JPS63126489A - フエニルアラニンのラセミ化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、フェニルアラニンのラセミ化方法に関し、
この方法はＤＬ−フェニルアラニンの光学分割により生
ずるし−あるいはＤ−フェニルアラニンのラセミ化のた
めに有用である。

〔従来の技術〕

従来、Ｌ−及びＤ一体のアミノ酸を基質として、それら
のラセミ化反応を触媒するアミノ酸ラセマーゼが数種類
知られている〔左右田、生上学、４６゜２０３、（１９
７４）　）。ところが、芳香族アミノ酸に作用する酵素
の存在については、わずかにＡＴＰ関与のフェニルアラ
ニンラセマーゼがバシルス・プレビス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　　ｂｒｅｖｉｓ）において報告されている〔山田ら
、Ｔｈｅム肛担り妊」旦並り虹起ｎ１６６、５２９　、
（１９６９））他、全く知られていない。シュードモナ
ス・ミャミズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　紅■計へ）
の菌体を用いてＤ−フェニルアラニンからＬ一体を得る
方法が報告されている〔千畑ら、ヱＵ−基並、１１．１
６３　、（１９６５））が、この異性化はアミノ基供与
体としてのＬ−アスパラギン酸を必要とすることがらＤ
−アミノ酸オキシダーゼとトランスアミナーゼの共役反
応によると考えられており、ラセミ化反応とは異なる。

一方、アミノ酸の化学的なラセミ化方法として、強酸、
強アルカリあるいはアルデヒドの存在下でアミノ酸を強
熱する方法が知られている〔ヤマダら・ハエ１牡」１没
」好山二江印工辻■、４８．８４３、（１９８３）　）
が、この方法は必ずしも実施が容易ではない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って本発明は、微生物の菌体又はその処理物を用いて
、温和な条件でフェニルアラニンのラセミ化を行なう新
規な方法を提供しようとするものである。

〔問題点を解決するための手段〕

前記の目的は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ＋ｍｏｎ
ａｓ）属に属しフェニルアラニンをラセミ化する能力を
有する細菌の国体又はその処理物の存在下でフェニルア
ラニンをラセミ化することを特徴とするフェニルアラニ
ンのラセミ化方法により達成される。

〔具体的な説明〕

本発明においてフェニルアラニンのラセミ化とは、Ｌ−
フェニルアラニンとＤ−フェニルアラニンとのｌ：１混
合物を生成する方向に向けてＬ−フェニルアラニン又は
Ｄ−フェニルアラニンヲ異性化することを意味する。従
って、Ｌ−フェニルアラニンとＤ−フェニルアラニンと
のｌ：ｌの比率を達成する反応に限定されない。従って
、Ｄ−フェニルアラニンを出発物質としその一部分をＬ
−フェニルアラニンに転換してＤ−フェニルアラニンと
Ｌ−フェニルアラニンとの混合物を生成する反応、Ｌ−
フェニルアラニンを出発物質としその一部分をＤ−フェ
ニルアラニンに転換してＤ−フェニルアラニンとＬ−フ
ェニルアラニンとの混合物を生成する反応、及びＬ−フ
ェニルアラニンとＤ−フェニルアラニンの混合物が１：
ｌでない両者の混合物においてその比率を１：１に近づ
ける異性化反応、はすべて本発明にいうラセミ化に含ま
れる。

（１）微生物 本発明において使用する微生物としてはシュードモナス
属に属し、Ｌ−またはＤ−フェニルアラニンをラセミ化
する能力をもつものであればよく、このような微生物は
保存株から選択することができ、又は自然界から分離す
ることができる。シュードモナス属に属する微生物とし
ては、例えばシュードモナス・プチダ５ＣＲＣ−７４４
を挙げることができる。新菌株シュードモナス・プチダ
５ＣＲＣ−７４４は工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研菌寄第９０３９号（ＦＥＲＭ　Ｐ　−９０３９）
　トｔ、Ｔ−ＴＦ託すしている。

前記の新菌株は次の第１表に示す組成の培地を用いて神
奈川県相模原市の土壌より分離した。

以下余白 】す二表 Ｄ−フェニルアラニン　　　０．２％ 酵母エキス　　　　　　　　０．０５ リン酸二カリウム　　　　　０．２ 塩化ナトリウム　　　　　　０．１ 硫酸マグネシウム　　　　　０．０５ ビタミン混液（−１（ｌ　ｌ 水道水　　　　　　　　　ｐＨ７，０ ビタミン７昆？夜（１ ビオチン　　　　　　　　　　　２μｇパントテン酸カ
ルシウム　　４００ イノシトール　　　　　　　２０００ 塩酸チアミン　　　　　　　　４００ 塩酸ピリドキシン　　　　　２００ ニコチン酸　　　　　　　　４００ ｐ−アミノ安息香酸　　　　２００ リボフラビン　　　　　　　　２００ 葉酸　　　　　　　　　　　　１０ 蒸留水　　　　　　　　　　１００ｆｆｌこの培地を試
験管（φ１Ｂｍｍ）に５ｍｌずつ分注し、１２０℃で１
５分間滅菌した。この培地に各地より採集した土壌サン
プルを少量加え、３７℃で２〜３日間振盪培養した。こ
の培養液を一白金耳とり、同じ培地に接種し、さらに３
７℃で２日間培養した。第１表の培地に２％の寒天を加
えた平板培地に培養液の一部を白金耳を用いて画線塗布
し、３０℃で数日保温した。出現したコロニーを同じ培
地組成の斜面培地に釣菌し、多数の菌株を分離した。

次に、表の培地５ｍｌを同試験管に分注し、同様に滅菌
した。それぞれの菌株をこの培地で３７℃、２０時間振
盪培養し、上清中のＤ−フェニルアラニンの減少が顕著
な菌株を選抜した。この菌株の培養物を、表に示した培
地２００　ｍ　ｌを５００ｍ！！容の三角フラスコに分
注し同様に滅菌したものに接種し、３７℃で２０時間回
転振盪培養した。この培養液から遠心分離で得られた菌
体を超音波により破砕した。これを１２．０ＯＯＸ　ｇ
で遠心分離して得られた上清を、０．１　ｍＭのＥＤＴ
Ａ、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、及び０．１ｎ
＋Ｈのピリドキサール−５′−リン酸を含む０．０１Ｍ
リン酸カリウム”ＭＬ　４ｉｉ液（ｐＨ７，０）でｉ！
ｉ析した。この上清に含まれるアミノ酸ラセマーゼ活性
を、Ｌ−またはＤ−フェニルアラニンより生ずるそれぞ
れの光学異性体を定量することにより測定した。なお、
Ｄ−フェニルアラニンはＤ−アミノ酸オキシダーゼによ
り定量し、Ｌ−フェニルアラニンの定量はＬ−アミノ酸
オキシダーゼ又は、ロイコノストック・メセンテロイデ
ス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉ
ｄｅｓ）ＡＴＣＣ８０４２を用いる微生物定量法によっ
た。

以上のようにして得た前記の新規な菌株は第２表に示す
ような蘭学的性質を有する。

以下余白 １ｍ表 観察項目　　　　　　　　　　　　　　　５ＣＲＣ−７
４４ａ）形態 １　細胞の型　　　　　　　　　　　　桿菌大きさ　　
　　　　　　　　　　１．８　Ｘ　０．７μｍ２　多形
性の有無　　　　　　　　　　なし３　運動性の有無　
　　　　　　　　　十鞭毛の着生状態　　　　　　　　
　極鞭毛４　胞子の有無　　　　　　　　　　　なし５
　グラム染色　　　　　　　　　　　−６抗酸性　　　
　　　　　　　　　　−ｂ）各培地における生育状態 ｌ　肉汁寒天平板培養（３０℃、３日間）イ）コロニー
形状（直径）３１１ ０）コロニーの形　　　　　　　　円形ハ）コロニー表
面の形状　　　　　平滑二）コロニーの隆起状態　　　
　　半レンズ状ホ）コロニーの周縁　　　　　　　金縁
へ）コロニーの色調　　　　　　　淡黄ト）コロニーの
透明度　　　　　　不透明チ）コロニーの光沢　　　　
　　　輝光り）可容性色素の生成　　　　　　　−２肉
汁寒天斜面培養（３０℃、３日間）イ）生育の良否　　
　　　　　　　生育良好口）コロニーの光沢　　　　　
　　輝光３　肉汁液体培養（３０℃、７日間） イ）表面の生育　　　　　　　　　あり（菌環）口）Ｓ
度　　　　　　　　　　　　やや濁るハ）沈殿　　　　
　　　　　　　　粉状二）ガス発生　　　　　　　　　
　なし４　肉汁ゼラチン（３０℃、７日間） ゼラチン液化　　　　　　　　　　　−５リトマスミル
り（３０℃、７日間）アルカリＣ）生理学的性質 １　硝酸塩の還元　　　　　　　　　　　−２脱窒　　
　　　　　　　　　　　　　−３ＭＲ− ４ＶＰ　　　　　　　　　　　　　　　　−５インドー
ル生成　　　　　　　　　　−６硫化水素の生成　　　
　　　　　　　−７　デンプンの加水分解　　　　　　
　　−８クエン酸利用 イ）　Ｋｏｓｅｒ　　　　　　　　　　　　　　　＋口
）　Ｓｉｍｍｏｎｓ　　　　　　　　　　　　　＋ハ）
　Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ　　　　　　　　　　＋９　
硝酸塩の利用　　　　　　　　　　　−１０色素生成 イ）ＫｉｎｇＡ　　培地　　　　　　　　−口）Ｋｉｎ
ｇＢ　　培地　　　　　　　　＋１１　　ウレアーゼ　
　　　　　　　　　　　　＋１２　　オキシダーゼ　　
　　　　　　　　　＋１３　　カタラーゼ　　　　　　
　　　　　　＋１４　　生育の範囲 イ）　ｐＨ５，０−９，０ 口）温度　　　　　　　　　　　　５−４０°Ｃ１５酸
素に対する態度　　　　　　　　好気性１６０−Ｆテス
ト（グルコース）　　　酸化１７　　糖類からの酸およ
び ガスの生成　　　　　　　　　酸　　ガスＩ　Ｌ−アラ
ビノース　　　　−− ２Ｄ−キシロース　　　　　−− ３Ｄ−グルコース　　　　　−− ４Ｄ−マンノース　　　　　　−− ５Ｄ−フラクトース　　　　−− ６Ｄ−ガラクトース　　　　−　　　−７麦芽糖　　　
　　　　　　−− ８シー１糖　　　　　　　　−− ９乳糖　　　　　　　　　　−− １０）レバロース　　　　　　　−　　　−１１Ｄ−ソ
ルビット　　　　　−− １２０−マンニット　　　　　　−− １３グリセリン　　　　　　−− １４デンプン　　　　　　　　　−　　　−１５ラフィ
ノース　　　　　　−　　　−１６イヌリン　　　　　
　　　−− １７Ｄ−リボース　　　　　　−− １８ソルボース　　　　　　　−− １９カルボキシメチル　　　　−− セルロース ２０　　グリコーゲン　　　　　　−　　　−ｄ）抗生
物質に対する怒受性 １　ペニシリンＧ　　　　　　　　− ２ストレプトマイシン　　　　　＋ ３　クロラムフェニコール　　　　＋ ４　テトラサイクリン　　　　　　＋ ５　ノボビオシン　　　　　　　　− ６ポリミキシンＢ　　　　　　　十 〇）その他の諸性質 ＤＮａ　　ｓ　　ｅ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　−リパーゼ　　　　　　　　　　　− レシチナーゼ　　　　　　　　　　− アルギニンの分解　　　　　　　　十 ゼラチンの分解性　　　　　　　　− ビタミン要求性　　　　　　　　　− 耐塩性　５％　　　　　　　　　　＋ ７％　　　　　　　　　　− １０％　　　　　　　　　　− 上記の菌学的性質に基づきＢｅｒ　ｅ　’ｓ　Ｍａｎｕ
ａｌ　ｏｆ−−む１知見１１虹１些遵狂士旦」江、第上
巻、１９８４年の分類基準およびＧｉｂｂｓ　＆　５ｋ
ｉｎｎｅｒによるＩｄｅｎｔｉｆｉｃ−１１幻しμＵお
刈１」ヅ二基辻μゆ士旦旦ｌ互助−に従って、前記の菌
株を次のように同定した。

本閉は、好気性で極鞄毛を持ち運動性を有するダラム陰
性の桿菌であり、肉エキスやペプトンに生育する。また
、オキシダーゼ反応陽性でグルコースを酸化的に分解す
ることから、シュードモナス属に属する細菌であると同
定した。さらに、キングＡ培地で発色せず、橙色の不審
色素や緑色の結晶を生成しないが、キングＢ培地で緑色
の蛍光色素を産生ずること、また４２℃で生育せず、ゼ
ラチンを液化しないこと及び炭素源の利用能等から、シ
ュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　胚
一旦並）であると同定した。

なお、本国に変異を生じさせて一層生産性の高い菌株を
得ることもできる。また、本菌株の細胞中に存在するア
ミノ酸ラセマーゼの生産に関与する遺伝子を切り出し、
これを適切なベクター例えばプラスミドに挿入し、この
ベクターを用いて適当な宿主、例えばエソシエリソヒア
・コリ（Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏ旦）や酵母
のごとき異種宿主またはシュードモナス属菌のごとき同
種宿主を形質転換することにより、本発明のアミノ酸ラ
セマーゼ生産株を人為的に創成することもできる。

この発明の菌株は、常法に従って保存することができ、
例えば寒天スラント上で、または凍結乾燥法により保存
することができる。寒天スラント培地としてはシュード
モナス属菌の保存に常用されている培地、例えば菌の分
離に関して前記した培地を使用することができる。また
凍結乾燥も常法に従って行なうことができる。

（２）微生物の培養 フェニルアラニンをラセミ化する能力をもつシュードモ
ナス属に属する細菌の栄養培地での培養は、一般微生物
の培養と同様に行なわれるが、通常は液体培地による振
盪培養法または通気撹拌培養法により行なわれる。栄養
培地としては、上記の細菌が資化利用できる栄養源を含
有するものであればよい。この培地は、窒素源として例
えば硫安、酵母エキス、ペプトン、肉エキス等の１種類
又は複数種類を含有する。また、この培地には必要に応
じて炭素源としてグルコース、澱粉、グリセリン等を加
えることができる。この培地には無機塩類、例えばリン
酸二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等を
加えることが好ましい。

アミノ酸ラセマーゼを誘導するために、前記基礎培地に
少量のし−もしくはＤ−フェニルアラニン、又はＤＬ−
フェニルアラニンを添加するのが好ましい。このフェニ
ルアラニンの添加量は、基礎培地の組成、培養する菌株
の性質等により異なるがおよそ０．０１〜５　ｗ　／　
ｖ％である。

培養は固体培地又は液体培地のいずれを用いてもよいが
、目的酵素を多量に得るためには、液体培地を用い、振
盪培養、通気・攪拌培養等により好気的条件下で培養を
行なうのが好ましい。培養温度は菌が生育し、アミノ酸
ラセマーゼが生産される温度範囲内であればいずれの温
度でも良いが、好ましくは２５〜３７℃である。ｐｌ＋
は５〜９の範囲である。培養時間は酵素活性が発現され
る一間を選べば良いが好ましくは６〜４８時間である。

こうして、フェニルアラニンをラセミ化する酵素を含有
する培養物が得られる。

（３）酵素含有物の調製 本発明の方法においては、フェニルアラニンをラセミ化
する酵素を含有する菌体又は菌体処理物を使用する。こ
こで、菌体とは、培養により直接得られた培養液中に存
在する菌体、濃縮された培養液中に存在する菌体、培養
液から分離された生菌体等を意味する。また、菌体処理
物とは生菌体を乾燥して得られる乾燥菌体、菌体の細胞
壁を破壊することにより得られる菌体破壊物、これらか
ら得られる抽出物、及び部分精製された酵素粗製物、並
びに前記の菌体又は上記の種々の態様の菌体処理物を常
法に従って固定化することにより得られる固定化物が挙
げられる。

前記菌体は、培養液を濾過又は遠心分離等により処理す
ることにより容易に得られる。乾燥菌体は、例えば、分
離された生菌体を凍結乾燥法等の穏和な条件下で乾燥す
ることにより、あるいは生菌体をアセトン、エタノール
等の有機溶剤で処理して脱水乾燥することにより得られ
る。菌体破壊物は、菌体の機械的破砕、自己消化、超音
波処理等により調製することができる。又、抽出物は、
上記細胞破壊物から、遠心分離、濾過等の常法に従って
細胞片を除去することにより調製することができる。酵
素粗製物は、前記の酵素含有抽出物を、除核酸処理、硫
安塩析、超遠心分離、二相分離、電気泳動、イオン交換
、吸着、ゲル′濾過、疎水性相互作用、又は親和性吸着
等の各種カラムクロマトグラフィー等、酵素の精製に常
用される手段を単独で、又は複数組合わせて用いること
により調製することができる。固定化物は、例えば担体
結合法、架橋法、又は格子型もしくはマイクロカプセル
型等による包括法等の常法を用いて調製することができ
る。

本発明の方法を精製酵素を用いて行うことができること
は言うまでもない。

（４）ラセミ化反応の実施 本発明のラセミ化方法は、フェニルアラニン基質を前記
のごとき種々の形態の酵素含有物と、水性媒体中で接触
せしめることにより行われる。

フェニルアラニン基質は、Ｌ−フェニルアラニンもしく
はＤ−フェニルアラニン、又はＬ−フェニルアラニンと
Ｄ−フェニルアラニンとの混合物であってその比率が１
：１でないもの、のいずれかである。このような基質と
しては、例えばフェニルアラニンのラセミ体混合物から
し一フェニルアラニン又はＤ−フェニルアラニンを分離
した後の副生物が考えられる。

反応のための水性媒体としては、例えば適当な緩衝液、
例えば酢酸ナトリウム、リン酸カリウム、トリス−塩酸
、グリシン−水酸化ナトリウム、グリシン−塩化カリウ
ム−水酸化カリウム等の緩衝液が使用される。この反応
はｐＨ５〜１１の条件下、好ましくはｐＨ７，５〜９の
条件下において、１０〜８０℃好ましくは３０〜６０℃
の温度範囲内で行なわれる。

反応所要時間は種々の条件により異なるが、通常１０時
間〜３日間である。媒体中の基質フェニルアラニン濃度
は０．１〜５　ｗ　／　ｖ％とするのが好ましい。

ラセミ化反応は回分式又は連続式に行うことができる。

回分法により実施する場合には、前記反応媒体に基質及
び酵素含有物を入れて相互に接触せしめることにより行
う。この場合、反応混合物を静置して行うこともでき、
又は反応混合物を間欠的もしくは連続的に攪拌すること
により基質と酵素含有物との接触を改良することもでき
る。基質は最初に一度に添加することもでき、反応の進
行と共に段階的に又は連続的に添加することもできる。

連続法においては、好ましくは、前記の固定化物をカラ
ムに充填し、このカラムに、基質を溶解した反応媒体を
流過せしめる。

反応終了後、反応液中の菌体を濾過または遠心分離など
により分離除去し、得られた濾液または上清からイオン
交換樹脂法、晶析性などにより、上記反応液中のＤＬ−
フェニルアラニンを分離取得することができる。

次に実施例により、この発明をさらに具体的に説明する
。

災施±エ シュードモナス・プチダ５ＣＲＣ−７４４を、次の組成
の培地１０ｍｆを入れたφ１８１１の試験管に一白金耳
接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。

培地組成 肉エキス　　　　　　　　　　１．０％ペプトン　　　
　　　　　　　１．０ 酵母エキス　　　　　　　　　０．２ ＤＬ−フェニルアラニン　　　０．２ リン酸二カリウム　　　　　　０．２ 塩化ナトリウム　　　　　　　０．１ 硫酸マグネシウム　　　　　　０．０５ｐ）１７．０ 遠心分離により集菌し、０．８５％食塩水で１回洗浄し
た。この菌体を０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　５　ｍＭの
２−メルカプトエタノール及び０．０１ｍＭピリドキサ
ール−５′−リン酸を含む０．０１Ｍリン酸カリウム緩
衝液に懸濁し、超音波破砕することにより菌体抽出物を
得た。これを同緩衝液に透析し、１６．０００Ｘ　ｇで
遠心分離した上清を用い、以下の反応を行った。すなわ
ち、Ｄ−フェニルアラニン６０　μｍｏｌ（９，９ｍｇ
）、ピリドキサール−５′−リン酸３μ＋１１０１　、
）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）　０．２６ｍｍｏｌ
及び上記上清１５０μｌを含む反応液１．５ｍｊ！を３
７℃で４時間反応させた。生じたし一フェニルアラニン
をし一アミノ酸オキシダーゼを用いて定量したところ４
、　Ｔ　μｍｏｌ（０，’７８ｑ）のＬ−フェニルアラ
ニンが生成していた。また、５１として６０μｍｏｌの
し一フェニルアラニンを用いた場合では、５．３μｍｏ
ｌ（０，８８■）のＤ−フェニルアラニンが生成してい
た。

スＪＩＪＬム シュードモナス・プチダ５ＣＲＣ−７４４を実施例１に
示した培地６ｍｌを入れたφ１８鶴の試験管に一白金耳
接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。

これを前接種菌として６００ｍβの同培地を入れた２１
容の三角フラスコに移し、同様に回転振盪培養した。こ
れを、８．０００Ｘ　ｇで１０分間遠心分離し、集菌し
た後、０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液で１回洗浄した
ものから、常法によりアセトン処理菌体１．１８ｇを得
、これを用いて以下の反応を行なった。すなわち、Ｄ−
フェニルアラニン８０μｍｏｌ（１３，２■）、ピリド
キサール−５′−リン酸１μｎｏｔ　ｓ　）リス−塩酸
緩衝液（ｐＨ８，５）　０．１　ｍ、ｍｏｌを含む反応
液１ｍ１ｌに上記菌体２ｍｇを加え、３７℃で２４時間
反応させた。反応後、遠心上清中のフェニルアラニンを
定量したところ、３６．４μｍｏｌ（６，０■）のし−
フェニルアラニンが生成し、Ｄ−フェニルアラニンは４
３．６μｍｏｌ（７，２■）含まれていた。基質として
８０μｍｏｌのＬ−フェニルアラニンを用いた場合では
、４１．８μｍｏｌ（６，９■）のＤ−フェニルアラニ
ンが生成し、Ｌ−フェニルアラニンは３８．２μｍｏｌ
（６，３■）含まれていた。

災宛桝１ シュードモナス・プチダ５ＣＲＣ−７４４を用い、実施
例２と同様にアセトン処理菌体を調製して、以下のよう
に反応を行なった。すなわち、Ｄ−またはＬ−フェニル
アラニン１．９８　ｇ　（１２，０ｍｍｏｌ）、ピリド
キサール−５′−リン酸１５０μｍ１１０１　％　　ト
リス−塩酸緩衝液（ａｌｌ　８．５　）　　１５　ｍｍ
ｏｌを含む反応液１５０ｍＡに上記菌体３２１．８■（
１５０ｍｌ培養液に相当）を加え、３７℃で５０時間反
応させた。遠心上清中のフェニルアラニンをＬ−または
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを用いて定量したところ、Ｄ
−フェニルアラニンを基質とした場合、反応液中に０．
９７　ｇ　（５，９ｍｎ＋ｏｌ）のし−フェニルアラニ
ンと１、０　ｇ　（６，１ｍｍｏｌ）のＤ−フェニルア
ラニンが含まれていた。また、Ｌ−フェニルアラニンを
基質とした場合には、０．９９ｇ　（６，０曙）のＤ−
フェニルアラニンと０．９９　ｇ　（６，Ｏｓｇ）のし
−フェニルアラニンが含まれていた。

そこで、この反応液に２０％トリクロロ酢酸１０．７ｍ
ｌ１を加え、遠心分離により菌体と蛋白を除き、陽イオ
ン交換樹脂ダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）５０Ｗ　−ｘ８
（Ｈ”　）カラムに吸着させ、１Ｍアンモニア水で溶出
させた。フェニルアラニンを含む両分を集め、陰イオン
交換樹脂バイオ・ランドエージ−（ＢＩＯ−ＲＡＤ　Ａ
Ｇ）　　１−ｘ４ＣＣ１−）カラムに吸着させ、１Ｍ’
ｌ酸で溶出させた。フェニルアラニンを含む両分をｆ３
縮乾固した。少量の温水に溶解し、エタノールを５０％
となるように加え冷蔵すると結晶が析出した。この結晶
を同様の操作により再結晶化し、Ｄ−フェニルアラニン
を基質とした場合１．０３ｇ、Ｌ−フェニルアラニンを
基質とした場合には、０．９６ｇの無色固体を得た。こ
れらの旋光度を測定したところ、Ｄ−及びＬ−フェニル
アラニンのいずれを基質とした場合でも光学活性は認め
られず、完全なラセミ体であることが判明した。

災誰班玉 シュードモナス・プチダ５ＣＲＣ−７４４を実施例２に
示した方法で１５１培養した。その洗浄菌体１６３ｇを
超音波破砕し、１２，０００ｘ　ｇで２０分間遠心分離
した上清からアミノ酸ラセマーゼを硫安分画（３０〜６
０％）　、ＤＥＡＩＥ−トヨバール、ＤＥＡＥ−セルロ
ース、ヒドロキシアパタイト、ブチルトヨバール６５０
Ｍ、セファデックスＧ−２００の各カラムクロマトグラ
フィーにより、収率８％、比活性で約３００倍に部分精
製し、３．８■の酵素標品を得た。

この部分精製酵素標品を用いて、以下のように反応を行
なった。

すなわち、Ｄ−フェニルアラニン４０μｎ＋ｏｌ（６，
６■）、ピリドキサール−５′−リン酸２μｌ１１ｏ１
、トリス−塩酸緩衝液（ｐ［１８，５）　３５　、ｃｒ
ｍｏｌおよび上記酵素標品２１μｇを含む反応液１ｍｌ
を３７℃で２０分間反応させた。生じたし一フェニルア
ラニンをＬ−アミノ酸オキシダーゼを用いて定量したと
ころ２μｍｏｌ　　（０，３■）のし−フェニルアラニ
ンが生成していた。また、ＪＡＭとして４０μｍｏｌの
Ｌ−フェニルアラニンを用いた場合で＆；ｉ　３．２μ
ｍｏｌ　　（０，５■）のＤ−フェニルアラニンが生成
していた。

１支■、　　の　−アミノ　の−セミ Ｄ−）リブトファン４０μｍｏｌを実施例４と同条件で
４時間反応したところ、１．７μｍｏｌ　のＬ−トリブ
トファンが生成した。また、Ｄ−チロシン４０ｕｎ＋ｏ
ｌを基質とした場合は、１．２　μｍｏｌのし一チロシ
ンが生成した。

以上のごとく、本発明の・ラセミ化方法は、フェニルア
ラニンのラセミ化のみならず、トリプトファン、チロシ
ン等の芳香族天然アミノ酸、及び種々の芳香族非天然ア
ミノ酸のラセミ化にも広く利用することができ、この場
合の方法は、フェニルアラニンのラセミ化について詳細
に記載した方法と同様である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属
   しフェニルアラニンをラセミ化する能力を有する細菌の
   菌体又はその処理物の存在下でフェニルアラニンをラセ
   ミ化することを特徴とするフェニルアラニンのラセミ化
   方法。 ２、前記細菌がシュードモナス・プチダ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）ＳＣＲＣ−
   ７４４である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、フェニルアラニンをラセミ化することのできるシュ
   ードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌。 ４、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
   ｐｕｔｉｄａ）ＳＣＲＣ−７４４である特許請求の範囲
   第３項記載の細菌。