JP3590647B2 - アルコール／アルデヒド脱水素酵素 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は新規なアルコール／アルデヒド脱水素酵素（本文中ＡＡＤＨと記す）およびその製造法、および本酵素をもちいたアルデヒド類、カルボン酸類およびケトン類化合物、特に該酵素をもちいた２ーケトーＬーグロン酸（本文中２ＫＧＡと記す）の製造方法に関する。
【０００２】
本発明によるＡＡＤＨはアルコール類およびアルデヒド類化合物の酸化を触媒し、それぞれに対応するアルデヒド類およびケトン類化合物およびカルボン酸化合物を生成する。さらに特徴的に、本発明によるＡＡＤＨはＬ−ソルボースを酸化しＬ−ソルボソンをへて２ＫＧＡを生成する。２ＫＧＡはビタミンＣ製造における重要な中間体である。
【０００３】
【従来技術及び発明が解決しようとする課題】
アルコールおよびアルデヒド化合物の酸化により対応するアルデヒドおよびカルボン酸を生成しピロロキノリン キノン（本文中ＰＱＱと記す）を補欠分子族として含有している酵素はこれまでにもいくつか報告されている。
【０００４】
アルコール脱水素酵素に属するメタノール脱水素酵素は一般にメタノール酸化によるホルムアルデヒド生成のみならずホルムアルデヒド酸化によるギ酸の生成も触媒する（アドバンセズ・イン・マイクロバイアル・フイジオロジー 第２７巻、１１３−２０９頁、１９８６）。これらの酵素はメタノール、エタノールのような一級アルコール類やアルデヒド類をアンモニアやメチルアミン類を活性化剤として酸化するが、しかし、これらの酵素のうち大部分は二級アルコールを酸化することはできない。メチロバクテリウム オルガノフィラム、シュードモナス Ｃ、ヂィプロコッカス PAR および ロドシュードモナス アシドフィルより得られるメタノール脱水素酵素は二級アルコールの酸化を触媒することができる例である。これらの前例に対して、本発明によるAADHは広い範囲の一級および二級アルコールを酸化し、既存のメタノール脱水素酵素と以下の点において明らかに異なっている。
【０００５】
本ＡＡＤＨはエタノールはよい基質とするが、メタノールを酸化できない。アンモニアやメチルアミンなどの活性化剤を必要としない。一般のメタノール脱水素酵素の等電点が７．０以上なのに対して、本ＡＡＤＨの等電点は約４．４である。
【０００６】
ＰＱＱを補欠分子族として含むアルコール脱水素酵素の例としてほかにシュードモナス エルギノーサのキノプロテインアルコール脱水素酵素（バイオケミカル・ジヤーナル、 第２２３巻、９２１−９２４頁、１９８４）およびシュ−ドモナス テストステロニのキノヘムプロテインアルコ−ル脱水素酵素（バイオケミカル・ジヤーナル、第２３４巻、６１１−６１５頁、１９８６）が知られている。前者は、本発明によるＡＡＤＨがサブユニットの二量体で存在し活性化剤を必要としないのに対して、分子量１０１、０００の単量体で活性化剤としてアンモニウム塩又はアミンを必要とする。後者は、本発明によるＡＡＤＨがサブユニットの二量対でヘムｃ分子団を含まないのに対して、分子量６７、０００の単量体で一分子ずつのＰＱＱとヘムｃ分子団を含む。
【０００７】
上記で述べたように、今日まで本発明で述べられているようなＡＡＤＨの報告はない。特定の菌株の菌体可溶性画分より単離された精製酵素がアルコ−ル類およびアルデヒド類の酸化を触媒し、アルコ−ル類からはアルデヒド類またはケトン類、アルデヒド類からはカルボン酸類を生成することが見いだされた。さらに特徴的には該酵素はＬ−ソルボ−スをＬ−ソルボソンを経て２ＫＧＡに酸化する。本発明はこの知見を基礎として完成された。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
後述の実施例に従って調製されるAADH精製標品の物理化学的諸性質を以下に示す：
１）酵素活性
本発明のAADHは電子受容体の存在下でアルコ−ル類およびアルデヒド類の酸化を触媒し、アルコ−ル類からはアルデヒド類またはケトン類、アルデヒド類からはカルボン酸類を生成する。
【０００９】
本酵素は酸素を直接電子受容体として利用できない。しかし、電子受容体として機能する能力のあるいくつかの適切な物質を本発明による酵素は利用することができる。電子受容体として、２、６−ジクロロフェノ−ルインドフェノ−ル（本文中以後、ＤＣＩＰと記す）、フェナジン メソサルフェイト（本文中以後、ＰＭＳと記す）、ウルスタ− ブル−、フェリシアナイド、コエンザイムＱおよびチトクロ−ムｃなどが使用できる。
【００１０】
酵素活性測定はスペクトロフォトメ−タ−（ＵＶＩＫＯＮ ８１０、コントロン社製）を用いＤＣＩＰの６００ ｎｍの吸光度の減少を２５℃で測定することによっておこなった。酵素活性１単位は１分間に１ μｍｏｌｅ量のＤＣＩＰの還元を触媒する酵素の量と定義した。ＤＣＩＰの分子吸光係数はｐＨ ８．０においてｍＭ濃度当たり１５とした。標準反応溶液（ １ ｍｌ）は０．１ ｍＭのＤＣＩＰ、１ ｍＭのＰＭＳ、１２５ ｍＭのＬ−ソルボ−ス、５０ ｍＭのトリス−マレイト−苛性ソ−ダ緩衝液（ｐＨ ８．０）と３−８ μｌの酵素溶液を含んでいる。比較対照用として上記反応溶液に基質のみを含まないものをもちいた。
【００１１】
２）基質特異性
ＡＡＤＨの基質特異性はＬ−ソルボ−スのかわりに様々な基質をもちいた上記１）の酵素活性測定法をもちいて決定された。測定結果は表１に示す。一級アルコ−ル、二級アルコ−ル、アルデヒドおよびポリエチレングリコ−ル、ポリビニルアルコ−ルを含む高分子量アルコ−ルと様々な物質が基質となりえた。
【００１２】
３）至適ｐＨ
ＡＡＤＨの反応速度とｐＨのあいだの関連性はトリス−マレイト−苛性ソ−ダ緩衝液（ｐＨ ６．０から８．０）とトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ９．０）でいくつかの基質をもちいて測定された。結果は表２に示す。基質の種類に関係なく、ＡＡＤＨはｐＨ ７．０から９．０の範囲でもっとも高い活性を示した。
【００１３】
４）ｐＨ安定性
精製ＡＡＤＨは表３に示す様々なｐＨ値の緩衝液中４℃で一定時間放置された。残存酵素活性はＬ−ソルボ−スまたはＬ−ソルボソンを基質としてもちい上記１）の酵素活性測定法で測定された。測定結果を表３に示す。精製酵素はアルカリｐＨ領域で比較的安定で、酸性化により不安定となる。
【００１４】
５）熱安定性
精製ＡＡＤＨは０．１ Ｍ ＮａＣｌ 、５％スクロ−スを含む２５ ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．０）中様々な温度で１０分間処理された後に、ただちに氷冷された。残存酵素活性はいくつかの基質をもちい上記１）の酵素活性測定法で測定された。測定結果を表４に示す。ＡＡＤＨは３０℃以下では安定であるが、４０℃以上で不安定である。
【００１５】
６）至適温度
ＡＡＤＨ の酵素活性は１０℃から５０℃の温度下でいくつかの基質をもちい上記１）の酵素活性測定法で測定された。結果は表５に示す。本酵素は２０℃から４０℃の温度領域に反応至適を示す。
【００１６】
７）分子量
ＡＡＤＨの分子量はゲル濾過カラムクロマトグラフィ−をもちいて決定された。酵素サンプルは酵素精製のための樹脂、たとえば０．１ Ｍ ＮａＣｌ 、５％スクロ−スを含む２５ ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．０）で平衡化されたセファクリルＳ−３００ＨＲ（ファルマシア社製）に添加された。分子量スタンダ−ドとして、チログロブリン（６７０，０００ ダルトン）、フェリチン（４５０，０００ ダルトン）、カタラ−ゼ（２４０，０００ ダルトン）、アルドラ−ゼ（１５８，０００ ダルトン）、ガンマ グロブリン（１５８，０００ ダルトン）、ウシ血清アルブミン（６６，２００ ダルトン）、オボアルブミン（４５，０００ ダルトン）、キモトリプシノゲン Ａ（２５，０００ ダルトン）、ミオグロビン（１７，０００ ダルトン）、チトクロ−ム ｃ（１２，５００ ダルトン）およびビタミン Ｂ１２（１，３６０ ダルトン）がもちいられた。結果として、ＡＡＤＨの分子量は１３５，０００±５，０００ ダルトンと決定された。つぎに、精製ＡＡＤＨはベ−タ メルカプトエタノ−ル存在下ソディウム ドデシル サルフェイト（ＳＤＳ）で処理され、その分子構造はＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動分析により解析された。分子量スタンダ−ドとして、 フォスフォリラ−ゼ Ｂ（９２，５００ ダルトン）、ウシ血清アルブミン（６６，２００ ダルトン）、オボアルブミン（４５，０００ ダルトン）、カ−ボニック アンヒドラ−ゼ（３１，０００ ダルトン）、大豆トリプシン インヒビタ−（２１，５００ ダルトン）およびリゾチ−ム（１４，４００ ダルトン）がもちいられた。本酵素は２種のサブユニットから成ることが示された。第一のサブユニット（アルファ サブユニット）は分子量が６４，５００±２，０００であり、第二のサブユニット（ベ−タ サブユニット）は分子量が６２，５００±２，０００である。
【００１７】
８）Ｋｍ（ミカエリス定数）値の測定
１）に記載の方法をもちいて、酸化速度と基質濃度変化の関係をみかけ上のミカエリス定数（Ｋｍ）として決定するために測定した。ＤＣＩＰとＰＭＳを電子受容体として含む反応液で測定した。Ｌ−ソルボ−スおよび１−プロパノ−ルに対するＫｍ値はそれぞれ２３０ ｍＭおよび２ ｍＭと算出された。
【００１８】
９）金属イオンの影響
１）に記載の方法をもちいて、様々な金属イオンの酵素活性に対する影響を測定した。表６に結果を示す。検査された金属イオン中、Ｍｇ２＋とＣａ２＋イオンのみが酵素活性に影響を与えなかった。他は酵素活性に対して強度および中度の影響を示した。Ｃｕ２＋， Ｍｎ２＋， Ｆｅ３＋ は酵素の強い阻害剤である。
【００１９】
１０）阻害剤の影響
１）に記される方法をもちいて、阻害剤の酵素活性に対する影響を測定した。表７に結果を示す。エチレンヂアミン テトラアセティック アシッド（ＥＤＴＡ）およびエチレン グリコ−ル ビス（ベ−タ−アミノエティルエ−テル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラアセティック アシッド（ＥＧＴＡ）は酵素活性に対して強い阻害を示した。
【００２０】
１１）補欠分子族
精製ＡＡＤＨの吸光スペクトルは図１に示すように２８０ ｎｍの極大吸収と２９０ ｎｍの肩を示した。第二の吸収ピ−クが３４０ ｎｍに３８０−４２０ ｎｍの広い肩をともない検出された。この吸収スペクトルはＡＡＤＨがＰＱＱを補欠分子族としてもっていることを強く示唆した。
【００２１】
１００ ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４−塩酸（ｐＨ 約 １．０） 中の精製酵素（４．５ ｍｇ量）に同容量のメタノ−ルを添加し混合した。サンプルより１５，０００ ｒｐｍ、１０分間遠心分離で沈殿物を除去した。この抽出物を補欠分子族の同定にもちいた。抽出物の吸収スペクトルはＰＱＱの標準サンプル（三菱ガス化学社製）と完全に一致した。さらに、逆相カラム（ＴＳＫ−ＯＤＳ ８０ＴＭ， トヨ−ソ−ダ社製）をもちいた高圧液体クロマトグラフィ−分析でＡＡＤＨ抽出物はＰＱＱ標準サンプルと同一の保持時間を示した。
【００２２】
１２）等電点
ＡＡＤＨの等電点（ｐＩ）が決定された。エレクトロ フォ−カシングのため８．５ Ｍ尿素、２％（ｗ／ｖ）非イオン性界面活性剤例えばノイデット Ｐ−４０および２．４％（ｗ／ｖ）のｐＨ勾配形成のための緩衝剤物質；アンフォライト例えばファルマライト， ｐＨ ２．５−５．０（ファルマシア社製）を含んだ４％濃度のポリアクリルアミド ゲルをもちいた。電極液としては、０．０１ Ｍのイミノ二酢酸を陰極に、０．０１ ＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルフォニック アシッド（ＨＥＰＥＳ）を陽極にもちいた。サンプルの等電点はファルマシア社製の低ｐＨキャリブレ−ション キット、ｐＨ ２．５−５．０との比較により算出した。結果として、ＡＡＤＨ は等電点約４．４ のバンド群を示した。
【００２３】
１３）精製法
ＡＡＤＨの精製は以下のような通常もちいられる精製法の組み合わせが有効である。
【００２４】
沈殿剤による分画、例えば 硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコールなど
イオン交換クロマトグラフィー
吸着クロマトグラフィー
ゲル濾過クロマトグラフィー
ゲル電気泳動
塩析および透析
本発明によるＡＡＤＨは、適切な微生物株を培養し、得られた細胞を破砕し、破砕細胞の無細胞抽出物、好ましくは微生物菌体可溶性画分（ｃｙｔｏｓｏｌ ｆｒａｃｔｉｏｎ）から調製する事ができる。
【００２５】
本発明により使用される微生物菌株は前述したＡＡＤＨを生産する能力をもつグルコノバクター属に属するすべての菌株を含む。また、本菌株の機能的同等物、継代培養、変異株および誘導体も本発明に使用できる。
【００２６】
好適な菌株はグルコノバクター オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）である。特に好適なグルコノバクター オキシダンス株はゲッチンゲン（ドイツ）にあるドイツ微生物寄託所（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｉｎ Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ； Ｇｅｒｍａｎｙ） にＤＳＭ Ｎｏ． ４０２５株として１９８７年４月１７日に寄託されている。
【００２７】
さらに、該菌株の継代培養はブタペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ） の契約規定にもとずいて微生物工業技術研究所（日本）（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｊａｐａｎ） に；グルコノバクター オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） ＤＳＭ Ｎｏ． ４０２５ ＦＥＲＭ ＢＰ−３８１２株として１９９２年３月３０日に寄託されている。
【００２８】
さらに、ヨーロッパ特許公開（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ） Ｎｏ．０２７８ ４４７ （４２２６／０８１ｋ）に本菌株の性質が記載されている。
【００２９】
本微生物は好気条件下、適切な栄養源を含んだ液体培地によって培養される。培養はｐＨ 約４．０−９．０の間でおこなえるが、好ましくはｐＨ約６．０−８．０のあいだがのぞましい。培養時間は、ｐＨ、温度および使用される培地条件によりことなるが、通常２ー５日間で好結果をもたらす。好ましい培養のための温度範囲は、約１３℃から３６℃であるが、好ましくは約１８℃から３３℃がのぞましい。
【００３０】
通常培養用培地は資化可能な炭素源、利用可能な窒素源や無機物質、ビタミン類、微量成分および他の成育促進因子などを含む。資化可能な炭素原としては、Ｌ−ソルボース、グリセロール、Ｄ−グルコース、Ｄ−マニトール、Ｄ−フルクトース、Ｄ−アラビトールおよびこれらに類するものが使用できる。
【００３１】
様々な無機および有機物質が窒素源としてもちいられる、例えばイースト エキストラクト、ミート エキストラクト、ペプトン、カゼイン、コーン スチィープ リカー、尿素、アミノ酸、硝酸、アンモニウム塩およびこれらに類するものが使用できる。 無機物質として硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、塩化第一および第二鉄、炭酸カルシウムおよびこれらに類するものが使用できる。
【００３２】
以下に、培養後の菌体からのＡＡＤＨの単離精製法の実施態様を簡便に記す。
【００３３】
（１）菌体を培養槽より遠心分離もしくは濾過によって収集する。
【００３４】
（２）該菌体を緩衝液に懸濁した後、ホモゲナイザー、超音波、リゾチーム処理など細胞破砕液を調製できるもので破砕する。
【００３５】
（３）ＡＡＤＨは破砕された細胞の無細胞抽出液より、さらに好ましくは微生物菌体の可溶性画分より単離精製される。
【００３６】
本発明によるＡＡＤＨはアルコール類およびアルデヒド類からのアルデヒド類、カルボン酸類およびケトン類、とくにＬ− ソルボースよりＬ−ソルボソンを経て２ＫＧＡを生産する触媒として有用である。
【００３７】
反応はトリスー塩酸緩衝液、リン酸緩衝液又はそれに類する溶媒中で、電子受容体例えばＤＣＩＰ、ＰＭＳ、ウルスタ− ブル−、フェリシアナイド、コエンザイムＱ、チトクロ−ムｃおよびそれに類するものの存在化、ｐＨ約 ６．０−９．０でおこなわれる。
【００３８】
該反応のためのこのましい温度範囲は約１０℃から５０℃である。ｐＨと温度がそれぞれ約７．０−８．０、２０℃−４０℃に設定されたとき通常最もこのましい反応結果が与えられる。
【００３９】
反応溶媒中の基質濃度は他の反応条件によって変得ることができる、しかし、一般的に約１０−１００ ｇ／ｌ濃度、さらに最も好ましくは約３０−４０ ｇ／ｌである。
【００４０】
該反応において、ＡＡＤＨは適切な担体に固定された状態でも使用できる。一般的にこれまで知られているような固定化酵素としても使用可能である。例えば、本酵素は直接反応基をもった膜、粒子、もしくは樹脂のようなものに結合できる、又はグルタルアルデヒドのような反応基物質を架橋として樹脂に結合することもできる。上記に加えて、培養された細胞もアルコール類およびアルデヒド類からのアルデヒド類、カルボン酸類およびケトン類、とくにＬ− ソルボースより２ＫＧＡを生産する触媒として有用である。
【００４１】
【実施例】
以下の実施例にてさらに本発明についてのべる。
【００４２】
実施例 １
ＡＡＤＨの調製
すべての操作は特に記載のないかぎり４℃でおこなわれた。
【００４３】
（１）グルコノバクター オキシダンス ＤＳＭ Ｎｏ． ４０２５（ＦＥＲＭ ＢＰ−３８１２）の培養
（Ａ）培地調製
Ｌ−ソルボース ８％（ｗ／ｖ）（別滅菌）、グリセロール ０．０５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２５％、コーン スティープ リカー １．７５％、ベーカーズ イースト ５．０％、ＣａＣＯ３ ０．５％と尿素 ０．５％（別滅菌）（滅菌前ｐＨ ７．０）を含む培養培地を試験管（それぞれ５ ｍｌ）にいれ１２０℃， ２０分間滅菌した。
【００４４】
（Ｂ）植菌、培養
この種培養培地に、Ｄ−マニトール ５．０％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２５％、コーン スティープ リカー １．７５％、ベーカーズ イースト ０．２５％、ＣａＣＯ３ ０．５％、尿素 ０．５％（別滅菌） および寒天 ２．０％（滅菌前ｐＨ ７．０）を含むスラント培養培地で２７℃、３日培養された菌株より一白金耳の細胞を植菌し３０℃で２４時間培養した。この種培養（５ ｍｌ）は５００ ｍｌ エルレンマイヤ− フラスコにいれた１００ ｍｌの上記と同様の培地に植菌され３０℃、２４時間培養した。さらに、この種培養（５ ｍｌ）は５００ ｍｌ エルレンマイヤ− フラスコにいれた１００ ｍｌの上記と同様の培地に植菌され３０℃、２４時間培養された。このように調製された種培養を３０ ｌ ジャー培養槽中の１５ ｌ の本培地への種菌としてもちいた。培地はＬ−ソルボース １０％（ｗ／ｖ）（別滅菌）、グリセロール ０．０５％、尿素 １．６％（別滅菌）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２５％、ベーカーズ イースト ５．０％、ＣａＣＯ３ １．５％とコーン スティープ リカー ３．０％を含む。発酵は、温度３０℃、攪拌５００ ｒｐｍおよび通気７．５ ｌ／分でおこなった。発酵開始４０時間後、菌体は遠心分離（１０，０００ ｇ， １５分）で集菌された。菌体は１ ｌ の０．９％ ＮａＣｌ、５ ｍＭのＭｇＣｌ２および１ ｍＭのフェニルメチルスルファニル フルオライド（ＰＭＳＦ）をふくむ２５ ｍＭトリスー塩酸、ｐＨ ７．０、に懸濁された。懸濁液はＣａＣＯ３および他の沈降性培地成分を除去するため５００ ｇ、５分間遠心分離された。その後、細胞は１０，０００ ｇ、１５分間の遠心分離で回収された。上記の操作は再度繰り返された。結果として、１２５ ｇ（湿式重量） のグルコノバクター オキシダンス ＤＳＭ Ｎｏ． ４０２５（ＦＥＲＭ ＢＰ−３８１２）細胞が得られた。洗浄菌体は次の精製段階まで、−２０℃で１週間冷凍保存された。
【００４５】
（２）可溶性画分の調整
上記ステップ（１）でえられたグルコノバクター オキシダンス ＤＳＭ Ｎｏ． ４０２５（ＦＥＲＭ ＢＰ−３８１２）細胞は１００ ｍｌの０．５ ｍＭのＰＭＳＦをふくむ２５ ｍＭのトリスー塩酸緩衝液、ｐＨ ８．０に懸濁され細胞破砕のため細胞破砕装置（フレンチ プレス）で２度処理（１，５００ ｋｇ／ｃｍ２）された。この均一化された懸濁液に ２ ｍｌの１ ｍｇ／ｍｌ のＤＮＡ切断用ＤＮＡ分解酵素Ｉ（シグマ社製）と１ ｍｌの０．５ Ｍ濃度のＭｇＣｌ２を添加し、混合物を１５分間放置した後に、細胞残さを除くため６，０００ ｇ、１５分間遠心分離した。こうして得られた無細胞抽出液（２１０ ｍｌ）は１００，０００ ｇ、６０分間遠心分離された。この上清を可溶性画分として回収した（２００ ｍｌ）。
【００４６】
（３）ＰＥＧ（ＭＷ６０００） 処理（ＤＮＡ沈殿）
上記ステップ（２）の可溶性画分（２００ ｍｌ）は２ Ｌの０．５ ｍＭのＰＭＳＦをふくむ２５ ｍＭのトリスー塩酸緩衝液、ｐＨ ８．０に対して透析された後に、４０ ｇのＰＥＧ ６０００（ 半井化学工業）と５ ｍｌ の２Ｎ ＫＣｌを添加され、３０分間放置され、１４，０００ ｇ、２０分間遠心分離された。上清は同様の緩衝液で４００ ｍｌまで希釈された。
【００４７】
（４）ＤＥＡＥ トヨパール ６５０Ｍ（弱イオン交換） カラム クロマトグラフィー
上記ステップ（３）でえられた上清（４００ ｍｌ）は０．２５ ｍＭのＰＭＳＦ、５％のスクロースを含む２５ ｍＭのトリスー塩酸緩衝液、ｐＨ ８．０で平衡化されたジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）トヨパール ６５０Ｍ カラム（内径２．５ ｃｍ、全長３５ ｃｍ）に添加された。カラムが同様の緩衝液６００ ｍｌで洗浄された後、酵素は同様の緩衝液（２０００ ｍｌ）に含まれる ０から０．５ ＭまでのＮａＣｌの濃度勾配によって溶出された。活性画分（１７４ ｍｌ）は回収され次のステップに供された。
【００４８】
（５）Ｑ−セファロース（強イオン交換） カラム クロマトグラフィー 「第２ステップ」
前ステップで得られた活性画分は０．２５ ｍＭのＰＭＳＦ、５％のスクロースを含む２５ ｍＭのトリスー塩酸緩衝液、ｐＨ ８．０で平衡化されたＱーセファロース カラム（内径２．５ ｃｍ、全長３５ ｃｍ）に添加された。カラムが緩衝液により完全に洗浄された後、酵素活性溶出は同様の緩衝液（２０００ ｍｌ）に含まれる ０．２５から０．５ ＭまでのＮａＣｌの濃度勾配によってなされた。電気泳動的に均一なＡＡＤＨを含む画分は回収され、ＰＭ−３０膜（アミコン コーポレイション）により２０ ｍｌまで濃縮された。
【００４９】
ＡＡＤＨ の精製段階の要約は表８に示す。
【００５０】
（６）単離されたＡＡＤＨ の純度
単離されたＡＡＤＨ の純度検定のため、ポリアクリルアミド ゲル電気泳動をおこなった。 サンプルはデイビス（Ｄａｖｉｓ）らの方法（Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １２１： ４０４， １９６９）にしたがってトリスー塩酸緩衝液、ｐＨ ９．４の７．５％ ポリアクリルアミドゲルに添加された。タンパク質はタンパク染色剤であるコマシー ブリリアント ブルー Ｒ−２５０によって染色された。ゲル中の酵素活性はニトロ ブルー テトラゾリウム クロライド（シグマ社製）の還元との共役によって検出された。ゲルは５０ ｍＭのトリス−マレイト−苛性ソ−ダ緩衝液、ｐＨ ８．０、０．０１ ｍＭのＰＱＱ、０．１ ｍＭのＰＭＳ、０．４ ｍＭのニトロ ブルー テトラゾリウム クロライドおよび０．２５ ＭのＬ−ソルボースを含む溶液に、３０ ℃暗所下浸された。
【００５１】
ＡＡＤＨはタンパク染色において３本の近接したバンドを示し、すべてのバンドは酵素活性を示した。 ３本のゲル中でのタンパクバンドは電気泳動中、酵素より補欠分子族であるＰＱＱが解離することに起因する。
【００５２】
（７）反応生成物の同定
５０ μｌの精製ＡＡＤＨ（１．５ ｍｇ）、０．１ ｍｌの１０ ｍＭ ＰＭＳ、０．５ ｍｌの０．４ Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ６．５、０．２５ ｍｌの水および０．１ ｍｌのさまざまな基質の２０％溶液を含む反応液が３０℃、１５時間、緩やかな攪拌をともない反応させられた。反応生成物は薄層クロマトグラフィ−で分析された。生成物は標準サンプルと直接比較することで同定された。結果は表９に示す。
【００５３】
実施例 ２
精製ＡＡＤＨによる２ＫＧＡ生産
０．５ ｍｌの精製ＡＡＤＨ（１５ ｍｇ）、１ ｍｌの２０％ Ｌ−ソルボ−ス溶液、１ ｍｌの１０ ｍＭ ＰＭＳ、５ ｍｌの０．４ Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ６．５ および２．５ ｍｌの水を含む反応液が３０℃で緩やかな攪拌をともない反応させられた。結果として、約７０ ｍｇ／時間の生成速度で２ＫＧＡが生産された。
【００５４】
実施例 ３
休止菌体系での２ＫＧＡ生産
反応液（１０ ｍｌ）： 実施例 １のステップ（１）と同様の方法で調整されたグルコノバクタ− オキシダンス ＤＳＭ Ｎｏ． ４０２５ （ＦＥＲＭ ＢＰ−３８１２）菌体 ０．２５ ｇ、１ ｍｌの２０％Ｌ−ソルボ−ス溶液、１ ｍｌの１０ ｍＭ ＰＭＳ、１ ｍｌの３％ 食塩水、１ ｍｌ の３０ μＭ ＰＱＱ、０．１ ｇ 炭酸カルシウム、が３０℃で緩やかな攪拌をともない反応させられた。結果として、約６ ｍｇ／時間の生成速度で２ＫＧＡが生産された。
【００５５】
【表１】
【００５６】
【表２】
【００５７】
【表３】
【００５８】
【表４】
【００５９】
【表５】
【００６０】
【表６】
【００６１】
【表７】
【００６２】
【表８】
（ａ） “活性“は５頁の酵素活性１）に記載の方法により測定した。
【００６３】
（ｂ） “無細胞抽出物”は実施例１（２）に記載の方法により調製された。
【００６４】
（ｃ） “可溶性画分”は実施例１（２）に記載の方法により調製された。
【００６５】
（ｄ） “ＰＥＧ ６０００上清は実施例１（３）に記載の方法により調製された。
（ｅ） “ＤＥＡＥ−トヨパール”は実施例１（４）に記載の方法により調製された。
【００６６】
（ｆ） “Ｑ−セフアロース”は実施例１（５）に記載の方法により調製された。
【００６７】
【表９】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＡＤＨの吸収スペクトルを示す。
【産業上の利用分野】
本発明は新規なアルコール／アルデヒド脱水素酵素（本文中ＡＡＤＨと記す）およびその製造法、および本酵素をもちいたアルデヒド類、カルボン酸類およびケトン類化合物、特に該酵素をもちいた２ーケトーＬーグロン酸（本文中２ＫＧＡと記す）の製造方法に関する。
【０００２】
本発明によるＡＡＤＨはアルコール類およびアルデヒド類化合物の酸化を触媒し、それぞれに対応するアルデヒド類およびケトン類化合物およびカルボン酸化合物を生成する。さらに特徴的に、本発明によるＡＡＤＨはＬ−ソルボースを酸化しＬ−ソルボソンをへて２ＫＧＡを生成する。２ＫＧＡはビタミンＣ製造における重要な中間体である。
【０００３】
【従来技術及び発明が解決しようとする課題】
アルコールおよびアルデヒド化合物の酸化により対応するアルデヒドおよびカルボン酸を生成しピロロキノリン キノン（本文中ＰＱＱと記す）を補欠分子族として含有している酵素はこれまでにもいくつか報告されている。
【０００４】
アルコール脱水素酵素に属するメタノール脱水素酵素は一般にメタノール酸化によるホルムアルデヒド生成のみならずホルムアルデヒド酸化によるギ酸の生成も触媒する（アドバンセズ・イン・マイクロバイアル・フイジオロジー 第２７巻、１１３−２０９頁、１９８６）。これらの酵素はメタノール、エタノールのような一級アルコール類やアルデヒド類をアンモニアやメチルアミン類を活性化剤として酸化するが、しかし、これらの酵素のうち大部分は二級アルコールを酸化することはできない。メチロバクテリウム オルガノフィラム、シュードモナス Ｃ、ヂィプロコッカス PAR および ロドシュードモナス アシドフィルより得られるメタノール脱水素酵素は二級アルコールの酸化を触媒することができる例である。これらの前例に対して、本発明によるAADHは広い範囲の一級および二級アルコールを酸化し、既存のメタノール脱水素酵素と以下の点において明らかに異なっている。
【０００５】
本ＡＡＤＨはエタノールはよい基質とするが、メタノールを酸化できない。アンモニアやメチルアミンなどの活性化剤を必要としない。一般のメタノール脱水素酵素の等電点が７．０以上なのに対して、本ＡＡＤＨの等電点は約４．４である。
【０００６】
ＰＱＱを補欠分子族として含むアルコール脱水素酵素の例としてほかにシュードモナス エルギノーサのキノプロテインアルコール脱水素酵素（バイオケミカル・ジヤーナル、 第２２３巻、９２１−９２４頁、１９８４）およびシュ−ドモナス テストステロニのキノヘムプロテインアルコ−ル脱水素酵素（バイオケミカル・ジヤーナル、第２３４巻、６１１−６１５頁、１９８６）が知られている。前者は、本発明によるＡＡＤＨがサブユニットの二量体で存在し活性化剤を必要としないのに対して、分子量１０１、０００の単量体で活性化剤としてアンモニウム塩又はアミンを必要とする。後者は、本発明によるＡＡＤＨがサブユニットの二量対でヘムｃ分子団を含まないのに対して、分子量６７、０００の単量体で一分子ずつのＰＱＱとヘムｃ分子団を含む。
【０００７】
上記で述べたように、今日まで本発明で述べられているようなＡＡＤＨの報告はない。特定の菌株の菌体可溶性画分より単離された精製酵素がアルコ−ル類およびアルデヒド類の酸化を触媒し、アルコ−ル類からはアルデヒド類またはケトン類、アルデヒド類からはカルボン酸類を生成することが見いだされた。さらに特徴的には該酵素はＬ−ソルボ−スをＬ−ソルボソンを経て２ＫＧＡに酸化する。本発明はこの知見を基礎として完成された。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
後述の実施例に従って調製されるAADH精製標品の物理化学的諸性質を以下に示す：
１）酵素活性
本発明のAADHは電子受容体の存在下でアルコ−ル類およびアルデヒド類の酸化を触媒し、アルコ−ル類からはアルデヒド類またはケトン類、アルデヒド類からはカルボン酸類を生成する。
【０００９】
本酵素は酸素を直接電子受容体として利用できない。しかし、電子受容体として機能する能力のあるいくつかの適切な物質を本発明による酵素は利用することができる。電子受容体として、２、６−ジクロロフェノ−ルインドフェノ−ル（本文中以後、ＤＣＩＰと記す）、フェナジン メソサルフェイト（本文中以後、ＰＭＳと記す）、ウルスタ− ブル−、フェリシアナイド、コエンザイムＱおよびチトクロ−ムｃなどが使用できる。
【００１０】
酵素活性測定はスペクトロフォトメ−タ−（ＵＶＩＫＯＮ ８１０、コントロン社製）を用いＤＣＩＰの６００ ｎｍの吸光度の減少を２５℃で測定することによっておこなった。酵素活性１単位は１分間に１ μｍｏｌｅ量のＤＣＩＰの還元を触媒する酵素の量と定義した。ＤＣＩＰの分子吸光係数はｐＨ ８．０においてｍＭ濃度当たり１５とした。標準反応溶液（ １ ｍｌ）は０．１ ｍＭのＤＣＩＰ、１ ｍＭのＰＭＳ、１２５ ｍＭのＬ−ソルボ−ス、５０ ｍＭのトリス−マレイト−苛性ソ−ダ緩衝液（ｐＨ ８．０）と３−８ μｌの酵素溶液を含んでいる。比較対照用として上記反応溶液に基質のみを含まないものをもちいた。
【００１１】
２）基質特異性
ＡＡＤＨの基質特異性はＬ−ソルボ−スのかわりに様々な基質をもちいた上記１）の酵素活性測定法をもちいて決定された。測定結果は表１に示す。一級アルコ−ル、二級アルコ−ル、アルデヒドおよびポリエチレングリコ−ル、ポリビニルアルコ−ルを含む高分子量アルコ−ルと様々な物質が基質となりえた。
【００１２】
３）至適ｐＨ
ＡＡＤＨの反応速度とｐＨのあいだの関連性はトリス−マレイト−苛性ソ−ダ緩衝液（ｐＨ ６．０から８．０）とトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ９．０）でいくつかの基質をもちいて測定された。結果は表２に示す。基質の種類に関係なく、ＡＡＤＨはｐＨ ７．０から９．０の範囲でもっとも高い活性を示した。
【００１３】
４）ｐＨ安定性
精製ＡＡＤＨは表３に示す様々なｐＨ値の緩衝液中４℃で一定時間放置された。残存酵素活性はＬ−ソルボ−スまたはＬ−ソルボソンを基質としてもちい上記１）の酵素活性測定法で測定された。測定結果を表３に示す。精製酵素はアルカリｐＨ領域で比較的安定で、酸性化により不安定となる。
【００１４】
５）熱安定性
精製ＡＡＤＨは０．１ Ｍ ＮａＣｌ 、５％スクロ−スを含む２５ ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．０）中様々な温度で１０分間処理された後に、ただちに氷冷された。残存酵素活性はいくつかの基質をもちい上記１）の酵素活性測定法で測定された。測定結果を表４に示す。ＡＡＤＨは３０℃以下では安定であるが、４０℃以上で不安定である。
【００１５】
６）至適温度
ＡＡＤＨ の酵素活性は１０℃から５０℃の温度下でいくつかの基質をもちい上記１）の酵素活性測定法で測定された。結果は表５に示す。本酵素は２０℃から４０℃の温度領域に反応至適を示す。
【００１６】
７）分子量
ＡＡＤＨの分子量はゲル濾過カラムクロマトグラフィ−をもちいて決定された。酵素サンプルは酵素精製のための樹脂、たとえば０．１ Ｍ ＮａＣｌ 、５％スクロ−スを含む２５ ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．０）で平衡化されたセファクリルＳ−３００ＨＲ（ファルマシア社製）に添加された。分子量スタンダ−ドとして、チログロブリン（６７０，０００ ダルトン）、フェリチン（４５０，０００ ダルトン）、カタラ−ゼ（２４０，０００ ダルトン）、アルドラ−ゼ（１５８，０００ ダルトン）、ガンマ グロブリン（１５８，０００ ダルトン）、ウシ血清アルブミン（６６，２００ ダルトン）、オボアルブミン（４５，０００ ダルトン）、キモトリプシノゲン Ａ（２５，０００ ダルトン）、ミオグロビン（１７，０００ ダルトン）、チトクロ−ム ｃ（１２，５００ ダルトン）およびビタミン Ｂ１２（１，３６０ ダルトン）がもちいられた。結果として、ＡＡＤＨの分子量は１３５，０００±５，０００ ダルトンと決定された。つぎに、精製ＡＡＤＨはベ−タ メルカプトエタノ−ル存在下ソディウム ドデシル サルフェイト（ＳＤＳ）で処理され、その分子構造はＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動分析により解析された。分子量スタンダ−ドとして、 フォスフォリラ−ゼ Ｂ（９２，５００ ダルトン）、ウシ血清アルブミン（６６，２００ ダルトン）、オボアルブミン（４５，０００ ダルトン）、カ−ボニック アンヒドラ−ゼ（３１，０００ ダルトン）、大豆トリプシン インヒビタ−（２１，５００ ダルトン）およびリゾチ−ム（１４，４００ ダルトン）がもちいられた。本酵素は２種のサブユニットから成ることが示された。第一のサブユニット（アルファ サブユニット）は分子量が６４，５００±２，０００であり、第二のサブユニット（ベ−タ サブユニット）は分子量が６２，５００±２，０００である。
【００１７】
８）Ｋｍ（ミカエリス定数）値の測定
１）に記載の方法をもちいて、酸化速度と基質濃度変化の関係をみかけ上のミカエリス定数（Ｋｍ）として決定するために測定した。ＤＣＩＰとＰＭＳを電子受容体として含む反応液で測定した。Ｌ−ソルボ−スおよび１−プロパノ−ルに対するＫｍ値はそれぞれ２３０ ｍＭおよび２ ｍＭと算出された。
【００１８】
９）金属イオンの影響
１）に記載の方法をもちいて、様々な金属イオンの酵素活性に対する影響を測定した。表６に結果を示す。検査された金属イオン中、Ｍｇ２＋とＣａ２＋イオンのみが酵素活性に影響を与えなかった。他は酵素活性に対して強度および中度の影響を示した。Ｃｕ２＋， Ｍｎ２＋， Ｆｅ３＋ は酵素の強い阻害剤である。
【００１９】
１０）阻害剤の影響
１）に記される方法をもちいて、阻害剤の酵素活性に対する影響を測定した。表７に結果を示す。エチレンヂアミン テトラアセティック アシッド（ＥＤＴＡ）およびエチレン グリコ−ル ビス（ベ−タ−アミノエティルエ−テル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラアセティック アシッド（ＥＧＴＡ）は酵素活性に対して強い阻害を示した。
【００２０】
１１）補欠分子族
精製ＡＡＤＨの吸光スペクトルは図１に示すように２８０ ｎｍの極大吸収と２９０ ｎｍの肩を示した。第二の吸収ピ−クが３４０ ｎｍに３８０−４２０ ｎｍの広い肩をともない検出された。この吸収スペクトルはＡＡＤＨがＰＱＱを補欠分子族としてもっていることを強く示唆した。
【００２１】
１００ ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４−塩酸（ｐＨ 約 １．０） 中の精製酵素（４．５ ｍｇ量）に同容量のメタノ−ルを添加し混合した。サンプルより１５，０００ ｒｐｍ、１０分間遠心分離で沈殿物を除去した。この抽出物を補欠分子族の同定にもちいた。抽出物の吸収スペクトルはＰＱＱの標準サンプル（三菱ガス化学社製）と完全に一致した。さらに、逆相カラム（ＴＳＫ−ＯＤＳ ８０ＴＭ， トヨ−ソ−ダ社製）をもちいた高圧液体クロマトグラフィ−分析でＡＡＤＨ抽出物はＰＱＱ標準サンプルと同一の保持時間を示した。
【００２２】
１２）等電点
ＡＡＤＨの等電点（ｐＩ）が決定された。エレクトロ フォ−カシングのため８．５ Ｍ尿素、２％（ｗ／ｖ）非イオン性界面活性剤例えばノイデット Ｐ−４０および２．４％（ｗ／ｖ）のｐＨ勾配形成のための緩衝剤物質；アンフォライト例えばファルマライト， ｐＨ ２．５−５．０（ファルマシア社製）を含んだ４％濃度のポリアクリルアミド ゲルをもちいた。電極液としては、０．０１ Ｍのイミノ二酢酸を陰極に、０．０１ ＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルフォニック アシッド（ＨＥＰＥＳ）を陽極にもちいた。サンプルの等電点はファルマシア社製の低ｐＨキャリブレ−ション キット、ｐＨ ２．５−５．０との比較により算出した。結果として、ＡＡＤＨ は等電点約４．４ のバンド群を示した。
【００２３】
１３）精製法
ＡＡＤＨの精製は以下のような通常もちいられる精製法の組み合わせが有効である。
【００２４】
沈殿剤による分画、例えば 硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコールなど
イオン交換クロマトグラフィー
吸着クロマトグラフィー
ゲル濾過クロマトグラフィー
ゲル電気泳動
塩析および透析
本発明によるＡＡＤＨは、適切な微生物株を培養し、得られた細胞を破砕し、破砕細胞の無細胞抽出物、好ましくは微生物菌体可溶性画分（ｃｙｔｏｓｏｌ ｆｒａｃｔｉｏｎ）から調製する事ができる。
【００２５】
本発明により使用される微生物菌株は前述したＡＡＤＨを生産する能力をもつグルコノバクター属に属するすべての菌株を含む。また、本菌株の機能的同等物、継代培養、変異株および誘導体も本発明に使用できる。
【００２６】
好適な菌株はグルコノバクター オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）である。特に好適なグルコノバクター オキシダンス株はゲッチンゲン（ドイツ）にあるドイツ微生物寄託所（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｉｎ Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ； Ｇｅｒｍａｎｙ） にＤＳＭ Ｎｏ． ４０２５株として１９８７年４月１７日に寄託されている。
【００２７】
さらに、該菌株の継代培養はブタペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ） の契約規定にもとずいて微生物工業技術研究所（日本）（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｊａｐａｎ） に；グルコノバクター オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） ＤＳＭ Ｎｏ． ４０２５ ＦＥＲＭ ＢＰ−３８１２株として１９９２年３月３０日に寄託されている。
【００２８】
さらに、ヨーロッパ特許公開（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ） Ｎｏ．０２７８ ４４７ （４２２６／０８１ｋ）に本菌株の性質が記載されている。
【００２９】
本微生物は好気条件下、適切な栄養源を含んだ液体培地によって培養される。培養はｐＨ 約４．０−９．０の間でおこなえるが、好ましくはｐＨ約６．０−８．０のあいだがのぞましい。培養時間は、ｐＨ、温度および使用される培地条件によりことなるが、通常２ー５日間で好結果をもたらす。好ましい培養のための温度範囲は、約１３℃から３６℃であるが、好ましくは約１８℃から３３℃がのぞましい。
【００３０】
通常培養用培地は資化可能な炭素源、利用可能な窒素源や無機物質、ビタミン類、微量成分および他の成育促進因子などを含む。資化可能な炭素原としては、Ｌ−ソルボース、グリセロール、Ｄ−グルコース、Ｄ−マニトール、Ｄ−フルクトース、Ｄ−アラビトールおよびこれらに類するものが使用できる。
【００３１】
様々な無機および有機物質が窒素源としてもちいられる、例えばイースト エキストラクト、ミート エキストラクト、ペプトン、カゼイン、コーン スチィープ リカー、尿素、アミノ酸、硝酸、アンモニウム塩およびこれらに類するものが使用できる。 無機物質として硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、塩化第一および第二鉄、炭酸カルシウムおよびこれらに類するものが使用できる。
【００３２】
以下に、培養後の菌体からのＡＡＤＨの単離精製法の実施態様を簡便に記す。
【００３３】
（１）菌体を培養槽より遠心分離もしくは濾過によって収集する。
【００３４】
（２）該菌体を緩衝液に懸濁した後、ホモゲナイザー、超音波、リゾチーム処理など細胞破砕液を調製できるもので破砕する。
【００３５】
（３）ＡＡＤＨは破砕された細胞の無細胞抽出液より、さらに好ましくは微生物菌体の可溶性画分より単離精製される。
【００３６】
本発明によるＡＡＤＨはアルコール類およびアルデヒド類からのアルデヒド類、カルボン酸類およびケトン類、とくにＬ− ソルボースよりＬ−ソルボソンを経て２ＫＧＡを生産する触媒として有用である。
【００３７】
反応はトリスー塩酸緩衝液、リン酸緩衝液又はそれに類する溶媒中で、電子受容体例えばＤＣＩＰ、ＰＭＳ、ウルスタ− ブル−、フェリシアナイド、コエンザイムＱ、チトクロ−ムｃおよびそれに類するものの存在化、ｐＨ約 ６．０−９．０でおこなわれる。
【００３８】
該反応のためのこのましい温度範囲は約１０℃から５０℃である。ｐＨと温度がそれぞれ約７．０−８．０、２０℃−４０℃に設定されたとき通常最もこのましい反応結果が与えられる。
【００３９】
反応溶媒中の基質濃度は他の反応条件によって変得ることができる、しかし、一般的に約１０−１００ ｇ／ｌ濃度、さらに最も好ましくは約３０−４０ ｇ／ｌである。
【００４０】
該反応において、ＡＡＤＨは適切な担体に固定された状態でも使用できる。一般的にこれまで知られているような固定化酵素としても使用可能である。例えば、本酵素は直接反応基をもった膜、粒子、もしくは樹脂のようなものに結合できる、又はグルタルアルデヒドのような反応基物質を架橋として樹脂に結合することもできる。上記に加えて、培養された細胞もアルコール類およびアルデヒド類からのアルデヒド類、カルボン酸類およびケトン類、とくにＬ− ソルボースより２ＫＧＡを生産する触媒として有用である。
【００４１】
【実施例】
以下の実施例にてさらに本発明についてのべる。
【００４２】
実施例 １
ＡＡＤＨの調製
すべての操作は特に記載のないかぎり４℃でおこなわれた。
【００４３】
（１）グルコノバクター オキシダンス ＤＳＭ Ｎｏ． ４０２５（ＦＥＲＭ ＢＰ−３８１２）の培養
（Ａ）培地調製
Ｌ−ソルボース ８％（ｗ／ｖ）（別滅菌）、グリセロール ０．０５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２５％、コーン スティープ リカー １．７５％、ベーカーズ イースト ５．０％、ＣａＣＯ３ ０．５％と尿素 ０．５％（別滅菌）（滅菌前ｐＨ ７．０）を含む培養培地を試験管（それぞれ５ ｍｌ）にいれ１２０℃， ２０分間滅菌した。
【００４４】
（Ｂ）植菌、培養
この種培養培地に、Ｄ−マニトール ５．０％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２５％、コーン スティープ リカー １．７５％、ベーカーズ イースト ０．２５％、ＣａＣＯ３ ０．５％、尿素 ０．５％（別滅菌） および寒天 ２．０％（滅菌前ｐＨ ７．０）を含むスラント培養培地で２７℃、３日培養された菌株より一白金耳の細胞を植菌し３０℃で２４時間培養した。この種培養（５ ｍｌ）は５００ ｍｌ エルレンマイヤ− フラスコにいれた１００ ｍｌの上記と同様の培地に植菌され３０℃、２４時間培養した。さらに、この種培養（５ ｍｌ）は５００ ｍｌ エルレンマイヤ− フラスコにいれた１００ ｍｌの上記と同様の培地に植菌され３０℃、２４時間培養された。このように調製された種培養を３０ ｌ ジャー培養槽中の１５ ｌ の本培地への種菌としてもちいた。培地はＬ−ソルボース １０％（ｗ／ｖ）（別滅菌）、グリセロール ０．０５％、尿素 １．６％（別滅菌）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２５％、ベーカーズ イースト ５．０％、ＣａＣＯ３ １．５％とコーン スティープ リカー ３．０％を含む。発酵は、温度３０℃、攪拌５００ ｒｐｍおよび通気７．５ ｌ／分でおこなった。発酵開始４０時間後、菌体は遠心分離（１０，０００ ｇ， １５分）で集菌された。菌体は１ ｌ の０．９％ ＮａＣｌ、５ ｍＭのＭｇＣｌ２および１ ｍＭのフェニルメチルスルファニル フルオライド（ＰＭＳＦ）をふくむ２５ ｍＭトリスー塩酸、ｐＨ ７．０、に懸濁された。懸濁液はＣａＣＯ３および他の沈降性培地成分を除去するため５００ ｇ、５分間遠心分離された。その後、細胞は１０，０００ ｇ、１５分間の遠心分離で回収された。上記の操作は再度繰り返された。結果として、１２５ ｇ（湿式重量） のグルコノバクター オキシダンス ＤＳＭ Ｎｏ． ４０２５（ＦＥＲＭ ＢＰ−３８１２）細胞が得られた。洗浄菌体は次の精製段階まで、−２０℃で１週間冷凍保存された。
【００４５】
（２）可溶性画分の調整
上記ステップ（１）でえられたグルコノバクター オキシダンス ＤＳＭ Ｎｏ． ４０２５（ＦＥＲＭ ＢＰ−３８１２）細胞は１００ ｍｌの０．５ ｍＭのＰＭＳＦをふくむ２５ ｍＭのトリスー塩酸緩衝液、ｐＨ ８．０に懸濁され細胞破砕のため細胞破砕装置（フレンチ プレス）で２度処理（１，５００ ｋｇ／ｃｍ２）された。この均一化された懸濁液に ２ ｍｌの１ ｍｇ／ｍｌ のＤＮＡ切断用ＤＮＡ分解酵素Ｉ（シグマ社製）と１ ｍｌの０．５ Ｍ濃度のＭｇＣｌ２を添加し、混合物を１５分間放置した後に、細胞残さを除くため６，０００ ｇ、１５分間遠心分離した。こうして得られた無細胞抽出液（２１０ ｍｌ）は１００，０００ ｇ、６０分間遠心分離された。この上清を可溶性画分として回収した（２００ ｍｌ）。
【００４６】
（３）ＰＥＧ（ＭＷ６０００） 処理（ＤＮＡ沈殿）
上記ステップ（２）の可溶性画分（２００ ｍｌ）は２ Ｌの０．５ ｍＭのＰＭＳＦをふくむ２５ ｍＭのトリスー塩酸緩衝液、ｐＨ ８．０に対して透析された後に、４０ ｇのＰＥＧ ６０００（ 半井化学工業）と５ ｍｌ の２Ｎ ＫＣｌを添加され、３０分間放置され、１４，０００ ｇ、２０分間遠心分離された。上清は同様の緩衝液で４００ ｍｌまで希釈された。
【００４７】
（４）ＤＥＡＥ トヨパール ６５０Ｍ（弱イオン交換） カラム クロマトグラフィー
上記ステップ（３）でえられた上清（４００ ｍｌ）は０．２５ ｍＭのＰＭＳＦ、５％のスクロースを含む２５ ｍＭのトリスー塩酸緩衝液、ｐＨ ８．０で平衡化されたジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）トヨパール ６５０Ｍ カラム（内径２．５ ｃｍ、全長３５ ｃｍ）に添加された。カラムが同様の緩衝液６００ ｍｌで洗浄された後、酵素は同様の緩衝液（２０００ ｍｌ）に含まれる ０から０．５ ＭまでのＮａＣｌの濃度勾配によって溶出された。活性画分（１７４ ｍｌ）は回収され次のステップに供された。
【００４８】
（５）Ｑ−セファロース（強イオン交換） カラム クロマトグラフィー 「第２ステップ」
前ステップで得られた活性画分は０．２５ ｍＭのＰＭＳＦ、５％のスクロースを含む２５ ｍＭのトリスー塩酸緩衝液、ｐＨ ８．０で平衡化されたＱーセファロース カラム（内径２．５ ｃｍ、全長３５ ｃｍ）に添加された。カラムが緩衝液により完全に洗浄された後、酵素活性溶出は同様の緩衝液（２０００ ｍｌ）に含まれる ０．２５から０．５ ＭまでのＮａＣｌの濃度勾配によってなされた。電気泳動的に均一なＡＡＤＨを含む画分は回収され、ＰＭ−３０膜（アミコン コーポレイション）により２０ ｍｌまで濃縮された。
【００４９】
ＡＡＤＨ の精製段階の要約は表８に示す。
【００５０】
（６）単離されたＡＡＤＨ の純度
単離されたＡＡＤＨ の純度検定のため、ポリアクリルアミド ゲル電気泳動をおこなった。 サンプルはデイビス（Ｄａｖｉｓ）らの方法（Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １２１： ４０４， １９６９）にしたがってトリスー塩酸緩衝液、ｐＨ ９．４の７．５％ ポリアクリルアミドゲルに添加された。タンパク質はタンパク染色剤であるコマシー ブリリアント ブルー Ｒ−２５０によって染色された。ゲル中の酵素活性はニトロ ブルー テトラゾリウム クロライド（シグマ社製）の還元との共役によって検出された。ゲルは５０ ｍＭのトリス−マレイト−苛性ソ−ダ緩衝液、ｐＨ ８．０、０．０１ ｍＭのＰＱＱ、０．１ ｍＭのＰＭＳ、０．４ ｍＭのニトロ ブルー テトラゾリウム クロライドおよび０．２５ ＭのＬ−ソルボースを含む溶液に、３０ ℃暗所下浸された。
【００５１】
ＡＡＤＨはタンパク染色において３本の近接したバンドを示し、すべてのバンドは酵素活性を示した。 ３本のゲル中でのタンパクバンドは電気泳動中、酵素より補欠分子族であるＰＱＱが解離することに起因する。
【００５２】
（７）反応生成物の同定
５０ μｌの精製ＡＡＤＨ（１．５ ｍｇ）、０．１ ｍｌの１０ ｍＭ ＰＭＳ、０．５ ｍｌの０．４ Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ６．５、０．２５ ｍｌの水および０．１ ｍｌのさまざまな基質の２０％溶液を含む反応液が３０℃、１５時間、緩やかな攪拌をともない反応させられた。反応生成物は薄層クロマトグラフィ−で分析された。生成物は標準サンプルと直接比較することで同定された。結果は表９に示す。
【００５３】
実施例 ２
精製ＡＡＤＨによる２ＫＧＡ生産
０．５ ｍｌの精製ＡＡＤＨ（１５ ｍｇ）、１ ｍｌの２０％ Ｌ−ソルボ−ス溶液、１ ｍｌの１０ ｍＭ ＰＭＳ、５ ｍｌの０．４ Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ６．５ および２．５ ｍｌの水を含む反応液が３０℃で緩やかな攪拌をともない反応させられた。結果として、約７０ ｍｇ／時間の生成速度で２ＫＧＡが生産された。
【００５４】
実施例 ３
休止菌体系での２ＫＧＡ生産
反応液（１０ ｍｌ）： 実施例 １のステップ（１）と同様の方法で調整されたグルコノバクタ− オキシダンス ＤＳＭ Ｎｏ． ４０２５ （ＦＥＲＭ ＢＰ−３８１２）菌体 ０．２５ ｇ、１ ｍｌの２０％Ｌ−ソルボ−ス溶液、１ ｍｌの１０ ｍＭ ＰＭＳ、１ ｍｌの３％ 食塩水、１ ｍｌ の３０ μＭ ＰＱＱ、０．１ ｇ 炭酸カルシウム、が３０℃で緩やかな攪拌をともない反応させられた。結果として、約６ ｍｇ／時間の生成速度で２ＫＧＡが生産された。
【００５５】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【００６３】
（ｂ） “無細胞抽出物”は実施例１（２）に記載の方法により調製された。
【００６４】
（ｃ） “可溶性画分”は実施例１（２）に記載の方法により調製された。
【００６５】
（ｄ） “ＰＥＧ ６０００上清は実施例１（３）に記載の方法により調製された。
（ｅ） “ＤＥＡＥ−トヨパール”は実施例１（４）に記載の方法により調製された。
【００６６】
（ｆ） “Ｑ−セフアロース”は実施例１（５）に記載の方法により調製された。
【００６７】
【表９】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＡＤＨの吸収スペクトルを示す。
Claims (10)
- 以下に示す物理化学的特性：
a) 至適pH ： 7.0 〜 9.0
b) 至適温度： 20 〜 40℃
c) 分子量：135,000 ± 5,000 ダルトン
（それぞれ分子量64,500± 2,000 と62,500±2,000のアルファ サブユニットとベー タ サブユニットのいずれの組み合わせからなる２つのサブユニットからなる）
d) 基質特異性：一級および二級アルコール類、およびアルデヒド類に活性を示す
e) 補欠分子族：ピロロキノリン キノン
f) 等電点：約 4.4
を有するアルコール／アルデヒド脱水素酵素。 - 請求項１に記載の特性を有するアルコール／アルデヒド脱水素酵素を生産する能力をもつグルコノバクター属に属する微生物より取得される、請求項１に記載のアルコール／アルデヒド脱水素酵素。
- 微生物がグルコノバクタ− オキシダンス DSM No. 4025 (FERM BP-3812)と同等と見なされる性質をもつグルコノバクター オキシダンスである請求項２に記載のアルコール／アルデヒド脱水素酵素。
- 該微生物がグルコノバクター オキシダンス DSM No. 4025 (FERM BP-3812)、継代培養又は変異株である請求項３に記載のアルコール／アルデヒド脱水素酵素。
- 以下に示す物理化学的特性：
a) 至適pH ： 7.0 〜 9.0
b) 至適温度： 20 〜 40℃
c) 分子量：135,000 ± 5,000 ダルトン
（それぞれ分子量64,500± 2,000 と62,500±2,000のアルファ サブユニットとベー タ サブユニットのいずれの組み合わせからなる２つのサブユニットからなる）
d) 基質特異性：一級および二級アルコール、およびアルデヒドに活性を示す、
e) 補欠分子族：ピロロキノリン キノン
f) 等電点：約 4.4
を有するアルコール／アルデヒド脱水素酵素を製造する方法であって、好気条件下液体栄養培地中で、上記の特性を有するアルコール／アルデヒド脱水素酵素を生産する能力をもつグルコノバクター属に属する微生物を培養し、該微生物の細胞を破砕し、該微生物の破砕された細胞の無細胞抽出液より酵素を単離精製することを特徴とする方法。 - 微生物がグルコノバクタ− オキシダンス DSM No. 4025 (FERM BP-3812)と同等と見なされる性質をもつグルコノバクター オキシダンスである請求項５に記載の製造方法。
- 微生物がグルコノバクター オキシダンス DSM No. 4025 (FERM BP-3812)、継代培養又は変異株である請求項６に記載の製造方法。
- アルコール及び／又はアルデヒドを、電子受容体の存在下に、
(i) 以下に示す物理化学的特性：
a) 至適pH ： 7.0 〜 9.0
b) 至適温度： 20 〜 40℃
c) 分子量：135,000 ± 5,000 ダルトン
（それぞれ分子量64,500± 2,000 と62,500±2,000のアルファ サブユニットとベー タ サブユニットのいずれの組み合わせからなる２つのサブユニットからなる）
d) 基質特異性：一級および二級アルコール、およびアルデヒドに活性を示す、
e) 補欠分子族：ピロロキノリン キノン
f) 等電点：約 4.4
を有するアルコール／アルデヒド脱水素酵素、又は
(ii) 好気条件下液体栄養培地中で上記の特性を有するアルコール／アルデヒド脱水素酵素を生産する能力をもつグルコノバクター属に属する微生物、又は
(iii) 該微生物の無細胞抽出液
と接触させ、そして生成するアルデヒド、ケトン又はカルボン酸を反応混合物から単離することを特徴とする、アルコール又はアルデヒドからアルデヒド、ケトン及び／またはカルボン酸を製造する方法。 - 微生物がグルコノバクタ− オキシダンス DSM No. 4025 (FERM BP-3812)と同等と見なされる性質をもつグルコノバクター オキシダンスである請求項８に記載の方法。
- 微生物がグルコノバクター オキシダンス DSM No. 4025 (FERM BP-3812)、継代培養又は変異株である請求項９に記載の方法。
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