BR112018014104B1

BR112018014104B1 - Método de produzir um produto lácteo fermentado,composição e produto alimentício

Info

Publication number: BR112018014104B1
Application number: BR112018014104-6A
Authority: BR
Inventors: Mirjana Curic-Bawden; Luciana Luciana Jimenez; Mette Oehrstroem Runge; Karen GUILLOTTE; Pia Frost Jensen
Original assignee: Chr. Hansen A/S
Priority date: 2016-01-21
Filing date: 2017-01-23
Publication date: 2022-11-29
Also published as: CN108882718A; DK3405040T3; US11744259B2; EP3405040B1; MX2018008608A; JP2022033142A; US20190082707A1; EP3405040A1; JP2019502393A; KR20180103140A; JP7316044B2; WO2017125600A1; BR112018014104A2

Abstract

A presente invenção refere-se a um método de produzir um produto lácteo fermentado compreendendo adicionar bactérias do ácido láctico ao leite, em que as bactérias compreendem Lactobacillus casei e pelo menos uma cepa adicional de bactérias do ácido láctico de uma espécie exceto Lactobacillus casei, em que a cepa adicional tem uma deficiência no metabolismo da lactose, mas é capaz de metabolizar um ou vários carboidratos, exceto lactose, presentes no leite.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a um método de produzir um produto lácteo fermentado compreendendo adicionar bactérias do ácido láctico ao leite, em que as bactérias compreendem Lactobacillus casei e pelo menos uma cepa adicional de bactérias do ácido láctico de uma espécie exceto Lactobacillus casei, tal como Streptococcus thermophilus.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] Bebidas probióticas cultivadas, também conhecidas como doses probióticas, frequentemente contêm Lactobacillus casei ou Lactobacillus paracasei. No presente pedido o termo L. casei é usado para referir-se a bactérias da espécie L. casei ou L. paracasei. Estas bebidas probióticas são muito populares em muitas partes do mundo, incluindo China, Coreia e a região do Extremo-Oriente assim como México. Em outras regiões no mundo a popularidade destas bebidas também aumenta.

[003] O produto é tipicamente obtido por fermentação do leite usando uma única cepa de L. casei. O crescimento de L. casei no leite é lento e como uma consequência, a fermentação é lenta. A fermentação geralmente necessita de 50 a 96 horas. Como uma outra consequência do crescimento lento, a fermentação frequentemente necessita de medidas específicas para impedir a contaminação e contaminação cruzada com outras bactérias do ácido láctico.

[004] As cepas de L. casei são cultivadas até atingirem um valor de pH de 4,2 a 3,7. Neste estágio, o leite fermentado é processado e opcionalmente diluído com xarope em uma razão de leite fermentado:xarope entre 30:60 e 75:25. O produto final é tipicamente embalado em porções de 65 a 100 ml. A contagem de célula alvo de L. casei na bebida láctea fermentada diluída final é mais alta do que 1 x 108 CFU/ml.

[005] Para aumentar a acidificação e assim, encurtar o tempo de produção, L. casei foi fermentada em combinação com outras espécies de bactérias do ácido láctico, incluindo St. thermophilus por exemplo usando FD-DVS CT-01. Com este método, o tempo de fermentação foi reduzido para cerca de 15 a 20 horas. Entretanto, a espécies adjuntas cresceram mais rápido do que L. casei e o ácido gerado devido ao crescimento da cultura adjunta causou inibição do crescimento de L. casei, que atingiu uma concentração de apenas 3 a 5 x 107 CFU/ml. Assim, existe ainda uma necessidade de melhorar métodos para produzir um produto lácteo fermentado, métodos estes usando L. casei para a fermentação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] Este problema é agora resolvido pela presente invenção, que é dirigida a um método de produzir um produto lácteo fermentado compreendendo adicionar bactérias do ácido láctico ao leite, em que as bactérias compreendem Lactobacillus casei e pelo menos uma cepa adicional de bactérias do ácido láctico de uma espécie exceto Lactobacillus casei, em que a cepa adicional tem uma deficiência no metabolismo de lactose mas é capaz de metabolizar um ou vários carboidratos exceto lactose presentes no leite.

[007] Os presentes inventores surpreendentemente descobriram que os problemas encontrados quando da geração de produtos lácteos fermentados usando L. casei podem ser superados fermentando-se o leite com L. casei e pelo menos uma cepa adicional com uma deficiência no metabolismo da lactose. A cepa adicional pode, por exemplo, ser capaz de metabolizar sacarose, galactose e/ou glicose. Um ou vários destes carboidratos podem ser adicionados em concentração baixa ao leite a ser fermentado. A cepa adicional metabolizará estes carboidratos prontamente e assim começará a acidificar o leite prontamente. A acidificação reduz o risco de crescimento de bactérias do ácido láctico indesejadas devido à contaminação. O crescimento da cepa adicional acelera o crescimento de L. casei. Isto é aparentemente devido ao fato de que a cepa adicional produz aminoácidos e peptídeos no leite por proteólise de caseína e outras proteínas do leite. Os aminoácidos e peptídeos aceleram o crescimento de L. casei. Entretanto, a cepa adicional não crescerá a um tal grau ou acidificará o leite a um tal grau que o crescimento de L. casei é significantemente inibido. Nos métodos de produzir um produto lácteo fermentado da presente invenção L. casei obtém a mesma contagem de célula máxima do que em métodos de produzir L. casei sem o uso de uma LAB adicional. Em outras palavras uma concentração alta de L. casei é obtida em um período de tempo mais curto enquanto o risco de contaminação é reduzido.

[008] Em um aspecto, a pelo menos uma cepa adicional de bactérias do ácido láctico tendo uma deficiência no metabolismo da lactose é uma cepa proteolítica. Em um aspecto preferido, a pelo menos uma cepa adicional de bactérias do ácido láctico tendo uma deficiência no metabolismo da lactose é uma cepa altamente proteolítica.

[009] Em um aspecto relacionado, a pelo menos uma cepa adicional de bactérias do ácido láctico tendo uma deficiência no metabolismo da lactose é uma bactéria da espécie Streptococcus thermophilus e/ou Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

[010] Outras modalidades da invenção referem-se ao uso de bactérias L. casei e pelo menos uma cepa adicional de bactérias do ácido láctico de uma espécie exceto L. casei, para produzir um produto lácteo fermentado, em que a cepa adicional tem uma deficiência no metabolismo da lactose mas é capaz de metabolizar um ou vários carboidratos exceto lactose presentes no leite.

[011] A presente invenção também fornece composições compreendendo bactérias da espécie L. casei e bactérias de pelo menos uma cepa adicional de bactérias do ácido láctico, em que a pelo menos uma cepa adicional de bactérias do ácido láctico tem uma deficiência no metabolismo da lactose. A pelo menos uma outra bactéria presente nas composições com uma deficiência no metabolismo da lactose é preferivelmente uma bactéria da espécie Streptococcus thermophilus e/ou Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

[012] Em uma outra modalidade a presente invenção fornece produtos alimentícios compreendendo bactérias da espécie L. casei e bactérias de pelo menos uma cepa adicional de bactérias do ácido láctico, em que a pelo menos uma cepa adicional de bactérias do ácido láctico tem uma deficiência no metabolismo da lactose. Em particular, o produto alimentício pode ser uma bebida láctea fermentada.

DIVULGAÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[013] Em geral, a presente invenção fornece métodos de produzir um produto lácteo fermentado compreendendo adicionar bactérias do ácido láctico ao leite, em que as bactérias compreendem Lactobacillus casei e pelo menos uma cepa adicional de bactérias do ácido láctico de uma espécie exceto Lactobacillus casei, em que a cepa adicional tem uma deficiência no metabolismo da lactose mas é capaz de metabolizar um ou vários carboidratos exceto lactose presentes no leite.

[014] No contexto do presente pedido, o termo "leite" é amplamente usado em seu significado comum para referir-se a líquidos produzidos pelas glândulas mamárias de animais ou por plantas. De acordo com a presente invenção o leite pode ter sido processado e o termo "leite" inclui leite integral, leite desnatado, leite sem gordura, leite com baixo teor de gordura, leite gordo, leite reduzido em lactose, ou leite concentrado. O leite sem gordura é o produto lácteo sem gordura ou desnatado. Leite com baixo teor de gordura é tipicamente definido como o leite que contém de cerca de 1 % a cerca de 2 % de gordura. Leite gordo frequentemente contém 2 % de gordura ou mais. O termo "leite" é intencionado a abranger leites de diferentes mamíferos e fontes vegetais. Fontes mamíferas de leite incluem, mas não são limitadas a vaca, ovelha, cabra, búfala, camela, lhama, égua e cerva. Fontes vegetais de leite incluem, mas não são limitadas a, leite extraído de soja, ervilha, amendoim, cevada, arroz, aveia, quinoa, amêndoa, caju, coco, avelã, cânhamo, semente de gergelim e semente de girassol.

[015] Nos métodos e produtos da presente invenção, o leite derivado de vacas é o mais preferivelmente usado como um material de partida para a fermentação.

[016] Leites com teor de lactose reduzido e com teor de gordura reduzido podem ser usados nos métodos da presente invenção. Leites com teor de lactose reduzido e com teor de gordura reduzido estão comercialmente disponíveis e podem ser produzidos de acordo com métodos bem conhecidos na técnica, incluindo hidrolisar a lactose pela enzima lactase à glicose e galactose, ou por nanofiltração, eletrodiálise, cromatografia de troca iônica e centrifugação.

[017] O termo "base láctea" é amplamente usado no presente pedido para referir-se a uma composição com base em leite ou componentes do leite que pode ser usada como um meio para o crescimento e fermentação de LAB. A base láctea compreende componentes derivados do leite e qualquer outro componente que possa ser usado para o propósito de cultivar ou fermentar LAB.

[018] Como já indicado acima, os termos "Lactobacillus casei" e "L. casei" são usados no presente pedido para referir-se a bactérias da espécie L. casei ou L. paracasei. Qualquer cepa de L. casei pode ser usada no contexto da presente invenção, incluindo misturas de cepas. Preferivelmente cepas de grau alimentício de L. casei são usadas. Cepas respectivas estão disponíveis a partir de numerosas fontes.

[019] No contexto do presente pedido, o termo "bactérias do ácido láctico" ou "LAB" é usado para referir-se a bactérias de grau alimentício que produzem ácido láctico como o principal produto final metabólico da fermentação de carboidrato. Estas bactérias são relacionadas por suas características metabólicas e fisiológicas comuns e são usualmente Gram positivas, com GC baixo, tolerantes a ácido, não esporulantes, não respirantes, bacilos na forma de bastão ou cocos. Durante o estágio de fermentação, o consumo de lactose por estas bactérias causa a formação de ácido láctico, reduzindo o pH e levando à formação de um coágulo proteico. Estas bactérias são assim responsáveis pela acidificação do leite e pela textura do produto lácteo. Como usado aqui, o termo "bactérias do ácido láctico" abrange, mas não é limitado ao, bactérias que pertencem ao gênero de Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Streptococcus spp., Lactococcus spp., tais como Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus lactis, Bifidobacterium animalis, Lactococcus lactis, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium breve e Leuconostoc spp.

[020] A etapa de fermentação do processo para fabricar produtos lácteos fermentados compreende a adição de bactérias do ácido láctico ao leite. As bactérias adicionadas ao leite são frequentemente identificadas como uma cultura iniciadora. O termo "cultura iniciadora" como usado no presente contexto refere-se a uma cultura de um ou mais microrganismos de grau alimentício, em particular bactérias do ácido láctico, que são responsáveis pela acidificação da base láctea. Culturas iniciadoras podem ser frescas, congeladas ou seca por congelamento. Para a produção de um produto lácteo fermentado, o iniciador pode ser adicionado em qualquer quantidade. Tipicamente, o iniciador é adicionado em uma quantidade para obter uma concentração de 0,001 a 3 %, preferivelmente de 0,001 a 0,025 % em volume da quantidade total de leite.

[021] Os termos "deficiência no metabolismo da lactose" e "deficiente em lactose" são usados no contexto da presente invenção para caracterizar LAB que parcialmente ou completamente perdeu a capacidade de usar lactose como uma fonte para o crescimento celular ou manutenção da viabilidade celular. As respectivas LAB são capazes de metabolizar um ou vários carboidratos selecionados do grupo consistindo em sacarose, galactose e glicose, ou um outro carboidrato fermentável. Visto que estes carboidratos não estão naturalmente presentes no leite em quantidades suficientes para sustentar a fermentação por mutantes deficientes em lactose, será necessário adicionar estes carboidratos ao leite. LAB parcialmente deficiente e deficiente em lactose pode ser caracterizada como colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal.

[022] Em um aspecto, a presente invenção, portanto, fornece um método de produzir um produto lácteo fermentado compreendendo adicionar bactérias do ácido láctico ao leite, em que as bactérias compreendem Lactobacillus casei e pelo menos uma cepa adicional de bactérias do ácido láctico de uma espécie exceto Lactobacillus casei, em que a pelo menos uma cepa adicional de bactérias do ácido láctico tendo uma deficiência no metabolismo da lactose é capaz de metabolizar um ou mais carboidratos selecionados do grupo consistindo em sacarose, galactose e glicose, e em que o dito carboidrato é adicionado ao leite antes da fermentação.

[023] Em uma modalidade preferida, um método de produzir um produto lácteo fermentado é fornecido, em que a cepa com uma deficiência no metabolismo da lactose é uma cepa proteolítica, por exemplo uma cepa proteolítica de S. thermophilus, mais preferivelmente a cepa adicional com uma deficiência no metabolismo da lactose é S. thermophilus DSM 28952.

[024] Como indicado acima, o crescimento da cepa adicional acelera o crescimento de L. casei, que é aparentemente devido ao fato de que a cepa adicional fornece aminoácidos e peptídeos no leite por proteólise de caseína e outras proteínas do leite. Consequentemente, o uso de uma outra LAB com atividade proteolítica representa uma modalidade vantajosa da presente invenção.

[025] De acordo com a presente invenção, uma LAB é uma LAB proteolítica se ela contém uma proteinase ativa da parede celular. Uma proteinase da parede celular hidrolisa as proteínas do leite, tais como caseína, e assim melhora a qualidade do leite como um meio para o crescimento rápido de LAB tendo auxotrofias de aminoácido. Proteinases da parede celular foram identificadas e caracterizadas em detalhe em numerosas LAB, incluindo a PrtP de L. lactis, a PrtS de S. thermophilus e a PrtB de Lb. bulgaricus. LAB proteolítica pode, assim, ser identificada pela presença do gene que codifica a proteinase da parede celular.

[026] Adicionalmente, LAB proteolítica pode ser identificada pelo ensaio de caseína rotulada com isotiocianato de fluoresceína ou caseína conjugada com FITC para substrato fluorescente, em que um aumento na fluorescência causada pelo crescimento da cepa por 6 horas em um meio contendo caseína fluorescentemente rotulada em comparação às amostras de controle sem células da cepa é determinado. Os detalhes completos do ensaio são fornecidos no Exemplo 1.

[027] Consequentemente, a presente invenção fornece métodos de produzir um produto lácteo fermentado compreendendo adicionar bactérias do ácido láctico ao leite, em que as bactérias compreendem Lactobacillus casei e pelo menos uma cepa adicional de bactérias do ácido láctico de uma espécie exceto Lactobacillus casei, em que a cepa adicional tem uma deficiência no metabolismo da lactose mas é capaz de metabolizar um ou vários carboidratos exceto lactose presentes no leite e em que a cepa adicional com uma deficiência no metabolismo da lactose é uma cepa proteolítica de S. thermophilus, em que uma cepa proteolítica é caracterizada: (a) pela presença de uma proteinase ativa da parede celular; e/ou (b) por um aumento na fluorescência causada pelo crescimento da cepa por 6 horas em um meio contendo caseína fluorescentemente rotulada em comparação às amostras de controle.

[028] Em uma modalidade particular do método da invenção, a cepa adicional com uma deficiência no metabolismo da lactose é uma cepa proteolítica de S. thermophilus, em que uma cepa proteolítica é caracterizada: (a) pela presença de uma proteinase ativa da parede celular; e/ou (b) por um aumento na fluorescência causada pelo crescimento da cepa por 6 horas em um meio contendo caseína fluorescentemente rotulada em comparação às amostras de controle.

[029] Em uma modalidade particular do método da invenção, a cepa de S. thermophilus proteolítica é selecionada do grupo consistindo em: (a) uma cepa de Streptococcus thermophilus, cepa esta que é: (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12-06-2014 sob o no de acesso DSM 28952; (ii) ou uma cepa derivada de DSM 28952, em que a cepa derivada é caracterizada ainda como tendo a capacidade de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal; (b) uma cepa de Streptococcus thermophilus, cepa esta que é: (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12-06-2014 sob o no de acesso DSM 28953; (ii) ou uma cepa derivada de DSM 28953, em que a cepa derivada é caracterizada ainda como tendo a capacidade de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal;

[030] Em uma modalidade particular do método da invenção, a cepa de Lactobacillus casei é selecionada do grupo consistindo em L. casei, CRL 431 depositada como ATCC 55544 e L. casei, CHCC2115 depositada como DSM19465.

[031] Em um outro aspecto o método da presente invenção usa bactérias do ácido láctico selecionadas de uma ou mais das cepas seguintes: (a) L. casei, CRL 431 depositada como ATCC 55544; (b) L. casei, CHCC2115 depositada como DSM19465; (c) S. thermophilus, CHCC17861 depositada como DSM28952, uma cepa com uma deficiência no metabolismo da lactose.

[032] Em um aspecto preferido os métodos usam bactérias do ácido láctico selecionadas de uma da combinação seguinte de cepas: (i) L. casei, CRL 431 depositada como ATCC 55544, e S. thermophilus, CHCC17861 depositada como DSM 28952, uma cepa com uma deficiência no metabolismo da lactose; ou (ii) L. casei, CHCC2115 depositada como DSM19465 com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 27-06-2007, e S. thermophilus, CHCC17861 depositada como DSM 28952, uma cepa com uma deficiência no metabolismo da lactose.

[033] LAB deficiente em lactose e métodos de produzir as mesmas foram geralmente descritos, exemplificados e depositados em Pedidos de Patentes prévios, incluindo WO 2013/160413, PCT/EP2015/063767 e PCT/EP2015/063742, que descrevem métodos para produzir LAB com uma deficiência no metabolismo da lactose e cepas específicas obtidas por estes métodos.

[034] Qualquer LAB com uma deficiência no metabolismo da lactose e misturas de cepas diferentes podem ser usadas no método da presente invenção. Em uma modalidade preferida do método da invenção, a cepa adicional com deficiência em lactose é selecionada do grupo consistindo em Streptococcus thermophilus (ST) e Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus (LB). Estas LAB deficientes em lactose metabolizam um carboidrato exceto lactose, por exemplo sacarose. Em uma modalidade preferida do método da invenção, a cepa adicional é selecionada do grupo consistindo em: (a) uma cepa de Streptococcus thermophilus, cepa esta que é: (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12-06-2014 sob o no de acesso DSM 28952; (ii) ou uma cepa derivada de DSM 28952, em que a cepa derivada é caracterizada ainda como tendo a capacidade de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal; (b) uma cepa de Streptococcus thermophilus, cepa esta que é: (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12-06-2014 sob o no de acesso DSM 28953; (ii) ou uma cepa derivada de DSM 28953, em que a cepa derivada é caracterizada ainda como tendo a capacidade de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal; (c) uma cepa de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, cepa esta que é: (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12-06-2014 sob o no de acesso DSM 28910; (ii) ou uma cepa derivada de DSM 28910, em que a cepa derivada é caracterizada ainda como tendo a capacidade de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal.

[035] O termo "capaz de metabolizar um ou vários carboidratos exceto lactose presentes no leite" é usado no contexto da presente invenção para descrever a atividade metabólica de LAB deficiente em lactose que causa a produção de ácido láctico como o principal produto final metabólico da fermentação de carboidrato usando um carboidrato exceto lactose. Para obter atividade metabólica detectável na base de um carboidrato exceto lactose, os outros carboidratos podem ter que ser adicionados ao leite.

[036] Em certas modalidades, os métodos da presente invenção usam LAB capazes de metabolizar sacarose, galactose e/ou glicose. A invenção, portanto, fornece métodos, em que sacarose, galactose e/ou glicose são adicionadas ao leite antes da fermentação. A quantidade de carboidratos a serem adicionados ao leite pode ser facilmente determinada na base das LAB usadas e da acidificação desejada principalmente causada pelas LAB exceto L. casei. Na maioria dos exemplos, sacarose, galactose e/ou glicose são adicionadas ao leite em uma quantidade que resulta em uma concentração na faixa de 0,4 g/l a 10 g/l, ou na faixa de 1 g/l a 8 g/l ou na faixa de 2 g/l a 6 g/l.

[037] A razão de contagem de célula bacteriana de L. casei e pelo menos uma cepa adicional de LAB com uma deficiência no metabolismo da lactose na cultura iniciadora ou no leite no começo da fermentação pode ser facilmente determinada por uma pessoa de habilidade comum. Em uma modalidade particular a razão está na faixa de L. casei: outra cepa de LAB de 95:5 a 5:95. Uma razão preferida está na faixa de 80:20 a 20:80, preferivelmente 70:30 a 30:70, mais preferivelmente 60:40 a 40:60, tal como cerca de 50:50.

[038] Em uma modalidade dos métodos da presente invenção, a fermentação é realizada em uma temperatura entre 22 e 45 °C, preferivelmente em torno de 30 °C. A fermentação é comumente realizada até um pH abaixo de 4,5 é atingido, preferivelmente um pH em torno de 4,0, tal como um pH entre 3,7 e 4,3.

[039] Os métodos da presente invenção são, em particular, caracterizados por obter concentrações altas de L. casei, preferivelmente uma concentração de 1 x 108 a 5 x 109 CFU/g, mais preferivelmente 1 x 109 a 5 x 109 CFU/g, e principalmente 1 x 109 a 3 x 109 CFU/g. Estas concentrações são obtidas em um período de tempo relativamente curto, por exemplo em um período entre 30 e 50 horas, o mais preferivelmente em um período entre 35 e 45 horas.

[040] A presente invenção, em particular, fornece métodos de produzir um produto lácteo fermentado compreendendo adicionar bactérias do ácido láctico ao leite, em que as bactérias compreendem: (a) L. casei e (b) uma bactéria com uma deficiência no metabolismo da lactose selecionada da Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus e misturas destas, em que as bactérias são adicionadas ao leite em uma razão de (a):(b) de 95:5 a 5:95, e em que o método produz uma concentração de L. casei de 1 x 108 a 1 x 1011 CFU/g em um período de 35 e 45 horas.

[041] A presente invenção fornece ainda métodos de produzir um produto lácteo fermentado compreendendo adicionar bactérias do ácido láctico ao leite, em que as bactérias compreendem: (a) uma cepa de L. casei selecionada de (i) L. casei, CRL 431 depositada como ATCC 55544; e/ou (ii) L. casei, CHCC2115 depositada como DSM19465; (b) uma bactéria com uma deficiência no metabolismo da lactose selecionada da Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus e misturas destas, preferivelmente compreendendo a cepa S. thermophilus, CHCC17861 depositada como DSM 28952; em que as bactérias são adicionadas ao leite em uma razão de (a):(b) de 95:5 a 5:95, e em que o método produz uma concentração de L. casei de 1 x 108 a 1 x 1011 CFU/g em um período de 35 e 45 horas.

[042] Em uma modalidade preferida, a pelo menos uma cepa adicional de bactérias do ácido láctico com uma deficiência no metabolismo da lactose é uma bactéria da espécie selecionada do grupo consistindo em Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

[043] Em uma modalidade particular do método da invenção, a pelo menos uma cepa adicional de bactérias do ácido láctico tendo uma deficiência no metabolismo da lactose é uma bactéria da espécie Streptococcus thermophilus.

[044] Em uma modalidade particular do método da invenção, a pelo menos uma cepa adicional de bactérias do ácido láctico tendo uma deficiência no metabolismo da lactose é uma bactéria da espécie Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

[045] Em uma modalidade relacionada, a presente invenção fornece o uso de bactérias L. casei e pelo menos uma cepa adicional de bactérias do ácido láctico de uma espécie exceto L. casei, para produzir um produto lácteo fermentado, em que a cepa adicional tem uma deficiência no metabolismo da lactose mas é capaz de metabolizar um ou vários carboidratos exceto lactose presentes no leite. Este uso de bactérias L. casei e de a pelo menos uma cepa adicional de bactérias do ácido láctico pode compreender a adição de sacarose, galactose e/ou glicose ao leite.

[046] Em modalidades preferidas, o uso também é caracterizado em que a pelo menos uma cepa adicional de bactérias do ácido láctico com uma deficiência no metabolismo da lactose é uma bactéria da espécie selecionada do grupo consistindo em Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

[047] Em um aspecto separado, a presente invenção fornece composições compreendendo bactérias da espécie L. casei e bactérias de pelo menos uma cepa adicional de bactérias do ácido láctico, em que a pelo menos uma cepa adicional de bactérias do ácido láctico tem uma deficiência no metabolismo da lactose. Em uma modalidade particular da invenção, a composição compreende bactérias da espécie Lactobacillus casei e bactérias de pelo menos uma cepa adicional de bactérias do ácido láctico de acordo com a reivindicação 10, em que a pelo menos uma outra bactéria é uma bactéria da espécie selecionada do grupo consistindo em Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

[048] A composição da presente invenção pode compreender qualquer número de componentes adicionais, incluindo leite fermentado, aditivos alimentares, estabilizadores, agentes crioprotetivos, agentes flavorizantes, adoçantes artificiais e semelhantes. A composição pode ser usada como uma cultura iniciadora para a produção de produtos lácteos fermentados usando os métodos da presente invenção como descrito acima.

[049] Alternativamente, estas composições representam os produtos lácteos fermentados como tal.

[050] A presente invenção refere-se ainda a um produto alimentício compreendendo bactérias da espécie L. casei e bactérias de pelo menos uma cepa adicional de bactérias do ácido láctico, em que a pelo menos uma cepa adicional de bactérias do ácido láctico tem uma deficiência no metabolismo da lactose.

[051] Em uma modalidade particular do produto alimentício da invenção, a pelo menos uma cepa adicional de bactérias do ácido láctico é uma bactéria da espécie selecionada do grupo consistindo em Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

[052] Uma modalidade particular do produto alimentício da invenção compreende L. casei em uma concentração de 1 x 108 CFU/g a 5 x 109 CFU/g, preferivelmente 1 x 109 CFU/g a 5 x 109 CFU/g, e mais preferivelmente 1 x 109 CFU/g a 3 x 109 CFU/g.

[053] Em uma modalidade particular do produto alimentício da invenção, o produto alimentício é uma bebida láctea fermentada.

[054] Em modalidades particularmente preferidas, os produtos alimentícios compreendem: (a) L. casei em uma concentração de L. casei de 1 x 108 a 1 x 1011 CFU/g ou em uma concentração de 1 x 109 a 1 x 1011 CFU/g e (b) uma bactéria com uma deficiência no metabolismo da lactose selecionada da Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus e misturas destas.

[055] A presente invenção, por exemplo, fornece produtos alimentícios compreendendo: (a) uma cepa de L. casei em uma concentração de L. casei de 1 x 108 a 1 x 1011 CFU/g ou em uma concentração de 1 x 109 a 1 x 1011 CFU/g, em que a cepa é selecionada de: (i) L. casei, CRL 431 depositada como ATCC 55544; e/ou (ii) L. casei, CHCC2115 depositada como DSM19465; e (b) uma bactéria com uma deficiência no metabolismo da lactose selecionada da Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus e misturas destas, preferivelmente compreendendo S. thermophilus, CHCC17861.

[056] Qualquer produto alimentício pode ser qualquer produto lácteo fermentado, incluindo iogurte, iogurte de fruta, iogurte bebível ou queijo.

[057] No contexto do presente pedido, o termo "iogurte" refere-se a produtos compreendendo Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus e opcionalmente outros microrganismos tais como Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Bifidobacterium animalis subsp. lactis, Lactococcus lactis, Lactobacillus acidophilus e Lactobacillus paracasei, ou qualquer microrganismo derivado destes. As cepas de ácido láctico exceto Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, são incluídas para fornecer ao produto acabado várias propriedades, tal como a propriedade de promover o equilíbrio da flora. Como usado aqui, o termo "iogurte" abrange iogurte firme, iogurte batido, iogurte para beber, Petit Suisse, iogurte tratado com calor, iogurte drenado ou estilo grego caracterizado por um alto nível proteico e produtos semelhantes a iogurte.

[058] Em particular, o termo "iogurte" abrange, mas não é limitado a, iogurte como definido de acordo com regulamentações francesas e europeias, por exemplo, produtos lácteos coagulados obtidos por fermentação de ácido láctico por meio de bactérias do ácido láctico termofílicas específicas apenas (isto é, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus e Streptococcus thermophilus) que são cultivadas simultaneamente e são encontradas vivas no produto final em uma quantidade de pelo menos 10 milhões de CFU (unidade de formação de colônia)/g. Iogurtes podem, opcionalmente, conter matérias-primas lácteas adicionadas (por exemplo, creme) ou outros ingredientes tais como açúcar ou agentes adoçantes, um ou mais flavorizantes, fruta, cereais, ou substâncias nutricionais, especialmente vitaminas, minerais e fibras, assim como estabilizadores e espessantes. Em uma alternativa, o iogurte satisfaz as especificações para leites e iogurtes fermentados do padrão AFNOR NF 04-600 e/ou do padrão codex StanA-lla-1975. De modo a satisfazer o padrão AFNOR NF 04-600, o produto não deve ter sido aquecido depois da fermentação e as matérias-primas lácteas devem representar um mínimo de 70 % (m/m) do produto acabado.

[059] Os produtos alimentícios da presente invenção também compreendem queijo, incluindo queijo muçarela, para pizza e feta produzido aplicando-se os métodos descritos acima para a tecnologia de produção de queijo bem conhecida na técnica (Hoier et al. (2010) em The Technology of Cheesemaking, 2a Ed. Blackwell Publishing, Oxford; 166 - 192).

[060] Em uma modalidade preferida, a presente invenção fornece uma bebida láctea fermentada, tal como um iogurte fermentado, obtido pelos métodos descritos acima. Uma bebida láctea fermentada pode, por exemplo, ser caracterizada como compreendendo: (a) L. casei em uma concentração de L. casei de 1 x 108 a 1 x 1011 CFU/g ou em uma concentração de 1 x 109 a 1 x 1011 CFU/g e (b) uma bactéria com uma deficiência no metabolismo da lactose selecionada da Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus e misturas destas.

[061] Esta bebida láctea fermentada pode, em particular, compreender: (a) uma cepa de L. casei em uma concentração de L. casei de 1 x 108 a 1 x 1011 CFU/g ou em uma concentração de 1 x 109 a 1 x 1011 CFU/g, em que a cepa é selecionada de: (1) L. casei, CRL 431 depositada como ATCC 55544; e/ou (ii) L. casei, CHCC2115 depositada como DSM 19465; e (b) uma bactéria com uma deficiência no metabolismo da lactose selecionada da Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus e misturas destas, preferivelmente compreendendo S. thermophilus, CHCC17861. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[062] A FIGURA 1 mostra curvas de acidificação do leite usando culturas iniciadoras diferentes.

[063] A FIGURA 2 mostra contagens de células (CFU/g) de L. casei depois da fermentação e armazenamento.

[064] A FIGURA 3 mostra contagens de células (CFU/g) de L. casei depois da fermentação e armazenamento. EXEMPLO 1

[065] Ensaio FITC: Protocolo para medir a atividade de proteinase em bactérias do ácido láctico (LAB), utilizando a unidade de manejo de líquido de Hamilton.

[066] A(s) proteinase(s) associada(s) à parede celular contribuem para o crescimento rápido de LAB no leite. As proteinases também são responsáveis pela primeira etapa na degradação de caseína e, desse modo, o desenvolvimento de flavor. O ensaio é fundamentado na caseína rotulada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) para substrato fluorescente.

MATERIAIS

[067] Placa de reservatórios profundos Costar - 2,0 ml

[068] Placas microtituladoras: Nunc, placas pretas, (Cat. No 237105), Nunc (produto no 167008), placa de PCR MJR (em forma de V, produto no HSP-9665)

[069] Robô de manejo de líquido de Hamilton

[070] Agulhas estéreis descartáveis de Hamilton

[071] Cloreto de cálcio di-hidratado (Cat. Merck No 1.02382.1000)

[072] Hidrato de MES, titulação mínima a 99,5 % (Sigma M8250 - 1 kg)

[073] Tris, (Cat. Sigma No T1503)

[074] Amostras em placa de reservatórios profundos Costar (2,0 ml)

[075] Enspire, leitor de rótulos múltiplos 2300, PerkinElmer

[076] Cepas de Controle: LH-Emfour, lote no 2995517, no do material 501638

[077] LH-32 lote no 2990465, material no 616703 adicionado como DVS descongelada (50 μl) para crescer durante a noite. Quando do uso de um novo lote de controle, comparar a atividade proteolítica ao lote antigo antes do uso.

[078] 500 mM de Tris-HCL, pH 8,5:

[079] 60,55 g de Tris-HCl. Adicionar água Milli-Q até 800 ml, ajustar o pH para 8,5 com HCl 1M. Encher com água Milli-Q até 1000 ml.

[080] FITC, caseína rotulada com FITC (Sigma C3777)

[081] 5 mg/ml de FITC, preparada em água Milli-Q filtrada estéril.

[082] MES 100 mM + CaCl2, pH 6,5

[083] 19,52 g de MES e 7,35 g de CaCl2. Adicionar água até 800 ml, ajustar o pH para 6,5, encher com água até 1000 ml, filtro estéril.

[084] 5 % de TCA

[085] 5 g de ácido acético triclórico são dissolvidos em água Milli- Q a um volume total de 100 ml.

[086] Meio de cultivo: caldo BD5-3

MÉTODOS Lavagem das células

[087] As cepas são cultivadas durante a noite na diluição apropriada, uma inoculação a 10% de WS-Plate em placa de reservatórios profundos com 1800 μl de caldo BD5-3. Lactococcus sp. são incubados a 30°C; Lactobacillus sp. e Streptococcus sp. são incubados a 37°C. Lavar 3 x com tampão de MES frio no pH 6,5 (centrifugar a placa de reservatórios profundos depois de cada lavagem, 4000 rpm por 4 min a 10 °C), medir OD620, e a partir daí tirar amostras para atividade de proteinase em substrato FITC e incubar a placa a 37°C por 6 h.

Protocolo de FITC

[088] - Dispensar 8 μl de solução de FITC a uma placa microtituladora de PCR MJR (reservatórios em forma de V de modo a minimizar a evaporação durante a incubação).

[089] - Dispensar 40 μl de suspensão celular lavada à placa microtituladora de PCR MJR & vedar as placas.

[090] - Incubar a placa microtituladora de PCR MJR por 0 a 6 h a 37 °C (Lb’s & St’s).

[091] - Dispensar 115 μl de TCA a 5 % p/v à placa microtituladora de PCR MJR.

[092] - Incubar a placa microtituladora de PCR MRJ por 1 h na temperatura ambiente ou 30 min em banho de gelo.

[093] - Centrifugar a placa microtituladora de PCR MJR (3700 rpm por 10 min, 10°C).

[094] - Dispensar 125 μl de Tris-HCl 0,5 M (pH 8,5) à placa microtituladora Nunc Black.

[095] - Aspirar 45 μl da placa microtituladora de PCR MJR para a placa microtituladora preta Nunc.

[096] - Ler a fluorescência em Excitação de 497 nm - Emissão de 515 nm, em leitor de rótulos múltiplos 2300, Enspire, PerkinElmer.

[097] T0 Amostras sem incubação

[098] T6 Amostras foram incubadas por 6 h a 37 °C, imediatamente depois da lavagem com tampão de MES.

[099] Dados do tratamento: Subtrair T0 de T6, fazer gráficos, depois dividir por OD das células lavadas, fazer novos gráficos. Verificar se atividade muito alta é devido a um OD baixo. Verificar se os controles estão em faixa normal.

EXEMPLO 2

[0100] Leite foi fermentado usando uma das duas cepas de L. casei diferentes seguintes de Chr. Hansen sozinhas ou em combinação com a cepa de Streptococcus thermophilus seguinte de Chr. Hansen: L. casei CRL 431 depositada como ATCC 55544; L. casei 01, CHCC2115 depositada como DSM19465; e S. thermophilus, CHCC17861 depositada como S. thermophilus DSM 28952.

[0101] A cepa de S. thermophilus tem uma deficiência no metabolismo da lactose.

[0102] Quando usadas em combinação, as razões seguintes foram usadas: (1) 50:50 (2) 90:90; e (3) 10:90.

[0103] S. thermophilus com uma deficiência no metabolismo da lactose sozinha e cada uma das duas cepas de L. casei sozinhas foram usadas como controles.

[0104] Leite padrão foi usado para as experiências (3,8 % de proteína, 1,5 % de gordura). Sacarose (0,4 % p/v) foi adicionada ao leite para permitir a acidificação rápida da S. thermophilus com uma deficiência no metabolismo da lactose até o pH 5,50. A acidificação foi realizada a 39 °C e a 37 °C.

[0105] O desenvolvimento do pH foi determinado durante a fermentação. O desenvolvimento da contagem de células foi determinado nos dias 1, 7 e 14 depois da fermentação.

[0106] Três repetições foram realizadas para confirmar os dados.

[0107] Resultados típicos são ilustrados nas Figuras 1 e 2. Como mostrado na Figura 1, L. casei 01 sozinha tem uma fase de latência muito longa e atinge o pH 4,5 apenas depois de 40 h de fermentação. Entretanto, quando combinada com S. thermophilus com uma deficiência no metabolismo da lactose em diferentes razões a fase de latência é significantemente reduzida (8 h para L. casei 01 sozinha para obter o pH 6,3; ao passo que apenas 1 h quando combinada com S. thermophilus com uma deficiência no metabolismo da lactose). S. thermophilus com uma deficiência no metabolismo da lactose sozinha reduziu o valor de pH para um pH final de 5,1 depois da supressão de sacarose. Entretanto, quando combinada com L. casei 01, a acidificação continua devido à presença de L. casei 01, que é capaz de usar a lactose presente no leite.

[0108] Os mesmos resultados foram obtidos usando L. casei CRL 431 e em experiências realizadas a 37 °C (dados não mostrados).

[0109] As contagens de células de L. casei 01 são mostradas na Figura 2. A Figura 2 mostra que a co-cultura de L. casei 01 e S. thermophilus com uma deficiência no metabolismo da lactose não reduz as contagens de células de L. casei, em comparação à única fermentação de cepa.

[0110] Como uma consequência, a combinação de L. casei 01 com uma Lac (-) ST estimula a L. casei 01 sem interromper seu crescimento (nenhuma competição). A combinação permite uma redução alta da fase de latência enquanto mantendo as contagens de células altas.

EXEMPLO 3

[0111] Leite foi fermentado usando a cepa de L. casei seguinte de Chr. Hansen sozinha ou em combinação com as cepas de Streptococcus thermophilus seguintes de Chr. Hansen:

[0112] L. casei CRL 431 depositada como ATCC 55544; em combinação com 1) S. thermophilus, CHCC17861 depositada como S. thermophilus DSM 28952. A cepa tem uma deficiência no metabolismo da lactose (Lac(-)); ou 2) S. thermophilus, CHCC11977 depositada como DSM22935, sem nenhuma deficiência no metabolismo da lactose (cepa-mãe de CHCC17861) (Lac(+)).

[0113] Quando usada em combinação a razão seguinte foi usada: (1) 50:50

[0114] A base láctea usada para o presente experimento é Leite em Pó Desnatado (SMP) reconstituído em 9,6%. A base láctea foi submetida a tratamento térmico a 99 0C por 15 minutos. Sacarose (0,3% p/v) foi adicionada ao leite para permitir a acidificação rápida da S. thermophilus com uma deficiência no metabolismo da lactose ao pH 5,50. A acidificação foi realizada a 39°C.

[0115] O desenvolvimento de contagem de células foi determinado 40 horas depois da fermentação.

[0116] Uma repetição do experimento foi realizada.

[0117] Como aparecerá a partir da Figura 3 a contagem de células de L. casei foi significantemente reduzida, quando a cepa de L. casei foi cultivada junto com uma cepa de S. thermophilus convencional (nenhuma deficiência no metabolismo da lactose (Lac(+)) quando comparado a quando a L. casei é cultivada sozinha. Também, a contagem de células de L. casei foi significantemente aumentada, quando a cepa de L. casei foi cultivada junto com uma cepa de S. thermophilus com uma deficiência no metabolismo da lactose (Lac(-)) quando comparado a quando a L. casei é cultivada sozinha.

DEPÓSITOS E SOLUÇÃO DO ESPECIALISTA

[0118] O Requerente requer que uma amostra do microrganismo depositado deva ser feita disponível apenas a um especialista aprovado pelo Requerente.

[0119] Cepa de Streptococcus thermophilus depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12-06-2014 sob o no de acesso DSM 28952.

[0120] Cepa de Streptococcus thermophilus depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12-06-2014 sob o no de acesso DSM 28953.

[0121] Cepa de Streptococcus thermophilus depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 08-09-2009 sob o no de acesso DSM22935.

[0122] Cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12-062014 sob o no de acesso DSM28910.

[0123] Cepa de Lactobacillus casei depositada com DSMZ- Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 27-06-2007 sob o no de acesso DSM19465.

[0124] Os depósitos foram feitos de acordo com o Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de microrganismos para os propósitos do procedimento de patente.

Claims

1. Método de produzir um produto lácteo fermentado, caracterizado pelo fato de que compreende adicionar bactérias do ácido láctico ao leite, em que as bactérias compreendem Lactobacillus casei e uma ou mais cepa(s) adicional(is) de bactérias do ácido láctico de uma espécie exceto Lactobacillus casei, em que a cepa adicional: tem uma deficiência no metabolismo da lactose, mas é capaz de metabolizar um ou vários carboidratos, exceto lactose, presentes no leite, tem a capacidade de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal; e é uma bactéria das espécies selecionadas do grupo que consiste em Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

2. Método de produzir um produto lácteo fermentado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a(s) uma ou mais cepa(s) adicional(is) de bactérias do ácido láctico tendo uma deficiência no metabolismo da lactose é capaz de metabolizar um ou mais carboidratos selecionados do grupo consistindo em sacarose, galactose e glicose, e em que o dito carboidrato é adicionado ao leite antes da fermentação.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a cepa de Lactobacillus casei é selecionada do grupo consistindo em L. casei, CRL 431 depositada como ATCC 55544 e L. casei, CHCC2115 depositada como DSM19465.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a cepa adicional é selecionada do grupo consistindo em: (a) uma cepa de Streptococcus thermophilus, cepa esta que é: (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12-06-2014 sob o no de acesso DSM 28952; (ii) ou uma cepa derivada de DSM 28952, em que a cepa derivada tem características ainda de ser capaz de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal; (b) uma cepa de Streptococcus thermophilus, cepa esta que é: (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12-06-2014 sob o no de acesso DSM 28953; (ii) ou uma cepa derivada de DSM 28953, em que a cepa derivada tem características ainda de ser capaz de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal; (c) uma cepa de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, cepa esta que é: (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12-06-2014 sob o no de acesso DSM 28910; (ii) ou uma cepa derivada de DSM 28910, em que a cepa derivada tem características ainda de ser capaz de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a cepa adicional com uma deficiência no metabolismo da lactose é uma cepa proteolítica de S. thermophilus, em que uma cepa proteolítica é caracterizada: (a) pela presença de uma proteinase ativa da parede celular; e/ou (b) por um aumento na fluorescência causado pelo crescimento da cepa por 6 horas em um meio contendo caseína fluorescentemente rotulada em comparação às amostras de controle.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o método produz L. casei em uma concentração de 1 x 108 a 5 x 109 CFU/g, preferivelmente 1 x 109 a 5 x 109 CFU/g, mais preferivelmente 1 x 109 a 3 x 109 CFU/g.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a adição de sacarose, galactose e/ou glicose ao leite.

8. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende bactérias da espécie L. casei e bactérias de uma ou mais cepa(s) adicional(is) de bactérias do ácido láctico de uma espécie diferente de Lactobacillus casei, em que a(s) uma ou mais cepa(s) adicional(is) de bactérias do ácido láctico apresenta(m) uma deficiência no metabolismo da lactose mas é(são) capaz(es) de metabolizar um ou vários carboidratos além da lactose presente no leite.

9. Composição compreendendo bactérias da espécie L. casei e bactérias de uma ou mais cepa(s) de bactérias do ácido lático, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que uma ou mais bactéria(s) adicional(is) é(são) uma bactéria das espécies selecionadas do grupo que consiste em Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

10. Produto alimentício, caracterizado pelo fato de que compreende bactérias da espécie L. casei e bactérias de uma ou mais cepa(s) adicional(is) de bactérias do ácido láctico de uma espécie diferente de Lactobacillus casei, em que a(s) uma ou mais cepa(s) adicional(is) de bactérias do ácido láctico apresenta(m) uma deficiência no metabolismo da lactose mas é(são) capaz(es) de metabolizar um ou vários carboidratos além da lactose presente no leite.

11. Produto alimentício, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a(s) uma ou mais cepa(s) adicional(is) de bactérias do ácido láctico é(são) uma bactéria das espécies selecionadas do grupo consistindo em Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

12. Produto alimentício, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que compreende L. casei em uma concentração de 1 x 108 CFU/g a 5 x 109 CFU/g, preferivelmente 1 x 109 CFU/g a 5 x 109 CFU/g, e mais preferivelmente 1 x 109 CFU/g a 3 x 109 CFU/g.

13. Produto alimentício, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que o produto alimentício é uma bebida láctea fermentada.