CN117016618A - 一种植物乳杆菌l3协同市售发酵剂的发酵乳、制备及质量评价 - Google Patents

一种植物乳杆菌l3协同市售发酵剂的发酵乳、制备及质量评价 Download PDF

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Abstract

本发明要解决添加植物乳杆菌L3改善发酵乳品质，抑制发酵乳腐败变质的问题。本发明以植物乳杆菌L3作为协同发酵剂，与市售发酵剂1：1进行复配，市售发酵剂单独发酵和植物乳杆菌L3单独发酵作为对照组，以全脂纯牛奶为主要原料，以白砂糖为辅料，通过混合、均质、发酵制得发酵乳。本发明制备的发酵乳组织状态细腻，无乳清析出现象，在发酵乳持水力、质构、感官评价和风味分析等品质评价中，植物乳杆菌L3协同发酵组表现优异，说明植物乳杆菌L3可作为发酵剂协同发酵，进而改善发酵乳的品质和延缓发酵乳货架期。本发明应用于发酵乳领域。

Description

一种植物乳杆菌L3协同市售发酵剂的发酵乳、制备及质量评价
技术领域
本发明涉及食品领域，具体涉及植物乳杆菌L3协同发酵制备发酵乳的方法。
背景技术
发酵乳是原料乳(生牛、羊等的乳或者乳粉)经杀菌和添加特定乳酸菌，将乳糖转化为乳酸而形成有益健康的乳制品。发酵乳因其风味独特，且营养丰富，富含多肽、B族维生素与以钙元素为主的多种矿物质，具有调节肠道菌群，促进蛋白质和脂肪的消化吸收，降低胆固醇以及减少乳糖不耐症等性能而深受喜爱。
传统发酵乳通常以保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌作为发酵剂，尽管一些保加利亚乳杆菌具有耐受消化道极端环境的能力，但保加利亚乳杆菌不具有宿主同源性，因此，发酵乳在生产中经常会添加一些常用的益生菌。益生菌与发酵剂联合发酵能在保持发酵乳良好风味的基础上提高其功能性，不仅能提高发酵乳质地，改善风味，同时发酵乳具有多种保健功能。发酵乳因有益人体健康成为益生菌的重要载体，如今市场上益生菌发酵乳制品(包含益生菌的发酵乳、酸乳酪以及益生菌复合口服液、咀嚼片、胶囊、粉末剂等)种类繁多。
益生菌是一类能够促进宿主肠内微生物菌群的生态平衡，对宿主健康或生理功能产生有益作用的活性微生物。人体通过摄入足够量的益生菌，能改善肠道菌群结构、促进肠道中有益菌增殖、抑制有害菌生长、增强机体免疫力，从而有利于抵御各种疾病发生。应用在食品中的益生菌必须耐受胃肠道的环境，特别是胃酸和胆汁刺激。20世纪60年代后，以双歧杆菌(Bifidobacterium)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)与发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)为代表的益生菌逐渐受到消费者的关注，它们能够改善宿主肠道微生态菌群平衡，使得发酵乳风靡全世界。
嗜热链球菌最早是从自然发酵的酸牛乳、冰淇淋、干酪等乳制品中分离得到的，是目前酸奶发酵剂的主要菌株，菌落形态为圆形或者椭圆形，为兼性厌氧的革兰氏阳性菌，其最佳生长温度为37-42℃。其发酵特点是生长繁殖迅速、产酸能力强，可以缩短发酵乳凝乳时间，代谢产生的各种芳香物质增加发酵乳的香气，产胞外多糖，可以水解蛋白质和脂肪利于营养物质的吸收等。在发酵初期，嗜热链球菌在β-半乳糖苷酶作用下可将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖，并后续转化为乳酸。嗜热链球菌可以生长代谢产生胞外多糖，该胞外多糖主要为D-葡萄糖、D-半乳糖和L-鼠李糖组成，可以使发酵乳粘度升高，改善发酵乳质地、降低乳清析出。嗜热链球菌产生的香气成分主要为乳酸和多羰基复合物，在发酵乳中产生的特征风味物质有乙醛、双乙酰、乙酸、甲酸、丁酸等。
保加利亚乳杆菌是德氏乳杆菌保加利亚亚种的简称，常被应用在发酵乳制品的发酵剂，菌株形态为杆状，菌落为无色或者淡白色，兼性厌氧的革兰氏阳性菌，最适生长温度为 40-44℃，具有很强的耐酸性和产酸能力，通过同型乳酸发酵将乳糖转化为乳酸，可将蛋白质降解为肽和氨基酸，其最适生长pH值为5.5-6.2。保加利亚乳杆菌能调节肠道菌群平衡、抗癌、免疫调节、抑制肠道中致病菌等益生性。保加利亚乳杆菌是发酵乳后期发酵的优势菌群，是导致后酸化的主要菌种。
植物乳杆菌是可以产多种益生物质的乳酸菌，广泛应用在食品发酵中。比较基因组学分析发现，植物乳杆菌在自然界中广泛分布于哺乳动物肠道、唾液、母乳和发酵制品(泡菜、豆腐、传统发酵乳制品)中。植物乳杆菌可通过代谢产生多种产物，如有机酸，细菌素，过氧化氢，双乙酰，抗菌肽等，因其代谢物可抑制病原菌生长，增加有益菌的定殖，从而调节肠道菌群，预防一些肠道疾病，分泌的胆盐水解酶，可以降低血清胆固醇，半乳糖苷酶可以缓解乳糖不耐症，以及通过分泌胞外多糖来发挥免疫调节、抗氧化、抗肿瘤等作用，从而起到益生作用。
如今，植物乳杆菌也经常被应用在发酵食品中，如发酵乳、泡菜、干酪、发酵肉类等食品中，添加植物乳杆菌可以提高食品的风味，改善食品品质、延长食品的保质期。因此，具有功能性的植物乳杆菌在食品开发被越来越多的人所关注。
益生菌在提高发酵乳功能性附加值方面意义重大，并且兼顾了安全无副作用已被广泛地应用到食品发酵、工业乳酸发酵与医疗保健领域等的实际生产中。它作为重要的功能性食品发酵剂，不仅能改善食品的风味物质和营养特性，还能产生抗菌肽物质，延长产品的保质期。
徐渊美将L.plantarum KX041应用于脱脂乳及豆乳发酵中，结果表明：其在脱脂乳中单独发酵性能较差，可以作为附属发酵剂与商业菌共同发酵发酵乳，对发酵乳的质构、酸度、风味无任何不良影响，且后酸化能力弱，在21天的冷藏期间，能够保持有效活菌浓度。许女等从开菲尔中分离出具有降胆固醇与调节肠道微生物环境的L.plantarum MA2，对其在牛乳中的发酵特性及风味进行研究，结果表明，4℃贮藏期间，添加了L.plantarum MA2的益生菌发酵乳的后酸化水平与乳清析出率明显低于普通发酵乳，但粘度却高于普通发酵乳，且口感绵滑、风味浓郁，发酵乳中过量的乙酸会产生刺激性气味，影响发酵乳品质，L.plantarum MA2发酵乳中乙酸含量明显低于普通发酵乳，而表征发酵乳风味的关键性物质乙醛的含量明显高于普通发酵乳，益生菌协同发酵促进了典型风味化合物的合成。Saarela等人研究表明益生菌在发酵乳制品中的应用能够改善发酵乳的感官品质，益生菌协助发酵乳的研究已成为市场趋势。
本发明用到的菌株植物乳杆菌L3(植物乳杆菌L3)是本课题组从酸菜中分离所得，该菌株对真菌和铜绿假单胞杆菌等致病菌具有一定的抑菌效果，经生理生化鉴定、序列分析确定该菌株为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌L3，进一步研究发现，该菌株可分泌一种蛋白，初步确定其为一种抗菌蛋白，基于该菌株的上述特性，本发明设想是利用该菌株发酵鲜奶生产发酵乳，并比较其与市售发酵剂的发酵效果。
发明内容
本实验采用课题组分离纯化出的植物乳杆菌L3作为协同发酵剂，将其与市售发酵剂联合发酵鲜奶，分别以植物乳杆菌L3单独发酵和市售发酵剂单独发酵鲜奶作为对照，评价植物乳杆菌单独应用或者与市售发酵剂联合对发酵乳品质(包括发酵乳的各项理化指标、微生物代谢情况、风味物质变化和发酵乳的功能性等)的影响。其研究意义在于：丰富发酵乳发酵剂的菌株，充分利用不同菌株之间可能存在的协同作用增进发酵乳产品的营养、感官或者贮藏品质；充分挖掘该菌株在发酵乳中的应用潜力，丰富该菌株的应用范围。
基于上述目的，本发明将植物乳杆菌L3与市售发酵剂协同发酵制备发酵乳，设置对照组1(植物乳杆菌L3发酵乳组)、对照组2(市售发酵剂发酵乳组)，通过测定各组发酵乳成品的持水力、质构、营养物质含量、感官评价、多糖含量、风味来验证植物乳杆菌L3对改善发酵乳品质和延缓货架期的作用。
附图说明
图1植物乳杆菌L3冻干粉的照片；
图2为各组发酵乳发酵终点图；
图3为各组发酵乳持水力图；
图4为各组发酵乳发酵成品图；
图5为各组发酵乳感官得分图；
图6为各组发酵乳电子鼻PCA图；
图7为各组发酵乳电子鼻检测雷达图；
图8为各组发酵乳基础成分含量图；
图9为各组发酵乳发酵前后多糖含量图；
图10为各组发酵乳贮藏期间活菌数变化图；
图11为各组发酵乳室温开盖贮藏14天发酵乳霉变情况情况图；
图12为各组发酵乳回接霉变发酵乳贮藏14天霉变情况图。
附表说明
表1植物乳杆菌L3冻干前后活菌数lg(cfu/g)；
表2各组发酵乳质构特性。
具体实施方式
本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明目的。
实施例
本实施例的植物乳杆菌L3协同发酵制备发酵乳的制备方法，它按以下步骤实现：
一、将冷冻保藏的植物乳杆菌L3活化，在超净台中将其无菌接种在灭菌MRS液体培养基中培养，在37℃恒温培养箱中培养24h。重复上述步骤3次，使植物乳杆菌充分活化；
二、将活化好的植物乳杆菌L3菌液分别在40mL和800mL的MRS液体培养基中进行两次扩培；
三、将充分活化扩培后的菌液离心，将离心后菌泥与生理盐水配制成菌悬液；，进行裸菌模拟胃肠道实验；
四、将充分活化扩培后的菌液离心，将离心所得菌泥配制成菌浓缩液，将菌浓缩液与冻干保护剂按4:1(w/v)的比例混合，放入-20℃冰箱预冻2h，冷冻干燥，即可制成冻干菌粉；五、将冻干菌粉进行菌落计数，发酵剂分组；
六、将全脂灭菌纯牛奶、白砂糖混合、灭菌、均质，添加发酵剂进行发酵制得发酵乳，分别以植物乳杆菌L3单独发酵和市售发酵剂单独发酵鲜奶作为对照；
七、在42℃下发酵，发酵完成后将发酵乳置于4℃的冰箱内后熟并贮藏。
步骤一中活化的植物乳杆菌L3的具体操作是：将-20℃甘油保存的植物乳杆菌L3菌种融化后，接种至5mL液体MRS培养基中，于37℃恒温培养箱培养24h后，再将复苏后的该菌种划线于MRS固体培养基中进行菌种纯化。纯化后菌种接种于MRS液体培养基中 37℃，培养24h，重复以上操作两次，使得菌种充分活化。
本实施例中MRS液体培养基的配制方式为：48.3g MRS培养基粉末，加1L蒸馏水，于锥形瓶中溶解，再121℃高压蒸汽灭菌20min。
本实施例中冻干保护剂的配制方式为：冻干保护剂的配制：准确称取10.43g脱脂乳粉、0.23g硫酸锰、8.91g蔗糖，用100mL蒸馏水溶解备用。
本实施例中将菌浓缩液与冻干保护剂按4:1(w/v)的比例混合，放入-20℃冰箱预冻 2h，冷冻干燥，即可制成冻干菌粉。
本实施方式制备的三组发酵乳外观颜色均呈乳白色，组织均匀，口感细腻，无乳清析出。
一、植物乳杆菌L3冻干菌粉制备及其活菌计数
菌浓缩液制备，将充分活化扩培后的菌液离心，将离心所得菌泥与生理盐水按比例1:5(w/v) 配制成菌浓缩液。将菌浓缩液与冻干保护剂按4:1(w/v)的比例混合，放入-20℃冰箱预冻 2h，冷冻干燥，即可制成冻干菌粉。冻干后菌粉如图1所示，植物乳杆菌L3冻干之后的菌粉组织状态呈松散、粉状；颜色为浅黄色。通过涂板计数可得冻干前后活菌数如表1所示，冻干前活菌数为14.71±0.02lg cfu/g，冻干后的活菌数为12.82±0.13lg cfu/g，冻干后存活率为87.15％，结果表明冻干后植物乳杆菌L3菌株仍具有较高的活菌量。
二、对本实施例的各组发酵乳发酵终点的确定
根据国标要求，发酵乳酸度需达到70°T以上，所以本实验发酵乳发酵终点以酸度达到 70°T为标准。
酸度测定：每2h取一次样，每次称取10g发酵乳样品，记录质量M，用20.00mL 蒸馏水将样品进行稀释，滴加酚酞作为指示剂摇匀，用0.1mol/L的标准NaOH溶液进行滴定，滴至溶液变为微红色，且30s内不变色，记录消耗的标准NaOH溶液体积V，计算样品酸度。试样中的酸度数值用下面公式进行计算，以吉尔涅尔度(°T)表示，记为X。每组样品取三个平行样进行测定。
式中X——试样的酸度，单位为度(°T)；
C——氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度(mol/L)；
V——滴定时所消耗氢氧化钠标准溶液的体积(mL)；
M——试样的质量(g)；
0.1——氢氧化钠的摩尔浓度(mol/L)
根据图2可知，实验组(植物乳杆菌L3+市售发酵剂)和阴性对照(市售发酵剂)组在4h 同时达到发酵终点，酸度分别为71.33±1.60a°T和73.17±1.26a°T，实验组酸度比阴性对照组低了1.84°T。阳性对照组(植物乳杆菌L3单独发酵)在9h才能达到发酵终点，酸度达70.33±2.02a°T。以上结果表明植物乳杆菌L3在协同市售发酵剂发酵牛乳中并不会延缓其发酵时间，两组发酵剂都在4h达到发酵终点，且4h时的酸度并没有显著性差异(p ＜0.05)；植物乳杆菌L3作为发酵剂单独发酵时发酵终点比其他两组都晚，这可能与植物乳杆菌L3最适生长温度为37℃，但发酵乳发酵温度在42℃，发酵温度较高影响了植物乳杆菌L3的生长，使得其在42℃发酵时产酸较其他两组慢，还可能是原料乳中游离氨基酸含量低，不能满足植物乳杆菌L3的需求，或者是植物乳杆菌L3系统不完善，缺乏细胞壁蛋白酶，从而影响了植物乳杆菌L3对牛乳中酪蛋白的利用从而导致凝乳时间较其他两组慢。
三、对各组发酵乳持水力比较
发酵乳持水力是评价发酵乳品质的重要指标，在发酵乳发酵过程中酪蛋白分子聚集形成网状结构，这些网状结构可以容纳水分等小分子物质，使得发酵乳持水能力增强，从而让发酵乳拥有更好的品质，若发酵乳结构疏松、空隙过大则会导致发酵乳持水力下降，引起乳清析出，导致发酵乳品质变差。
持水力测定：取10g的不同组别的发酵乳样品(W1)，于4℃下以955×g离心10min,弃掉上清液，记录此时的发酵乳质量(W2)，每组样品取三个平行样进行测定。持水力(WHC)按照以下公式计算：
各组发酵乳持水力如由图3所示，植物乳杆菌L3协同发酵组持水力为78.09±0.84％；市售发酵剂组持水力为75.16±1.04％；L3单独发酵组持水力为79.55±1.72％，植物乳杆菌L3协同发酵组与L3单独发酵组持水力没有显著性差异，均高于市售发酵剂组且与其都有显著性差异(p＜0.05)。有研究表明益生菌产胞外多糖可提高发酵乳的持水力，因此本实验中添加植物乳杆菌L3参与发酵可提高发酵乳的持水力，这可能与植物乳杆菌L3可以产胞外多糖有关。
四、对各组发酵乳质构特性的比较
发酵乳的质构是发酵乳品质评价的一个重要指标，本实验利用TA-XT EXPRESS物性测试仪测定发酵乳的硬度、胶粘性、弹性、内聚性和回复性等质构性能。具体参数如下：探头选用P/36R；设定测试距离为15.0mm；测定前、测定时和测定后探头速度分别为5.0、2.5、2.0mm/s；测定时间为5.00s，感应力为5.0g。每组样品取三个平行样进行测定。
由表2可知，植物乳杆菌L3协同发酵组和植物乳杆菌L3单独发酵组发酵乳的硬度、胶粘性、回复性均高于市售发酵剂组，说明添加植物乳杆菌L3作为发酵剂可以提高发酵乳的硬度、胶粘性和回复性，且均与市售发酵剂组的质构特性具有显著差异性(p＜0.05)。这可能与植物乳杆菌L3可以产生胞外多糖有关，胞外多糖可以与蛋白质相互作用形成稳定的三维网状结构，使得发酵乳质构性能更加稳定。以上结果表明，添加植物乳杆菌L3作为协同发酵剂可以明显改善发酵乳的质构性能，使发酵乳拥有更好的品质。
五、对各组发酵乳感官评价的比较
参照发酵乳卫生标准《GB 19302-2010》，利用模糊数学法进行感官评定。选取10名同学组成感官评价小组，在评价之前，对评定组成员进行评价标准培训，使评定员能客观地进行评价，增强评价一致性，采用10分打分法进行评价。以发酵乳的气味、组织状态、色泽等为评定指标：因素集U(组织，色泽，口感，风味)；评语集V(好，较好，一般，差)；权重集X。10名感官评定员根据发酵乳感官评定标准，对制得的9组样品(实验组和对照组，每组三个平行)的4个感官特性指标进行感官评价。根据感官评定表得出模糊矩阵R，模糊关系综合评定集Y＝X×R；根据Y来评定大家各组发酵乳喜好度。每组样品取三个平行样进行测定。
各组发酵乳成品如图4所示，植物乳杆菌L3协同发酵组和单独发酵组与市售发酵剂组发酵乳外观并无明显差异，外观均色泽光亮、为乳白色，较少或者无明显乳清析出。这表明植物乳杆菌L3作为发酵剂并不会对发酵乳感官造成不利影响。
感官得分如图5所示，从结果可知三组发酵乳得分均在6.5分以上，植物乳杆菌L3协同发酵组和市售发酵组得分均在7分以上两者并无显著性差异，比植物乳杆菌L3单独发酵组的的得分高并具有显著性差异(p＜0.05)。
六、对各组发酵乳风味物质的比较
为了探究不同发酵剂菌株对发酵乳挥发性风味物质的影响，对三组发酵乳进行了电子鼻检测，其电子鼻的主成分分析图和雷达图如图6和7所示，其中主成分1的贡献率为74.7％，主成分2的贡献率为16.3％，二者贡献率相加为91％，说明说明主成分1和2已经包含了样品的基本信息量，可以反映样品的整体信息。由图可以看出，三组发酵乳各自平行样间风味差异不大，但不同组间风味具有差异，植物乳杆菌L3协同发酵组和植物乳杆菌L3单独发酵组部分发酵乳间风味具有相似性。从雷达图中我们可以看出三组发酵乳气味在W1C(芳香成分，苯类)、W3C(芳香成分、氨类灵敏)、W5C(短链烷烃芳香成分灵敏)、W1W(对硫化物灵敏)上差异不大；植物乳杆菌L3协同发酵的发酵乳在W2W(芳香成分，对有机硫化物灵敏) 相较其他两组发酵乳更突出；植物乳杆菌L3单独发酵的发酵乳在W1S(对甲基类灵敏)和 W2S(对醇，醛酮灵敏)上相较其他两组发酵乳更突出。以上结果说明添加了植物乳杆菌 L3的发酵乳增多了甲基类、醇类、醛酮类等气味成分，改善了发酵乳的风味。出现以上结果可能与改变了发酵剂的菌株，使得菌株共生关系发生改变，从而导致代谢产物(挥发性风味物质)的种类和含量发生变化。
七、对各组发酵乳基本营养成分的测定：
由图8可知，脂肪含量分别为2.22±0.14g/100g、2.27±0.25g/100g、2.28±0.17g/100g均复合国标要求。三组发酵乳灰分含量分别为5.15±0.25g/100g、5.13±0.36g/100g、5.11±0.31 g/100g；固形物含量分别为17.86±0.13g/100g、18.12±0.26g/100g、18.08±0.22g/100g。三组发酵乳不同指标进行显著性分析发现各组发酵乳不同指标间均无显著性差异(p＜0.05)。
【蛋白质】根据国标GB5009.3，利用凯氏定氮法进行检测，测得植物乳杆菌L3协同发酵组、市售发酵剂组、植物乳杆菌L3单独发酵组三组发酵乳蛋白质分别为3.34±0.20 g/100g、3.14±0.18g/100g、3.12±0.11g/100g，符合发酵乳国家标准的要求。
【脂肪】根据国标GB5009.6，利用索氏抽提法进行检测，测得三组发酵乳脂肪含量分别为2.59±0.19g/100g、2.67±0.25g/100g、2.75±0.21g/100g。符合风味发酵乳国家标准的要求。
【灰分】根据国标GB5009.4，灼烧后直接称重，计算可得三组发酵乳灰分分别为5.15±0.25g/100g、5.13±0.36g/100g、5.11±0.31g/100g。
固形物含量：取恒重后的蒸发皿，重量记为m0；发酵乳样品置于蒸发皿内，精确称其质量，记为m1,将样品烘干至恒质量记为m2；每组样品取三个平行样进行测定。总固形物含量按照以下公式计算：
计算得三组发酵乳固形物含量分别为17.86±0.13g/100g、18.12±0.26g/100g、18.08±0.22 g/100g。
八、对各组发酵乳发酵前后多糖含量的测定：
微生物胞外多糖(EPS)具有安全无毒、易降解、不易产生二次污染的等特性。因此，EPS 常被作为增稠剂和稳定剂用来提高食品的质量和贮藏期品质此，研究表明EPS可赋予发酵乳特殊的质构和风味，EPS还具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、降胆固醇和免疫调节等益生作用。多糖含量依据苯酚-硫酸法测得，三组发酵乳多糖含量如图9所示，三组发酵乳多糖含量分别为425.15±12.30μg/mL、369.87±7.76μg/mL、442.23±11.18μg/mL；发酵后多糖含量为718.60±16.02μg/mL、429.20±11.69μg/mL、746.99±5.59μg/mL；发酵前后三组发酵乳多糖含量分别升高了293.45±8.55μg/mL、59.33±7.75μg/mL、3304.79±8.25μg/mL可以明显看出植物乳杆菌L3单独发酵的发酵乳多糖含量最高，其次是植物乳杆菌L3协同发酵组，市售发酵剂组相对最低，这与于三组发酵乳持水力、质构结果相一致，都表明了添加植物乳杆菌L3可以改善发酵乳的品质且与植物乳杆菌L3产胞外多糖有关。
九、各组发酵乳发酵贮藏期间活菌数变化：
根据国标规定发酵乳活菌数应大于106cfu/g(mL)，依据图10，可以得出三组发酵乳在21天贮藏期内活菌数均高于国标要求，均在107cfu/mL以上，整体呈现出持续下降的趋势。在第 0天时，植物乳杆菌L3协同发酵组活菌数菌较高于其他两组；在7天后植物乳杆菌L3协同发酵组活菌数较低于市售发酵剂组但高于植物乳杆菌L3单独发酵组；在14天时植物乳杆菌 L3协同发酵组活菌数为7.55±0.11lg(cfu/mL)略低于市售发酵剂组活菌数为7.8±0.13lg (cfu/mL)，显著性分析时发现并没有显著差异性(p＜0.05)；在14天之后其活菌数下降速度明显低于市售发酵剂组，植物乳杆菌L3协同发酵组和市售发酵剂单组发酵组活菌数相差不大；在21天贮藏期内，植物乳杆菌L3单独发酵的发酵乳活菌数均较低于其他两组但仍在7 lg(cfu/mL)以上。
十、各组发酵乳发酵贮藏期间霉变情况变化：
图11是室温开盖贮藏14天发酵乳霉变情况，图12是回接霉变发酵乳贮藏14天霉变情况。
通过图11可看出三组发酵乳在室温开盖贮藏时，产生了不同程度的腐败变质。由照片可以看出第7天时只有市售发酵剂出现明显的腐败变质，发酵乳的表面长出了明显的青色和发黄的霉菌菌落，发酵乳的乳清析出较其他两组明显，该组发酵乳的品质明显变差；在第 14天的图片中可以看出三组发酵乳都产生了不同程度变质，市售发酵剂组腐败变质最为严重，三个平行样品均发生明显肉眼可见的腐败变质现象，植物乳杆菌L3协同发酵组的三个平行样品也出现了不同程度的腐败变质，但较市售发酵剂组明显腐败程度低，植物乳杆菌 L3单独发酵组三个平行样品均无明显的腐败变质现象，只有一个样品长处理肉眼可见的霉菌菌落。
由于室温开盖贮藏桑14天内三组发酵乳腐败变质情况不尽相同，为了排除偶然性，故将市售发酵剂中霉变最严重的发酵乳原液回接到新鲜牛乳中，通过不同发酵剂进行发酵、观察在14天内霉变情况来佐证植物乳杆菌L3确实对抑制发酵乳腐败变质的准确性，为了避免在贮藏期间发酵乳接入环境中其他腐败菌干扰实验结果，因此将回接霉变发酵乳发酵的样品进行封盖贮藏。由图12可看出三组不同发酵剂组的发酵乳在14天内的霉变情况，在第7 天时市售发酵剂组出现明显的霉菌菌落，其他两组并没有观察到明显的霉菌菌落，且市售发酵剂组出现的菌落于回接样品出现的菌落一样；在第14天的图片中可看存储三组发酵乳均出现了通回接样品一样的霉菌菌落，但是三组发酵乳霉变程度不同，可以观察到市售发酵剂组三个平行样的霉变情况都较其他两组严重，其次时植物乳杆菌L3协同发酵组，最后是植物乳杆菌L3单独发酵组，这也验证了植物乳杆菌L3确实有抑制发酵乳腐败变质的性能，且抑制效果明显。郑玮丽等研究发现植物乳杆菌和副干酪乳杆菌对发酵乳中分离出来的霉菌和酵母菌具有抑制作用，与本实验结果相似。
综合以上结果表明，添加植物乳杆菌L3作为协同发酵剂可以提高发酵乳得品质，抑制贮藏期霉变情况。
表1
表2

Claims (8)

1.植物乳杆菌L3协同发酵制备发酵乳的制备方法，其特征在于它按以下步骤实现：
一、将冷冻保藏的植物乳杆菌L3活化，在超净台中将其无菌接种在灭菌MRS液体培养基中培养，在37℃恒温培养箱中培养24 h。
重复上述步骤3次，使植物乳杆菌充分活化；
二、将活化好的植物乳杆菌L3菌液分别在40 mL和800 mL的MRS液体培养基中进行两次扩培；
三、将充分活化扩培后的菌液离心，将离心后菌泥与生理盐水配制成菌悬液；，进行植物乳杆菌L3裸菌模拟胃肠道实验；
四、将充分活化扩培后的菌液离心，将离心所得菌泥配制成菌浓缩液，将菌浓缩液与冻干保护剂按4:1（w/v）的比例混合，放入-20℃冰箱预冻2 h，冷冻干燥，即可制成冻干菌粉；
五、将冻干菌粉进行菌落计数，发酵剂分组；
六、将全脂灭菌纯牛奶、白砂糖混合、灭菌、均质，添加植物乳杆菌L3和发酵剂进行发酵制得发酵乳，分别以单独发酵和市售发酵剂单独发酵鲜奶作为对照；
七、在42℃下发酵，发酵完成后将发酵乳置于4℃的冰箱内后熟并贮藏。
2.根据专利要求1所述的植物乳杆菌L3协同发酵制备发酵乳的制备方法，其特征在于所用的植物乳杆菌L3是本课题组自主分离的菌株，该菌株具有广谱抑菌性能。
3.根据专利要求1所述的植物乳杆菌L3协同发酵制备发酵乳的制备方法，其特征在于所述的植物乳杆菌L3活化的方法为：将-20℃甘油保存的植物乳杆菌L3菌种融化后，接种至5mL液体MRS培养基中，于37℃恒温培养箱培养24 h后，再将复苏后的该菌种划线于37℃固体MRS培养基中进行菌种纯化。
纯化后菌种接种于MRS液体培养基中37℃，培养24 h，重复以上操作两次，使得菌种充分活化。
4.根据专利要求1所述的植物乳杆菌L3协同发酵制备发酵乳的制备方法，其特征在于将活化好得菌种进行扩培，从而保证所得菌泥足够后续实验所需得量，具体操作如下：取2 mL活化后得菌液接种于40 mL MRS液体培养基中，37℃恒温培养箱中培养24 h进行第一次扩培。
再将第一次扩培后的菌液40 mL全部倒入 800 mL MRS 液体培养基中37℃，24 h进行第二次扩培。
5.根据专利要求1所述的植物乳杆菌L3协同发酵制备发酵乳的制备方法，其特征在菌浓缩液制备，将充分活化扩培后的菌液离心，将离心所得菌泥与生理盐水按比例1:5（w/v）配制成菌浓缩液。
冻干保护剂的配制：准确称取10.43 g脱脂乳粉、0.23 g硫酸锰、8.91 g蔗糖，用100 mL蒸馏水溶解备用。
将菌浓缩液与冻干保护剂按4:1（w/v）的比例混合，放入-20℃冰箱预冻2 h，冷冻干燥，即可制成冻干菌粉。
6.根据专利要求1所述的植物乳杆菌L3协同发酵制备发酵乳的制备方法，其特征在于将冻干菌粉通过涂板计数法得到冻干菌粉的活菌数，将植物乳杆菌L3与市售发酵剂按活菌数1：1进行复配，以植物乳杆菌L3单独发酵和市售发酵剂单独发酵作对照。
7.根据专利要求1所述的植物乳杆菌L3协同发酵制备发酵乳的制备方法，其特征在将全脂灭菌纯牛奶、7%（m/v）的白砂糖混合均质，在85℃条件下灭菌15 min，再将其冷却至45℃左右后加入发酵剂发酵，分别以植物乳杆菌L3单独发酵和市售发酵剂单独发酵鲜奶作为对照。
8.根据专利要求1所述的植物乳杆菌L3协同发酵制备发酵乳的制备方法，其特征在，将42℃下发酵完成后的发酵乳，置于4℃的冰箱内后熟并贮藏，进而测定各项指标，从而评价发酵乳的品质。
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