PT1624761E

PT1624761E - Processo e inóculo para fermentação láctica acidificante

Info

Publication number: PT1624761E
Application number: PT04742686T
Authority: PT
Inventors: Laurent Marchal
Original assignee: Gervais Danone Sa
Priority date: 2003-05-19
Filing date: 2004-05-07
Publication date: 2007-02-28
Also published as: BRPI0410444A; ES2278329T3; DK1624761T3; MXPA05012399A; ATE347811T1; DE602004003695T2; WO2004103082A1; EP1624761B1; BRPI0410444B1; DE602004003695D1; EP1624761A1; RU2005139560A; FR2855182B1; RU2337558C2; FR2855182A1

Description

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DESCRIÇÃO "PROCESSO E INOCULO PARA FERMENTAÇÃO LÁCTICA ACIDIFICANTE" 0 presente pedido de patente refere-se ao domínio da indústria leiteira. Este é relativo a um novo processo de fermentação láctica acidificante, a uma nova composição de inoculo de fermentos lácteos, a meios para a sua preparação e às suas aplicações para a produção de produtos lácteos fermentados.

No domínio dos produtos lácteos, os gostos do consumidor são actualmente geralmente orientados para as texturas cremosas e com sabores doces. Isto leva as indústrias leiteiras a previligiar qualquer meio e todas as condições operatórias que permitam obter uma acidificação suave do substracto lácteo na altura da fermentação láctica, de maneira a obter um produto lácteo fermentado que apresente um pH, mas também uma textura e qualidades organolépticas de acordo com estes gostos.

Tipicamente, na altura da produção dos iogurtes por fermentação láctica por inoculação directa, os industriais leiteiros procuram obter um abrandamento da cinética de acidificação a partir de um pH compreendido entre 5 e 4,5, por exemplo, a partir de 4,6, de maneira a obter um patamar de acidificação que se estabilize num pH 2 ΡΕ1624761 entre 4,5 e 4, por exemplo, um pH a 1000 minutos de 4,25 (o pH a 1000 minutos representa o pH medido 1000 minutos após o inicio da fermentação). Este desejo de arranjar uma cinética de acidificação que seja suave é, por outro, lado colocado em equilíbrio com o facto de ser igualmente desejável atingir um pH de 5,5 tão rapidamente quanto possível, de maneira a limitar diversos riscos de contaminações. Com efeito, quanto mais rapidamente é atingido o pH de 5,5, menores são os riscos de desenvolvimento de contaminantes resistentes ao tratamento térmico, tais como os esporos e, nomeadamente, os esporos de Bacillus; além disso, as fermentações curtas limitam os incidentes fágicos. Para além disso, é também com certeza útil manter tempos de fermentação bastante curtos para que a produção industrial seja o mais rentável possível.

No campo da preparação de queijo fresco e de queijos do tipo petit-suisse, importa, após uma fase de acidificação rápida, obter um patamar de acidificação que se estabilize entre 4,6 e 4,3 de modo a permitir uma drenagem centrífuga óptima.

Os problemas técnicos com os quais os industriais leiteiros são actualmente confrontados podem, portanto, resumir-se a encontrar fermentos e condições operatórias que, na altura da fermentação láctica por inoculação directa num substracto lácteo, permitindo por um lado proceder a uma acidificação rápida e por outro lado estabilizar esta acidificação a pHs elevados (tipicamente 3 ΡΕ1624761 para alimentos lácteos do tipo iogurtes, leites fermentados, queijos frescos e queijos do tipo petit-suisse, deve geralmente ter a estabilização entre 4,8 e 4,2) .

Face a estes problemas que a priori parecem ser conflituosos, os industriais leiteiros optaram por uma solução de comprimisso que utiliza famílias de fermentos lácteos escolhidos pela sua baixa velocidade de crescimento e/ou metabolismo, de maneira a obter uma cinética suave de acidificação, seleccionando de entre estas famílias, aquelas que ainda se mantêm suficientemente rápidas para satisfazer as exigências sanitárias e económicas.

Esta selecção tornou-se, aliás, um trabalho a tempo inteiro, ao qual se consagram empresas especializadas. As preparações de fermentos destinados a inoculação directa ou semi-directa estão assim disponíveis, prontas a utilizar, comercialmente, e pode-se, por exemplo, comprar fermentos lácticos sob a forma de grânulos (tais como grânulos congelados), que são destinados a uma inoculação directa no substracto lácteo. Estas formulações de grânulos evitam ao industrial leiteiro a etapa delicada e longa da preparação do fermento assegurando a constância qualitativa requerida para a produção de produtos industriais para utilização alimentar. É preciso notar que a formulação dos fermentos em grânulos junta ainda uma fase de latência no arranque do processo de fermentação, o que por outro lado pode ser impeditivo para certas aplicações. 4 ΡΕ1624761

Em resposta a estas necessidades de meios e/ou condições operatórias que permitem conduzir a uma acidificação rápida mais suave na altura da fermentação láctica acidificante. 0 presente invento propôs meios que permitem controlar a cinética de acidificação na altura da fermentação láctica e que apresentam, para além disso, numerosas outras vantagens. Estas permitem nomeadamente conduzir uma acidificação que, sendo mais rápida, se estabiliza só a pHs elevados adequados ao fabrico de alimentos lácteos, melhorando a textura dos produtos fabricados, e sem prejudicar as qualidades organolépticas.

Os novos meios de acordo com o invento compreendem a utilização de uma levedura lisada, um contributo nutricional em pelo menos um fermento láctico com activi-dade acidificante. Esta levedura não é, portanto, capaz de se multiplicar significativamente num substrato lácteo e, por si só, não assegura nenhum metabolismo fermentário no substrato lácteo. Mas esta coopera coopera, portanto, de maneira sinérgica com o metabolismo fermentário do(s) fermento(s) láctico(s).

De acordo com o presente invento, a levedura lisada é inoculada directamente no substracto lácteo que deve ser fermentado ou que esteja em vias de o ser, sob uma forma que favoreça a disponibilidade dos diferentes elementos que a constituem ou que a contêm, e de maneira a que esta levedura pudesse estar na presença do(s) 5 ΡΕ1624761 fermento(s) láctico(s) em funcionamento. Preferencialmente, usa-se a levedura lisada antes de começar a fermentação láctica acidificante ou no inicio desta.

Os inventores constataram que, de maneira vantajosa, pode-se escolher eficazmente utilizar o(s) fermento (s) láctico(s) e a levedura lisada de maneira sequencial, ou de maneira simultânea: é suficiente que a levedura lisada seja colocada na presença do(s) fermento(s) láctico (s) na altura da sua actividade de fermentação láctica acidificante.

Em meio industrial, será frequentemente mais simples, e mais seguro, utilizar os dois tipos de ingrediente de maneira simultânea. De maneira vantajosa, os inventores demonstram que a levedura lisada pode ser utilizada em mistura com o(s) fermento(s).

Certos processos de fermentação que utilizam culturas de partida que compreendem um fermento láctico e uma levedura lisada são conhecidos da arte anterior (por exemplo, Chumchuere et al., Food Microbiology, 1999, 16, 129-137; GB 1085699A; EP 0 154 614A). Contudo as razões de levedura lisada em relação aos fermentos lácticos diferem dos presentemente descritos. Láctico(s). Esta composição de inoculo que compreende, em mistura, levedura lisada e fermento(s) láctico(s), é destinada a ser utilizada após pasteurização. Este modo de realização é mais particularmente adaptado às situações em que não se utiliza a levedura lisada a não ser com baixas doses. 6 ΡΕ1624761

Os inventores demonstraram que, de maneira vantajosa, a levedura lisada e o(s) fermento(s) láctico(s) podem, alternativamente, ser utilizados de maneira separada no tempo, por exemplo, utilizando antes a levedura lisada e, em seguida, o(s) fermento(s) láctico (s). A levedura lisada e o(s) fermento(s) láctico(s) formam então, em conjunto, uma composição sob a forma de colecção (composição sob a forma de "kit de partes"). Este modo permite, nomeadamente, utilizar a levedura antes da pasteurização o que, de um ponto de vista sanitário, é preferível quando se trabalha com fortes doses de levedura lisada. 0 novo inoculo de acordo com o invento é portanto especialmente adapatado à inoculação directa num substrato lácteo e à transformação deste substrato lácteo num alimento lácteo fermentado. Este compreende, seja em mistura, seja sob a forma de colecção ("kit de partes"): - pelo menos um microorganismo sob uma forma tal que seja capaz de exercer uma actividade de fermento num substrato lácteo, e - pelo menos uma levedura sob a forma lisada. o referido microorganismo possui a capacidade de fermento no referido inoculo, ou se houver vários, o conjunto dos microorganismos possui a capacidade do(s) fermento(s) contido(s) no referido inoculo sendo escolhi- 7 ΡΕ1624761 do(s) de entre as bactérias lácticas aptas a produzir um alimento lácteo fermentado por fermentação láctica acidificante de um substrato lácteo. Dá-se à expressão "capacidade de exercer uma actividade de fermento num substrato" o seu significado usual neste dominio, ou seja, uma capacidade de exercer no referido substrato uma actividade metabólica que conduz à transformação de um ou vários compostos deste substrato. 0 referido pelo menos um microorganismo com capacidade de fermento apresenta uma membrana celular substancialmente intacta.

Segundo um modo de realização preferencial do invento, que é mais particularmente destinado a baixas doses de levedura lisada, o (ou o conjunto dos) micro-organismo (s) possui a capacidade de fermento(s) e a pelo menos uma levedura lisada estão presentes em mistura no referido inoculo, com vantagem em mistura homogénea, tal como uma mistura de grânulos de levedura lisada e de grânulos de fermento(s) láctico(s) acidificante(s).

Segundo um outro modo de realização, que é mais particularmente destinado a fortes doses de levedura lisada, o(s) microorganismo(s) possui(em) a capacidade do(s) fermento(s) e a pelo menos uma levedura lisada estão presentes no referido inoculo sob a forma de uma colecção ("kit de partes"), tal como uma colecção sem mistura intima de levedura lisada, por exemplo, sob a forma de pó ou de liquido, e de fermento(s) láctico(s). ΡΕ1624761

Para o fim do presente invento, a referida levedura lisada está presente no referido inoculo em quantidades definidas e numa proporção definida em relação ao(s) fermento(s), de maneira a obter o efeito combinado da aceleração da cinética de acidificação e da obtenção de uma estabilização da acidificação num pH de patamar. É este efeito combinado de aceleração e de estabilização que permite fabricar alimentos lácteos fermentados do tipo iogurtes, leites fermentados, queijos e queijos do tipo petit-suisse de maneira mais rápida e portanto sanitari-amente mais seguros, melhorando as qualidades de textura, e tudo isso sem prejudicar as qualidades gustativas do alimento.

De acordo com o presente invento, para a produção de alimentos lácteos fermentados, tais como iogurtes, leites fermentados, queijos frescos e queijos do tipo petit-suisse, é imperativo utilizar a levedura lisada numa proporção, em relação ao(s) fermento(s) láctico(s), que está compreendida entre 1 g de levedura pura para 2.10 de bactérias lácticas e 1 g de levedura pura para 2.10 de bactérias lácticas, preferencialmente, entre 1 g de levedura pura para 1.1012 de bactérias lácticas e 1 g de levedura pura para 2.108 de bactérias lácticas.

No presente invento as massas da levedura lisada são entendidas como sendo em peso seco. A referida levedura lisada pode ter sido lisada 9 ΡΕ1624761 através de qualquer meio adequado de rotura das membranas que conduz a uma libertação dos elementos constituintes da levedura e, nomeadamente por lise mecânica, osmótica, quimica. As leveduras lisadas estão disponíveis no comércio (por exemplo, um extracto de levedura "sem sal liquido" com 50% de extracto seco é comercializado pela BioSpringer com o código 153). O novo inoculo de acordo com o invento é especialmente adaptado à inoculação directa num substrato lácteo e à transformação deste substrato lácteo em iogurte, leite fermentado, queijos frescos ou queijos do tipo petit- suisse.

De maneira surpreendente, o novo inoculo de acordo com o invento dá a esta fermentação láctica num substrato lácteo uma cinética de acidificação que é mais rápida que um inoculo testemunha sem levedura lisada, mas que é portanto sempre também branda no que respeita ao pH final.

Os inventores colocaram com efeito em evidência que a adição de levedura lisada directamente no substrato lácteo é capaz de estimular os fermentos lácticos acidificantes de tal maneira que a eficácia e a qualidade da fermentação láctica acidificante do substrato lácteo são melhorados, sem que seja ultrapassado um estado considerado como óptimo para os produtos lácteos fermentados destinados ao consumo humano e nomeadamente os iogurtes, leites 10 ΡΕ1624761 fermentados, queijos frescos e queijos do tipo petit-suisse. Os inventores demonstraram assim que se pode exercer entre a(s) levedura(s) lisada(s) e o(s) fermento(s) láctico(s) acidificante(s) uma estimulação tal que a cinética de acidificação da fermentação se encontre acelerada, sem que seja por isso perturbado o patamar final desta cinética de acidificação. Este resultado é igualmente mais inesperado que antes do presente invento, não sendo um especialista na matéria incitado a adicionar uma inoculação directa de um material do tipo levedura, ao sistema reaccional já complexo e delicado que é necessário à produção de alimentos lácteos fermentados destinados ao consumo humano. A utilização de levedura lisada de acordo com o invento premite assim resolver os problemas da obtenção de uma cinética de acidificação rápida mas portanto branda, o que até agora eram considerado como conflituoso. Graças ao emprego da levedura lisada de acordo com o invento, o tempo necessário para atingir o pH de 5,5 e a acidificação final desejada é muito diminuída. Ganhos de uma a várias horas puderam, por exemplo, ser obtidos com condições operatórias do tipo industrial na produção de iogurtes.

De maneira assinalável, esta cinética mais rápida apresenta um patamar final de acidificação não alterado em relação ao inoculo testemunha sem levedura (cf. exemplos a seguir e mais particularmente figuras 2 e 3) . A utilização de levedura lisada de acordo com o invento permite assim 11 ΡΕ1624761 estimular a cinética de acidificação da fermentação láctica, sem que o pH ao qual se inicia o patamar de fim de acificação e sem que o pH final desta acidificação (o pH a 1000 min pode servir de referência para este fim) sejam substancialmente diferentes dos que seriam na ausência da levedura lisada. No mínimo, o pH em fim de acidificação é de um valor tal que o produto de fermentação não perca a sua capacidade de ser utilizado como alimento lácteo fermentado. Neste caso, graças ao invento pode-se observar uma redução de 5 a 30%, mais geralmente de 10 a 20% dos tempos de fermentação industriais. A utilização de levedura lisada de acordo com o invento constitui portanto bem mais do que a justaposição de fermento(s) láctico (s) e de um qualquer activador de crescimento: esta constitui uma combinação de meios que permite não apenas estimular a cinética de acidificação mas sobretudo ajustar e controlar o efeito, o que é essencial à obtenção de produtos que possam ser considerados como produtos lácteos fermentados destinados ao consumo humano, o que conduz a uma solução inesperada para problemas técnicos que até agora eram considerados como conflituosos.

Por "produtos lácteos fermentados" entende-se, mais particularmente, os produtos lácteos fermentados prontos para consumo humano, ou seja, alimentos lácteos fermentados. No presente invento são mais particularmente visados os leites fermentados e os iogurtes. Os referidos alimentos leiteiros fermentados podem, alternativamente, ser queijos frescos ou queijos do tipo petit-suisse. 12 ΡΕ1624761 Dá-se aos termos "leites fermentados" e "iogurtes" os seus significados usuais no domínio da indústria leiteira, ou seja, produtos que são destinados ao consumo humano e que são o resultado da fermentação láctica acidi-ficante de um substrato leiteiro. Estes produtos podem conter ingredientes secundários, tais como frutos, vegetais, açúcar, etc..

Pode-se, por exemplo, referir o Decreto francês n° 88-1203 de 30 de Dezembro de 1988 relativo aos leites fermentados e iogurte ou ao iogurte, publicado no Jornal Oficial da República Francesa de 31 de Dezembro de 1988.

Pode-se igualmente referir o "Codex Alimentarus" preparado pela Comissão do Codex Alimentarus sob a égide da FAO e da OMS e publicado pela Divisão Informação da FAO, disponível em http://www.codexalimentarus.net ; cf. Mais particularmente o volume 12 do Codex Alimentarus "Normes Codex pour le lait et les produits laitiers" e a norma "CODEX STAN A-ll(a)-1975"). O termo "leite fermentado" é assim reservado no presente invento ao produto lácteo preparado com um substrato lácteo que sofreu um tratamento pelo menos equivalente à pasteurização, inoculado com microorganismos que pertencem à espécie ou às espécies características de cada produto. Um "leite fermentado" não sofreu qualquer tratamento permitindo subtrair um elemento constituinte do 13 ΡΕ1624761 substrato lácteo utilizado e, nomeadamente, não sofreu escorrimento do coágulo. A coagulação dos "leites fermentados" não deve ser obtida por outros meios que não os que resultam da actividade dos microorganismos utilizados. 0 termo "iogurte" é reservado ao leite fermentado obtido, de acordo com utilizações leais e constantes, pelo desenvolvimento de bactérias lácticas termófilas especificas designadas por Lactobacillus bulgarius e Strepto-coccus thermophilus, que se devem encontrar vivas no produto final, numa proporção de 10 milhões de bactérias por grama em relação à parte láctea.

Em certos países, a regulamentação autoriza a junção de outras bactérias lácticas na produção de iogurte, e, nomeadamente, a utilização adicional de estirpes de Bifidobacterium e/ou Lactobacillus acidophilus e/ou de Lactobacillus casei.

Estas estirpes lácticas adicionais são destinadas a conferir ao produto final diversas propriedades, tais como a propriedade de favorecer o equilíbrio da flora intestinal, ou de controlar o sistema imunitário.

Na prática, o termo "leite fermentado" é assim geralmente utilizado para designar os leites fermentados que não os iogurtes, e pode ter, segundo os países, o nome de "Kefir", "Kumiss", "Lassi", "Dahi", "Leben", "Filjõlk", "Villi", "Acidophilus milk", por exemplo. 14 ΡΕ1624761 A quantidade de ácido láctico livre contido no substrato lácteo fermentado não deve ser inferior a 0,6 g por 100 g na altura da venda ao consumidor, e o teor de matéria proteica utilizada na parte láctea não deve ser inferior à de um leite normal. A quantidade de ácido láctico livre contido no iogurte não deve ser inferior a 0,7 g por 100 g na altura da venda ao consumidor. A denominação "queijo fresco" ou "petit-suisse" é, no presente invento, reservada a um queijo não afinado, sem sal, que sofreu uma fermentação unicamente por bactérias lácticas (sem outra fermentação que não a fermentação láctica). O teor em matéria seca dos queijos frescos pode ser baixado até 15 g ou 10 g por 100 g de queijo fresco, desde que o teor em matéria gorda seja superior a 20 g, ou no máximo igual a 20 g, por 100 g de queijo fresco, após dessecação completa: o teor em matéria seca de um queijo fresco está compreendido entre 13 e 20%. O teor em matéria seca de um queijo do tipo petit-suisse, não é inferior a 23 g por 100 g de petit-suisse. Este está geralmente compreendido entre 25 e 30%. O termo "leite" cobre, no dominio da indústria leiteira, o leite de origem animal sob todas as suas formas 15 ΡΕ1624761 e em todas as suas variações de composições; o leite desnatado ou não, o leite condensado ou não, leite ultrafiltrado ou não, leite em pó ou não, leite que tenha sofrido um tratamento térmico ou não, leite enriquecido em constituintes do leite ou não, leite adicionado ou não, com agentes úteis à produção ou à qualidade do produto final, tais como agentes de sabor, de aroma, açúcar, etc. 0 termo "substrato lácteo" cobre tanto leite como uma composição que compreende leite e a partir da qual um produto lácteo fermentado pode ser produzido.

Para a produção de iogurtes e leites fermentados, utiliza-se geralmente leites desnatados ou não, leites concentrados ou leites em pó desnatados ou não, eventualmente enriquecidos com constituintes de leite. Para a produção de queijos frescos e de queijos do tipo petit-suisse podem igualmente utilizar-se outras matérias, sempre de origem exclusivamente leiteira, tais como natas, matéria gorda, soro, utilizados sós ou em mistura.

No domínio da indústria leiteira entende-se por "fermento láctico" um microorganismo ou uma estirpe de microorganismos, tal como uma bactéria ou uma estirpe de bactérias, que seja capaz de provocar num substrato lácteo uma fermentação através da qual a lactose ou um outro açúcar presentes no substrato lácteo é degradado em metabolito(s) e, nomeadamente, em ácido láctico, conduzindo assim a uma acidificação do substrato lácteo até um certo 16 ΡΕ1624761 pH, de forma a que se produza uma gelificação do substrato lácteo, e que resulte num produto lácteo fermentado do tipo iogurte ou leite fermentado. 0 pH inicial do substrato lácteo situa-se, com efeito, geralmente entre 8 e 6, para descer de duas a quatro unidades de pH e atingir, no final da fermentação láctica, um pH final que está geralmente compreendido entre 5 e 4 (geralmente pH de 4,7-4,6 para os iogurtes; 4,6-4,3 para os queijos frescos e do tipo petit-suisse) . Ou, a um pH compreendido entre 4 e 5, a micela da caseína é desestabilizada pela solubilização do fosfato de cálcio, e esta precipita, provocando assim a coagulação de proteínas do leite e a formação de um gel.

No presente invento, dá-se a todos os termos a importância e o significado que tomam usualmente no domínio da indústria leiteira. Deste modo, quando é feita referência a uma "fermentação láctica", trata-se com efeito de uma fermentação láctica acidificante, que se traduz por uma acidificação a seguir à produção de ácido láctico podendo ser acompanhada da produção de outros ácidos, de CO2 ou de etanol e de substâncias diversas, tais como os exopolissacáridos ou substâncias aromáticas, por exemplo, diacetilo ou acetaldeído.

Do mesmo modo, entende-se por "fermento láctico", um microorganismo ou uma estirpe de microorganismos que é capaz de provocar uma tal fermentação láctica acidificante num substrato lácteo. 17 ΡΕ1624761

De acordo com o presente invento, escolher-se-á, de maneira vantajosa, como microorganismo(s) com capacidade de fermento(s) láctico(s), bactérias lácticas utilizadas na produção de iogurtes e/ou utilizadas na produção de leites fermentados e, mais particularmente, bactérias lácticas escolhidas de entre o grupo seguinte: - as estirpes de Streptococcus thermophilus (por exemplo, a estirpe Streptococcus thermophilus que está disponível com o número 1-1630 na C.N.C.M.), - as estirpes de Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus (por exemplo, a estirpe Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus que está disponível na C.N.C.M. sob o número 1-1519), - as estirpes de Bifidobacterium, tais como os B. lactis (por exemplo, C.N.C.M. 1-2494), B. breve, B. bifidum, os B. longum, os B. infantis, as estirpes de Lactobacillus acidophilus (C.N.C.M., 1-0967, por exemplo), - as estirpes de Lactobacillus casei (C.N.C.M., 1-518, por exemplo), - as estirpes de Lactobacillus helveticus, - as estirpes de Lactobacillus delbruecki ssp. Lactis (C.N.C.M. 1-2843, por exemplo), - as estirpes de Lactobacillus cremoris, - as estirpes de Lactobacillus lactis ssp. Lactis (C.N.C.M. 1-1631, por exemplo), - as estirpes de Lactobacillus lactis ssp. Lactis biovar diacetylactis (C.N.C.M. 1-2806, por exemplo), 18 ΡΕ1624761 - as estirpes de Pediococcus acidilactici - as estirpes de Leuconostoc cremoris, - as estirpes de Leuconostoc dextranicum, - as estirpes de Leuconostoc lactis. A C.N.C.M. é a Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M. Institut Pasteur - 28, rue du Docteur Roux - 75724 Paris Cedex 15 - France).

De maneira preferencial, o referido pelo menos um mciroorganismo com capacidade de fermento contido no inoculo de acordo com o invento, é uma bactéria da espécie Streptococcus thermophilus, ou uma bactéria da espécie

Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus.

De maneira ainda preferencial, as duas espécies Lactobacillus delbruecki ssp. Bulgaricus e Streptococcus thermophilus estão representadas no conjunto de microor-ganismos com capacidade de fermentos contidos no referido inoculo. Estas duas espécies podem ser as únicas duas espécies do referido conjunto de microorganismos com capacidade de fermentos. 0 inoculo de acordo com o invento é então especialmente adaptado à produção de iogurtes. Em certos paises, estas poderão ser acompanhadas por bactérias das espécies Bifidobacterium e/ou Lactobacillus acido-philusf e/ou Lactobacillus.

Qualquer levedura é a priori adaptada à utilização do presente invento. Uma levedura da espécie Saccha-romyces cerevisiae é um exemplo particularmente adequado. 19 ΡΕ1624761 A referida pelo menos uma levedura lisada pode ser utilizada no substrato lácteo, e/ou estar presente no referido inoculo, sob qualquer forma adaptada à sua função de contributo nutricional.

Esta pode, por exemplo, ser utilizada sob a forma liquida (por exemplo, o extracto de levedura de padeiro comercializado por Lievitech sob o código 30701 - "Special Light Type "F"": "Baker's Yeast extract; Super Protex, without salt, Liquid"), ou sob a forma de pó (por exemplo, o extracto de levedura (autolisado puro) sem sal, tipo D comercializado pela Bio Springer sob os códigos 107 - pó tradicional - ou 180 - pó microgranulado - ou então extracto de levedura sem sal liquido 153 da SPRINGER BIOTECH). Quando está sob a forma liquida, a referida levedura lisada pode ser introduzida por injecção na linha de produção. Quando esta está sob a forma de pó, pode-se utilizar a referida levedura lisada no momento da etapa de transformação do leite em pó (mistura - "mix" - de leite e pó de leite desnatado). Este modo de utilização da levedura sob a forma de pó ou de liquido é particularmente bem adaptado a uma utilização da levedura lisada antes da pasteurização, dado que permite facilmente uma utilização da levedura lisada com doses fortes.

Segundo uma outra forma de realização do invento, a levedura lisada é utilizada no substracto lácteo a fermentar ou em fermentação sob a forma de grânulos, e de 20 ΡΕ1624761 maneira vantajosa sob a forma de grânulos congelados (cf. Exemplo 1 a seguir). A forma "grânulo" facilita a manipulação da levedura lisada em meio industrial, e a conservação dos stocks de levedura. Além disso, a forma "granulo congelado" torna a dissolução e a homogeneização no substrato lácteo mais simples e mais rápida. A forma "grânulo" é particularmente bem adaptada quando a levedura lisada é destinada a ser introduzida no substrato lácteo após pasteurização, dado que se trata geralmente de uma utilização de levedura lisada com baixa dose.

Antes da pasteurização, pode-se trabalhar com fortes doses de levedura lisada e, nomeadamente, com doses de levedura lisada que vão de 1 grama de levedura lisada pura por 4.1011 bactérias lácticas a 1 grama de levedura lisada pura por 2.108 bactérias lácticas, de um modo preferido, entre 1 grama de levedura lisada pura por 4.1011 bactérias lácticas e 1 grama de levedura lisada pura por 3.108 bactérias lácticas. Com estas doses verifica-se, geralmente, que é mais fácil utilizar a levedura lisada sob a forma de pó ou líquido. O(s) fermento(s) láctico(s) é(são) sempre utilizado(s) após a pasteurização.

Após pasteurização, trabalhar-se-á de maneira vantajosa com uma dose de levedura lisada que vai de 1 grama de levedura lisada pura por 2.1013 bactérias lácticas a 1 grama de levedura lisada pura por 1.109 bactérias 21 ΡΕ1624761 lácticas, de um modo preferido, com uma dose de levedura lisada que vai de 1 grama de levedura lisada pura por 8.1011 bactérias lácticas a 1 grama de levedura lisada pura por 3.1010 bactérias lácticas, de um modo mais preferido, uma dose de levedura lisada que vai de 1 grama de levedura lisada pura por 2.1011 bactérias lácticas a 1 grama de levedura lisada pura por 3.1010 bactérias lácticas. Poder-se-á então, de maneira vantajosa, utilizar um inoculo no qual o(s) fermento(s) láctico(s) e a levedura lisada estão misturados nas referidas proporções no seio de uma mesma composição de modo a que estes possam ser utilizados em conjunto numa única operação no substrato lácteo. Poder-se-á, nomeadamente, utilizar eficazmente uma mistura de grânulos de levedura lisada e de grânulos de fermento(s) láctico(s). 0 referido pelo menos um microorganismo com capacidade de fermento pode ser utilizado, e/ou estar presente no referido inoculo, sob qualquer forma adequada à sua função de fermento.

De preferência, quando a referida levedura lisada é utilizada sob a forma de grânulos, tais como os grânulos congelados, o(s) fermento(s) láctico (s) são também utilizados sob a forma de grânulos, tais como os grânulos congelados. 0 conjunto do inoculo compreenderá então, por sua vez, grânulos de fermentos e grânulos de levedura, o que dá uma homogeneidade de forma e facilita a mistura homogénea dos dois tipos de grânulos. Esta mistura pode então fazer-se por simples via mecânica. 22 ΡΕ1624761

Quando é formulada sob a forma de grânulos e, mais particularmente, sob a forma de grânulos congelados, a composição do inoculo segundo o invento é particularmente bem adaptada à inoculação directa do substrato leiteiro.

Tipicamente, os grânulos apresentarão uma forma esférica, com um diâmetro geralmente compreendido entre cerca de 2 e 10 mm. A produção de grânulos de fermentos lácticos é uma operação bem conhecida dos especialistas na matéria. Para a produção de grânulos de fermentos lácticos poder-se-á, por exemplo, referir "Bactéries lactiques: Aspect fondamentaux et technologique", Volume 1, Uriage: Lorica, 1994, ver nomeadamente o Capitulo III-4, páginas 539-553, Lejard et al. "Production de ferments concentrés pour ensemencement direct"), onde se encontrarão exemplos de produção de fermentos concentrados para a inoculação directa. Encontrar-se-á no exemplo 2 a seguir um exemplo de produção de grânulos de L. bulgaricus e de grânulos de S. thermophilus.

Em compensação, no que respeita ao conhecimento do inventor a produção de grânulos de leveduras lisadas é nova: não foram ainda produzidos grânulos de leveduras lisadas e, nomeadamente, grânulos congelados de leveduras lisadas. Para isso, pode-se proceder como se segue: as leveduras lisadas, por exemplo, sob a forma de um extracto 23 ΡΕ1624761 de levedura, tal como disponível no comércio, são submetidas a esterilização, formadas em grânulos (por exemplo, por pingamento em azoto líquido e depois congeladas em condições estéreis). 0 exemplo 1 a seguir dá uma ilustração de um tal protocolo. As características físicas dos grânulos de leveduras lisadas (extracto seco, pressão osmótica, higroscopicidade) diferem de maneira muito substancial das dos grânulos dos fermentos.

De acordo com o presente invento, a levedura lisada não é utilizada em excesso, mas de maneira controlada e limitada.

Para estimular a cinética de acidificação de uma fermentação láctica num substrato lácteo sem perturbar significativamente o fim da acidificação e, assim, obter um alimento lácteo fermentado do tipo iogurte, leite fermentado, queijo fresco ou do tipo petit-suisse, cujas qualidades organolépticas e a textura estão de acordo com os gostos dos consumidores, limitar-se-á assim, de acordo com o presente invento, a utilização de levedura lisada às doses estritamente necessárias à obtenção de uma curva de acidificação ideal (acidificação rápida mas estabilização alta) . Em qualquer caso, a dose máxima da levedura lisada, qualquer que seja o seu modo de introdução, quaisquer que sejam as estirpes e as concentrações das bactérias lácticas utilizadas, não deverá, jamais, ser superior a 0,6 g de levedura pura por litro de substrato a fermentar e, de preferência, não superior a 0,5 g de levedura pura por litro de substrato a fermentar. 24 ΡΕ1624761 0 ou os fermento(s) são utilizados em doses adequadas para a produção do produto lácteo fermentado; tipicamente, estes são geralmente utilizados numa dose compreendida entre 0,01 e 0,5 g/1, de um modo preferido entre 0,05 e 0,2 g/1.

As proporções respectivas da levedura lisada e de fermento(s) láctico(s) no inoculo de acordo com o invento podem ser as duas ajustadas de maneira a obter a qualidade desejada de levedura lisada a utilizar. Produzem-se facilmente grânulos de levedura lisada que contêm de 10 a 80% em peso de levedura, de um modo preferido entre 25 e 65% em peso de levedura, por exemplo, produzindo grânulos congelados de levedura (cf. Exemplo 1 abaixo) . Uma proporção de grânulos de levedura lisada num inoculo de acordo com o invento que contém os fermentos lácticos também sob a forma de grânulos estará então, correntemente, compreendida entre 5% e 60% em peso de grânulos de levedura lisada, de um modo preferido 20% e 40% em peso de grânulos de levedura, em relação ao peso total do conjunto dos grânulos (peso dos grânulos de fermentos + peso dos grânulos de levedura lisada). Os grânulos de fermento(s) compreendem geralmente entre 109 e 1011 bactérias lácticas por grama (cf. Exemplo 2 abaixo).

De maneira inesperada constatou-se igualmente que os novos meios de acordo com o invento trazem consigo um ganho em termos de textura ao alimento lácteo fermentado 25 ΡΕ1624761 obtido, nomeadamente na produção de iogurtes na presença de L. bulgaricus e S. thermophilus. Os inventores observaram, deste modo, que durante a conservação, os iogurtes produzidos de acordo com o presente invento (ou seja, por inoculação directa de um inoculo constituído por grânulos congelados de levedura lisada, por exemplo, S. cerevisiae lisada e de grânulos congelados de fermentos L. bulgaricus e S. thermophilus) adquirem uma consistência e uma viscosidade aumentadas em relação aos iogurtes testemunha obtidos a partir de um inoculo equivalente mas que não compreende levedura lisada (aumento da consistência da ordem de 5% a 15% medida por penetrometria com um equipamento TAXT-2, e aumento da viscosidade da ordem de 5% a 25% medida com um Rhéomat 180). O presente invento visa assim, como produtos, os alimentos lácteos fermentados do tipo iogurte, leites fermentados, queijos frescos e do tipo petit-suisse, que são susceptíveis de serem obtidos de acordo com o presente invento. Estes apresentam, com efeito, características diferentes e, nomeadamente, caracte-rísticas de consistência e de viscosidade melhoradas, em relação aos alimentos testemunha correspondentes.

Os mecanismos à base de estimulação controlada da cinética de acidificação não foram até hoje completamente elucidados pelos inventores. De qualquer modo, parece daqui em diante que estes novos meios agem no mínimo sobre a velocidade de crescimento dos fermentos. Isto permite limitar a etapa prévia usual de propagação dos fermentos na altura de uma inoculação indirecta ou semi-directa e, por 26 ΡΕ1624761 isso, um ganho em termos de tempo e de custo, sendo dado que os meios de cultura necessários nesta etapa são especialmente mais onerosos que os novos meios objecto do presente invento.

De maneira preferencial, o presente invento visa a utilização das leveduras lisadas como contributo nutricional a pelo menos um microorganismo com capacidade de fermento escolhido de entre as bactérias lácticas termófilas. De um modo mais preferido, escolher-se-á uma ou mais bactéria(s), láctica(s) termófila(s) homofermen-tar(es). De maneira vantajosa, escolher-se-á mais particularmente um microorganismo com capacidade de fermento escolhido de entre as estirpes das espécies Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbruecki ssp. Bulgaricus, ou seja, entre as estirpes utilizáveis para a produção de iogurtes. 0 presente invento visa, assim, de maneira particular, todas as composições que compreendem, pelo menos, uma bactéria da espécie S. thermophilus e/ou da espécie L.bulgaricus e, pelo menos, uma levedura lisada; uma tal composição é especialmente adaptada para a produção de iogurtes.

De um modo mais preferido, o presente invento visa a utilização de levedura lisada como contributo nutricional a, pelo menos, um microorganismo com capacidade de fermento escolhido de entre as estirpes das espécies Streptococcus thermophilus e com, pelo menos, um microorganismo com capacidade de fermento escolhido de entre as 27 ΡΕ1624761 estirpes da espécie Lactobacillus delbruecki ssp. Bulga-ricus. Existe, com efeito, uma relação simbiótica entre o S. thermophilus e L. bulgaricus, as bactérias de uma espécie estimuladora das de outra espécie. 0 L. bulgaricus estimula o crescimento do S. thermophilus libertando aminoácidos e péptidos a partir de proteínas do leite, o que permite ao S. thermophilus ter um crescimento mais rápido no arranque da incubação. 0 S. thermophilus por seu lado, produz o ácido fórmico que estimula o crescimento de L. bulgaricus. Esta simbiose é conhecida sob a nome de "proto-cooperação", e conduz a tempos de fermentação mais curtos, e igualmente a um produto que apresenta caracte-rísticas diferentes das que apresenta um produto obtido com o auxilio de uma só das duas espécies (aroma especifico "iogurte", textura melhorada).

Os inventores constataram, pela sua parte, que a utilização de levedura lisada como contributo nutricional no minimo uma estirpe de cada uma destas duas espécies, conduz a uma estimulação da sinergia inicial entre as duas estirpes respeitando as condições de não alteração do patamar de acidificação que são exigidos para a produção de um alimento lácteo destinado ao consumo humano, tal como um iogurte (cf. Exemplo 4 abaixo). 0 presente presente invento visa assim, em particular, qualquer composição de inoculo que compreenda, pelo menos, uma levedura lisada e em que os fermentos são das espécies S. thermophilus e L. bulgaricus. 28 ΡΕ1624761

De acordo com um outro aspecto do invento, o presente invento visa igualmente um processo para a produção de um inoculo para inoculação directa de acordo com o invento, caracterizado por se misturar em conjunto ou por se colocar conjuntamente em colecção: - pelo menos um microorganismo com capacidade de fermento láctico apto para produzir um alimento lácteo fermentado por fermentação láctea de um substrato lácteo, tal como um fermento lácteo apto a produzir um leite fermentado, um iogurte, um queijo fresco ou de um tipo petit-suisse, - pelo menos, uma levedura lisada. 0 presente invento visa igualmente aplicações do invento no domínio da produção de produtos lácteos fermentados e, mais particularmente, alimentos lácteos fermentados. 0 presente invento visa assim um novo processo de fermentação láctica de um substrato lácteo. Este novo processo de fermentação é caracterizado por dar a este substrato lácteo um(vários) micoorganismo(s) com capacidade de fermento(s) lácteo(s) e, pelo menos, uma levedura lisada, e em que se mantém este substrato em condições favoráveis à actividade de fermentação do(s) microorganismo (s) com capacidade de fermento(s) lácteo(s) utilizado (s) . 0 presente invento visa, mais particularmente, um 29 ΡΕ1624761 processo de fermentação láctica de um substrato lácteo, segundo o qual o(s) referido(s) microorganismo(s) possui (em) a capacidade de fermento(s) láctico (s) e a referida levedura lisada são adicionados ao referido substrato lácteo sob a forma de um inoculo de acordo com o presente invento. Após pasteurização e, eventualmente, homogeneização do substrato lácteo, utiliza-se o referido substrato lácteo, o referido pelo menos um microorganismo com capacidade de fermento e a referida pelo menos uma levedura lisada, coloca-se o substrato lácteo em incubação de modo a permitir a fermentação desejada, e depois arrefece-se o substrato a um pH fixo (definido pelo tipo de alimento que se produz: para um iogurte, por exemplo, pára-se a fermentação quando o pH está entre 4,5 e 4).

Por natureza, o substrato lácteo contém uma fonte de lactose. Um especialista na matéria sabe adaptar as condições operatórias de fermentação e, nomeadamente, as condições de temperatura, de agitação e de quantidade de oxigénio presente, no(s) fermento(s) lácteo(s) presente(s) no substrato lácteo, de maneira a que este(s) fermento(s) lácteo(s) pudessem exprimir neste substrato a sua capacidade de transformar a lactose em ácido láctico. Para a produção de iogurtes, por exemplo, trabalha-se em geral a uma temperatura de 40°C. Para a produção de leites fermentados, trabalha-se em geral a uma temperatura de 37°C. Para a produção de queijos frescos e do tipo petit-suisse, trabalha-se em geral a uma temperatura de 17°C a 30 °C. 30 ΡΕ1624761 O processo de fermentação láctica segundo o invento permite produzir directamente os produtos lácteos fermentados e o presente invento visa assim, igualmente, todos os processos de produção de produtos lácteos fermentados e, mais particularmente, os alimentos lácteos fermentados, tais como os iogurtes, leites fermentados, queijo fresco e do tipo petit-suisse, por fermentação láctea acidificante de um substrato lácteo pasteurizado, caracterizado por a fermentação láctea acidificante utilizada para a produção destes produtos ser uma fermentação láctica segundo o invento, ou seja, que: - se utiliza, pelo menos, uma levedura lisada no substrato lácteo de modo que, na altura da referida fermentação láctica acidificante, o(s) fermento(s) láctico(s) acidificante(s) estão na presença desta, pelo menos, uma levedura lisada, sendo a pelo menos uma levedura lisada, utilizada numa quantidade que vai de 1 grama de levedura lisada pura por 2.1013 bactérias lácticas, até 1 grama de levedura lisada pura por 2.108 bactérias lácticas, desde que a quantidade de total de levedura lisada no substrato lácteo não ultrapasse 0,6 gramas de levedura lisada pura por litro do substrato a fermentar e, de um modo preferido, 0,5 gramas de levedura lisada pura por litro de substrato a fermentar, e que se mantém este substrato lácteo inoculado em 31 ΡΕ1624761 condições favoráveis à actividade de fermentação do(s) fermento(s) láctico(s) acidificante(s), de modo a produzir o alimento lácteo fermentado desejado. A globalidade da produção de alimentos lácteos fermentados do tipo iogurtes, leites fermentados, queijos frescos e do tipo petit-suisse compreende as etapas de pasteurização do substrato lácteo e de fermentação láctea acidificante do substrato lácteo pasteurizado. De acordo com o presente invento, a levedura lisada pode ser utilizada antes ou após a pasteurização, nas proporções indicadas abaixo. Este processo de acordo com o presente invento permite utilizar os fermentos lácticos directamente sem pré-cultura. 0 presente invento é ilustrado pelos exemplos que se seguem, nos quais é feita referência às figuras 1, 2 e 3. A figura 1 apresenta uma curva que ilustra a estimulação exercida pelos grânulos de levedura lisada na cinética de acidificação de um fermento de L. bulgaricus num substrato lácteo. A figura 2 apresenta uma curva que ilustra a estimulação exercida pelos grânulos de levedura lisada na cinética de acidificação da simbiose que desenvolvem um fermento de L. bulbaricus e um fermento de S. thermophilus no substrato lácteo. 32 ΡΕ1624761 A figura 3 apresenta uma curva que ilustra a estimulação exercida por um extracto de levedura seca utilizado antes da pasteurização, na fermentação exercida pelo S. thermophilus.

Exemplo 1: preparação de grânulos congelados de levedura lisada É utilizado um extracto de levedura BIOSPRINGER "sem sal liquido" com 50% de extracto seco (código 153) como levedura lisada. Os grânulos de levedura lisada são preparados de acordo com o protocolo seguinte: 1 - Esterilização de um litro de extracto de levedura (EL) em autoclave (121°C 15')· Numa garrafa de vidro em que a rolha permite retirar uma amostra estéril do liquido após tratamento térmico, 2 - Arrefecimento do EL entre 20°C e 30°C, e proceder em seguida numa hotthe de fluxo laminar com material estéril, 3 - Ligação da garrafa a uma bomba peristáltica com a ajuda de um tubo flexível de pequena secção, em que a outra extremidade está ligada a um sistema que permite a ligação a várias agulhas de seringa, 4 - Dispor um contentor isotérmico cheio com azoto líquido sob as agulhas, 33 ΡΕ1624761 5 - Arrancar com a bomba peristáltica e regular o caudal para se obter um gotejamento regular de EL no azoto líquido, 6 - Recuperar e condicionar os grânulos esterilmente e depois conservá-los a -80°C.

Exemplo 2: produção de grânulos congelados de bactérias lácticas 1 - Preparação de inoculo a partir da estirpe I-1519 de L. bulgaricus e da estirpe 1-1630 de S. thermophilus.

Revivificação da estirpe através de três repicagens sucessivas no leite mais extracto de levedura (pó de leite desnatado de 90 g a 140 g mais extracto de levedura em pó de 0,5 a 3 g QSP 1 kg com água destilada, esterilização a 121°C, 15 minutos):

Inoculação a 1%, incubação a 40°C (S. thermophilus = ST); 44°C (L. bulgaricus = LB) - Paragem das repicagens por arrefecimento (4°C) após a coagulação (gelificação do leite)

Inocular com o auxílio da última repicagem (1%), 200 ml de M17 a 40°C (ST), 200 ml de MRS a 44°C (LB) - Fazer um seguimento da densidade óptica num espectrofotómetro a 660 nanometros, 34 ΡΕ1624761 - Paragem do crescimento bacteriano do inoculo pelo frio (4°C) . Após obtenção do fim da fase exponencial de crescimento (cerca de 4h a 4h30m em boas condições) 2 - Preparação do fermentador (Exemplo: Tipo BIOSTAT ED)

Escolha da normalidade da base de regulação

- Solução ST de NaOH 6N

- solução LB de NaOH 2N

Esterilização em autoclave a 121°C durante 15 minutos - Sistema da admissão de base e de inoculação. - Solução de base. - Rotor e corpo da centrifugadora - Ligações do fermentador à centrifugadora - Ligações para recuperar o sobrenadante estéril num frasco - Ligação da garrafa de concentrado estéril no azoto (tubo + agulha)

Aferição da sonda de pH

Esterilização do fermentador - Enchimento com água ultra pura 35 ΡΕ1624761 - Programar um ciclo de esterilização in situ (1210 C, 20') 3 - Preparação do meio de cultura - Utilização de água destilada - Pesar os diferentes compostos do meio (ver as receitas abaixo) - Hidratação durante 30' sob agitação - Esterilização em - Arrefecimento a - Transferência do de maneira asséptica

Meio de propagação ST - Água destilada - Permeado de ultrafiltração 50 g/1 - Extracto de levedura 10 g/1 - Sulfato de manganês 0,1 g/1 - Pó de leite desnatado 10 g/1 pH de partida 6,5 autoclave (121°C, 15 minutos) °C: 40 °C (ST), 44 °C (LB) meio de cultura no fermentador

Meio de propagação LB - Água destilada - Permeado de ultrafiltração 50 g/1 - Extracto de levedura 15 g/1 - Sulfato de manganês 0,1 g/1 - Tween 80 pH de partida 6,5 4 - Lançamento da propagaçao - Inoculação do fermentador com o inoculo à razão de 100 ml por 6 litros - Lançamento do programa do fermentador permitindo regular a temperatura, regular o pH através das soluções de soda, agitar o meio de cultura, registar o pH, a temperatura e o volume de soda aplicado. 36 ΡΕ1624761 5 - Paragem da propagaçao

Os dados sobre o volume de soda aplicado durante a fermentação para regular o pH, são tratados para obter uma curva do acumulado do volume de soda consumido em função do tempo, e depois para obter uma curva da velocidade de consumo da soda em função do tempo. 0 ponto máximo desta última curva corresponde ao momento em que se deve parar a propagação por arrefecimento do fermentado. 6 - Centrifugação a frio (Exemplo: Rotor de fluxo continuo 8575) . - recolha do fermentado por bomba peristáltica, e alimentação do corpo da centrifugadora. - Velocidade: 13 000 rpm (ST), 10 000 (LB) - Recuperação de uma parte do sobrenadante num frasco estéril - Após centrifugação, diluir a massa obtida com o sobrenadante até que seja pipetável, transferir para uma garrafa estéril previamente arrefecida (trabalhar na hotte com fluxo laminar, manter o concentrado a temperaturas inferiores a 10°C) 7 - Congelamento (trabalhar na hotte com fluxo laminar, manipulação asséptica, manter o concentrado a temperaturas inferiores a 10°C). 37 ΡΕ1624761 - Ligação da garrafa com a massa diluída a uma bomba peristáltica com a ajuda de um tubo flexível com pequena secção em que a outra extremidade está ligada a um sistema que permite a ligação a várias agulhas de seringa - Dispor um contentor isotérmico cheio com azoto líquido sob as agulhas, - Arrancar com a bomba peristáltica e regular o caudal para se obter um gotejamento regular do concentrado no azoto líquido

- Recuperar e condicionar esterilmente os grânulos e depois conservá-los a -80°C 8 - Controlo de granulados concentrados conge lados

Após se terem feito fundir rapidamente os granulados, efectuar uma contagem (ST ou LB: Método FIL 117A: 198)

Os grânulos de S. thermophilus apresentam uma população superior a IO10 cfu/g.

Os grânulos de S. bulgaricus apresentam uma população superior a 5.109 cfu/g.

Exemplo 3: os grânulos de levedura lisada estimulam a cinética de acidificação das bactérias da espécie Lactobacillus bulgaricus A partir da estirpe de Lactobacillus bulgaricus 38 ΡΕ1624761 que é disponibilizada sob o número 1-1519 da C.N.C.M. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes Institut Pasteur - 28, rue du Docteur Roux - 75724 Paris Cedex 15 - France), preparam-se grânulos de fermento sguindo o método descrito no exemplo 2.

Prepara-se igualmente uma composição de acordo com o invento, constituído por uma mistura de grânulos de fermento 1-1519, com grânulos de levedura lisada que foram preparados como indicado no exemplo 1 abaixo. Os grânulos de fermento 1-1519 são utilizados numa quantidade correspondente a 0,1 g de grânulos de fermento por litro de mistura láctea a fermentar, e os grânulos de levedura numa quantidade correspondente a 0,05 g de grânulos de levedura por litro de mistura láctea a fermentar. Os dois tipos de grânulos são misturados em conjunto mecanicamente, de maneira a obter uma distribuição igualmente homogénea dos dois tipos de grânulos na composição.

Prepara-se, a título de substrato lácteo, uma mistura láctea a partir de 120 g de pó de leite desnatado, de 70 g de sacarose, de 930 ml de água permutada e pasteuriza-se esta mistura mantendo-se em banho-maria a 95°C durante 10 min.

Faz-se a inoculação da mistura láctea pasteurizada com: a) grânulos de fermento com uma quantidade de 0,1 39 ΡΕ1624761 g de grânulos por litro de mistura láctea a fermentar, ou com b) a composição de acordo com o presente invento indicada abaixo, que é constituída por uma mistura de grânulos de fermento na proporção de 0,1 g/1 e grânulos de levedura lisada na proporção de 0,05 g/1 (ou seja 1 grama de levedura lisada pura por 4.1010 bactérias lácticas).

Conduz-se a fermentação láctica do substrato lácteo inoculado a uma temperatura de 38°C, durante 18 h, e mede-se o pH do substrato no decurso da fermentação. As medições de pH foram realizadas com a ajuda de um aparelho de análise da marca CINAC (fabricado e distribuído pela empresa YSEBAERT-10, avenue Charles de Gaulle - 95740 Fré-pillon - France), medindo o pH todos os min durante 18 h.

Os resultados relativos à cinética de acidifi-cação são ilustrados pela Figura 1 (eixo das ordenadas: valores de pH; eixo das abcissas: tempos em min a partir do arranque da acidificação). A curva superior corresponde à inoculação a) (grânulos de fermento de L. bulgaricus, sem grânulos de levedura lisada), a curva inferior corresponde à inoculação b) (composição de acordo com o presente invento constituída por grânulos de fermento de L. bulgaricus e grânulos de levedura lisada).

Observa-se que na presença de grânulos de levedura lisada a cinética de acidificação da estirpe de L. bulgaricus é fortemente estimulada. 40 ΡΕ1624761

Exemplo 4: os grânulos de levedura lisada estimulam a cinética de acidificação da simbiose fermentar Lactobacillus bulgaricus - Streptococcus thermophilus sem alterar o patamar de fim de acidificação e o valor de pH aos 1000 min A partir da estirpe de Lactobacillus bulgaricus que está disponível sob o número 1-1519 na C.N.C.M. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes

Institut Pasteur - 28, rue du Docteur Roux - 75724 Paris Cedex 15 - France), preparam-se grânulos de fermento 1-1519 como indicado no exemplo 3 abaixo. A partir da estirpe de Streptococcus thermophilus que está disponível sob o número 1-1630 na C.N.C.M. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes

Institut Pasteur - 28, rue du Docteur Roux - 75724 Paris Cedex 15 - France), preparam-se grânulos de fermento 1-1630 como indicado no exemplo 3 abaixo para a estirpe Lactobacillus bulgaricus.

Prepara-se uma composição constituída por 95% em peso de grânulos de fermento 1-1519 e de 5% em peso de grânulos de fermento 1-1630 por mistura mecânica homogénea.

Prepara-se igualmente uma composição de acordo com o presente invento constituída por 76% em peso de grânulos de fermento 1-1519, de 4% em peso de grânulos de 41 ΡΕ1624761 fermento 1-1630 e de 20% em peso de grânulos de levedura lisada que foram preparados como indicado no exemplo 1 atrás (ou seja, 1 grama de levedura lisada pura por 8.1010 de bactérias lácticas).

Prepara-se, como substrato lácteo, uma mistura láctea constituída por 120 g de pó de leite desnatado, 70 g de sacarose e 930 ml de água permutada, e pasteuriza-se esta mistura mantendo-se em banho-maria a 95°C, durante 10 min.

Inocula-se a mistura láctea pasteurizada com: a) a composição constituída por grânulos dos fermentos 1-1519 e 1-1630 em proporções de 95%-5%, na proporção de 0,19 g de grânulos de fermento 1-1519 e de 0,01 g de grânulos de fermento 1-1630 por litro de mistura láctea a fermentar. b) a composição de acordo com o presente invento constituída por grânulos dos fermentos 1-1519 e I-1630 e de grânulos de levedura lisada em proporções de 76%-4%-20%, na proporção de 0,19 g de grânulos de fermento 1-1519, de 0,01 g de grânulos de fermento 1-1630 e de 0,05 g de grânulos de levedura lisada por litro de mistura láctea a fermentar.

Conduz-se a fermentação láctica do substrato lácteo inoculado a uma temperatura de 38°C durante 18 h, e 42 ΡΕ1624761 mede-se o pH do substrato no decurso da fermentação. As medições de pH foram realizadas com o auxilio de um equipamento de análise da marca CINAC (fabricada e distribuída pela empresa YSEBAERT - 10, avenue Charles de Gaulle - 95740 Frépillon - France) medindo o pH a cada 4 min durante 18 h.

Os resultados relativos à cinética de acidifi-cação são ilustrados pela Figura 2 (eixo das ordenadas: valores de pH; eixo das abcissas: tempo em min a partir do arranque da acidificação até ao tempo de 1000 min). A curva superior corresponde à inoculação a) (grânulos de fermentos, sem grânulos de levedura lisada), a curva inferior corresponde à inoculação b) (composição de acordo com o presente invento constituída por grânulos de fermentos e grânulos de levedura lisada).

Verifica-se que a adição de grânulos de levedura conduz a uma estimulação nítida da actividade acidificante da simbiose fermentar (1-1519 + 1-1630), conservando as características intrínsecas do fermento (patamar de acidificaçao a partir do pH de 4,6, pH a 1000 min idêntico).

Exemplo 5: adição de levedura lisada antes da pasteurização

Estractos de leveduras secos (autolisado puro, sem sal, código 107 de BIOSPRINGER) contendo 100% de 43 ΡΕ1624761 levedura lisada pura são adicionados directamente com os outros ingredientes constituindo a fórmula do produto acabado (salvo as bactérias lácticas), na proporção de 0,3 g de extracto de levedura seco por litro. O conjunto é pasteurizado. Depois juntam-se grânulos da estirpe Streptococcus thermophilus CNCM 1-2774, na proporção de 0,2 gramas de granulados por litro de produto acabado. Estes granulados foram preparados da mesma maneira que os granulados da estirpe CNCM 1-1630 no exemplo 3. Estes contêm 3,1 x IO10 bactérias por grama de granulado, 0,3 g de levedura lisada pura é então utilizada com 6,2 x 109 bactérias lácticas, ou seja, 1 g de de levedura lisada pura para 2,07 x 1010 bactérias lácticas.

Por comparação com a fórmula sem leveduras lisadas, constata-se uma acidificação mais rápida durante as primeiras três horas, e depois uma acidificação menos rápida que com a fórmula sem leveduras lisadas assim como ilustrado na figura 3.

Lisboa, 15 de Fevereiro de 2007

Claims

ΡΕ1624761 1 REIVINDICAÇÕES 1. Inoculo que é especialmente adaptado à inoculação directa num substrato lácteo para a transformação deste substrato lácteo em alimento lácteo fermentado, caracterizado por este inoculo compreender em mistura, ou sob forma de colecção ("kit de partes"): - pelo menos um microorganismo sob uma forma tal que é capaz de exercer uma actividade de fermento sobre um substrato lácteo, e pelo menos, uma levedura sob forma lisada, o referido microorganismo com capacidade de fermento contido no referido inoculo ou, se houver vários, o conjunto dos microorganismos com capacidade de fermento(s) contido (s) no referido inoculo sendo constituído por bactérias lácticas aptas a produzir um alimento lácteo fermentado por fermentação láctica acidificante de um substrato lácteo e estando a referida levedura lisada presente no referido inoculo numa quantidade que vai de 1 grama de levedura lisada 1 3 pura por 2.10 bactérias lácticas a 1 grama de levedura lisada pura por 2.108 bactérias lácticas.
2. Inoculo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida levedura lisada estar presente no referido inoculo numa quantidade que vai de 1 grama de levedura lisada pura por 1.1012 bactérias lácticas a 1 grama de levedura lisada pura por 3.10 bactérias lacticas. 2 ΡΕ1624761
3. Inoculo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a referida levedura lisada estar presente no referido inoculo e numa quantidade que vai de 1 qrama de levedura lisada pura por 4.1011 bactérias lácticas a 1 grama de levedura lisada pura por 2.108 bactérias lácticas.
4. Inoculo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por este compreender a referida pelo menos uma levedura lisada e o referio pelo menos um micro-organismo com capacidade de fermento sob a forma de colecção, sem mistura ("kit de partes" inoculo).
5. Inoculo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a referida levedura lisada estar presente no referido inoculo e numa quantidade que vai de 1 grama de levedura lisada pura por 2.1013 bactérias lácticas a 1 grama de levedura lisada pura por 3.1010 bactérias lácticas.
6. Inoculo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a referida levedura lisada estar presente no referido inoculo e numa quantidade que vai de 1 grama de levedura lisada pura por 8.1011 bactérias lácticas a 1 grama de levedura lisada pura por 3.1010 bactérias lácticas.
7. Inoculo de acordo com a reivindicação 5 ou 3 ΡΕ1624761 6, caracterizado por a referida levedura lisada estar presente no referido inoculo e numa quantidade que vai de 1 grama de levedura lisada pura por 2.1011 bactérias lácticas a 1 grama de levedura lisada pura por 3.1010 bactérias lácticas.
8. Inoculo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado por a referida levedura lisada estar em mistura com o referido microorganismo com capacidade de fermento.
9. Inoculo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por a referida levedura lisada estar presente sob a forma de pó ou de líquido.
10. Inoculo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por a referida levedura lisada estar presente sob a forma de grânulos.
11. Inoculo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por os referidos grânulos de levedura lisada estarem sob a forma congelada.
12. Inoculo de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado por os referidos grânulos de levedura conterem de 10 a 80% em peso de levedura lisada, de um modo preferido, 25 a 65% em peso.
13. Inoculo de acordo com qualquer uma das rei- 4 ΡΕ1624761 vindicações 1 a 12, caracterizado por a referida levedura lisada ser da espécie Saccharomyces cerevisiae.
14. Inoculo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por o referido pelo menos um microorganismo com capacidade de fermento estar presente sob a forma de grânulos.
15. Inoculo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por os referidos grânulos de levedura lisada estarem sob a forma congelada.
16. Inoculo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por o referido alimento lácteo ser escolhido do grupo constituído por iogurtes, leites fermentados, queijos frescos e do tipo petit-suisse.
17. Inoculo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado por o referido pelo menos um microorganismo com capacidade de fermento contido neste inoculo pertencer à espécie Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus ou à espécie Streptococcus thermophilus.
18. Inoculo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado por as duas espécies Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus e Streptococcus thermophilus estarem representadas no conjunto de micro-organismos com capacidade de fermentos contidos no referido inoculo. 5 ΡΕ1624761
19. Processo de produção de alimentos lácteos fermentados e, mais particularmente, iogurtes, leites fermentados, queijos frescos e do tipo petit-suisse, por fermentação láctica acidificante de um substrato lácteo pasteurizado, caracterizado por se utilizar, pelo menos, uma levedura lisada no substrato lácteo, de forma que, na altura da referida fermentação láctea acidificante, o(s) fermento(s) láctico (s) acidificante (s) estarem na presença desta, pelo menos, uma levedura lisada, sendo a referida pelo menos uma levedura lisada utilizada numa quantidade que vai de 1 grama de levedura lisada pura por 2.1013 bactérias lácticas, a 1 grama de levedura lisada pura por 2.108 bactérias lácticas, desde que a quantidade total de levedura lisada utilizada no substrato lácteo não ultrapasse 0,6 gramas de levedura lisada pura por litro de substrato a fermentar e por se manter este substrato lácteo inoculado em condições favoráveis à actividade de fermentação do(s) fermento(s) lácteo(s) acidificante(s), de forma a produzir um alimento lácteo fermentado desejado.
20. Processo de produção de alimentos lácteos fermentados de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a quantidade total de levedura lisada utilizada no substrato lácteo não ultrapassar 0,5 gramas de levedura lisada pura por litro de substrato a fermentar.
21. Processo de produção de alimentos lácteos fermentados de acordo com a reivindicação 19 ou 20, carac- 6 ΡΕ1624761 terizado por a referida pelo menos uma levedura lisada ser utilizada numa quantidade de 1 grama de levedura lisada pura por 1.1012 bactérias lácticas, a 1 grama de levedura lisada pura por 3.108 bactérias lácticas.
22. Processo de produção de alimentos lácteos fermentados de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 ou 21, caracterizado por a referida pelo menos uma levedura lisada ser utilizada antes da pasteurização do substrato lácteo e com uma dose que vai de 1 grama de levedura lisada pura por 4.1011 bactérias lácticas, a 1 grama de levedura lisada pura por 2.108 bactérias lácticas.
23. Processo de produção de alimentos lácteos fermentados de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 ou 21, caracterizado por a referida pelo menos uma levedura lisada ser utilizada após a pasteurização e com uma dose que vai de 1 grama de levedura lisada pura por 2.1013 bactérias lácticas, a 1 grama de levedura lisada pura por 109 bactérias lácticas.
24. Processo de produção de alimentos lácteos fermentados de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por a referida pelo menos uma levedura lisada que é utilizada após a pasteurização ser utilizada com uma dose que vai de 1 grama de levedura lisada pura por 8.1011 bactérias lácticas, a 1 grama de levedura lisada pura por 3 . IO10 bactérias lácticas. 7 ΡΕ1624761
25. Processo de produção de alimentos lácteos fermentados de acordo com a reivindicação 23 ou 24, carac-terizado por a referida pelo menos uma levedura lisada que é utilizada após a pasteurização ser utilizada com uma dose que vai de 1 grama de levedura lisada pura por 2.1011 bactérias lácticas, a 1 grama de levedura lisada pura por 3.1010 bactérias lácticas.
26. Processo de produção de alimentos lácteos fermentados de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 ou 25, caracterizado por o(s) fermento(s) láctico(s) acidificante(s) ser(em) utilizado(s) no substrato lácteo directamente sem pré-cultura.
27. Estirpe 1-2774 tal como depositada na CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur - 28, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France). Lisboa, 15 de Fevereiro de 2007