JPH0678765A - 高活性なｎａｄｈ依存性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】本発明はＮＡＤＨの存在下において、パラヒド
ロキシ安息香酸に作用して、プロトカテキュ酸を生成さ
せる等の所定の酵素学的性質を有するＮＡＤＨ依存性パ
ラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ、およびその製
造方法に関する。 【効果】本発明のＮＡＤＨ依存性パラヒドロキシ安息香
酸ヒドロキシラーゼは、高活性であるとともに、ＮＡＤ
Ｈの存在下において、パラヒドロキシ安息香酸に作用し
て、プロトカテキュ酸を生成する性質を有しているの
で、プロトカテキュ酸の工業生産の実用化に極めて有用
である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＮＡＤＨ依存性パラヒ
ドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼおよびロドコッカス
属に属する細菌の突然変異株を用いた該酵素の製造方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術・発明が解決しようとする課題】プロトカ
テキュ酸は防錆剤、食品用抗酸化剤の製造原料、香料な
どとして用いるバニリンの製造原料、各種医薬品の製造
原料などとして広く用いられている。このプロトカテキ
ュ酸の製造方法としては、有機合成反応によるものと、
高い基質特異性を有する微生物由来の酵素を用いての酵
素反応によるものとが知られている。後者の方法とし
て、パラヒドロキシ安息香酸に酵素としてパラヒドロキ
シ安息香酸ヒドロキシラーゼを作用させることにより、
プロトカテキュ酸を生成させる方法が知られている。ま
た、パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼは、プロ
トカテキュ酸の生成以外の他の用途として、臨床検査の
分野において血清コリンエステラ−ゼ活性の測定法に用
いられる可能性がある。

【０００３】このような従来より報告されているパラヒ
ドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼは、例えば、シュー
ドモナス属の微生物より産生されるもの（J.Biol.Che
m.,241,2453(1966) 、Biochem.Biophys.Res.Communs.,3
4, 1(1969)) 、またマイクロコッカス属の微生物により
産生されるもの（Current Science,54,419(1985)) であ
る。これらの酵素はいずれもＮＡＤＰＨ（ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドリン酸）を補酵素とするもの
であり、微生物により産生されるパラヒドロキシ安息香
酸ヒドロキシラーゼとしては、ＮＡＤＰＨの存在下で反
応が行なわれるＮＡＤＰＨ依存性パラヒドロキシ安息香
酸ヒドロキシラーゼのみが一般に知られているのが現状
である。

【０００４】しかしながら、ＮＡＤＰＨ依存性パラヒド
ロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼは、その補酵素である
ＮＡＤＰＨが高価であるため、ＮＡＤＰＨ依存性の該酵
素を現実のプロトカテキュ酸の製造に用いることは工業
的には不利である。更に、ｐＨ７以上でＮＡＤＰＨはＮ
ＡＤＨより安定性が低いといった問題もあることから、
当業界ではより工業生産に好適なパラヒドロキシ安息香
酸ヒドロキシラーゼの開発が望まれているのが実情であ
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らはかかる課題
を解決するためにパラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラ
ーゼ生産能を有する微生物を広く自然界より検索した。
その結果、本発明者らは先にイソフタル酸を主炭素源と
する培地で Rhodococcus ｓｐ．Ｌ−１株( 微工研菌寄
第１０６１４号）を培養することにより、プロトカテキ
ュ酸を採取できることを見いだし（特開平２−２３４６
８２号公報）、更に、この微生物が意外にもＮＡＤＨ
（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を補酵素と
するＮＡＤＨ依存性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシ
ラーゼを生産することを見い出した（特願平４−８２７
５７号）。今回、更に研究を進めたところ、前記 Rhodo
coccus ｓｐ．Ｌ−１株にＵＶ照射を行い突然変異株と
することにより、レスティングセル法に供することが可
能になった Rhodococcus ｓｐ．Ｌ−１ Ｅ−１０８
（微工研菌寄第１２９３１号）由来のパラヒドロキシ安
息香酸ヒドロキシラーゼはＮＡＤＨ依存性であるばかり
でなく、高活性を有することを確認して本発明を完成す
るに至った。

【０００６】即ち、本発明の要旨は、（１）ＮＡＤＨ
（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）の存在下に
おいて、パラヒドロキシ安息香酸に作用して、プロトカ
テキュ酸を生成させる等の所定の酵素学的性質を有する
ＮＡＤＨ依存性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラー
ゼ、並びに（２）ロドコッカス属に属し、ＮＡＤＨ依存
性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼを生産する
能力を有する微生物の突然変異株を培養し、培養物より
ＮＡＤＨ依存性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラー
ゼを採取することを特徴とするＮＡＤＨ依存性パラヒド
ロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼの製造方法に関する。

【０００７】以下に本発明のＮＡＤＨ依存性パラヒドロ
キシ安息香酸ヒドロキシラーゼについて詳細に説明す
る。 １）酵素の作用 ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）の
存在下において、パラヒドロキシ安息香酸に作用して、
プロトカテキュ酸を生成させる。

【０００８】２）基質特異性 パラヒドロキシ安息香酸の類似化合物１４種類について
活性を調べた結果、パラヒドロキシ安息香酸に対する活
性を１００％とした場合、１０％以上の活性を示した化
合物は、２，４−ジヒドロキシ安息香酸（１６％）のみ
であり、その他の化合物では５％以下の活性を示した物
は４種であった。従って、本酵素はパラヒドロキシ安息
香酸を特異的基質とする酵素である。

【０００９】３）力価の測定法 酵素活性の測定は、パラヒドロキシ安息香酸４０nmolお
よび還元型ピリジンヌクレオチド（ＮＡＤＨまたはＮＡ
ＤＰＨ）４０nmolを含有する５０ｍＭヘペス緩衝液（ｐ
Ｈ７．６）０．６ｍｌ中で３３℃で１分間反応させ、３
４０ｎｍにおける吸光度を測定することにより行った。
対照としてパラヒドロキシ安息香酸を含有させずに反応
させたときの吸光度を測定し、コントロールの値として
差し引いて求めた。また、酵素単位は１分間に１μmol
の還元型ピリジンヌクレオチドを減少させる酵素活性を
１単位とした。

【００１０】４）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 至適ｐＨは図１に示すとおり、ｐＨ７．５〜７．８であ
る。安定ｐＨ範囲は２５℃、１時間の保持条件の場合、
図２に示すとおりｐＨ７．４〜７．８であった。

【００１１】５）至適温度および安定温度 反応の至適温度は３３℃であった（図３）。安定温度範
囲はｐＨ７．６、５０ｍＭヘペス緩衝液中に各温度で６
０分間保温して残存活性を測定した。その結果、本発明
の酵素は２５℃まで安定であり、４５℃で約５０％の残
存活性を示し６０℃以上で完全失活した（図４）。

【００１２】６）ＮＡＤＨのＫｍ値 本酵素に対するＮＡＤＨのＫｍ値は、図５に示す通り５
５．３μＭであった。

【００１３】７）ＮＡＤＰＨのＫｍ値 本酵素に対するＮＡＤＰＨのＫｍ値は図６に示す通り３
３３μＭであった。

【００１４】８）パラヒドロキシ安息香酸のＫｍ値 本酵素に対するパラヒドロキシ安息香酸のＫｍ値は、補
酵素ＮＡＤＨを用いた場合６．７μＭであり（図７）、
補酵素ＮＡＤＰＨを用いた場合１７．２μＭであった
（図８）。

【００１５】９）抽出・精製方法 ＮＡＤＨ依存性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラー
ゼは誘導酵素であり、後述するようにロドコッカス属に
属する微生物を、イソフタル酸を炭素源として含む培地
で培養を行うことにより産生させることができる。培養
終了後、培養物より遠心分離法等の方法にて菌体を分離
する。

【００１６】分離した菌体をそのまま酵素源として用い
てもよいが、さらに酵素を抽出し精製することが好まし
い。酵素を菌体から分離する場合は、採取した菌体を懸
濁してから、例えば、超音波、圧力変化（Ｆｒｅｎｃｈ
プレス、Ｈｕｇｅｓプレス）、攪拌（ホモジナイザー、
ビーズミル、ブレンダー）、凍結融解等による物理的方
法、あるいは酵素、界面活性剤、カオトロピックイオ
ン、酸アルカリ、抗生物質、自己消化等による化学的方
法により菌体を破壊して無細胞抽出液を得ることができ
る。本酵素の抽出および精製は、酵素の一般的な抽出・
精製方法を適宜選択することにより行うことができ、特
に制限されるものではない。例えば、塩析法、限外濾過
法、カラムクロマトグラフィー（イオン交換、アフィニ
ティー、ゲル濾過等）、電気泳動法等が挙げられる。

【００１７】１０）分子量 本酵素の分子量は、クリアパックＧＦＳ−３（８．０ｍ
ｍＩＤ×３０ｃｍ：アトー社製）とＴＳＫ ｇｅｌＧ３
０００ＳＷ（７．５ｍｍＩＤ×３０ｃｍ：東ソー社製）
を連結して用いた高速ゲル濾過カラム法で約６．７×１
０⁴ と推定された。

【００１８】１１）阻害剤等の影響 本酵素について種々の添加物質の影響について検討した
ところ、ハロゲンイオン、チオシアンイオンにより阻害
された。また、ナトリウムイオン、カリウムイオン等の
カチオンイオンにより阻害されなかった。 １２）比活性 本酵素の精製品についての比活性は、単位時間における
還元型ピリジンヌクレオチドの減少を３４０ｎｍの吸光
度で測定した場合、少なくとも約１０Ｕ／ｍｇである。

【００１９】このように本酵素は、パラヒドロキシ安息
香酸に作用して、プロトカテキュ酸を生成させることか
ら、パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼである。
さらに、前記のように本酵素のＮＡＤＨに対するＫｍ値
は５５．３μＭ、ＮＡＤＰＨに対するＫｍ値は３３３μ
Ｍであることから、ＮＡＤＨに対するＫｍ値はＮＡＤＰ
Ｈに対するものよりも１／６倍も低いＫｍ値を示すもの
であり、このことから本酵素は、ＮＡＤＨ依存性パラヒ
ドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼである。

【００２０】次に、本発明のＮＡＤＨ依存性パラヒドロ
キシ安息香酸ヒドロキシラーゼを生産する能力を有する
微生物の突然変異株について説明する。本発明に使用す
る微生物は、ロドコッカス属に属し、前記の特性を有す
るＮＡＤＨ依存性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラ
ーゼを生産する能力を持つものであればいかなるもので
も良い。それらのうち好ましい菌株は、本発明者らによ
り東京都内の土壌から分離したロドコッカスｓｐ．Ｌ−
１株（Rhodococcus sp.Ｌ−１株，微工研菌寄第１０６
１４号）をＵＶ照射により突然変異させたロドコッカス
ｓｐ．Ｌ−１ Ｅ−１０８株（Rhodococcus sp. Ｌ−１
Ｅ−１０８，微工研菌寄第１２９３１号）を例示でき
る。ＵＶ照射の条件は、２５ｃｍの距離より波長２５４
及び３６６ｎｍにて６０分間処理した。

【００２１】該突然変異株の親菌は次のような菌学的性
質を有するものである。 (1) 形態学的性質 菌 形 ： 桿 菌 大 き さ ： ０．８×１．５〜２．０μｍ 多 形 性 ： ３０℃で培養すると、１〜２
日で菌糸を形成し、その後、フラグメンテーションを起
こし、桿菌となる。気菌糸は形成しない。 抗 酸 性 ： な し グラム染色性 ： 陽 性 鞭 毛 ： な し 胞 子 ： な し

【００２２】(2) 培養的性質 肉汁寒天平板培養：生育良好。コロニー形状は円形、
周囲は平滑で、色は乳白色。 肉汁寒天斜面培養：糸状。コロニーの色は乳白色。 肉汁液体培養：均一に混濁。 イソフタル酸寒天平板培養：生育良好。コロニー形状
は円形で、周囲は平滑で、色は白色。

【００２３】(3) 生理学的性質 （1) 最適生育温度 ： ２５〜３３℃ （2) 生 育 温 度 ： ２０〜３５℃ （3) 最 適 ｐＨ ： ６．０〜８．０ （4) 生 育 ｐＨ ： ５．０〜１０．
０ （5) 酸 素 要 求 性 ： 好気的 （6) 色 素 の 生 産 ： な し （7) ゼラチン液化性 ： 陽 性 （8) カタラーゼ活性 ： 陽 性 （9) オキシダーゼ活性 ： 陰 性 （10) ウレアーゼ活性 ： 陽 性 （11) インドールの生産 ： 陰 性 （12) デンプンの加水分解活性 ： 陰 性 （13) 硝酸塩の還元 ： 陰 性 （14) クエン酸培地における生育 ： 生育する （15) メチルレッド試験 ： 陰 性 （16) ＶＰ反応 ： 陰 性

【００２４】 （17) Ｏ−Ｆテスト（Hugh Leifson法，30℃，10日間，開放系，密閉系）： 〔糖〕 〔開放系〕 〔密閉系〕 グルコース 変化なし 変化なし サッカロース 変化なし 変化なし D-フラクトース 変化なし 変化なし D-マンニット 変化なし 変化なし L-ソルボース 変化なし 変化なし D-ラフィノース 変化なし 変化なし D-ラムノース 変化なし 変化なし D-ガラクトース 変化なし 変化なし meso- エリストール 変化なし 変化なし D-ラクトース 変化なし 変化なし myo-イノシット 変化なし 変化なし D-キシロース 変化なし 変化なし イノシトール 変化なし 変化なし トレハロース 変化なし 変化なし D-アラビノース 変化なし 変化なし L-アラビノース 変化なし 変化なし セロビオース 変化なし 変化なし

【００２５】 （18) 糖の分解（Barsiekow 培地，30℃，10日間）： 〔糖〕 〔酸産生〕 〔ガス産生〕 グルコース 産生しない 産生しない サッカロース 産生しない 産生しない D-ラクトース 産生しない 産生しない グリセロール 産生しない 産生しない D-アラビノース 産生しない 産生しない

【００２６】（19) 細胞壁のジアミノピメリン酸異性
体：meso−ＤＡＰ。 （20) 細胞壁アシル型（グリコリル試験）：グリコリル
基が存在。 （21) ミコール酸の存在：存在する。 （22) 分 離 源 ：東京都内土壌

【００２７】次に、このようなロドコッカス属に属する
微生物の突然変異株を用いてＮＡＤＨ依存性パラヒドロ
キシ安息香酸ヒドロキシラーゼを生産するには、次のよ
うな培地を用いて培養する。すなわち、主炭素源として
のイソフタル酸、ちっ素源、無機塩類、ビタミン、その
他の栄養因子を適宜含有する培地であれば、天然培地で
も合成培地でも使用できる。ちっ素源としては、硝酸ア
ンモニウム、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機ちっ素
源、ペプトン、肉エキス、コンスティープリカー、酵母
エキス、カザミノ酸、大豆粉などを単独でまたは組み合
わせて用いることができる。無機塩類として、リン酸カ
リウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マ
ンガン、硫酸鉄、硫酸亜鉛、硫酸銅、モリブデン酸ナト
リウム、塩化カルシウム、塩化カリウムなどを加えても
よい。これらの他、生育に必要な栄養因子としては、ビ
タミン類、アミノ酸、核酸およびその塩類などがある。
また、ペプトン、肉エキス、コンスティープリカー、酵
母エキス、カザミノ酸などの上記栄養因子を含有する天
然有機栄養物を適宜添加することもできる。

【００２８】培養は、好気的条件、例えば振盪培養法、
通気攪拌培養法が好適であるが、適宜液体静置培養法を
組み合わせることもできる。培養温度は２０〜３５℃、
特に２５〜３３℃が良好で、培養時のｐＨは７〜９であ
る。培地中のイソフタル酸の濃度は通常０．１〜１０
％、好ましくは０．５〜３．０％が好適である。イソフ
タル酸を主炭素源として、培地ｐＨ７．０付近、３０℃
で振盪培養あるいは通気攪拌培養する。培養時間は通常
６５〜７５時間程度である。培養終了後、培養液から本
発明のＮＡＤＨ依存性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキ
シラーゼを採取し、前記のような方法により精製する。

【００２９】

【実施例】以下、実施例および参考例により本発明をさ
らに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるもの
ではない。 実施例１ イソフタル酸２％、硫安０．２％、リン酸一カリウム
０．１５％、リン酸二カリウム０．１５％、硫酸マグネ
シウム０．０５％、塩化ナトリウム０．０１％、塩化カ
ルシウム０．００２％、硫化鉄０．００１％、硫化マン
ガン０．０００２％、硫化亜鉛０．０００２％、モリブ
デン酸ナトリウム０．０００２％、ｐＨ７．２からなる
培地４０ｍｌを１００ｍｌ容の三角フラスコに１白金耳
ロドコッカスｓｐ．Ｌ−１ Ｅ−１０８株（微工研菌寄
第１２９３１号）を接種して３０℃で７０時間振盪培養
したものを１００μｌ抽出してから新たな培地４０ｍｌ
へ接種し、計４８本の三角フラスコを３０℃で７０時間
振盪培養した。

【００３０】培養終了後、培養液２リットルを遠心分離
し、菌体２５．７ｇ（湿菌重量）を得た。このようにし
て得られた菌体を５ｍＭＭｇ²⁺を含む５０ｍＭヘペス緩
衝液（ｐＨ７．６）に２５．７ｇ／１００ｍｌ濃度にな
るように懸濁し、ソニーケーター２５０（ＢＲＡＮＳＯ
Ｎ社製）により菌体を破砕後、遠心分離（１０万×ｇ）
を行い無細胞抽出液を得た。この抽出液の比活性は１
５．３×１０^-2Ｕ／ｍｇの酵素標品であった。

【００３１】次に、この抽出液を５ｍＭＭｇ²⁺を含む５
０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．６）流速１ｍｌ／ｍｉｎ
で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕｅカラム（２ｃｍＩ
Ｄ×４ｃｍ：ファルマシア社製）に吸着させ、同平衡化
緩衝液にて洗浄後、１５０ｍＭＫＣｌを含む５０ｍＭヘ
ペス緩衝液（ｐＨ７．６）で段階的溶出を行い、目的と
する酵素の活性画分を得た（図９）。この活性画分を遠
心タイプの限外濾過器具であるウルトラセントー３０
（東ソー社製）を用いて脱塩し、５０ｍＭヘペス緩衝液
で平衡化したクリアパックＩＥＰ／ＤＥＡＥ（６０ｍｍ
ＩＤ×１０ｃｍ：アトー社製）に吸着させ、０．０から
０．５ＭＫＣｌのイオン強度による直線勾配溶出法によ
り、０．８ｍｌ／ｍｉｎの流速で酵素活性画分を得た
（図１０）。この酵素活性画分をウルトラセントー３０
を用いて５００μｌまで脱塩、濃縮し、クリアパックＧ
ＦＳ−３（８．０ｍｍＩＤ×３０ｃｍ：アトー社製）と
ＴＳＫ ｇｅｌＧ３０００ＳＷ（７．５ｍｍＩＤ×３０
ｃｍ：東ソー社製）を連結させた高速ゲル濾過カラム
で、０．５ＭＫＣｌを含む５０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ
７．６）にて分離溶出を行い（図１１）、電気泳動的に
単一な活性画分を得た（図１２）。電気泳動はＬａｅｍ
ｍｌｉ法によるスラブゲル電気泳動法により１０％ＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲルで泳動後、銀染色法により染
色を行った。尚、この活性画分の分子量は、クリアパッ
クＧＦＳ−３とＴＳＫ ｇｅｌＧ３０００ＳＷを連結さ
せた高速ゲル濾過カラムを用いた前記分離溶出の結果か
らは約６．７×１０⁴ と推定された。また、ここで得ら
れた精製品の比活性は１８．５Ｕ／ｍｇであった。

【００３２】参考例１ パラヒドロキシ安息香酸（最終濃度４０nmol）１０μl
およびＮＡＤＨ（最終濃度４０nmol）８μl を５０mMヘ
ペス緩衝液（ｐＨ７．６）４３２μl に溶解した後、実
施例１で得られた酵素抽出液（10万×ｇの上清液、687.
9 μｇタンパク／ｍl ）２５０μl を加えて、０，１
０，２０分間、反応温度３３℃下で反応を行い、１Ｍ過
塩素酸＋０．２％ＥＤＴＡ−Na溶液を各６００μl 加え
て反応を停止させた。次いで、反応液を１５００ｒｐ
ｍ、１０分間で遠心を行い、除タンパクし、得られた上
清液を高速液体クロマトグラフィーにより分析を行っ
た。その結果、反応０時間において認められたパラヒド
ロキシ安息香酸のピークは、反応１０分後には大きく減
少し、反応２０分後には完全に消失した。

【００３３】参考例２ パラヒドロキシ安息香酸（最終濃度４０ｎｍｏｌ）１０
μｌ及びＮＡＤＨ（最終濃度４０ｎｍｏｌ）１０μｌ及
び定量用内部標準物質である３，４−ジヒドロキシフェ
ニル酢酸（最終濃度４００ｎｍｏｌ）１０μｌを５０ｍ
Ｍヘペス緩衝液（ｐＨ７．６）４７０μｌに溶解した
後、実施例１で得られた粗酵素（ＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕ
ｅカラム（２ｃｍＩＤ×４ｃｍ）の溶出液、１０５μｇ
／ｍｌ）１０μｌを加えて０，３，１０，２０，４０，
６０，１００分間、反応温度３３℃下で反応を行い、１
Ｍ過塩素酸＋０．２％ＥＤＴＡ−Ｎａ溶液を各５００μ
ｌ加え、反応を停止させた。次いで反応液を１５００ｒ
ｐｍ、１０分間遠心を行い、除タンパクし、得られた上
清液を高速液体クロマトグラフィーにより分析を行っ
た。その結果、経時的にプロトカテキュ酸のピークが増
加した。各経過時間のプロトカテキュ酸量を、内部標準
物質で定量し、図１３に示すようなプロトカテキュ酸生
成量の増加曲線を得た。

【００３４】

【発明の効果】本発明のＮＡＤＨ依存性パラヒドロキシ
安息香酸ヒドロキシラーゼは、高活性であるとともに、
ＮＡＤＨの存在下において、パラヒドロキシ安息香酸に
作用して、プロトカテキュ酸を生成する性質を有してい
るので、プロトカテキュ酸の工業生産の実用化に極めて
有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本酵素の至適ｐＨを示す図である。

【図２】図２は本酵素のｐＨ安定性を示す図である。

【図３】図３は本酵素の至適温度を示す図である。

【図４】図４は本酵素の温度安定性を示す図である。

【図５】図５は本酵素のＮＡＤＨに対するＫｍ値を示す
図である。

【図６】図６は本酵素のＨＡＤＰＨに対するＫｍ値を示
す図である。

【図７】図７はＮＡＤＨを用いた場合の本酵素のパラヒ
ドロキシ安息香酸に対するＫｍ値を示す図である。

【図８】図８はＮＡＤＰＨを用いた場合の本酵素のパラ
ヒドロキシ安息香酸に対するＫｍ値を示す図である。

【図９】図９は実施例においてＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕｅ
カラムを用いた本酵素の溶出パターンを示す図である。

【図１０】図１０は実施例においてクリアパックＩＥＰ
／ＤＥＡＥを用いた直線勾配溶出法による本酵素の溶出
パターンを示す図である。

【図１１】図１１は実施例において高速ゲル濾過カラム
を用いた本酵素の溶出パターンを示す図である。

【図１２】図１２は実施例において１０％ＳＤＳポリア
クリルアミドゲルを用いた本酵素活性画分の電気泳動図
を示す。

【図１３】図１３は参考例２において得られたプロトカ
テキュ酸生成量の増加曲線を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の酵素学的性質を有するＮＡＤＨ依存
   性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ。 作用 ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）の
   存在下において、パラヒドロキシ安息香酸に作用して、
   プロトカテキュ酸を生成させる。 基質特異性 パラヒドロキシ安息香酸を特異的基質とする。 至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 至適ｐＨはｐＨ７．５〜７．８であり、安定ｐＨ範囲は
   ２５℃、１時間の保持条件においてｐＨ７．４〜７．８
   である。 至適温度および安定温度範囲 反応の至適温度は３３℃であり、ｐＨ７．６で６０分間
   保温した時、２５℃まで安定であり、６０℃以上で完全
   失活する。 分子量 高速ゲル濾過カラム法により測定した分子量は約６．７
   ×１０⁴ である。 阻害剤等の影響 ハロゲンイオン、チオシアンイオンにより阻害される
   が、ナトリウムイオン、カリウムイオン等のカチオンイ
   オンにより阻害されない。 比活性 単位時間における還元型ピリジンヌクレオチドの減少を
   ３４０ｎｍの吸光度で測定した場合、少なくとも約１０
   Ｕ／ｍｇの比活性を有する。
2. 【請求項２】 ロドコッカス属に属し、ＮＡＤＨ依存性
   パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼを生産する能
   力を有する微生物の突然変異株を培養し、培養物よりＮ
   ＡＤＨ依存性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ
   を採取することを特徴とするＮＡＤＨ依存性パラヒドロ
   キシ安息香酸ヒドロキシラーゼの製造方法。