JPH05219979A - Nadhの酸化方法 - Google Patents
Nadhの酸化方法Info
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- JPH05219979A JPH05219979A JP2134292A JP2134292A JPH05219979A JP H05219979 A JPH05219979 A JP H05219979A JP 2134292 A JP2134292 A JP 2134292A JP 2134292 A JP2134292 A JP 2134292A JP H05219979 A JPH05219979 A JP H05219979A
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- nadh oxidase
- nadh
- adenine dinucleotide
- oxidase
- nicotinamide adenine
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 アルカリ性領域に至適pHを有する通性嫌気
性のNADHオキシダーゼ生産菌EP01株に由来する
NADHオキシダーゼの存在下にNADHを酸化してN
AD+ を再生させるに際し、反応系にEDTAを添加す
るNADHの酸化方法。 【効果】 高い反応速度でNAD+ を再生させることが
できる。
性のNADHオキシダーゼ生産菌EP01株に由来する
NADHオキシダーゼの存在下にNADHを酸化してN
AD+ を再生させるに際し、反応系にEDTAを添加す
るNADHの酸化方法。 【効果】 高い反応速度でNAD+ を再生させることが
できる。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、或る種のNADHオキ
シダーゼを用いるNADHの酸化方法に関する。NAD
Hオキシダーゼは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド(以下、これを「NADH」と略すことがあ
る)を分子状酸素を用いて酸化し、酸化型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド(以下、これを「NAD+ 」
と略すことがある)を再生する有用な酵素である。NA
DHオキシダーゼによって再生されるNAD+ は、生体
内で行なわれる種々の脱水素酵素反応の補酵素として作
用する有用な物質である。このNAD+ を補酵素とする
脱水素酵素の多くは、工業的に有用な光学活性化合物や
反応中間体等の製造に好適に用いられているものであ
る。
シダーゼを用いるNADHの酸化方法に関する。NAD
Hオキシダーゼは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド(以下、これを「NADH」と略すことがあ
る)を分子状酸素を用いて酸化し、酸化型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド(以下、これを「NAD+ 」
と略すことがある)を再生する有用な酵素である。NA
DHオキシダーゼによって再生されるNAD+ は、生体
内で行なわれる種々の脱水素酵素反応の補酵素として作
用する有用な物質である。このNAD+ を補酵素とする
脱水素酵素の多くは、工業的に有用な光学活性化合物や
反応中間体等の製造に好適に用いられているものであ
る。
【0002】
【従来の技術】本発明者らは、先に、工業的製造に適し
たNADHオキシダーゼ源微生物について広く検索した
結果、アルカリ性領域に至適生育pHを有する酸素の存
在下でも不在下でも生存しうる或る種の嫌気性細菌が、
温度安定性に優れたNADHオキシダーゼを生産するこ
とを見い出し、該微生物を培地で培養し、NADHオキ
シダーゼを工業的に製造する方法を提案した(特開平2
−107186号公報参照;以下、上記微生物を「好ア
ルカリ性通性嫌気性のNADHオキシダーゼ生産菌」と
言うことがある)。
たNADHオキシダーゼ源微生物について広く検索した
結果、アルカリ性領域に至適生育pHを有する酸素の存
在下でも不在下でも生存しうる或る種の嫌気性細菌が、
温度安定性に優れたNADHオキシダーゼを生産するこ
とを見い出し、該微生物を培地で培養し、NADHオキ
シダーゼを工業的に製造する方法を提案した(特開平2
−107186号公報参照;以下、上記微生物を「好ア
ルカリ性通性嫌気性のNADHオキシダーゼ生産菌」と
言うことがある)。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、更に該
好アルカリ性通性嫌気性のNADHオキシダーゼ生産菌
に由来するNADHオキシダーゼによりNADHを効率
的に酸化する方法を鋭意検討した結果、反応系にエチレ
ンジアミン四酢酸(以下これを「EDTA」と言うこと
がある)もしくはその塩を添加することにより、酸化反
応速度が著しく増大することを見い出し、本発明を完成
するに至った。
好アルカリ性通性嫌気性のNADHオキシダーゼ生産菌
に由来するNADHオキシダーゼによりNADHを効率
的に酸化する方法を鋭意検討した結果、反応系にエチレ
ンジアミン四酢酸(以下これを「EDTA」と言うこと
がある)もしくはその塩を添加することにより、酸化反
応速度が著しく増大することを見い出し、本発明を完成
するに至った。
【0004】
【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、アルカリ性領域に至適pHを有する通性嫌気性のN
ADHオキシダーゼ生産菌に由来するNADHオキシダ
ーゼの存在下に還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドを酸化して酸化型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドを再生させるに際し、エチレンジアミン四酢酸
もしくはその塩を反応系に添加することを特徴とする還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの酸化方法
が提供される。
ば、アルカリ性領域に至適pHを有する通性嫌気性のN
ADHオキシダーゼ生産菌に由来するNADHオキシダ
ーゼの存在下に還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドを酸化して酸化型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドを再生させるに際し、エチレンジアミン四酢酸
もしくはその塩を反応系に添加することを特徴とする還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの酸化方法
が提供される。
【0005】本発明で用いるNADHオキシダーゼの供
給源となる微生物としては、好アルカリ性通性嫌気性細
菌に属し、NADHオキシダーゼ生産能を有する菌株ま
たこれらの変異株を用いることができる。これらの性質
を有する菌株の好適具体例としては、例えば、アグリカ
ルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー
(Agricaltural and Biologi
cal Chemistry)、第51巻、第2271
〜2275ページ(1987)に記載されているEp0
1株があげられる。本菌株は工業技術院微生物工業技術
研究所に微生物受託番号 微工研条寄第2744号(F
ERM BP−2744)として寄託されている。な
お、このEp01株は、インターナショナル・ジャーナ
ル・オブ・システマティック・バクテリオロジー(In
ternational Journal of Sy
stematic Bacteriology)第40
巻、第297〜301ページ(1990)において、新
属新種の細菌アンフィバチルス・キシンランス(Amp
hibacillus xylans)として認められ
ている。
給源となる微生物としては、好アルカリ性通性嫌気性細
菌に属し、NADHオキシダーゼ生産能を有する菌株ま
たこれらの変異株を用いることができる。これらの性質
を有する菌株の好適具体例としては、例えば、アグリカ
ルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー
(Agricaltural and Biologi
cal Chemistry)、第51巻、第2271
〜2275ページ(1987)に記載されているEp0
1株があげられる。本菌株は工業技術院微生物工業技術
研究所に微生物受託番号 微工研条寄第2744号(F
ERM BP−2744)として寄託されている。な
お、このEp01株は、インターナショナル・ジャーナ
ル・オブ・システマティック・バクテリオロジー(In
ternational Journal of Sy
stematic Bacteriology)第40
巻、第297〜301ページ(1990)において、新
属新種の細菌アンフィバチルス・キシンランス(Amp
hibacillus xylans)として認められ
ている。
【0006】上記したNADHオキシダーゼ生産菌の培
養はそれ自体既知の方法で行なうことができ、その際に
使用し得る培地の栄養源である窒素源としては、例え
ば、アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム等の無機窒素化合物を単独でもし
くは混合して用いることができる。また、無機金属塩と
しては、例えば、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素
カリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マン
ガン、硫酸第一鉄等を用いることができる。以上のよう
な無機栄養源の他に、コーンスティープリカー、酵母エ
キス、ペプトン等の天然栄養源を加えてもよい。さら
に、炭素源として例えば、グルコース、キシロース、マ
ンノース、フルクトース、アルトース、シュークロー
ス、セロビオース、キシラン等を培地に添加することが
できる。
養はそれ自体既知の方法で行なうことができ、その際に
使用し得る培地の栄養源である窒素源としては、例え
ば、アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム等の無機窒素化合物を単独でもし
くは混合して用いることができる。また、無機金属塩と
しては、例えば、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素
カリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マン
ガン、硫酸第一鉄等を用いることができる。以上のよう
な無機栄養源の他に、コーンスティープリカー、酵母エ
キス、ペプトン等の天然栄養源を加えてもよい。さら
に、炭素源として例えば、グルコース、キシロース、マ
ンノース、フルクトース、アルトース、シュークロー
ス、セロビオース、キシラン等を培地に添加することが
できる。
【0007】前述したNADHオキシダーゼ生産菌EP
01株を上記の如き組成の培地で培養する場合、培養温
度は通常約20〜約50℃、好ましくは約35〜約45
℃の範囲内が適当である。また、培養中の培地のpHは
約7.5以上のアルカリ性領域であれば厳密に限定され
るものではないが、一般には8〜10.5、好ましくは
8.5〜10.0の範囲内が有利である。培地のpH
は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア炭
酸ナトリウム等のアルカリを適宜培地に添加することに
より至適範囲内となるよう調製するのが好都合である。
培養時間は通常3〜24時間、好ましくは5〜20時間
程度とすることができる。培養は通気攪拌、振盪等の好
気的条件下で行なうことができ、或いは無酸素嫌気的条
件下で行ってもよい。
01株を上記の如き組成の培地で培養する場合、培養温
度は通常約20〜約50℃、好ましくは約35〜約45
℃の範囲内が適当である。また、培養中の培地のpHは
約7.5以上のアルカリ性領域であれば厳密に限定され
るものではないが、一般には8〜10.5、好ましくは
8.5〜10.0の範囲内が有利である。培地のpH
は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア炭
酸ナトリウム等のアルカリを適宜培地に添加することに
より至適範囲内となるよう調製するのが好都合である。
培養時間は通常3〜24時間、好ましくは5〜20時間
程度とすることができる。培養は通気攪拌、振盪等の好
気的条件下で行なうことができ、或いは無酸素嫌気的条
件下で行ってもよい。
【0008】嫌気的条件下で培養を行なう場合には、還
元銅カラムで酸素を除去した窒素ガス、ヘリウムガス、
アルゴンガス又はそれ等の混合物等の酸素不含ガス雰囲
気や、培地の酸化還元電位を低下させて嫌気性菌の生育
を容易にするチタニウム(III)クエン酸、ジチオナイト
等の還元剤の添加等、通性嫌気性菌の培養に際し通常用
いられる手法〔例えば山里、宇田川、児玉、森地編、
「微生物の分離法」R&Dプランニング(1986年
刊)246〜274頁、等参照〕の中から、本菌の生育
至適とするアルカリ性領域において効力を有し、かつ本
菌の生育に悪影響を及ぼさない条件を適当に選択し、そ
れを適用することができる。
元銅カラムで酸素を除去した窒素ガス、ヘリウムガス、
アルゴンガス又はそれ等の混合物等の酸素不含ガス雰囲
気や、培地の酸化還元電位を低下させて嫌気性菌の生育
を容易にするチタニウム(III)クエン酸、ジチオナイト
等の還元剤の添加等、通性嫌気性菌の培養に際し通常用
いられる手法〔例えば山里、宇田川、児玉、森地編、
「微生物の分離法」R&Dプランニング(1986年
刊)246〜274頁、等参照〕の中から、本菌の生育
至適とするアルカリ性領域において効力を有し、かつ本
菌の生育に悪影響を及ぼさない条件を適当に選択し、そ
れを適用することができる。
【0009】さらに、菌体取得にいたるまでの培養はそ
の全段階を嫌気条件下又は好気条件下の一条件下で行な
う必要はなく、培養途中で嫌気条件から好気条件に、あ
るいは好気条件から嫌気条件に変更することにより、両
者の条件を組み合わせて培養するのもまた好ましい方法
である。かくして培養される菌体は、NADHオキシダ
ーゼをその菌体内に含有しているので、取得菌体をその
まま、または取得菌体を例えば超音波処理、酵素処理、
ホモジナイズ等通常用いられる手段にて破砕し、得られ
る無細胞抽出液をそのまま、本発明の酸化方法に用いる
ことができる。あるいは、該無細胞抽出液を塩析、イオ
ン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等のそれ自体既知
の分離、精製方法〔例えば日本生化学会編 生化学実験
講座第1巻「タンパク質の化学I分離精製」東京化学同
人刊、1〜334頁;堀尾武一、山下仁平編「蛋白質・
酵素の基礎実験法」南江堂刊、1〜379頁等参照〕に
付することによりNADHオキシダーゼを部分精製また
は、完全精製した後に、本発明の酸化方法に用いること
もできる。
の全段階を嫌気条件下又は好気条件下の一条件下で行な
う必要はなく、培養途中で嫌気条件から好気条件に、あ
るいは好気条件から嫌気条件に変更することにより、両
者の条件を組み合わせて培養するのもまた好ましい方法
である。かくして培養される菌体は、NADHオキシダ
ーゼをその菌体内に含有しているので、取得菌体をその
まま、または取得菌体を例えば超音波処理、酵素処理、
ホモジナイズ等通常用いられる手段にて破砕し、得られ
る無細胞抽出液をそのまま、本発明の酸化方法に用いる
ことができる。あるいは、該無細胞抽出液を塩析、イオ
ン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等のそれ自体既知
の分離、精製方法〔例えば日本生化学会編 生化学実験
講座第1巻「タンパク質の化学I分離精製」東京化学同
人刊、1〜334頁;堀尾武一、山下仁平編「蛋白質・
酵素の基礎実験法」南江堂刊、1〜379頁等参照〕に
付することによりNADHオキシダーゼを部分精製また
は、完全精製した後に、本発明の酸化方法に用いること
もできる。
【0010】以上に述べた如くして製造されるNADH
オキシダーゼの酵素学的及び理科学的性質を示せば以下
のとおりである。 (1)作用:本酵素は以下の反応式で示される如くNA
DHを酸化してNAD+と過酸化水素を生成する。 NADH+H+ +O2 → NAD+ +H2 O2 (2)至適pH:酢酸緩衝液、トリス緩衝液、炭酸緩衝
液を用いて測定すると、本酵素はpH8〜9付近に至適
pHを有する。 (3)至適温度及び熱安定性:リン酸緩衝液(pH7.
0)を用いて測定すると、本酵素は約37℃に至適温度
を有する。 (4)温度安定性:本酵素を上記(3)にて用いたと同
じ緩衝液に懸濁し37℃にて保存した場合、100時間
経過後も0時間におけると略々同等の活性を有する。 (5)一価陽イオンの要求:無細胞菌体抽出液を50m
Mトリス緩衝液にて透析して得た酵素液のNADHオキ
シダーゼ活性を100とした場合、該酵素液に20mM
濃度となるようにK+ 、Na+ 、NH4 + を添加したと
きの活性はそれぞれ、310、180、310である。 (6)NADHオキシダーゼは無細胞抽出液を100,
000×gで1時間超遠心処理した上清画分に存在す
る。
オキシダーゼの酵素学的及び理科学的性質を示せば以下
のとおりである。 (1)作用:本酵素は以下の反応式で示される如くNA
DHを酸化してNAD+と過酸化水素を生成する。 NADH+H+ +O2 → NAD+ +H2 O2 (2)至適pH:酢酸緩衝液、トリス緩衝液、炭酸緩衝
液を用いて測定すると、本酵素はpH8〜9付近に至適
pHを有する。 (3)至適温度及び熱安定性:リン酸緩衝液(pH7.
0)を用いて測定すると、本酵素は約37℃に至適温度
を有する。 (4)温度安定性:本酵素を上記(3)にて用いたと同
じ緩衝液に懸濁し37℃にて保存した場合、100時間
経過後も0時間におけると略々同等の活性を有する。 (5)一価陽イオンの要求:無細胞菌体抽出液を50m
Mトリス緩衝液にて透析して得た酵素液のNADHオキ
シダーゼ活性を100とした場合、該酵素液に20mM
濃度となるようにK+ 、Na+ 、NH4 + を添加したと
きの活性はそれぞれ、310、180、310である。 (6)NADHオキシダーゼは無細胞抽出液を100,
000×gで1時間超遠心処理した上清画分に存在す
る。
【0011】前記の如くして得られるそのNADHオキ
シダーゼは、種々のNAD+ を補酵素とする脱水素酵素
と共役させることにより、対応する基質の脱水素反応に
利用することができ、それにより種々の化学物質の生産
及び生化学反応への応用が可能である。本発明のNAD
Hオキシダーゼと共役させうる脱水素酵素としては、例
えば、以下のものを挙げることができる。 (1)リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.
38、ECl.1.1.39)
シダーゼは、種々のNAD+ を補酵素とする脱水素酵素
と共役させることにより、対応する基質の脱水素反応に
利用することができ、それにより種々の化学物質の生産
及び生化学反応への応用が可能である。本発明のNAD
Hオキシダーゼと共役させうる脱水素酵素としては、例
えば、以下のものを挙げることができる。 (1)リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.
38、ECl.1.1.39)
【0012】
【化1】
【0013】(2)アルコールデヒドロゲナーゼ(EC
1.1.1.1)
1.1.1.1)
【0014】
【化2】
【0015】(3)グリセロールデヒドロゲナーゼ(E
C 1.1.1.6)
C 1.1.1.6)
【0016】
【化3】
【0017】(4)乳酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.
1.1.27)
1.1.27)
【0018】
【化4】
【0019】(5)3−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナー
ゼ(EC 1.1.1.30)
ゼ(EC 1.1.1.30)
【0020】
【化5】
【0021】(6)イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(E
C 1.1.1.41)
C 1.1.1.41)
【0022】
【化6】
【0023】(7)ガラクトースデヒドロゲナーゼ(E
C 1.1.1.48)
C 1.1.1.48)
【0024】
【化7】
【0025】(8)テストロン17β−デヒドロゲナー
ゼ(EC 1.1.1.63)
ゼ(EC 1.1.1.63)
【0026】
【化8】
【0027】(9)ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ
(EC 1.2.1.1)
(EC 1.2.1.1)
【0028】
【化9】
【0029】(10)ギ酸デヒドロゲナーゼ(EC
1.2.1.2) 反応:ギ酸+NAD+ →CO2 +NADH+H+ (11)アラニンデヒドロゲナーゼ(EC 1.4.
1.1)
1.2.1.2) 反応:ギ酸+NAD+ →CO2 +NADH+H+ (11)アラニンデヒドロゲナーゼ(EC 1.4.
1.1)
【0030】
【化10】
【0031】(12)グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
(EC 1.4.1.2)
(EC 1.4.1.2)
【0032】
【化11】
【0033】以上の例示は、本発明で用いるNADHオ
キシダーゼと共役して有用物質の生産に用いうる脱水素
酵素について、具体的な認識を得る一助としてのみ挙げ
たものであり、これによって本発明の範囲は何ら限定さ
れるものではない。
キシダーゼと共役して有用物質の生産に用いうる脱水素
酵素について、具体的な認識を得る一助としてのみ挙げ
たものであり、これによって本発明の範囲は何ら限定さ
れるものではない。
【0034】本発明のNADHの酸化反応方法は、通常
緩衝液中で行なわれ、用いうる緩衝液は、特に厳密に限
定されるものではないが、NADHオキシダーゼと共役
しうる脱水素酵素反応の反応平衡は、アルカリ側におい
て、NAD+ →NADHの方向に移り、アルカリ側に至
適pHを有する本発明で用いるNADHオキシダーゼと
共役させることにより基質の脱水素反応が容易に進行す
るから、アルカリ領域の緩衝液、好ましくはpH8〜
9.5の緩衝液が望ましい。アルカリ領域の緩衝液とし
ては、トリス緩衝液、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液を挙げ
ることができる。
緩衝液中で行なわれ、用いうる緩衝液は、特に厳密に限
定されるものではないが、NADHオキシダーゼと共役
しうる脱水素酵素反応の反応平衡は、アルカリ側におい
て、NAD+ →NADHの方向に移り、アルカリ側に至
適pHを有する本発明で用いるNADHオキシダーゼと
共役させることにより基質の脱水素反応が容易に進行す
るから、アルカリ領域の緩衝液、好ましくはpH8〜
9.5の緩衝液が望ましい。アルカリ領域の緩衝液とし
ては、トリス緩衝液、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液を挙げ
ることができる。
【0035】反応に使用する前記NADHオキシダーゼ
の量、及び脱水素酵素と共役反応させる場合の該酵素の
量は、それぞれ、通常0.05〜10単位、好ましくは
0.1〜5単位の範囲内とすることができる。反応温度
は通常20〜40℃の範囲内であり、また反応時間は1
〜6時間程度とすることができる。補酵素は通常1〜2
00μM、好ましくは5〜100μMの範囲内で用いる
ことができる。
の量、及び脱水素酵素と共役反応させる場合の該酵素の
量は、それぞれ、通常0.05〜10単位、好ましくは
0.1〜5単位の範囲内とすることができる。反応温度
は通常20〜40℃の範囲内であり、また反応時間は1
〜6時間程度とすることができる。補酵素は通常1〜2
00μM、好ましくは5〜100μMの範囲内で用いる
ことができる。
【0036】反応系中に添加することができるエチレン
ジアミン四酢酸(EDTA)もしくはその塩の量は特に
限定されないが、通常0.3〜10mM、さらに好まし
くは0.5〜1.0mMとすることができる。また、E
DTAの塩としては、ナトリウム、カリウム等のアルカ
リ金属塩;カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類
金属塩;アンモニウム塩、リチウム塩等を挙げることが
できる。
ジアミン四酢酸(EDTA)もしくはその塩の量は特に
限定されないが、通常0.3〜10mM、さらに好まし
くは0.5〜1.0mMとすることができる。また、E
DTAの塩としては、ナトリウム、カリウム等のアルカ
リ金属塩;カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類
金属塩;アンモニウム塩、リチウム塩等を挙げることが
できる。
【0037】
【実施例】次に、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。しかしながら、下記の実施例は本発明につい
て具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであ
り、これによって本発明の範囲は何ら限定されるもので
はない。
説明する。しかしながら、下記の実施例は本発明につい
て具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであ
り、これによって本発明の範囲は何ら限定されるもので
はない。
【0038】実施例1:NADHオキシダーゼの調製 K2 HPO4 1g、硝酸アンモニウム2g、MgSO
4 ・7H2 O 200mg、MnSO4 ・7H2 O 5
mg、FeSO4 ・7H2 O 5mg、CaCl2 ・2
H2 O 700mg、酵母エキス3g、ポリペプトン3
00mg、キシラン10g及びレサズリン1mgを蒸留
水900mlに溶解し、90mlずつ100ml容血清
ビンに分注した。煮沸脱気し、還元銅カラムを通過して
調製した無酸素窒素ガスを通気後ブチル栓をかぶせ、ア
ルミキャップにて封じ120℃15分殺菌を行なった。
この培地に120℃、15分滅菌済みの10%炭酸ナト
リウム水溶液(pH10.6)を10ml添加し、培地
のpHを10とした。さらに、還元剤としてサイエンス
(Science)第194巻1165〜1166頁記
載のA.J.B.Zehnder & K.Wuhrm
annらの方法に準じて調製したチタニウム(III)クエ
ン酸溶液を最終濃度0.13mMとなるように添加し
た。本培地に好アルカリ性通性嫌気性細菌Ep01株
(FERM BP−2744)を接種し、40℃、20
時間静置培養を行なったものを種培養液とした。
4 ・7H2 O 200mg、MnSO4 ・7H2 O 5
mg、FeSO4 ・7H2 O 5mg、CaCl2 ・2
H2 O 700mg、酵母エキス3g、ポリペプトン3
00mg、キシラン10g及びレサズリン1mgを蒸留
水900mlに溶解し、90mlずつ100ml容血清
ビンに分注した。煮沸脱気し、還元銅カラムを通過して
調製した無酸素窒素ガスを通気後ブチル栓をかぶせ、ア
ルミキャップにて封じ120℃15分殺菌を行なった。
この培地に120℃、15分滅菌済みの10%炭酸ナト
リウム水溶液(pH10.6)を10ml添加し、培地
のpHを10とした。さらに、還元剤としてサイエンス
(Science)第194巻1165〜1166頁記
載のA.J.B.Zehnder & K.Wuhrm
annらの方法に準じて調製したチタニウム(III)クエ
ン酸溶液を最終濃度0.13mMとなるように添加し
た。本培地に好アルカリ性通性嫌気性細菌Ep01株
(FERM BP−2744)を接種し、40℃、20
時間静置培養を行なったものを種培養液とした。
【0039】キシラン10gをグルコース10gに変え
た他は同組成の培地450mlを500ml容血清ビン
に分注し、同様の操作を行ない120℃、15分殺菌
後、10%炭酸ナトリウム水溶液50ml、チタニウム
(III)クエン酸溶液を最終濃度0.13mMとなるよう
に添加した。前記種培養液10mlを接種し、40℃、
24時間静置培養した。培養終了後培養液100ml
を、1,000×g、20分遠心し得られた菌体を50
mM Tris塩酸緩衝液に懸濁後、遠心集菌し洗浄菌
体を得た。この菌体を同上緩衝液5mlに懸濁後、超音
波処理により菌体を破壊し、遠心分離(12,000r
pm,20分間)して得られた上澄を酵素液とした。
た他は同組成の培地450mlを500ml容血清ビン
に分注し、同様の操作を行ない120℃、15分殺菌
後、10%炭酸ナトリウム水溶液50ml、チタニウム
(III)クエン酸溶液を最終濃度0.13mMとなるよう
に添加した。前記種培養液10mlを接種し、40℃、
24時間静置培養した。培養終了後培養液100ml
を、1,000×g、20分遠心し得られた菌体を50
mM Tris塩酸緩衝液に懸濁後、遠心集菌し洗浄菌
体を得た。この菌体を同上緩衝液5mlに懸濁後、超音
波処理により菌体を破壊し、遠心分離(12,000r
pm,20分間)して得られた上澄を酵素液とした。
【0040】実施例2:NADHオキシダーゼによるN
ADHの酸化 NADHオキシダーゼによるNADHの酸化は、次のよ
うにして行った。すなわち、50mMリン酸ナトリウム
緩衝液1.9ml、実施例1で調製した酵素液0.05
mlからなる反応液に、EDTAを各々0.5mM、1
mM、2mM、5mM、10mMになるように添加した
反応液を37℃にて予め保持した後、5mM NADH
0.05mlを加え反応を開始し、340nmにおけ
る吸光の減少を測定した。吸光度の変化より、単位時間
あたりのNADHの減少量を求め、酵素活性の指標とし
た。その結果を第1表に示す。表中において、酵素活性
は、EDTAを0.5mM添加した時の比活性を100
とし、各々との相対値(%)によって表した。
ADHの酸化 NADHオキシダーゼによるNADHの酸化は、次のよ
うにして行った。すなわち、50mMリン酸ナトリウム
緩衝液1.9ml、実施例1で調製した酵素液0.05
mlからなる反応液に、EDTAを各々0.5mM、1
mM、2mM、5mM、10mMになるように添加した
反応液を37℃にて予め保持した後、5mM NADH
0.05mlを加え反応を開始し、340nmにおけ
る吸光の減少を測定した。吸光度の変化より、単位時間
あたりのNADHの減少量を求め、酵素活性の指標とし
た。その結果を第1表に示す。表中において、酵素活性
は、EDTAを0.5mM添加した時の比活性を100
とし、各々との相対値(%)によって表した。
【0041】 第 1 表 EDTA添加濃度(mM) 0 0.5 1.0 2.0 5.0 10 比活性(%) 10 100 100 95 85 80
【0042】第1表から明らかなとおり、反応系にED
TAを添加することにより、EDTA無添加時に比較し
て、NAD+ が約10倍の速度で生成された。
TAを添加することにより、EDTA無添加時に比較し
て、NAD+ が約10倍の速度で生成された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央8丁目3番1号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内
Claims (1)
- 【請求項1】 アルカリ性領域に至適pHを有する通性
嫌気性のNADHオキシダーゼ生産菌に由来するNAD
Hオキシダーゼの存在下に還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドを酸化して酸化型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドを再生させるに際し、エチレンジア
ミン四酢酸もしくはその塩を反応系に添加することを特
徴とする還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
の酸化方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2134292A JPH05219979A (ja) | 1992-02-06 | 1992-02-06 | Nadhの酸化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2134292A JPH05219979A (ja) | 1992-02-06 | 1992-02-06 | Nadhの酸化方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH05219979A true JPH05219979A (ja) | 1993-08-31 |
Family
ID=12052429
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2134292A Pending JPH05219979A (ja) | 1992-02-06 | 1992-02-06 | Nadhの酸化方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH05219979A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004303601A (ja) * | 2003-03-31 | 2004-10-28 | Sharp Corp | エネルギー回収システム |
-
1992
- 1992-02-06 JP JP2134292A patent/JPH05219979A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004303601A (ja) * | 2003-03-31 | 2004-10-28 | Sharp Corp | エネルギー回収システム |
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