含至少一种嗜热链球菌的菌株和/或至少一种保加利亚乳杆菌的菌株。
在本申请中，缩写词CNCM代表法国微生物保藏中心(CollectionNationale de Cultures de Microorganismes)(CNCM，Institut Pasteur；25，rue du Docteur Roux；F-75724 PARIS CEDEX 15)。在CNCM保藏的菌株开头带有符号“I-“，如“I-2494”(动物乳酸双歧杆菌菌株)、“I-1630”(嗜热链球菌菌株)、“I-1632”或“I-1519”(保加利亚乳杆菌菌株)。
与“包括”或“含有”同义的术语“包含”是开放式术语，并且不排除不会明确指出的另外的一个或多个组分、成分或步骤的存在，而术语“组成”或“由...组成”是封闭式式术语，其排除任何其它别的没有明确说明的组分、步骤或成分的存在。术语“基本上组成”或“基本上由...组成”是部分开放式的术语，其不排除另外的一个或多个组分、成分或步骤的存在，条件是那些一个或多个另外的组分、成分或步骤对本发明的基本性质没有实质影响。
因此，术语“包含(comprenant)”(或“包含(comprend(comprennent))”)包括术语“组成”、“由...组成”以及术语“基本上组成”和“基本上由...组成”。
本申请引用的每一文件、著作或出版物的内容通过引用并入本文。
以下实施例纯粹以说明的方式给出，不以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1：使用半胱氨酸-HCI不适于生产会同时包含半胱氨酸和动物乳酸双歧杆菌的被称为“整合”颗粒的颗粒
方法和仪器
在本实施例中，按照图2所示的颗粒生产原理。
在本实施例中使用如下益生菌菌株：
-Chr.Hansen A/S，Hoersholm，Danemark销售的动物乳酸双歧杆菌菌株
-可得自CNCM的动物乳酸双歧杆菌菌株I-2494(在CNCM的保藏日期＝2000年6月20日)；参见热尔韦·达诺尼公司于2001年7月4日提交的国际专利申请WO-02/02800以及该国际申请的国家或地区副本；更具体地，关于该国际申请的美国副本，见专利US 7,008,785B2。
如果必要的话，菌株在使用前解冻。
所用的半胱氨酸是半胱氨酸-HCl，其由于溶解度良好(20℃下大约110g每100g H2O)而通常被用来提供半胱氨酸。
半胱氨酸-HCl是盐酸L-半胱氨酸的一水合物(或(R)-2-氨基-3-巯基丙酸单盐酸盐的一水合物)。它的通式为C3H7NO2S·HCl·H2O(或L-半胱氨酸·HCl·H2O)。它的CAS号是7048-04-6；它的摩尔质量是175.63。
半胱氨酸-盐酸是可购自例如Ajinomoto Aminoscience LLC，Raleigh NC 27610，USA。
生产颗粒的方法(见图2)：
将50克动物乳酸双歧杆菌的每一菌株与以下混合：
-15克325g/L的半胱氨酸-HCl(G4I Cys-HCl整合颗粒)；或
-15克水(参考颗粒I-2494T和BB12T)。
混合在搅拌下进行以便完全合并半胱氨酸-HCl溶液(或参考情况下的水)。
通过将混合物滴入液氮中生产冷冻颗粒。向包括若干通过管子与蠕动泵相连的注射器针头的装置供给混合物，使针头末端处形成的小滴落入充满液氮的等温容器中。
获得G4I Cys-HCl益生菌酵素的冷冻颗粒(含有半胱氨酸-HCl的动物乳酸双歧杆菌I-2494或
颗粒)和含有水而不是半胱氨酸-HCl的参考颗粒。
乳制品混合物(＝乳制品底物)的制备：
乳制品混合物由以下成分组成：含0％脂肪的脱脂乳、含40％脂肪的奶油和含33％蛋白的脱脂乳粉(PLE)。
首先，用
搅拌器在大约750rpm下搅拌介质60分钟以便使蛋白再水合，将所有成分混合在一起以将乳标准化至蛋白含量(TP)为4.4％，脂肪含量(MG)为3.5％且干物质含量为15.8％。
使用来自的MILKOSCAN FT
红外检测器检验标准化。以下给出使乳获得目标特性所需的每一成分的量的实例。
表1：
| 成分 | ％ |
| 脱脂乳0％MG | 87.5 |
| 奶油，40％MG | 8.7 |
| 脱脂乳蛋白，33％TP | 3.8 |
| 共计 | 100 |
然后将乳加热至50℃至60℃的温度以使脂肪球完全融化。一旦达到该温度，将10升在
中匀化。这通过在350巴的压力下使毛细管中的乳过筛破坏脂肪球。
准备
水浴并调整到103℃。将乳转移至8个1升的瓶中，精确称量放置在每一瓶中的量。
将瓶浸至颈底部，于103℃在水浴中下浸35分钟，然后于95℃在相同水浴中下浸10分钟。
将瓶置于连续流动冷水浴中冷却，然后在冰箱中4℃储存12至24小时直至使用。
乳制品混合物的接种：
接种酵素前45分钟将乳瓶从冰箱中取出并置于发酵温度(37℃)下的水浴中。
对乳制品混合物进行四种不同的接种：
-I-2494 G4I Cys-HCl颗粒；
-I-2494 T参考颗粒；
-BB12 G4I Cys-HCl颗粒；
-BB12 T参考颗粒。
每一接种以0.2克颗粒每升乳制品混合物的量进行。
将瓶再次浸入水浴(37℃)中并监测pH随时间的变化(来自
的
仪器)。
结果：
对于动物乳酸双歧杆菌I-2494，如同对于动物乳酸双歧杆菌
一样，由于颗粒中半胱氨酸-HCl的存在，观察到了在益生菌生理状态下的降解(生理学时间＝细菌使pH降低0.08个pH单位所需的时间；这提供了这些细菌的代谢活性恢复的量度)。
这些结果显示于图3(I-2494 G4I，与I-2494 T相比)中。
向益生菌颗粒中添加半胱氨酸-HCl非常影响益生菌动物乳酸双歧杆菌的活性(Ta增加)。
半胱氨酸-HCl不是生产整合颗粒的半胱氨酸的满意来源，所述整合颗粒在相同颗粒中包含动物乳酸双歧杆菌和半胱氨酸，并且用于生产具有高益生菌价值的发酵乳制品。
整合溶液(动物乳酸双歧杆菌颗粒+半胱氨酸)不能使用半胱氨酸-HCl，因为它使得益生菌酵素的代谢活性不适当。
鉴于这些结果，会观察到半胱氨酸-HCl溶液的pH小于3.5；更具体地，1g每100mL H2O的浓度的半胱氨酸-HCl溶液的pH为1.5至2.0，而且益生菌动物乳酸双歧杆菌对低pH特别敏感，甚至当将接触时间减少时。
因此，有必要鉴定能够被动物乳酸双歧杆菌吸收、适合人类消费并且其溶液的pH对动物乳酸双歧杆菌没有压力的半胱氨酸的来源。
实施例2：选择适合生产高效“整合”颗粒的L-半胱氨酸碱，尽管存在与这种形式的半胱氨酸的低溶解度相关的问题
方法与以上的实施例1的方法类似，但是选择了L-半胱氨酸碱(L-半胱氨酸；C3H7NO2S；CAS号：52-90-4；摩尔质量：121.16)而不是半胱氨酸-HCl。
L-半胱氨酸碱可得自Ajinomoto Aminoscience LLC，Raleigh NC27610，USA。
所述半胱氨酸碱的溶解度是20℃下每100g H2O 16g。
50mL H2O含1.15g半胱氨酸碱的溶液的pH为4.5至5.5。
制备含有160g/L半胱氨酸碱储备溶液，并将3克这种储备溶液与10克动物乳酸双歧杆菌酵素(动物乳酸双歧杆菌菌株I-2494或菌株
)混合，所述动物乳酸双歧杆菌酵素如以上的实施例1所述被配制入冷冻颗粒(I-2494 G4I Cys-碱；和BB12 G4I Cys-碱)。
用3克水而不是半胱氨酸碱制备参考颗粒I-2494 T和BB12 T。
这些颗粒的生产图表如图4所示。
如以上的实施例1所述进行四种不同的0.2g/L的乳制品混合物的接种。
因此，G4I颗粒中所含的半胱氨酸碱的量是这样的：
(160×3)/(3+10)＝36.92毫克半胱氨酸碱每克冷冻G4I颗粒。
在该试验中，动物乳酸双歧杆菌的量大约是2×1010cfu每克冷冻G4I或G4颗粒(I-2494或BB12)。
因此，在这种情况下每十亿cfu的动物乳酸双歧杆菌酵素添加1.85mg半胱氨酸C3H7NO2S。
通过接种至0.2g/L浓度的G4I颗粒向乳制品混合物添加的半胱氨酸碱的量为0.2×36.92＝7.384mg半胱氨酸每升乳制品混合物。
37℃下孵育该混合物的结果表明选择半胱氨酸碱能够防止益生菌酵素的生理状态降解程度太大。
这些结果如图5(菌株I-2494)所示。
“整合半胱氨酸颗粒”方法(动物乳酸双歧杆菌+半胱氨酸颗粒)可以用L-半胱氨酸碱进行，因为动物乳酸双歧杆菌可以因此保持其适当的代谢活性。
实施例3：整合G4I Cys-碱系统的性能，首先与结合G4系统(不同于益生菌酵素颗粒的半胱氨酸颗粒)相比，其次与参考系统(T颗粒，无半胱氨酸)相比
在本实施例中，使用如实施例2所述生产的动物乳酸双歧杆菌酵素颗粒，即：
-BB12 T颗粒(含有动物乳酸双歧杆菌
+水的参考颗粒)；
-BB12 G4I颗粒(含有动物乳酸双歧杆菌
+浓度为每十亿cfu益生菌酵素大约1.85mg L-半胱氨酸C3H7NO2S的L-半胱氨酸碱的整合颗粒)；
-I-2494 T颗粒(含有动物乳酸双歧杆菌I-2494+水的参考颗粒)；和
-I-2494 G4I颗粒(含有动物乳酸双歧杆菌I-2494+量为每十亿cfu益生菌酵素大约1.85mg半胱氨酸C3H7NO2S的L-半胱氨酸碱的整合颗粒)。
在本实施例中，还使用被称为工业酵素的酵素；它们是嗜热链球菌和德尔布吕克氏乳杆菌保加利亚亚种的酵素。
在此使用的工业酵素对应于三种工业酵素，即嗜热链球菌的I-1630菌株和保加利亚乳杆菌的菌株I-1632和I-1519(可得自CNCM的菌株)，的混合物。
工业酵素以冷冻颗粒的形式提供。
将工业酵素接种至乳制品混合物中，至每克乳制品底物大约1×106cfu嗜热链球菌I-1630，和大约2.7×105cfu保加利亚乳杆菌(含5％的菌株I-1632和95％的菌株I-1519)的量。
如实施例1所述制备六种乳制品混合物并如下接种：
-混合物BB12 T和混合物I-2494 T：用工业酵素颗粒分别与BB12T颗粒或I-2494 T颗粒的混合物接种的参考混合物(含有益生菌动物乳酸双歧杆菌不含半胱氨酸的颗粒)；
-混合物BB12 G4和混合物I-2494 G4：结合方法的混合物，如参考混合物进行接种，并且其中还添加了冷冻半胱氨酸颗粒；
-混合物BB12 G4I和混合物I-2494 G4I：用工业酵素颗粒分别与BB12 G4I颗粒或I-2494 G4I颗粒的混合物接种的“整合”方法混合物(含有整合形式半胱氨酸的动物乳酸双歧杆菌的颗粒)。
混合物的接种量为0.5g/L的颗粒混合物(0.3g/L工业酵素和0.2g/L益生菌酵素颗粒动物乳酸双歧杆菌)。
添加G4混合物的半胱氨酸颗粒以便向混合物提供7.5mg/L的半胱氨酸，即相当于G4I颗粒提供的半胱氨酸的量(计算值7.384mg/L的半胱氨酸；见以上的实施例2)。
将这六种接种的混合物在37℃下如实施例1中描述的那样孵育。
将瓶冷却并在20℃下储存。接着，对瓶进行手动“破坏”。
向125mL壶中的包装手动进行，并用来自
的DNV-100-25 PPV-
热封口机加热密封进行封闭。整个测试期间将产品储存在10℃的冷库中。
在发酵期间测量pH并在10℃下储存乳制品期间测量生物量的变化(作为天数的函数的cfu/mL)。
结果如图6至9所示。
动物乳酸双歧杆菌的菌株BB12提供的结果完全与菌株I-2494给出的结果相当。
在图6和7(作为以小时的时间函数的pH变化)，观察到了半胱氨酸的存在引起了Vmax与参考混合物相比的不同。因此，半胱氨酸对动物乳酸双歧杆菌的酸化动力学的影响是明显的。
还观察到，G4I混合物(整合入动物乳酸双歧杆菌颗粒的L-半胱氨酸碱)提供的结果完全与G4混合物(不同于动物乳酸双歧杆菌颗粒的L-半胱氨酸碱颗粒)的结果相当。因此生长因子的整合十分成功。
以下的表2和3显示图6和7中给出的若干酸化动力学参数值。
表2(图6的BB12酸化动力学)
| 工业酵素含有 | Ta | Vmax | pHm | Tmax | pH0 | TpH5.5 | TpH5 |
| BB12 T | 105 | -0.0069 | 5.97 | 196 | 6.43 | 277 | 417 |
| BB12 G4 | 100 | -0.0094 | 5.88 | 216 | 6.54 | 289 | 425 |
| BB12 G4I | 102 | -0.0096 | 5.88 | 218 | 6.55 | 288 | 423 |
表3(图7的I-2494酸化动力学)
| 工业酵素含有 | Ta | Vmax | pHm | Tmax | pH0 | TpH5.5 | TpH5 |
| I-2494 T | 97 | -0.0060 | 6.13 | 185 | 6.52 | 309 | 489 |
| I-2494 G4 | 95 | -0.0095 | 5.87 | 218 | 6.53 | 290 | 418 |
| I-2494 G4I | 98 | -0.0092 | 5.88 | 219 | 6.54 | 289 | 419 |
Ta 潜伏期(min)；
Vmax 最大速率(pH单位/min)；
pHm 最大酸化率处的pH；
Tmax 达到Vmax的时间(min)；
pH0 发酵开始时的pH；
TpH5.5 pH达到5.5的时间(min)；
TpH5 pH达到5的时间(min)。
图8和9显示在10℃下储存发酵乳制品期间(除动物乳酸双歧杆菌以外嗜热链球菌-保加利亚乳杆菌共生)，图8中益生菌酵素动物乳酸双歧杆菌BB12和图9中动物乳酸双歧杆菌益生菌I-2494的细胞种群的变化。
这些细胞种群图证实了用图6和7给出的酸化动力学观察到的结果。
L-半胱氨酸的存在明显地刺激了益生菌的细胞种群并且L-半胱氨酸碱的整合对于两种动物乳酸双歧杆菌菌株中的每一种都十分成功。
因此，与“结合”G4系统(动物乳酸双歧杆菌益生菌酵素颗粒+不同的L-半胱氨酸碱颗粒)相比，L-半胱氨酸碱的“整合”G4I颗粒也有效：它们能够引起至少质量同样优良的共生乳酸发酵(嗜热链球菌+保加利亚乳杆菌)并且能够产生动物乳酸双歧杆菌益生菌酵素的细胞种群，所述种群在规模上完全相当而且在发酵乳储存期间维持同样长的时间。
因此，选择L-半胱氨酸碱能够引起动物乳酸双歧杆菌的特异性生长激活剂的成功整合。
含有动物乳酸双歧杆菌益生菌酵素和L-半胱氨酸碱的“整合”G4I颗粒和“结合”G4颗粒(不同于益生菌颗粒的L-半胱氨酸碱颗粒)比无半胱氨酸的参考系统(T颗粒)有效得多：它们引起益生菌的共生乳酸发酵(嗜热链球菌+保加利亚乳杆菌)，其量至少相当，但是产生高得多而且在发酵乳储存期间维持长得多的时间的动物乳酸双歧杆菌酵素的细胞种群。
Claims (20)
1.接种体，其特别适合向乳制品底物中直接接种至少一种动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis ssp.lactis)的菌株，以将所述乳制品底物转化成适于人类消费的发酵乳制品，其特征在于，所述接种体包含混合物或成套形式的：
-不通过肽键与其它氨基酸相连的半胱氨酸；和
-至少一种动物乳酸双歧杆菌(B.animalis lactis)的菌株；
所述半胱氨酸和所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株分别包含在一种或多种冷冻颗粒和/或一种或多种冻干粉中或者为一种或多种冷冻颗粒和/或一种或多种冻干粉的形式；
所述半胱氨酸是L-半胱氨酸碱，其简化形式的通式为HSCH2CH(NH2)CO2H，使得在：
-使所述一种或多种颗粒解冻；和/或
-使所述一种或多种冻干粉以1至2克一种或多种冻干粉每8至10mL H2O的比例再溶解；
之后所得溶液的pH至少为4；
所述半胱氨酸在所述接种体中的量为：
-每1×1014cfu所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株1克；
-至每3.5×1010cfu所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株1克。
2.根据权利要求1所述的接种体，其特征在于，所述半胱氨酸是在溶液中时pH大于4的L-半胱氨酸碱。
3.根据权利要求1所述的接种体，其特征在于，它不包含盐酸半胱氨酸。
4.根据权利要求1所述的接种体，其特征在于，它包含至少一种冷冻颗粒和/或冻干粉，所述冷冻颗粒和/或冻干粉同时包含：
-全部或部分所述半胱氨酸；和
-所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株的细胞。
5.根据权利要求1所述的接种体，其特征在于，它包含：
-至少两种冷冻颗粒；或
-至少两种不同的冻干粉；或
-至少一种冷冻颗粒和至少一种冻干粉；
其特征在于，对于这些物理实体对中的每一对：
-两种所述物理实体中的一种含有全部或部分所述半胱氨酸而不含有动物乳酸双歧杆菌的细胞；以及
-两种所述物理实体中的另一种含有动物乳酸双歧杆菌的细胞而不含有所述半胱氨酸。
6.根据权利要求1所述的接种体，其特征在于，所述半胱氨酸在所述接种体中的量为：
-每0.2×1014cfu所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株1克；
-至每10×1010cfu所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株1克。
7.根据权利要求1所述的接种体，其特征在于，所述半胱氨酸在所述接种体中的量为：
-每十亿cfu所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株0.05毫克；
-每十亿cfu所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株10毫克。
8.根据权利要求1所述的接种体，其特征在于，干物质含量为16％至17％的1克所述颗粒包含5×109至5×1011cfu所述至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株。
9.根据权利要求1所述的接种体，其特征在于，干物质含量为16％至17％的1克所述颗粒包含4.90mg至144mg所述半胱氨酸。
10.根据权利要求1所述的接种体，其特征在于，它含有不超过0.5％(w/w)的酵母、酵母提取物或酵母自溶产物。
11.根据权利要求1所述的接种体，其特征在于，所述动物乳酸双歧杆菌的菌株是菌株I-2494。
12.根据权利要求1所述的接种体，其特征在于，它还包含除动物乳酸双歧杆菌以外的至少一种乳酸菌的菌株。
13.根据权利要求12所述的接种体，其特征在于，所述除动物乳酸双歧杆菌以外的至少一种乳酸菌的菌株存在于如下物理结构中：其不同于含有动物乳酸双歧杆菌细胞的物理结构。
14.根据权利要求12所述的接种体，其特征在于，所述除动物乳酸双歧杆菌以外的至少一种其它乳酸菌的菌株包含至少一种嗜热链球菌(S.thermophilus)的菌株和至少一种保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)的菌株。
15.冷冻颗粒，其能够是权利要求1至14中任一权利要求所述的接种体，其特征在于，它包含至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株和不通过肽键与其它氨基酸相连的L-半胱氨酸，所述L-半胱氨酸是如下形式的半胱氨酸：其使得在使所述一种或多种颗粒解冻后所得溶液的pH至少为4。
16.冻干粉，其能够是权利要求1至14中任一权利要求所述的接种体，其特征在于，它包含至少一种动物乳酸双歧杆菌的菌株和不通过肽键与其它氨基酸相连的L-半胱氨酸，所述L-半胱氨酸的形式使得在使所述一种或多种冻干粉以1至2克一种或多种冻干粉每8至10mLH2O的比例再溶解后所得溶液的pH至少为4。
17.在乳制品底物上刺激动物乳酸双歧杆菌生长和/或代谢的方法，其包括：
-用权利要求1至14中任一权利要求所述的至少一种接种体，和/或用权利要求15所述的至少一种颗粒，和/或用权利要求16所述的至少一种冻干粉接种乳制品底物；以及
-将所述接种的底物保持在有利于动物乳酸双歧杆菌代谢的温度和大气中。
18.生产具有高益生菌价值的发酵乳制品的方法，其包括：
-用权利要求1至14中任一权利要求所述的至少一种接种体，和/或用权利要求15所述的至少一种颗粒，和/或用权利要求16所述的至少一种冻干粉接种乳制品底物；以及
-用所述至少一种接种体和/或所述至少一种颗粒和/或所述至少一种冻干粉使所述底物发酵。
19.根据权利要求18所述的方法，其包括：
-用权利要求1至14中任一权利要求所述的至少一种接种体，和/或用权利要求15所述的至少一种颗粒，和/或用权利要求16所述的至少一种冻干粉接种乳制品底物；以及
-用至少一种嗜热链球菌的菌株和至少一种保加利亚乳杆菌的菌株接种所述乳制品底物；以及
-用所述至少一种接种体和/或所述至少一种颗粒和/或所述至少一种冻干粉和所述嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的菌株使所述底物发酵。
20.根据权利要求17至19中任一权利要求所述的方法，其特征在于，向所述乳制品底物添加的所述接种体的量为以每升乳制品底物7至11mg所述L-半胱氨酸碱、每升乳制品底物109至1011cfu动物乳酸双歧杆菌细胞的量添加所述L-半胱氨酸碱和动物乳酸双歧杆菌的细胞。
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