JPH03224484A

JPH03224484A - アルギン酸リアーゼの製造法

Info

Publication number: JPH03224484A
Application number: JP2003390A
Authority: JP
Inventors: Yoshitsugu Kaneko; 義次金子; Yoshimasa Yonemoto; 米本　善政; Kenichi Okayama; 岡山　謙一; Kosaku Murata; 幸作村田; Hikari Kimura; 光木村
Original assignee: Otsuka Chemical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Chemical Co Ltd
Priority date: 1990-01-29
Filing date: 1990-01-29
Publication date: 1991-10-03
Anticipated expiration: 2014-07-28
Also published as: JP2926249B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、アルギン酸リアーゼの製造法に関する。

従来技術とその課題］ンブ、ワカメ、ヒジキ等の褐藻類の構成多糖であるア
ルギン酸は、従来から食物繊維として注目されている。

またアルギン酸のカリウム塩は、Ｋ−Ｎａイオン交換能
を有し、体内のＮａを排泄する作用があると言われてい
る。かかる特性を有するアルギン酸を食品に適用できれ
ば、食品の生理的機能を高め得ることは明らかである。

しかるに、アルギン酸は水に溶解すると高粘性を示すた
め、一般の食品に適用することは非常に困難である。ア
ルギン酸リアーゼでアルギン酸を低分子化すれば、アル
ギン酸水溶液の粘度を低下させ得ることが予測される。

従来、アルギン酸リアーゼは、シュードモナス（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　）　、ビブリオ、フラボバクテリウ
ム（Ｆｌｘｖｏｂｉｃｔｅｒｉｕｍ）等に属する細菌の
培養物から得られている。しかしながら、これらの細菌
はアルギン酸リアーゼ産生能が非常に低いため、工業的
規模でアルギン酸を低分子化するのに十分な量のアルギ
ン酸リアーゼを得るには、多大なコストが必要となり、
実質的には不可能である。

課題を解決するための手段本発明者は、上記従来技術の課題を解決すべく日本各地
の土壌、池、川、下水、水田等からサンプルを採取し、
アルギン酸分解能を有する微生物の検索を行なった結果
、アルギン酸分解活性を有する特定の３種の細菌を混合
培養する場合には、該３種の細菌が相乗的に作用して、
非常に高い収量でアルギン酸リアーゼを得ることができ
、工業的規模でアルギン酸を低分子化するのに必要な量
のアルギン酸リアーゼを容易に供給できることを見出し
、本発明を完成した。

すなわち本発明は、アルギン酸分解能を有する、フラボ
バクテリウム・スビリチボラム、アルカリゲネス・デニ
トリフィカンス及びバチルス・ラテロスポラスを混合培
養し、培養物からアルギン酸リアーゼを採取することを
特徴とするアルギン酸リアーゼの製造法に係る。

本発明方法では、まず、アルギン酸分解能を有する特定
の３種の細菌、すなわちフラボバクテリウム・スピリチ
ボラム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｐｉｒｉｔｉ
ｖｏｒｕｍ）　、アルカリゲネス・デニトリフィカンス
（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎ
ｓ　）及びバチルスやラテロスポラス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　１ａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ　）を混合培養する。

フラボバクテリウム番スビリチボラムとしては、例えば
、フラボバクテリウム・スピリチボラムＯＴＣ−３を例
示できる。該菌は、工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託されている（微工研菌寄第１１１９１号）。該菌の
菌学的性質を以下に挙げる。

（＆）形態（１）細胞の形及び大きさ：通常０．５μｍｘ１．Ｏμｍ程度（２）細胞の多形性の有無；無し、単独である。

（３）運動性の有無：無しく４）胞子の有無：無しく５）ダラム染色性：陰性（ｂ）各培地における生育状態（１）肉汁寒天平板培養３５℃、２４時間の培養で、直径１〜２ｓ＋ｍの凸形コ
ロニー、表面は滑らかで黄色。

（２）肉汁寒天斜面培養３５℃、２４時間の培養で、糸状、周縁は滑らかで光沢
有り、生育は普通。

（３）肉汁液体培養３５℃、２４時間で生育し、生育は普通。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養３５℃、２４時間で生育し、生育は普通。液化は漏斗状
。

（５）リドマスミルク培養３５℃の培養で凝固せず、色調は青紫色で変化なし。

（Ｃ）生理学的性質１）硝酸塩の還元：　　　　陰性２）脱窒反応：　　　　　　陰性３）ＭＲテスト：　　　　　陰性４）　Ｖ　Ｐテスト：　　　　　陰性５）インドールの生成：　　陰性６）硫化水素の生成：　　　陰性７）デンプンの加水分解：　陰性８）クエン酸の利用：　　　陰性９）無機窒素源の利用：　　陰性１０）色素の生成：　　　　陽性、黄色１１）ウレアー
ゼ：　　　　陰性１２）オキシダーゼ：　　　陽性１３）カタラーゼ：　　　　陽性（１４）生育の範囲＝　　　　１８〜３７℃（１５）酸
素に対する態度：　好気的（１６）　ＯＦテスト：　　　　陰性（１７）糖類から酸の生成：陽性・・・グルコース、マルトース、サッカロース、キ
シロース、ガラクトース、ラクトース、マンニトール、
アラビノース、フラクトース陰性・・・デンプン、イノ
シトール以上の結果から、フラボバクテリウム争スビリチボラム
ＯＴＣ−３は、ラムノースからの酸の生成及びウレアー
ゼ反応陰性の点で従来のものとは異なっており、新種で
あることが確認された。

アルカリゲネス・デニトリフィカンスとしては、例えば
、アルカリゲネス拳デニトリフィカンス０ＴＯ−４を例
示できる。該菌は、工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託されている（微工研菌寄第１１１９２号）。該菌の
菌学的性質を以下に挙げる。

（ａ）形態（１）細胞の形及び大きさ；通常０．５μｍＸ１．０μｍ程麿１？）細胞の多形性の有無：無し、単独である。

（３）運動性の有無：有り、周鞭毛を有する。

（４）胞子の有無：無しく５）ダラム染色性：陰性（ｂ）各培地における生育状態（１）肉汁寒天平板培養３５℃、４８時間の培養で、直径１〜２ｍｍの凸形コロ
ニー、表面は滑らかで白色。

（２）肉汁寒天斜面培養３５℃、４８時間の培養で、糸状、周縁は滑らかで光沢
有り、生育は普通。

（３）肉汁液体培養３５℃、４８時間で生育し、生育は普通。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養３５℃の培養で４８時間で生育するが、生育は劣り、液
化はしない。

（ｃ）生理学的性質１）硝酸塩の還元：　　　　陽性２）脱窒反応：　　　　　　陰性３）ＭＲテスト：　　　　　陰性４）　Ｖ　Ｐテスト：　　　　　陰性５）インドールの生成：　　陰性６）硫化水素の生成：　　　陰性７）デンプンの加水分解：　陰性（８）クエン酸の利用：陰性（シモンズクエン酸培地）陽性（クリステンゼン培地）（９）無機窒素源の利用：　　陰性（１０）色素の生成：　　　　陰性（１１）ウレアーゼ：　　　　陰性１２　　オキシダーゼ：１３　　カタラーゼ：１４　　生育の範囲：１５　　酸素に対する態度：１６０Ｆテスト：１７　　糖類から酸の生成：陽性・・・− 陰性・・・グルコース、マルトース、サッカロース、キ
シロース、ガラクトース、ラクトース、マンニトール、
アラビノース、フラクトース（１８）グルコネイトの資
化性：　陰性（１９）アルギニンの分解；　陽性以上の結果から、アルカリゲネス−デニトリフィカンス
ＯＴＣ−４は、グルコネイトの資化性及びアルギニンの
分解性の点で従来のものとは異なっており、新種である
ことが確認された。

バチルスφラテロスポラスとしては、例えば、バチルス
・ラテロスボラスＯＴＣ−５を例示でき陽性陽性２０〜３７℃ 好気的陰性る。該菌は、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ
れている（微工研菌寄第１１１９３号）。

該菌の菌学的性質を以下に挙げる。

（１）形態（１）細胞の形及び大きさ：通常１．０μｍＸ２．０μｍ程度（２）細胞の多形性の有無：無し、単独である。

（３）運動性の有無：有り、周鞭毛を有する。

（４）胞子の有無：有り、球状で０．５μｍＸ１μｍ１末端か準末端。

（５）ダラム染色性：陽性（ｂ）各培地における生育状態（１）肉汁寒天平板培養３５°０１２４時間の培養で、直径２〜３ｍｌ１１の台
形、コロニー表面は粗く白い。

（２）肉汁寒天斜面培養３５℃、２４時間の培養で、糸状、周縁は粗く、光沢無
し、生育は普通。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養３５℃の培養で２４時間で生育し、生育は普通。液化は
漏斗状。

（５）リドマスミルク培養３５℃の培養で凝固し、色調は赤紫色に変化。

（ｃ）生理学的性質１硝酸塩の還元：　　　　陰性２脱窒反応：　　　　　　陰性３ＭＲテスト：　　　　　陰性４ＶＰテスト：　　　　　陰性５インドールの生成：　　陰性６硫化水素の生成：　　　陰性７デンプンの加水分解：　陰性８）クエン酸の利用：　　　陰性９無機窒素源の利用：　　陰性（１０）色素の生成：　　　　陰性（１１）ウレアーゼ：　　　　陰性（１２）オキシダーゼ：　　　陽性（１３）カタラーゼ：　　　　陽性（１４）生育の範囲＝　　　　１０〜４０℃（１５）酸
素に対する態度：　好気的（１６）ＯＦテスト：　　　　陰性（１７）糖類から酸の生成：陽性・・・グルコース、フラクトース、ラクトース、マ
ンニトール陰性・・・ガラクトース、アラビノース、キシロース、
イノシトール、サッカロース、デンプン以上の結果から
、バチルス拳うテロスボラスＯＴＣ−５は公知種である
と確認された。

混合培養は、通常の細菌の培養と同様に行なうことがで
き、液体培地中にて通気撹拌下に行なうのが好ましい。

培養に用いられる培地は、アルギン酸類を必須成分とす
る。アルギン酸類としては、例えば、アルギン酸、その
塩、エステル等を挙げることができる。アルギン酸の添
加量は特に制限されないが、通常０．１〜０．５％程度
とすればよい。更に、本発明で使用する培地には、アル
ギン酸類以外に、細菌の培養に用いられる通常の炭素源
、窒素源、無機塩類等が含まれていてもよい。炭素源と
しては、例えば、グルコース、シュクロース、フラクト
ース、ラクトース、スターチ、グリセロール等を、窒素
源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、コーンスチ
ープリカー、酵母エキス等の有機窒素化合物や硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム等の無機窒素化合物を、無
機塩類としては、例えば、リン酸１カリウム、リン酸２
カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等を挙げ
ることができる。

上記３菌種の培地への接種割合は特に制限されないが、
通常同量ずつ接種するのがよい。

培養は、３０〜３５℃程度の温度下及び７．　０〜７．
４程度のｐＨ条件下に行なわれ、通常２４〜４８時間程
度で終了する。

得られる培養物を公知の手段に従って精製することによ
り、アルギン酸リアーゼを採取することができる。例え
ば、遠心分離にて培養物から菌体を分取し、これを超音
波破砕機、加圧ミル等で破砕抽出した後、ＤＥＡＥ−セ
ルロース、セファデックスＧ−１５０、ヒドロキシルア
パタイト等を用いたカラムクロマトグラフィー等によっ
て精製すればよい。

かくして得られる酵素は、下記理化学的性質を有してい
る。

（１）作　用アルギン酸類を、非還元末端のＣａ　　Ｃｓ間に２重結
合を有する糖に分解し、最終的に４−デオキシ−５−ケ
トウロン酸に分解する。

（２）基質特異性アルギン酸類、すなわちアルギン酸及びその塩、エステ
ルに作用する。詳細を下記第１表に示す。

第１表（３）至適ｐＨ本酵素の至適ｐＨは８．０である。

（４）安定ｐＨ本酵素の安定ｐＨは７．０〜８．０である。

（５）至適温度本酵素の至適温度は４０℃である。

（６）金属イオン及び阻害剤の影響本酵素は、水銀、ＰＣＭＢによって阻害されることがら、本酵素がＳＨ酵素であることが示唆される。

詳細を下記第２表に示す。

第表＋・・・阻害する −・・・影響を与えない（７）分子量本酵素は２種のアイソザイム（アルギン酸リアーゼＰ１
及びアルギン酸リアーゼＰ２）を含んでいる。

アルギン酸リアーゼＰ１及びＰ２の酵素液４０μｌを、
それぞれ１０％５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に
かけ、染色液（エタノール４５％、酢酸１０％、Ｈ２Ｏ
４５％、コマジ−ブリリアントブルーＲ−２５００，２
５％）中にて、３７℃で３時間振盪し、脱色液（エタノ
ール２５％、酢酸７％）で数回脱色した後、分子量を決
定した。この結果、ｐｔは分子量１８０００と３４００
０のサブユニットからなる分子ｆ１５２０００の蛋白で
あり、Ｐ２は分子量３４０００と４６０００の２つのサ
ブユニットからなる分子量８００００の蛋白であること
が判った。

以上の結果から、本発明方法により得られる酵素がアル
ギン酸リアーゼであることが確認された。

アルギン酸リアーゼによるアルギン酸類の分解は、通常
の方法に従って行なわれる。例えば、アルギン酸類の水
溶液に酵素を添加すれば良い。前記水溶液中のアルギン
酸類の濃度は特に制限されないが、通常０．１〜２重出
％程度、好ましくは０．１〜０．５重量％程度とすれば
よい。アルギン酸リアーゼの添加量も特に制限されない
が、通常アルギン酸類１ｇに対して０．１〜１１＆、好
ましくは０．１〜０．５Ｕ程度とすればよい。

反応温度はアルギン酸リアーゼが作用し得る温度であれ
ばよく、通常２５〜４０℃程度の温度下に行なわれる。

発明の効果本発明によれば、上記特定の３種の細菌を混合培養する
ことにより、アルギン酸リアーゼを非常に高い収率で得
ることができ、工業的規模でアルギン酸を低分子化する
のに必要な量のアルギン酸リアーゼを容易に供給できる
。

実施例以下に実施例及び比較例を挙げ、本発明を一層明瞭なも
のとする。

なお、アルギン酸リアーゼの活性は、アルギン酸にアル
ギン酸リアーゼを作用させて得られる非還元末端のＣａ
　　Ｃｓ間に２重結合を有する糖が２３５ｎｍに特異的
な吸光度上昇を示すことを利用して測定した。すなわち
、０．２％アルギン酸ナトリウム水溶液０．５ｚｌ、１
００ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）　０．　
５２Ａ’及び酵素液０、Ｏ１ｚ／を混合し、２５℃で５
分間反応させた後、反応を停止させ、２３５ｎｍの吸光
度を測定する。本酵素の１単位（Ｕ）は、１分間に２３
５ｎｍの吸光度を「１」上昇させる酵素量をいう。

実施例１フラボバクテリウム・スピリチボラムＯＴＣ−３、アル
カリゲネス・デニトリフィカンスＯＴＣ４及びバチルス
・ラテロスポラスＯＴＣ−５を、オートクレーブで殺菌
した液体培地（アルギン酸ナトリウム０．２０％、（Ｎ
Ｈ，ａ　）　２　Ｓ　０ａＯ０１０％、Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ
ａ・７Ｈ２００，０１％、ＫＨ２ＰＯ４０，１０％、Ｎ
ａ２　ＨＰＯ４１２Ｈ２００，４０％、及び酵母エスキ
０．０５％を含む、ｐＨ７，２）１０１に接種し一３０
℃で２４時間振盪培養した。

得られた培養液を遠心分離し、菌体４０ｇを得た。これ
を５ｍＭ）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）４０２／に
懸濁し、９０ＫＨ２，５分の超音波破砕処理を施した後
、遠心分離（２５０００Ｘｇ、３０分）して上清液７８
１１を得た。これを、ＤＥＡＥ−セルロース〔商標名、
和光純薬■製〕カラム（９，５ｃｍｘ５５ｃｍ、グラジ
エント二〇、６Ｍ　　ＫＯ２）で精製し、活性画分２０
１！を得た。該活性画分を、セファデックス−Ｇ−１５
０（商標名、ファルマシア社製）カラム（１，２ｃｍＸ
　１１５ｃｍ、溶出液：１０ｍＭトリス争塩酸緩衝液、
ｐＨ７，５）で精製し、アルギン酸リアーゼの酵素液６
２０ｚ／（４９６５単位）を得た。引続きヒドロキシ−
アパタイト〔商標名、東洋曹達■製〕カラム（０，６ｃ
ｒｎＸ２２ｃｍ、グラジェント：５００ｍＭリン酸に緩
衝液、ｐＨ７，５）で精製し、アルギン酸リアーゼＰ１
を主に含む酵素液ＩＬｚ７（５０６単位）及びアルギン
酸リアーゼＰ２を主に含む酵素液１０１！（１８２５単
位）を得た。

実施例２及び比較例１〜６フラボバクテリウム・スピリチボラムＯＴＣ−３（Ｓｔ
ｒａｉｎ　３）　、アルカリゲネス・デニトリフィカン
スＯＴＣ−４（Ｓｔｒａｉｎ　４）又はバチルス・ラテ
ロスポラスＯＴＣ−５（Ｓｔｒａｉｎ　５）を単独で或
いはそれらの中の２種又は３種を混合して用い、培養時
間を４８時間とする以外は、実施例１と同様にして培養
及び精製を行ない、アルギン酸リアーゼを得た。得られ
た酵素の総括性を、３種を混合して用いた場合の酵素活
性を１００とする相対活性で表わした。下記第３表に示
す。

第３表以上の結果から、３種の菌株を混合培養した時に、アル
ギン酸リアーゼが非常に高い収率で得られることが判る
。

実験例１アルギン酸すトリウムの０．４％水溶液１００１！に、
アルギン酸リアーゼを添加し、３５℃で酵素反応させ、
前記水溶液の粘度の経時変化を調べた。結果を第１図に
示す。第１図において、Ａはアルギン酸リアーゼを加え
ない場合、Ｂはアルギン酸リアーゼを１．０ｇ／ｘｉの
割合で添加した場合、およびＢはアルギン酸リアーゼを
２．０ｇ／ｌｌの割合で添加した場合をそれぞれ示す。

第１図から、酵素添加後５分でアルギン酸ナトリウム水
溶液の粘性が１／４に低下し、約１２時間で水と同程度
の粘性になることが判る。

また、上記Ｂの場合の酵素反応液から経時的にサンプル
を採取し、薄層クロマトグラムを行なった（展開溶媒；
ｎ−ブタノール：酢酸：水＝５０＝１２：２５、薄層プ
レート：シリカゲル・７０プレート、商品名、和光純薬
■製）。結果を第２図に示す。第２図から、アルギン酸
ナトリウムが経時的に分解されていることが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、アルギン酸ナトリウム水溶液にアルギン酸リ
アーゼを添加した時の、該水溶液の粘度の経時変化を示
すグラフである。第２図は、アルギン酸ナトリウム水溶
液にアルギン酸リアーゼを添加し、経時的に採取したサ
ンプルを薄層クロマトグラムにかけた時の溶出パターン
を示す図面である。（以　上）第図時間（分）時間（時間）２

Claims

【特許請求の範囲】

（１）アルギン酸分解能を有する、フラボバクテリウム
・スピリチボラム、アルカリゲネス・デニトリフィカン
ス及びバチルス・ラテロスポラスを混合培養し、培養物
からアルギン酸リアーゼを採取することを特徴とするア
ルギン酸リアーゼの製造法。
（２）フラボバクテリウム・スピリチボラムが、フラボ
バクテリウム・スピリチボラムＯＴＣ−３である請求項
（１）の方法。
（３）アルカリゲネス・デニトリフィカンスが、アルカ
リゲネス・デニトリフィカンスＯＴＣ−４である請求項
（１）の方法。
（４）バチルス・ラテロスポラスが、バチルス・ラテロ
スポラスＯＴＣ−５である請求項（１）の方法。