JPH043947B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド：（ジクロロフエノールインドフエノ
ール）オキシド レダクターゼを高濃度に含有す
る新規なバチルス ステアサーモフイラス
（Bacillus stearothemophilus）UK563菌株に関
するものである。 還元型ニコチンアミドアデニンヌクレオチド：
（ジクロロフエノールインドフエノール）オキシ
ド レダクターゼは通常ジアホラーゼと呼ばれ、
動物組織、酵母、微生物などに見い出され、還元
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以後
NADHと称す）を基質としてメナジオン、フエ
リシアニド、ニトロテトラゾリウムブルー、2.6
−ジクロロフエノールインドフエノールなどを還
元発色させる酵素である。そのため、臨床検査で
NADHの関与する各種分析キツトの発色系の酵
素として汎用されており、例えばグルコース、ク
レアチン、乳酸、ピルビン酸、胆汁酸などの測定
に使用されている。かかるジアホラーゼの製造に
関しては、成育速度が速いことや大量生産のしや
すさから、もつぱら微生物菌体より分離精製され
ているが、ジアホラーゼは菌体内酵素であるた
め、菌体を破壊して目的のジアホラーゼのみを精
製するためには夾雑する他の蛋白をすべて除外す
る複雑な工程が必要である。そのため、純度の高
いジアホラーゼは著しく高価なものとなり、経済
的な点で産業上大きな問題となつている。 かかる問題を解決するためにジアホラーゼ含有
量の高い菌株を自然界より分離し、使用に供する
努力がなされてきており、例えばジヤーナル オ
ブ アプライド バイオケミストリー １巻247
〜258頁1979年（Journal of Applied
Biochemistry）には、約10万ユニツト／Kg乾燥
菌体のジアホラーゼを含有するバチルス ステア
ロサーモフイラスNCA1503株が報告されている。
また、バイオケミカル ジヤーナル 191巻457〜
465頁1980年（Biochem.J.1980）には、約50万ユ
ニツト／Kg乾燥菌体のジアホラーゼを含有するバ
チルス ステアロサーモフイラスPH24について
報告がなされている。後者の場合、一見含有量が
高いようであるが、酵素含有量の測定温度が55℃
で行われており、酵素反応速度は10℃低下すると
約1/2になることから、臨床検査で用いられる測
定温度30℃では、約６〜８万ユニツト／Kg乾燥菌
体と計算され、工業生産上両者とも含有量が低く
困難が予想される。 本発明者等は、ジアホラーゼ含有量の高い好熱
性細菌を求めて広く自然界を対象に寒天平板法で
スクリーニングを行つた結果、京都府宇治市小桜
の土壌より、バチルス ステアロサーモフイラス
に属すると考えられる新菌株を発見し、その新菌
株がジクロロフエノールインドフエノールを水素
受容体とした場合に特異的にNADHオキシドレ
ダクターゼ作用を示す酵素を驚くべきことに従来
菌株の50〜80倍、すなわち少なくとも500万ユニ
ツト／Kg乾燥菌体含有する好熱性細菌であること
を見い出し、本発明を完成するに至つた。 すなわち本発明は、バチルス ステアロサーモ
フイラスに属し、NADH：（ジクロロフエノール
インドフエノール）オキシド レダクターゼを少
なくとも500万ユニツト／Kg湿菌体含有する
UK563株である。 本発明のUK563菌株は、ジアホラーゼが0.06ｍ
Ｍジクロロフエノールインドフエノール及び１ｍ
Ｍ還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
を含む50ｍＭのリン酸緩衝液（30℃、PH7.5）を
加えたときの600nｍの吸光度の単位時間当りの
減少量を測定し、１分間当り吸光度を６減少せし
める酵素活性を１ユニツトとした時に、少なくと
も500万ユニツト／Kg乾燥菌体を含有している。 次に本発明の菌株の菌学的性質を示す。この菌
学的性質の検討には、マニユアル・オブ・マイク
ロバイオロジカル・メソツズ（Manual of
Micro−biological Methods；Society of
American Bacteriologists、Mcgraw−Hill
Book Company）、微生物の分類と同定（長谷川
武治編著、東京大学出版会）及び培地学各論（坂
崎利一著、納谷書店）に記載されている方法、培
地組成を用いた。また、寒天培地の場合には、寒
天を３％（重量）を加えた。 〔形態的所見〕60℃、24時間培養 １ 細胞の形及び大きさ：桿状、（0.5〜0.8）×
（１〜２）ミクロン ２ 多形成：なし ３ 運動性：あり ４ 胞子：円筒形の内生胞子を細胞中央ないしは
先端に形成する。胞子のうはふくれない。 ５ グラム染色：陽性 ６ 抗酸性：なし 〔生育状態〕60℃、24時間培養 １ 肉汁寒天平板培養 形状：円形 周縁：波状 隆起：偏平 光沢：なし 表面：平滑 色調：透明 ２ 肉汁寒天斜面培養 生育度：良好 形状：糸状 ３ 肉汁液体培養 表面生育：わずかに菌環を形成する。 濁度：混濁 沈渣：少量 着色、脱色：なし ４ 肉汁ゼラチン穿刺培養 ゼラチン30％添加、60℃で適時培養した後、冷
却して固化状態を判定：ゼラチン液化 ５ 肉汁寒天穿刺培養 形状：念珠状 表面生育：良好 ６ リトマス、ミルク リトマス退色PH6.0、ミルクは固化された後、
液化される。 〔生理学的性質〕60℃、１〜２日培養 １ 硫酸塩の還元：あり ２ 脱窒反応：陰性 ３ MRテスト：陽性 ４ VPテスト：陽性 ５ インドールの生成：なし ６ 硫化水素の生成：弱い陽性 ７ デンプンの加水分解：あり ８ クエン酸の利用：なし ９ 硝酸塩の利用：なし 10 アンモニウム塩の利用：なし 11 色素の生成：なし 12 ウレアーゼ活性：なし 13 オキシダーゼ活性：あり 14 カタラーゼ活性：あり 15 生育PH：5.0〜8.5 至適PH：6.0〜7.5 16 生育温度：40〜70℃ 至適温度：50〜63℃ 17 酸素に対応する態度 好気的で良く生育するが、嫌気下でも弱い生育
が見られる。 18 Ｏ−Ｆテスト：陰性 19 フエニルアラニンの脱アミノ反応：陰性 20 塩化ナトリウムの耐性：５％では生育する
が、７％では生育できない。 21 ビタミン要求性：あり。ビオチン及びビタミ
ンＢ群 22 チロジンの分解性：なし 〔炭素源からの酸及びガスの生成〕60℃、１〜２
日培養

【表】 以上の菌学的性質から、バージイのマニユアル
オブ・デイタミネイテイブ・バクテリオロジー第
８版（Bergey′s Manual of Determinative
Bacteri−ology 8ed.）に基づき検索した結果、
バチルスステアロサーモフイラス（Bacillus
stearothermo−phillusに大略一致した。そこで
バチルス ステアロサーモフイラスの標準菌株、
IAM 11001、11002、11003、11004（以上東京大
学応用微生物研究所保管株）、IFO12550（財団法
人発酵研究所保管株）との対比を行つたところ、
２，３，の生理学的性質において、上記標準菌株
と互いに異なつており、本菌株はバチルス ステ
アロサーモフイラスに属するものであるが、既存
菌株とは異なつており、特にジアホラーゼ含有量
が著しく高いことから新菌株と判定できるので、
バチルス ステアロサーモフイラスUK563と命
名し、昭和58年９月29日に通産省工業技術院微生
物工業技術研究所へ寄託した。その微生物受託番
号は微工研菌寄第7275号（FERM Ｐ−7275）で
ある。 本発明のUK563菌株を培養するに際して用い
られる培地としては、細菌の一般的培地であれば
よく、特に液体培地を用いることが好ましい。こ
の培地の栄養源において炭素源としては、例えば
グルコース、シユークロス、フルクトース、殿
粉、加水分解物、糖密、亜硫酸パルプ廃液の糖
類、酢酸、乳酸等の有機酸類、さらにUK563菌
株が資化しうるアルコール類、油脂、脂肪類及び
グリセリン等が使用でき、窒素源として、例えば
アミノ酸、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等の
有機物が使用でき、必要に応じて無機の窒素源を
加えても良い。さらに無機塩類として、例えばカ
リウム、ナトリウム、リン酸、亜鉛、鉄、マグネ
シウム、マンガン、銅、カルシウム、コバルト等
の各塩類、微量金属塩、コーン・ステープ・リカ
ー、ビタミン類、核酸等を使用してもよく、細菌
の一般的栄養源が使用できる。これらの培地を用
いて、UK563株を20℃〜80℃、好ましくは40℃
〜70℃、最適には50℃〜63℃で約２〜６時間、好
気的に培養すればよい。この場合、回分培養法及
び連続培養法のどちらでも菌体を得ることができ
る。 本発明のUK563菌株は、ジアホラーゼ含有量
が著しく高いため、ジアホラーゼを効率良く得る
ことが可能で、精製法も簡略化でき、工業生産上
メリツトが大きい。実際にジアホラーゼを単離精
製するには、菌体を緩衝液に懸濁させ、通常の方
法で破砕後、塩あるいは界面活性剤を含む溶液な
どで抽出し、核酸の除去、硫酸アンモニウムを用
いた塩析による分画などを行つた後、種々の担体
を用いたカラムクロマトグラフイーを実施すれば
よい。カラムクロマトグラフイーとしては、特に
高価なアフイニテイークロマトグラフイーを必要
とせず、一般によく用いられているDEAE（ジエ
チルアミノエチル）−セルロースのようなイオン
交換クロマトグラフイー、フエニルアガロースの
ような疎水性クロマトグラフイー及びゲル濾過ク
ロマトグラフイーを行うことにより、高純度のジ
アホラーゼを得ることができる。 次に本発明の菌株から得られるジアホラーゼの
理化学的性質を示す。 (1) 作用：次の反応を触媒する。 NADH＋ジクロロフエノールインドフエノー
ル→NAD＋還元型ジクロロフエノールインド
フエノール (2) 基質特異性：２，６−ジクロロフエノールイ
ドフエノールの活性値を100％とすると、メナ
ジオンで18％、フエリシアン化カリでおよそ
1.5％、ｐ−アイオドニトロテトラゾリウムで
およそ１％、ニトロテトラゾリウムブルーでお
よそ0.1％である。 (3) 至適PH：約PH7.5（温度30℃） (4) 安定PH範囲：PH7.0〜11.0で４℃、24時間の
処理でほとんど失活が起こらない。 (5) 作用適温の範囲：PH7.5で、25℃より65℃ま
での温度の上昇とともに活性は増大する。通常
は30℃において反応を行わしめる。 (6) 耐熱性：60℃、15分間の加熱に対して100％
の活性を保持し安定である。 (7) 分子量：セフアデツクスＧ−75ゲルクロマト
グラフイーから約30000であつた。 (8) 活性の測定法：0.06ｍＭの２，６−ジクロロ
フエノールインドフエノール及び１ｍＭの
NADHを含む50ｍＭのリン酸緩衝液（PH7.5）
にジアホラーゼを加えたときの600nｍの吸光
度の単位時間当りの減少量を測定し（30℃）、
１分間当り吸光度を６減少せしめる酵素活性を
１ユニツトとした。 (9) 単一性：精製標品にはアクリルアミドデイス
ク電気泳動法により陽極側に移動し、単一なバ
ンドを与えた。 本発明の菌株は、ジアホラーゼ含有量が著しく
高いため、カラムクロマトグラフイーなどの精製
工程が大幅に小型化、簡略化でき、操業性、収率
が向上し、ジアホラーゼを効率良く、かつ工業生
産に適した経済性でもつて製造することができ
る。 次に本発明を実施例によつて具体的に説明す
る。 実施例１、比較例１ グルコース0.175％（Ｗ／Ｗ、以下同様）、酵母
エキス0.15％、ペプトン0.10％、KH₂PO₄0.10％、
Na₂HPO₄・12H₂O0.10％、MgSO₄・7H₂O0.05％
の組成よりなるPH7.4の培地100mlを500ml三角フ
ラスコに入れ、１気圧加圧下、121℃で湿熱滅菌
した。これに同組成の寒天培地で生育させたバチ
ルス ステアロサーモフイラスUK563株（微工
研菌寄第7275号）を植菌し、58℃で回転振盪培養
（高崎製作所、RGR No.２型180rpm）を開始し
た。約３時間で菌の増殖が対数増殖後期となつた
ので、培養を中止し、8000G5分間遠心分離（ト
ミー製作所、RS71型）を行つて菌体を集菌した。 こうして得られた湿菌体１ｇ（乾燥菌体200mg
に相当）を20mlの0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）に
懸濁し、超音波破砕機（久保田商事200M型）を
用いて破砕し、菌体中のジアホラーゼ含有量を測
定したところ、530万ユニツト／Kg乾燥菌体の高
含有量値を示した。 なお、比較のため、バチルス ステアロサーモ
フイラスIAM 11003株（東京大学応用微生物研
究所より入手、バチルス ステアトサーモフイラ
スNCA 1503株と同じ菌株。）を用いる以外は、
上記と全く同様にして湿菌体を得、上記と全く同
様にして菌体中のジアホラーゼ含有量を測定した
ところ、28万ユニツト／Kg乾燥菌体であつた。 実施例 ２ 実施例１と同様にして500ml三角フラスコで培
養を行つた後、三角フラスコ10本分の培養液を同
組成の培地20を入れ、あらかじめ湿熱滅菌
（121℃、１気圧加圧下10分）した30容ジヤーフ
アーメンター（丸菱理化装置、MSJ−Ｕ型、平
羽根タービン式）に接種した。通気量20／分、
回転数400rpm、温度60℃で培養を開始したとこ
ろ、直ちに菌の生育がみられ増殖に伴いPHの低下
が起こつたので、4N NaOHでPHを6.8〜7.2に調
整しつつ培養を続けたところ、約２時間で波長
660nｍにおける吸光度が1.2に達し、ほぼ培地中
の主要炭素減であるグルコースを消費しつくした
ので、炭素源制限型の連続培養の実施した。連続
培養はバツチ培養に用いたものと同組成の培地を
20／Hrの速度下で供給すると同時に、同速度
で培養液をジヤーフアーメンターから抜き出し、
希釈率を1.0hr^-1に設定して実施した。 連続培養移行後、３時間目の菌体のジアホラー
ゼ含有量を測定したところ、560万ユニツト／Kg
乾燥菌体であり、連続培養によつてもジアホラー
ゼ高含有量の菌体が得られることが確認された。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ バチルス ステアロサーモフイラスに属し、
   還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド：
   （ジクロロフエノールインドフエノール）オキシ
   ド レダクターゼを少なくとも500万ユニツト／
   Kg乾燥菌体含有するUK563菌株。