JPH01108980A

JPH01108980A - シクロヘキサノール脱水素酵素およびその製造方法

Info

Publication number: JPH01108980A
Application number: JP26398987A
Authority: JP
Inventors: Sadayoshi Horiguchi; 堀口　貞由; Komaichi Gomi; 五味　駒一
Original assignee: Research Association for Utilization of Light Oil
Current assignee: Research Association for Utilization of Light Oil
Priority date: 1987-10-21
Filing date: 1987-10-21
Publication date: 1989-04-26

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、シクロヘキサノールをシクロヘキサノンに変
換するシクロヘキサノール脱水素酵素および該酵素の製
造方法に関するものであシ、本発明のシクロヘキサノー
ル脱水素酵素は、ＮＡＤを補酵素としてシクロヘキサノ
ールからシクロヘキサノンを生成させる。

（従来の技術）従来、シクロヘキサノールをシクロヘキサノンに変換す
る反応は、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ　）属に属す
る微生物（Ｄ、　Ｂｅ　Ｎｏｒｒｉｓ、　ＰＡＷ、　Ｔ
ｒｕｄｇｉ　１１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、１２１．３
６５　へ３７０　、（１９７１））およびアシネトバク
タ−（Ａｃ１ｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　）　ＪｒｉＫ　ｌ
ｉする微生物（Ｎ。

Ａ、Ｄｏｎｏｇｈｕｅ、Ｐ、Ｗ、　Ｔｒｕｄｇｉ　ｌ　
ｌ　、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈａｎ、　、６０　
、　ｔ　−７゜（１９７５）］によって行われることは
知られていた。

（発明が解決しようとする問題点）しかしながら、従来の報告では、無細胞抽出液を用いて
反応を行わせ、生産物の定性的な同定が行われてい九に
すぎなく、酵素の存在の確認は行われておらず、酵素を
規定できる諸性質も知られていな込ので、工業的利用は
不可能であった。

（問題点を解決するための手段）本発明者らは、微生物由来のシクロヘキサノール脱水素
酵素について鋭意研究を重ねた結果、アースロバフタ−
（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　）属に属する微生物に、
従来確認されていなかったシクロヘキサノール脱水素酵
素が存在することを見いだし、さらに、アースＣＩバク
ター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　）属に属する微生物
から、このシクロヘキサノール脱水素酵素を単離精製し
、性質を明らかにした。これらの知見にもとづいて本発
明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、下記の特性を有し、シクロヘキサ
ノールから脱水素してシクロヘキサノンに変換する酵素
、およびアースロバフタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ
　）属に属する微生物を培養し、その菌体から前記酵素
を採取するシクロヘキサノール脱水素酵素の製造方法で
ある。

ａ、ｐ　Ｈ１０，ＯＳ１１．５のグリシン−ＮａＯＨ緩
衝液（０，０５Ｍ）中での反応最適温度が３５〜４５１
）、４０Ｃのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（０，０５Ｍ）
中で測定して最適ｐＨが１０．５　Ｓ１１．５ｃ、４℃
の緩衝液中でｐ　Ｈ４，５〜１　Ｆ：Ｊ、０の範囲で安
定ｄ、田８．０のトリス−塩酸緩衝液（０，０５Ｍ）中で
２５Ｃまで安定ｅ、ｓＤｓポリアクリルアミド電気泳動による測定で分
子量が３０，０００±２，０００ダルトンｆ、ゲル濾過
による測定で分子量が５５，０００±２，０００ダルト
ンｇ１等電点がｐ　Ｈ６，５±０．２ｂ、Ｎ末端アミノ酸配列が下記に示す配列Ｘ−Ｘ’−Ｘ
　−ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−１１ｅ　−Ａｌ
ａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｊｙ−Ａｌａ
　−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−１，シ
クロヘキサノール脱水素酵素活性が１　ｍｇ当り１〜１
００単位本発明において用いられる微生物は、アースロバフタ−
（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　）属に属する微生物であ
り、このようなものとしては、たとえば、アースロパク
ター・オキシダ７　スＡ　Ｋ　６５−６　（Ａｒｔｈｒ
ｏｂａｃ−ｔｅｒ　ｏｘｙｄａｎｓ　Ａ　Ｋ　６５−６
、微工研菌寄第９４３０号〕をあげることができる。

アースロバフタ−・オキシダンスＡＫ６５−６の菌学的
性状は次のとおりである。

（ａ）形態学的性状 ■細胞の形および大きさ：短桿菌、　０，６　Ｘ　Ｏ，
８〜１μ■細胞の多形性の有無：多形性（分校等）■運
動性の有無：なし ■胞子の有無：なし ■グラム染色性：陽性 ■抗酸性：陰性（ｂ）培養性状 ■肉汁寒天平板培養：乳白色、クリーム状、生育良好■
肉汁寒天斜面培養：乳白色、クリーム状、生育良好■肉
汁液体培養：白色ｓ　ｏＤ、、。：４．生育良好■肉汁
ゼラチン穿刺培養：液化 ■リドマス・ミルク：アルカリ性、液化（ｃ）生理学的
性質 ■硝酸塩の還元＝ｌＳ性 ■脱窒反応：陰性 ■ＭＲテスト：陰性 ■ｖｐテスト：陰性 ■インドールの生成：陰性 ■硫化水素の生成：陽性 ■デンプンの加水分解：陽性 ■クエン酸の利用：陽性 ■無機窒素源の利用：陽性Ｏ色素の生成：生成しない ■ウレアーゼ：陰性 ■カタラーゼ：陽性 ■生育の温度およびｐ　Ｈ：　２０．Ｓ　０Ｃ１ｐＨ６
，５へ８．０［相］酸素に対する態度：好気性［株］Ｏ−Ｆテスト：陰性［相］糟類から酸およびガスの生成の有無：（１）　Ｌ
−アラビノース　　　− （２）Ｄ−キシロース　　　　− （３）Ｄ−グルコース　　　　± （４）Ｄ−マンノース　　　　士（５）Ｄ−フラクトース　　　士（６）Ｄ−ガラクトース　　　− （７）麦芽糖　　　　　　　　− （８）ショ糖　　　　　　　　士（鴫乳　糖　　　　　　　　− （Ｉｎ　）レバロース　　　　　− ＱＩＩＤ−ソルビット　　　　士（１１−マンニット　　　　士 α３イノジツト　　　　　　− αａグリセリン　　　　　　− αタデンプン　　　　　　　− 本菌は土壌より分離され、化学分類、生理試験ニヨリア
ースロバクター・オキシダンス（Ａｒｔｈｒ−ｏｂａｃ
ｔｅｒ　ｏｘｙｄａｎｓ　）と同定されたものである。

すなわち、細胞壁ペプチドグリカンのアミノ酸配列につ
いては、内田欣哉ら〔微生物の化学分類実験法、学会出
版センター（１９８２））、、用本勲ら　。

〔放線菌の同定実験法１日本放線菌研究会編（１９８５
））の方法にしたがって、菌体脂肪酸組成およびインプ
レノイドキノンについては、鈴木健一部ら〔放線菌の同
定実験法１日本放線菌研究会編（１９８５））の方法に
したがって分析し、生理試験については、駒形和男ら〔
微生物の分類と同定（１９８５））、シャーリングら（
Ｅ、Ｂ。

Ｓｈｉｒｌｉｎｇ、Ｉｎｔ、　Ｊ、　５ｙｓｔ、Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、、１６．．５　ｔ　５−−３４０（１９
６６））、スタックブランドら（Ｅ、　５ｔａｃｋｅｂ
ｒａｎｄｔ、　５ｙｓｔ、　Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ、。

４．４７０−４８６（１９８５））の方法にしたがって
行った。

これらの結果を既存菌株の試験結果および文献記載（Ｋ
、　Ｈ，５ｃｈｌｅｉｆｅｒ、　Ｏ，Ｋａｎｄｌｅｒ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

Ｒｅｖ、、　５４　、４０７　（１９７２）　、Ｋ、５
ｕｚｕｋｉ。

Ｋ−Ｋ（）ｎｎａｇａ　Ｌ　ａ　、Ｉ　ｎ　Ｌ　ｅ　Ｊ
　−ＳＹＳ　ｉ　＊　ＢａＣＬ　ｅｒ　ｊ　０１−　＊
　３５　）　１８８（１９８３）、Ｙ、Ｙａｍａｄａ、
　Ｇｅ１ｎｏｕｅ、Ｙ、Ｔａｈａｒａ。

Ｈ，０ｙａｉｚｕ、に、Ｋｏｍａｇａｔａ、Ｊ、Ｇｅｎ
、Ａｐｐｌ　、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　、　。

２２．２０３−２１４（１９７６）、Ｍ、Ｄ。

Ｃｏｆｆ１ｎｓ、Ｊ、Ａｐｐｌ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
、５２　、４５７−４６０（１９８２）：ｌと照合した
結果。

Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｏｘｙｄａｎｓであると同
定され、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｏｘｙｄａｎｓ　
ＡＫ６５−６と命名された（表１ないし表４）。

表　２　　生理試験 ×１　普通寒天培地、Ｊ２硝酸、こはく酸培地、ｒ：赤
色表　３　有機化合物の資化性試験（注）Ｗ：弱い生育表４　糖から酸の生成アースロバフタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　）属に
属する微生物の培養は２０〜４０Ｃ１好ましくは２４〜
ＳＳ’Ｑの範囲で行われる。培養液の初発のｐＨは６．
５〜８．５．好ましくは６．８〜７．５である。培養液
には、炭素源としてシクロヘキサノール、シクロヘキサ
ノンあるいはその混合物、窒素源としてアンモニウム塩
、硝酸塩、例えば、硫安、塩酸アンモニウム、硝酸アン
モニウム、燐酸アンモニ惟。

硝酸カリ、硝酸ナトリウムなどの無機塩、および／また
はポリペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、コーンスチ
ープリカー肉エキスなどの有機栄養源を加える。無機イ
オンとしては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、
鉄、マンガン、亜鉛、銅。

コバルト、カルシウム、燐酸、クロル、硫酸などを加え
る。これらの栄養源は、すべてまたは一部を組み合わせ
て用いられる。

培養終了後、遠心分離、濾過などによって菌体を集め、
ｐＨを調整した緩衝液等に懸濁し念後。

ホモゲナイズし、本発明の酵素を含む遠心上清液を得る
。この遠心上清液を粗酵素液とし、これより酵素の一般
的分離精製法、すなわち、硫安塩析法、除核酸法、イオ
ン交換樹脂、逆相分配、アフィニティー、ゲル濾過等の
クロマトグラフィー、電気泳動、限外濾過膜等を用いた
濃縮法等を組み合わせることによって１本発明の酵素を
精製することができる。

次に１本発明の酵素の性質について述べる。

軸）　作用本発明の酵素が補酵素の存在下でシクロヘキサノールに
作用した場合、シクロヘキサノンが生成する。すなわち
、下記のような反応を触媒する。

（ｂ）　　最適ｐＨおよびｐＨ安定性　　　′種々のｐ
Ｈの緩衝液を用いて測定した本発明の酵素の作用、ｐＨ
範囲はｐ　ｌ（５，０〜１２．０、最適ｐＨ範囲は１０
．５〜１１．５である。本発明の酵素を４Ｃにおいて、
それぞれのｐＨで２４時間処理した場合、ｐ　Ｈ４，５
へｔｏ、ｏ、＠にｐ　Ｈ５，５へ９．０の範囲で安定で
ある。

（ｃ）　　最適温度および温度安定性種々の温度で測定した本発明の酵素の作用温度は５〜５
０Ｃ１最適温度は５５〜４５Ｃである。

本発明の酵素をｐ　Ｈ８，０の緩衝液中において、それ
ぞれの温度で２０分間処理した場合、２５Ｃまで安定で
ある。

（ｄ）　　分子量高速液体クロマトグラフィー（５ｈｏｄｅｘ　８０５　
Ｆ）を用いたゲル濾過法により求めた本発明の酵素の分
子量は５５，０００±２，０００ダルトンである。

ドデシル硫酸ナトリウムを含む電気泳動によシ求めた本
発明の酵素の分子量は３０，０００±２，０００ダルト
ンである。

（ｅ）　　等電点等電点電気泳動法により求められた本発明の酵素の等電
点はｐＨ６，５±２である。

（ｆ）　　Ｎ末端アミノ酸配列エドマン分解法により求められた本発明の酵素のＮ末端
アミノ酸配列は、下記のとおりである。

Ｘ　−Ｘ　−Ｘ　−Ｍａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−
１１ｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−ａｔｙ−ａ
ｔｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ　−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇ　− （２）酵素活性測定法本発明の酵素の酵素活性の測定は、ＮＡＤ存在下で、シ
クロヘキサノールを基質として生成するＮＡＤＨの量を
、３４０　ｎｍの吸光度の増加を追跡することによって
測定きれる。すなわち、５０ｍＭシクロヘキサノール１
００μｔ、５０ｍＭＮＡＤ１００μ４グリシン−ＮａＯ
Ｈ緩衝液（ｐＨ１１，０）７９０μｔ、および適当に希
釈した酵素液１０μｔをよく混合し、３０Ｃで反応させ
、ＮＡＤＨに基づ（３４Ｑ　ｎｍの吸収の増加を測定し
た。本発明の酵素の活性単位は、３０Ｃで１分間当りに
生成するＮＡＤＨのマイクロモル数を１単位とした。

このようにして測定した本発明の酵素の酵素活性は、１
ダ当シ１〜１００ｕである。

（発明の効果）本発明の酵素を用いることによって、シクロヘキサノー
ルからシクロヘキサノンを効率よく生産することができ
る。シクロヘキサノンは、高分子ポリマーや可塑剤の原
料であるアジピン酸の製造原料となり、非常に有用であ
る。

（実施例）以下に実施例をあげて１本発明をさらに詳細に説明する
が１本発明は、これら実施例により何ら限定されるもの
ではない。

実施例アースロバフタ−オキシダンスＡＫ６５−６（Ａｒｔｈ
ｒｏｂａｃｔｅｒ　ｏｘｙｄａｎｓ　Ａ　Ｋ　６５−６
　、微工研菌寄第９４３０号）を、表５に示す組成の培
養液２ｔを含む３を容量のジャーファーメンタ−に植菌
し、３０Ｃ１２４時間６００　ｒｐｍで攪拌培養し念。

表　　　５バクトドリプトン　　　　１０２イーストエキス　　　　　５ｙ食塩　　　　５１シクロヘキサノール　　　０．５２水　　　　　　　　　　　　　　　　　１　を培養中の
ｐＨに、ＩＮの塩酸で７．２にコントロールした。同時
にシクロヘキサノールの消費に合わせて、シクロヘキサ
ノールを添加した。全シクロヘキサノール添加量は８１
であった。培養液から遠心分離によって菌体を集め、約
５０ｆの湿菌体を得た。５２の菌体をトリス−塩酸緩衝
液（ｐ）Ｉａ、０　）　１５ｔｎｔに懸濁し、等容のガ
ラスピーズと共にブラウンセルホモゲナイザーを用いて
。

４．００　Ｏｒｐｍで１分間、菌体を破砕した。破砕物
１０．００ＯＳ’を４Ｃで３０分間、遠心分離した上清
を粗酵素液とした。粗酵素液を七ントリコン（アミコン
社製）を用いて濃縮した後、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８，０）を用いて、高速液体クロマトグラフィ
ー（ＤＥＡＥ−５ＰＷニア、５龍Ｘ７．５（ＩＩ東洋曹
達社製）にかけ、流速５−７Ｍで２８０　ｎｍの吸光度
を追跡しながら、０〜０．５Ｍ食塩の直線的濃度勾配に
よって１本発明の酵素を溶出した。溶出の様子を第１図
にグラフで示した。活性画分を集め、七ントリコン（ア
ミコン社製）を用いて濃縮した後、さらに高速液体クロ
マトグラフィー（５ｈｏｄｅｘ　８０３　Ｆ　：　８ｇ
ｍｘ３０ａａ。

昭和電工社！Ｒ）にかけた。活性画分は分子量約５５．
０００の位置に溶出され、その酵素活性は５ｕ／Ｉｎ９
であった。この活性画分についてドデシル硫酸ナトリウ
ムを含む電気泳動を行ったところ、分子量約３０，００
０の単一なバンドが認められた（第２図参照）。この精
製された本発明の酵素のＮ末端アミノ酸配列を、アミノ
酸シークエンサー（アプライド　バイオシステム社製）
を用いて分析し念ところ、前記した配列であることが判
明した。

精製された本発明の酵素を用いて、ＮＡＤを含む５０　
ｍＭのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１１，０）中で
シクロヘキサノールに作用させ、ガスクロマトグラフィ
ーで分析したところ、シクロヘキサノンの生成が確認さ
れた。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例における本発明の酵素の高速液体クロマ
トグラフィー（ＤＥＡＥ−５ＰＷ）からの溶出の様子を
示すグラフ、第２図は同酵素のドデシル硫酸ナトリウム
を含む電気泳動の結果を示す模式図である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）下記の特性を有し、シクロヘキサノールから脱水
素してシクロヘキサノンに変換する酵素。ａ、ｐＨ１０．０〜１１．５のグリシン−ＮａＯＨ緩衝
液（０．０５Ｍ）中での反応最適温度が３５〜４５℃ ｂ、４０℃のグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（０．０５Ｍ）
中で測定して最適ｐＨが１０．５〜１１．５ｃ、４℃の緩衝液中でｐＨ４．５〜１０．０の範囲で安
定ｄ、ｐＨ８．０のトリス−塩酸緩衝液（０．０５Ｍ）中
で２５℃まで安定ｅ、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動による測定で分
子量３０，０００±２，０００ダルトンｆ、ゲル濾過による測定で分子量が５５，０００±２，
０００ダルトンｇ、等電点がｐＨ６．５±０．２ｈ、Ｎ末端アミノ酸配列が下記に示す配列【遺伝子配列があります】ｉ、シクロヘキサノール脱水素酵素活性が１ｍｇ当り１
〜１００単位
（２）アースロバクター属に属する微生物を培養し、菌
体から下記の特性を有し、シクロヘキサノールから脱水
素してシクロヘキサノンに変換する酵素を採取すること
を特徴とするシクロヘキサノール脱水素酵素の製造方法
。ａ、ｐＨ１０．５〜１１．５のグリシン−ＮａＯＨ緩衝
液（０．０５Ｍ）中での反応最適温度が３５〜４５℃ ｂ、４０℃のグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（０．０５Ｍ）
中で、測定して最適ｐＨが１０．５〜１１．５ｃ、４℃の緩衝液中でｐＨ４．５〜１０．０の範囲で安
定ｄ、ｐＨ８．０のトリス−塩酸緩衝液（０．０５Ｍ）中
で２５℃まで安定ｅ、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動による測定で分
子量３０，０００±２，０００ダルトンｆ、ゲル濾過による測定で分子量が５５，０００±２，
０００ダルトンｇ、等電点がｐＨ６．５±０．２ｈ、Ｎ末端アミノ酸配列が下記に示す配列【遺伝子配列があります】ｉ、シクロヘキサノール脱水素酵素活性が１ｍｇ当り１
〜１００単位