CN109943601B - 利用2-酮基-l古龙酸结晶母液制备吡咯喹啉醌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了利用2‑酮基‑L古龙酸结晶母液制备吡咯喹啉醌的方法，该方法是以2‑酮基‑L‑古龙酸结晶母液为原料液，从中提取出4,5‑二氢‑4,5‑二氧代‑1H‑吡咯并[2,3‑f]喹啉‑2,7,9‑三羧酸。本发明利用2‑酮基‑L‑古龙酸结晶母液制备4,5‑二氢‑4,5‑二氧代‑1H‑吡咯并[2,3‑f]喹啉‑2,7,9‑三羧酸，不需要再经过发酵、离子交换、浓缩等工艺，步骤简单，节约了大量成本，变废为宝，充分利用资源，对环境友好。且本发明方法制备的产品吡咯喹啉醌为还原态，抗氧化效果更好。本发明步骤简便，分离效率高，绿色环保。

Description

利用2-酮基-L古龙酸结晶母液制备吡咯喹啉醌的方法

技术领域

本发明涉及一种制备吡咯喹啉醌的方法，具体涉及一种利用2-酮基-L-古龙酸结晶母液制备4,5-二氢-4,5-二氧代-1H-吡咯并[2,3-f]喹啉-2,7,9-三羧酸的方法。

背景技术

吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，PQQ，又名4,5-二氢-4,5-二氧代-1H-吡咯并[2,3-f]喹啉-2,7,9-三羧酸)包括氧化态和还原态形式。它是继核黄素和烟酰胺之后发现的第三类辅酶，为B族维生素成员，其作为多种酶类辅基，对生命体有重要生理活性。研究发现，缺乏PQQ的小鼠生长缓慢、皮肤脆弱、骨质疏松、骨骼异常、免疫应答低下、生殖能力差，容易产生关节炎症。值得注意的是，哺乳动物体内不能合成PQQ，必须从外部摄入以满足生命活动的需要。因此，PQQ被认为是人体必须的维生素及营养素，可用作新型功能食品原料。

然而，PQQ的生产制备却是其大规模应用的瓶颈。目前，PQQ的制备方法主要有微生物发酵和化学合成方法。已报道的PQQ化学合成方法需要经过十步以上的反应才能获得，产率低，并且需要使用大量有毒试剂和重金属催化剂，对环境破坏比较大。微生物发酵法制备PQQ的主要问题是PQQ发酵产量非常低(报道的仅有一百微克每升)，远远达不到生产要求。因此，寻找高效、绿色的PQQ制备方法至关重要。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种利用2-酮基-L-古龙酸结晶母液制备4,5-二氢-4,5-二氧代-1H-吡咯并[2,3-f]喹啉-2,7,9-三羧酸的方法，该方法步骤简便，分离效率高，且得到的吡咯喹啉醌为还原态，抗氧化效果更好。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

利用2-酮基-L-古龙酸结晶母液制备4,5-二氢-4,5-二氧代-1H-吡咯并[2,3-f]喹啉-2,7,9-三羧酸的方法，是以2-酮基-L-古龙酸结晶母液为原料液，从中提取出4,5-二氢-4,5-二氧代-1H-吡咯并[2,3-f]喹啉-2,7,9-三羧酸。

2-酮基-L-古龙酸结晶母液是维生素C生产过程中的二步发酵法产生的2-酮基-L-古龙酸钠醪液，经阴离子交换、浓缩、结晶而来的母液。

上述提取包括沉淀除杂、有机溶剂萃取富集、色谱分离纯化和结晶过程。

沉淀除杂是利用二价金属离子与2-酮基-L-古龙酸结晶母液中组分进行反应形成沉淀物除杂，其中二价金属离子为Mg²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺中的至少一种；二价金属离子以金属盐或金属盐溶液的形式参与反应，金属盐溶液与2-酮基-L-古龙酸结晶母液的体积比为1:2-10，金属盐溶液中二价金属离子总浓度为1-10mol/L。

有机溶剂萃取富集是先用萃取液对沉淀除杂后的2-酮基-L-古龙酸结晶母液进行萃取，分离有机层，再用氨水对有机层进行反萃，分离氨水层，得到氨水反萃液；所述萃取液与沉淀除杂后的2-酮基-L-古龙酸结晶母液的体积比为1-5:1；萃取液包括萃取剂和稀释剂，萃取剂与稀释剂的体积比为1:1-20；氨水与萃取剂的体积比为1-3:1；氨水的质量分数为1-20％。

萃取剂为乙二胺、三乙胺、氨水、吡啶、四丁基氢氧化铵、三辛胺中的至少一种；稀释剂为正丙醇、正丁醇、叔丁醇、正戊醇、异戊醇、正辛醇、乙酸乙酯、氯仿中的至少一种。

色谱分离纯化是将氨水反萃液浓缩，上色谱柱，再洗脱，收集洗脱液；色谱柱填料为聚酰胺、聚苯乙烯微球、氨基硅胶，柱体积与浓缩后的氨水反萃液的体积比为1:1-3；色谱柱洗脱是依次用2-10倍柱体积水、3-15倍柱体积5-80％(v/v)乙醇-水洗脱，收集乙醇-水洗脱部位；洗脱后将乙醇-水洗脱部位旋蒸，得到粗产品。

乙醇-水的水中含有质量分数0.01-0.1％的氨水。

结晶是将粗产品在30-60℃下用质量分数0.5-30％的氨水溶解得到粗产品溶液，然后滴加质量分数0.5-20％的盐酸，4-10℃下静置4-10h，过滤得到沉淀结晶，即为4,5-二氢-4,5-二氧代-1H-吡咯并[2,3-f]喹啉-2,7,9-三羧酸。

粗产品与氨水的料液比为1:1-10(g/mL)，盐酸体积为粗产品溶液体积的0.3-20倍。

本发明有益效果：

1、变废为宝，充分利用资源。在维生素C生产过程中，所用菌种转化山梨醇生产山梨糖以及山梨糖转化成2-酮基-L-古龙酸等发酵过程，不仅产生了2-酮基-L-古龙酸，也发酵产生了吡咯喹啉醌。由于吡咯喹啉醌具有酸性，因此其可与2-酮基-L-古龙酸一起经过离子交换、浓缩、结晶等工艺步骤，累积在2-酮基-L-古龙酸结晶母液中。2-酮基-L-古龙酸经过三次结晶之后的母液一般作为废液排放，不仅污染环境，而且缺乏对资源的有效利用。本发明则是利用2-酮基-L-古龙酸结晶母液制备吡咯喹啉醌，不需要再经过发酵、离子交换、浓缩等工艺，步骤简单，节约了大量成本，且对环境友好。

2、本发明方法制备的产品吡咯喹啉醌为还原态，抗氧化效果更好。本发明生产工艺的结晶母液中2-酮基-L-古龙酸在现有条件下转变为维生素C，维生素C可以将氧化态吡咯喹啉醌还原为还原态。还原态吡咯喹啉醌具有更高的抗氧化活性。

3、本发明利用二价金属盐选择性沉淀杂质。根据对2-酮基-L-古龙酸结晶母液中化学成分分析，该母液中主要杂质成分为2-酮基-L-古龙酸、2-酮基-L-古龙酸氧化物、维生素C、腺苷等。钙、镁、锰、锌、铁、铜等金属离子可以与这些杂质发生络合反应形成不溶性沉淀，从而达到分离杂质与目标物的目的。

4、本发明在萃取富集和分离纯化中充分利用目标物结构特征，使用可以与目标物进行特异性分子间相互作用的材料，从而达到选择性分离纯化的目的。例如，在萃取富集中，使用碱性有机溶剂(三辛胺、乙二胺、吡啶、氨水等)可与目标物形成离子对；在色谱分离中，使用聚酰胺、聚苯乙烯微球、氨基硅胶等可与目标物形成氢键络合、π离域电子络合等。

5、本发明步骤简便，分离效率高，绿色环保。能够利用反萃取法循环利用有机萃取液，所用有机洗脱剂和氨水减压浓缩回收后可继续利用，这些措施可减少有机液排放，达到绿色环保的效果。

附图说明

图1为2-酮基-L-古龙酸三次结晶母液色谱图。

图2为本发明最终产物的质谱图。

图3为本发明最终产物的¹H-NMR图谱。

图4为本发明最终产物的¹³C-NMR图谱。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1、2-酮基-L-古龙酸结晶母液的制备

D-山梨醇通过二步发酵法产生2-酮基-L-古龙酸钠醪液。2-酮基-L-古龙酸钠醪液经过超滤过滤去除蛋白、菌丝等杂质，再经过树脂柱进行树脂交换，产生2-酮基-L-古龙酸树脂交换液。量取2-酮基-L-古龙酸树脂交换液1L，进行减压浓缩(温度55～80℃，真空度-0.055～-0.09MPa)，其中，2-酮基-L-古龙酸含量为123mg/mL，再降温至4℃结晶，经过离心分离得到2-酮基-L-古龙酸一次母液70mL。2-酮基-L-古龙酸一次母液，减压浓缩(温度50～70℃，真空度-0.065～-0.1MPa)，再降温至4℃结晶、离心分离得到2-酮基-L-古龙酸二次母液。2-酮基-L-古龙酸二次母液加质量分数为2％的碳酸钠和5％的甲醇，4℃结晶、离心分离得到2-酮基-L-古龙酸三次母液，即为本发明所用的2-酮基-L-古龙酸结晶母液。

HPLC检测(图1)：采用

XB-SAX色谱柱，以乙腈：水(乙腈和水均含2％甲酸)为流动相，梯度洗脱(30-90％，30min)，流速0.5mL/min，洗脱60min，检测波长249nm，可以得到较好的色谱分析结果。通过在上述HPLC条件下与PQQ标准品对比，发现28.369min为PQQ峰。

实施例2

利用10L规模2-酮基-L-古龙酸结晶母液制备PQQ的方法，包括以下步骤：

1、沉淀除杂

利用铁和钙盐沉淀法除杂，将1L的二价金属离子总浓度为1mol/L的CaCl₂和FeCl₂溶液加入10L 2-酮基-L-古龙酸结晶母液中，再加入200g Ca(OH)₂调节pH，搅拌1h，过滤分离，得到沉淀物和上清液。

2、萃取富集

在上清液中加入萃取液，进行有机溶剂离子对络合萃取富集，萃取液与上清液的体积比为1:1，萃取液包括萃取剂(三辛胺、氨水(质量分数31.2％))和稀释剂(正丁醇、叔丁醇、正辛醇)，其体积比为正丁醇：叔丁醇：正辛醇：三辛胺：氨水＝6:2:1:1:0.2，分离有机层，用质量分数2％氨水对有机层进行反萃，氨水与萃取剂体积比1:1，分离氨水层，得到氨水反萃液。

3、色谱分离

将氨水反萃液减压浓缩至1L，上柱体积1L的聚酰胺柱色谱分离，依次用3L水、4L5％(v/v)乙醇-水(水中含有质量分数0.01％的氨水)洗脱，HPLC法分析检测。在乙醇-水部位中含有PQQ，旋蒸，获得5.2g纯度为90％的PQQ粗产品，收率为91.3％。

4、结晶纯化

碱溶酸沉法：1g PQQ粗产品在50℃下用质量分数1％氨水溶解，得到浓度为1g/mLPQQ溶液，然后滴加质量分数10％的盐酸0.3mL，再加入0.3mL乙腈和0.1mL二甲基亚砜，4℃下静置6h，过滤得到0.71g沉淀结晶。

产物分析：

产物的质谱、¹H-NMR、¹³C-NMR数据(图2、3、4)：通过质谱、¹H-NMR、¹³C-NMR对产品PQQ进行结构鉴定，最终确定产品为还原态二钾盐(PQQH₂K₂)。首先，通过质谱分析确定产品的分子量。PQQ分子量为330，还原态PQQ分子量为332，还原态二钾盐PQQH₂K₂分子量为408，从图中可以看出，图为去氢负离子，即[M-H]^-＝408-1＝407。通过¹H-NMR分析可以确定结构中的氢信号。有三种氢信号分别对应PQQ结构中3种氢，1号7.2，2号6.8，3号6.2。通过¹³C-NMR分析可以确定结构中的碳信号。图中13个碳信号对应结构中13种碳，1号151.5，2号133.8，3号158.3，4号145.7，5号116.1，6号117.8，7号118.3，8号158.8，9号158.5，10号113.8，11号120.9，12号159.1，13号和14号172.9。

产物的HPLC检测：采用

XB-SAX色谱柱，以乙腈：水(乙腈和水均含2％甲酸)为流动相，梯度洗脱(30-90％，30min)，流速0.5mL/min，洗脱60min，检测波长249nm，可以得到较好的色谱分析结果。结果表明，最终产物为纯度达到95％以上的吡咯喹啉醌。

实施例3

利用10L规模2-酮基-L-古龙酸结晶母液制备PQQ的方法，包括以下步骤：

1、沉淀除杂

利用锌和锰盐沉淀法除杂，将2L二价金属离子总浓度为3mol/L的ZnCl₂和MnCl₂溶液加入10L 2-酮基-L-古龙酸结晶母液中，再加入100g Ca(OH)₂调节pH，搅拌1h，过滤分离，得到沉淀物和上清液。

2、萃取富集

在上清液中加入萃取液，进行有机溶剂离子对络合萃取富集，萃取液与上清液的体积比为3:1，萃取液包括萃取剂(三辛胺、乙二胺)和稀释剂(正丁醇、正丙醇、异戊醇)，其体积比为正丁醇：正丙醇：异戊醇：三辛胺：乙二胺＝6:2:2:2:0.5，分离有机层，用质量分数5％氨水对有机层进行反萃，氨水与萃取剂体积比2:1，分离氨水层，得到氨水反萃液。

3、色谱分离

将氨水反萃液减压浓缩至2L，上柱体积1L的氨基硅胶色谱柱分离，依次用2L水、6L10％(v/v)乙醇-水(水中含有质量分数0.02％的氨水)洗脱，在乙醇-水部位中含有PQQ，旋蒸，获得5.1g纯度为90％的PQQ粗产品，收率为90.9％。

4、结晶纯化

碱溶酸沉法：1g PQQ粗产品在50℃下用质量分数1％氨水溶解，得到浓度为1g/mLPQQ溶液，然后滴加质量分数10％的盐酸0.3mL，再加入0.3mL乙腈和0.1mL二甲基亚砜，4℃下静置6h，过滤得到0.70g沉淀结晶，即纯度在95％以上的PQQ产品。

实施例4

利用10L规模2-酮基-L-古龙酸结晶母液制备PQQ的方法，包括以下步骤：

1、沉淀除杂

利用镁和铜盐沉淀法除杂，将5L二价金属离子总离子浓度3mol/L的MgCl₂和CuCl₂溶液加入10L 2-酮基-L-古龙酸结晶母液中，再加入100g Ca(OH)₂调节pH，搅拌1h，过滤分离，得到沉淀物和上清液。

2、萃取富集

在上清液中加入萃取液，进行有机溶剂离子对络合萃取富集，萃取液与上清液的体积比为3:1，萃取液包括萃取剂(三辛胺、吡啶、四丁基氢氧化铵)和稀释剂(正丁醇、叔丁醇、正辛醇)，其体积比为正丁醇：叔丁醇：正辛醇：三辛胺：吡啶：四丁基氢氧化铵＝6:3:2:3:0.2：0.3，分离有机层，用质量分数5％氨水对有机层进行反萃，氨水与萃取剂体积比3:1，分离氨水层，得到氨水反萃液。

3、色谱分离

将氨水反萃液减压浓缩至3L，上柱体积1L的聚苯乙烯微球色谱柱分离，依次用6L水、9L 10％(v/v)乙醇-水(水中含有质量分数0.02％的氨水)洗脱，在乙醇-水部位中含有PQQ，旋蒸，获得5.2g纯度为90％的PQQ粗产品，收率为91.2％。

4、结晶纯化

碱溶酸沉法：1g PQQ粗产品在50℃下用质量分数1％氨水溶解，得到浓度为1g/mLPQQ溶液，然后滴加质量分数10％的盐酸0.3mL，再加入0.3mL乙腈和0.1mL二甲基亚砜，4℃下静置6h，过滤得到0.72g沉淀结晶，即纯度在95％以上的PQQ产品。

对比实验1、黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)清除O₂ ^-自由基能力

采用南京建成生物工程研究所生产的超氧化物歧化酶测试盒，利用黄嘌呤氧化酶法测定不同样品清除O₂ ^-自由基能力，具体步骤参照试剂盒标准操作说明进行，结果见下表。

从上表可以看出，本发明获得的产品清除O₂ ^-自由基的能力高于在市场上购买的PQQ标准品。

对比实验2、Fenton试剂法测定过氧化氢酶清除羟基自由基活力

实验采用测吸光度的方法测定样品清除羟基自由基的活性。

基本原理：Fenton试剂是H₂O₂与Fe²⁺构成的氧化体系。Fe²⁺与H₂O₂反应快速生成羟基，羟基有很强的加成反应性。反应中会有Fe³⁺生成，Fe³⁺可以与H₂O₂反应生成Fe²⁺，如此反复，会生成大量的羟基自由基。加入显色剂，测定其吸光度，就可以知道Fenton反应初始产生的羟基自由基的量。加入待测样品，再次测量吸光度，就可以推断出样品的羟基自由基的清除率。

具体步骤：①在10mL容量瓶中加入1mL 0.02mol/L的PBS缓冲液(pH＝7)，0.8mL0.15mol/L的亚甲蓝溶液，用90％(v/v)乙醇稀释至10mL，摇匀，作为空白组；②在10mL容量瓶中加入1mL 0.02mol/L的PBS缓冲液(pH＝7)，0.8mL 0.15mol/L的亚甲蓝溶液，0.4mL的Fe(Ⅱ)-EDTA溶液和0.2mL 7.5mmol/L的H₂O₂溶液，用90％(v/v)乙醇稀释至10mL，摇匀，作为对照组；③在10mL容量瓶中加入1mL 0.02mol/L的PBS缓冲液(pH＝7)，0.8mL 0.15mol/L的亚甲蓝溶液，0.4mL的Fe(Ⅱ)-EDTA溶液，0.2mL 7.5mmol/L的H₂O₂溶液和1mL1mg/mL的待测样品溶液(维生素C溶液，PQQ标准品溶液，以及实施例2产品溶液)，用90％(v/v)乙醇稀释至10mL，摇匀，作为测试组；反应2h，用紫外-可见分光光度计测定660nnm下的吸光度。

羟基自由基清除率(％)＝[1-(A₀-A₂)/(A₀-A₁)]×100

公式中，A₀——空白组的吸光度；

A₁——对照组的吸光度；

A₂——测试组的吸光度；

测试结果

从上表可以看出，本发明获得的产品清除羟基自由基的能力高于在市场上购买的PQQ标准品。

Claims (4)

1.利用2-酮基-L-古龙酸结晶母液制备吡咯喹啉醌的方法，其特征在于，以2-酮基-L-古龙酸结晶母液为原料液，从中提取出吡咯喹啉醌；所述2-酮基-L-古龙酸结晶母液是维生素C生产过程中的二步发酵法产生的2-酮基-L-古龙酸钠醪液，经阴离子交换、浓缩、结晶而来的母液；所述提取包括沉淀除杂、有机溶剂萃取富集、色谱分离纯化和结晶过程；

所述沉淀除杂是利用二价金属离子与2-酮基-L-古龙酸结晶母液中组分进行反应形成沉淀物除杂，其中二价金属离子为Mg²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺中的至少一种；二价金属离子以金属盐或金属盐溶液的形式参与反应，金属盐溶液与2-酮基-L-古龙酸结晶母液的体积比为1:2-10，金属盐溶液中二价金属离子总浓度为1-10 mol/L；

所述有机溶剂萃取富集是先用萃取液对沉淀除杂后的2-酮基-L-古龙酸结晶母液进行萃取，分离有机层，再用氨水对有机层进行反萃，分离氨水层，得到氨水反萃液；所述萃取液与沉淀除杂后的2-酮基-L-古龙酸结晶母液的体积比为1-5:1；萃取液包括萃取剂和稀释剂，萃取剂与稀释剂的体积比为1:1-20；氨水与萃取剂的体积比为1-3:1；氨水的质量分数为1-20%；

所述萃取剂为乙二胺、三乙胺、氨水、吡啶、四丁基氢氧化铵、三辛胺中的至少一种；所述稀释剂为正丙醇、正丁醇、叔丁醇、正戊醇、异戊醇、正辛醇、乙酸乙酯、氯仿中的至少一种；

所述色谱分离纯化是将氨水反萃液浓缩，上色谱柱，再洗脱，收集洗脱液；色谱柱填料为聚酰胺、聚苯乙烯微球、氨基硅胶，柱体积与浓缩后的氨水反萃液的体积比为1:1-3；色谱柱洗脱是依次用2-10倍柱体积水、3-15倍柱体积5-80% v/v乙醇-水洗脱，收集乙醇-水洗脱部位；洗脱后将乙醇-水洗脱部位旋蒸，得到粗产品。

2.根据权利要求1所述的利用2-酮基-L-古龙酸结晶母液制备吡咯喹啉醌的方法，其特征在于，所述乙醇-水的水中含有质量分数0.01-0.1%的氨水。

3.根据权利要求1所述的利用2-酮基-L-古龙酸结晶母液制备吡咯喹啉醌的方法，其特征在于，所述结晶是将粗产品在30-60℃下用质量分数0.5-30%的氨水溶解得到粗产品溶液，然后滴加质量分数0.5-20%的盐酸，4-10℃下静置4-10h，过滤得到沉淀结晶，即为吡咯喹啉醌。

4.根据权利要求3所述的利用2-酮基-L-古龙酸结晶母液制备吡咯喹啉醌的方法，其特征在于，粗产品与氨水的料液比为1:1-10 g/mL，盐酸体积为粗产品溶液体积的0.3-20倍。

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