JPH05219979A - Ｎａｄｈの酸化方法 - Google Patents
Ｎａｄｈの酸化方法Info
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- JPH05219979A JPH05219979A JP2134292A JP2134292A JPH05219979A JP H05219979 A JPH05219979 A JP H05219979A JP 2134292 A JP2134292 A JP 2134292A JP 2134292 A JP2134292 A JP 2134292A JP H05219979 A JPH05219979 A JP H05219979A
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- oxidase
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 アルカリ性領域に至適ｐＨを有する通性嫌気
性のＮＡＤＨオキシダーゼ生産菌ＥＰ０１株に由来する
ＮＡＤＨオキシダーゼの存在下にＮＡＤＨを酸化してＮ
ＡＤ+ を再生させるに際し、反応系にＥＤＴＡを添加す
るＮＡＤＨの酸化方法。 【効果】 高い反応速度でＮＡＤ+ を再生させることが
できる。
性のＮＡＤＨオキシダーゼ生産菌ＥＰ０１株に由来する
ＮＡＤＨオキシダーゼの存在下にＮＡＤＨを酸化してＮ
ＡＤ+ を再生させるに際し、反応系にＥＤＴＡを添加す
るＮＡＤＨの酸化方法。 【効果】 高い反応速度でＮＡＤ+ を再生させることが
できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、或る種のＮＡＤＨオキ
シダーゼを用いるＮＡＤＨの酸化方法に関する。ＮＡＤ
Ｈオキシダーゼは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（以下、これを「ＮＡＤＨ」と略すことがあ
る）を分子状酸素を用いて酸化し、酸化型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド（以下、これを「ＮＡＤ+ 」
と略すことがある）を再生する有用な酵素である。ＮＡ
ＤＨオキシダーゼによって再生されるＮＡＤ+ は、生体
内で行なわれる種々の脱水素酵素反応の補酵素として作
用する有用な物質である。このＮＡＤ+ を補酵素とする
脱水素酵素の多くは、工業的に有用な光学活性化合物や
反応中間体等の製造に好適に用いられているものであ
る。
シダーゼを用いるＮＡＤＨの酸化方法に関する。ＮＡＤ
Ｈオキシダーゼは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（以下、これを「ＮＡＤＨ」と略すことがあ
る）を分子状酸素を用いて酸化し、酸化型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド（以下、これを「ＮＡＤ+ 」
と略すことがある）を再生する有用な酵素である。ＮＡ
ＤＨオキシダーゼによって再生されるＮＡＤ+ は、生体
内で行なわれる種々の脱水素酵素反応の補酵素として作
用する有用な物質である。このＮＡＤ+ を補酵素とする
脱水素酵素の多くは、工業的に有用な光学活性化合物や
反応中間体等の製造に好適に用いられているものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】本発明者らは、先に、工業的製造に適し
たＮＡＤＨオキシダーゼ源微生物について広く検索した
結果、アルカリ性領域に至適生育ｐＨを有する酸素の存
在下でも不在下でも生存しうる或る種の嫌気性細菌が、
温度安定性に優れたＮＡＤＨオキシダーゼを生産するこ
とを見い出し、該微生物を培地で培養し、ＮＡＤＨオキ
シダーゼを工業的に製造する方法を提案した（特開平２
−１０７１８６号公報参照；以下、上記微生物を「好ア
ルカリ性通性嫌気性のＮＡＤＨオキシダーゼ生産菌」と
言うことがある）。
たＮＡＤＨオキシダーゼ源微生物について広く検索した
結果、アルカリ性領域に至適生育ｐＨを有する酸素の存
在下でも不在下でも生存しうる或る種の嫌気性細菌が、
温度安定性に優れたＮＡＤＨオキシダーゼを生産するこ
とを見い出し、該微生物を培地で培養し、ＮＡＤＨオキ
シダーゼを工業的に製造する方法を提案した（特開平２
−１０７１８６号公報参照；以下、上記微生物を「好ア
ルカリ性通性嫌気性のＮＡＤＨオキシダーゼ生産菌」と
言うことがある）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、更に該
好アルカリ性通性嫌気性のＮＡＤＨオキシダーゼ生産菌
に由来するＮＡＤＨオキシダーゼによりＮＡＤＨを効率
的に酸化する方法を鋭意検討した結果、反応系にエチレ
ンジアミン四酢酸（以下これを「ＥＤＴＡ」と言うこと
がある）もしくはその塩を添加することにより、酸化反
応速度が著しく増大することを見い出し、本発明を完成
するに至った。
好アルカリ性通性嫌気性のＮＡＤＨオキシダーゼ生産菌
に由来するＮＡＤＨオキシダーゼによりＮＡＤＨを効率
的に酸化する方法を鋭意検討した結果、反応系にエチレ
ンジアミン四酢酸（以下これを「ＥＤＴＡ」と言うこと
がある）もしくはその塩を添加することにより、酸化反
応速度が著しく増大することを見い出し、本発明を完成
するに至った。
【０００４】
【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、アルカリ性領域に至適ｐＨを有する通性嫌気性のＮ
ＡＤＨオキシダーゼ生産菌に由来するＮＡＤＨオキシダ
ーゼの存在下に還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドを酸化して酸化型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドを再生させるに際し、エチレンジアミン四酢酸
もしくはその塩を反応系に添加することを特徴とする還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの酸化方法
が提供される。
ば、アルカリ性領域に至適ｐＨを有する通性嫌気性のＮ
ＡＤＨオキシダーゼ生産菌に由来するＮＡＤＨオキシダ
ーゼの存在下に還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドを酸化して酸化型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドを再生させるに際し、エチレンジアミン四酢酸
もしくはその塩を反応系に添加することを特徴とする還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの酸化方法
が提供される。
【０００５】本発明で用いるＮＡＤＨオキシダーゼの供
給源となる微生物としては、好アルカリ性通性嫌気性細
菌に属し、ＮＡＤＨオキシダーゼ生産能を有する菌株ま
たこれらの変異株を用いることができる。これらの性質
を有する菌株の好適具体例としては、例えば、アグリカ
ルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー
（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第５１巻、第２２７１
〜２２７５ページ（１９８７）に記載されているＥｐ０
１株があげられる。本菌株は工業技術院微生物工業技術
研究所に微生物受託番号 微工研条寄第２７４４号（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−２７４４）として寄託されている。な
お、このＥｐ０１株は、インターナショナル・ジャーナ
ル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｉｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙ
ｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第４０
巻、第２９７〜３０１ページ（１９９０）において、新
属新種の細菌アンフィバチルス・キシンランス（Ａｍｐ
ｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｙｌａｎｓ）として認められ
ている。
給源となる微生物としては、好アルカリ性通性嫌気性細
菌に属し、ＮＡＤＨオキシダーゼ生産能を有する菌株ま
たこれらの変異株を用いることができる。これらの性質
を有する菌株の好適具体例としては、例えば、アグリカ
ルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー
（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第５１巻、第２２７１
〜２２７５ページ（１９８７）に記載されているＥｐ０
１株があげられる。本菌株は工業技術院微生物工業技術
研究所に微生物受託番号 微工研条寄第２７４４号（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−２７４４）として寄託されている。な
お、このＥｐ０１株は、インターナショナル・ジャーナ
ル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｉｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙ
ｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第４０
巻、第２９７〜３０１ページ（１９９０）において、新
属新種の細菌アンフィバチルス・キシンランス（Ａｍｐ
ｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｙｌａｎｓ）として認められ
ている。
【０００６】上記したＮＡＤＨオキシダーゼ生産菌の培
養はそれ自体既知の方法で行なうことができ、その際に
使用し得る培地の栄養源である窒素源としては、例え
ば、アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム等の無機窒素化合物を単独でもし
くは混合して用いることができる。また、無機金属塩と
しては、例えば、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素
カリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マン
ガン、硫酸第一鉄等を用いることができる。以上のよう
な無機栄養源の他に、コーンスティープリカー、酵母エ
キス、ペプトン等の天然栄養源を加えてもよい。さら
に、炭素源として例えば、グルコース、キシロース、マ
ンノース、フルクトース、アルトース、シュークロー
ス、セロビオース、キシラン等を培地に添加することが
できる。
養はそれ自体既知の方法で行なうことができ、その際に
使用し得る培地の栄養源である窒素源としては、例え
ば、アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム等の無機窒素化合物を単独でもし
くは混合して用いることができる。また、無機金属塩と
しては、例えば、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素
カリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マン
ガン、硫酸第一鉄等を用いることができる。以上のよう
な無機栄養源の他に、コーンスティープリカー、酵母エ
キス、ペプトン等の天然栄養源を加えてもよい。さら
に、炭素源として例えば、グルコース、キシロース、マ
ンノース、フルクトース、アルトース、シュークロー
ス、セロビオース、キシラン等を培地に添加することが
できる。
【０００７】前述したＮＡＤＨオキシダーゼ生産菌ＥＰ
０１株を上記の如き組成の培地で培養する場合、培養温
度は通常約２０〜約５０℃、好ましくは約３５〜約４５
℃の範囲内が適当である。また、培養中の培地のｐＨは
約７．５以上のアルカリ性領域であれば厳密に限定され
るものではないが、一般には８〜１０．５、好ましくは
８．５〜１０．０の範囲内が有利である。培地のｐＨ
は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア炭
酸ナトリウム等のアルカリを適宜培地に添加することに
より至適範囲内となるよう調製するのが好都合である。
培養時間は通常３〜２４時間、好ましくは５〜２０時間
程度とすることができる。培養は通気攪拌、振盪等の好
気的条件下で行なうことができ、或いは無酸素嫌気的条
件下で行ってもよい。
０１株を上記の如き組成の培地で培養する場合、培養温
度は通常約２０〜約５０℃、好ましくは約３５〜約４５
℃の範囲内が適当である。また、培養中の培地のｐＨは
約７．５以上のアルカリ性領域であれば厳密に限定され
るものではないが、一般には８〜１０．５、好ましくは
８．５〜１０．０の範囲内が有利である。培地のｐＨ
は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア炭
酸ナトリウム等のアルカリを適宜培地に添加することに
より至適範囲内となるよう調製するのが好都合である。
培養時間は通常３〜２４時間、好ましくは５〜２０時間
程度とすることができる。培養は通気攪拌、振盪等の好
気的条件下で行なうことができ、或いは無酸素嫌気的条
件下で行ってもよい。
【０００８】嫌気的条件下で培養を行なう場合には、還
元銅カラムで酸素を除去した窒素ガス、ヘリウムガス、
アルゴンガス又はそれ等の混合物等の酸素不含ガス雰囲
気や、培地の酸化還元電位を低下させて嫌気性菌の生育
を容易にするチタニウム（III)クエン酸、ジチオナイト
等の還元剤の添加等、通性嫌気性菌の培養に際し通常用
いられる手法〔例えば山里、宇田川、児玉、森地編、
「微生物の分離法」Ｒ＆Ｄプランニング（１９８６年
刊）２４６〜２７４頁、等参照〕の中から、本菌の生育
至適とするアルカリ性領域において効力を有し、かつ本
菌の生育に悪影響を及ぼさない条件を適当に選択し、そ
れを適用することができる。
元銅カラムで酸素を除去した窒素ガス、ヘリウムガス、
アルゴンガス又はそれ等の混合物等の酸素不含ガス雰囲
気や、培地の酸化還元電位を低下させて嫌気性菌の生育
を容易にするチタニウム（III)クエン酸、ジチオナイト
等の還元剤の添加等、通性嫌気性菌の培養に際し通常用
いられる手法〔例えば山里、宇田川、児玉、森地編、
「微生物の分離法」Ｒ＆Ｄプランニング（１９８６年
刊）２４６〜２７４頁、等参照〕の中から、本菌の生育
至適とするアルカリ性領域において効力を有し、かつ本
菌の生育に悪影響を及ぼさない条件を適当に選択し、そ
れを適用することができる。
【０００９】さらに、菌体取得にいたるまでの培養はそ
の全段階を嫌気条件下又は好気条件下の一条件下で行な
う必要はなく、培養途中で嫌気条件から好気条件に、あ
るいは好気条件から嫌気条件に変更することにより、両
者の条件を組み合わせて培養するのもまた好ましい方法
である。かくして培養される菌体は、ＮＡＤＨオキシダ
ーゼをその菌体内に含有しているので、取得菌体をその
まま、または取得菌体を例えば超音波処理、酵素処理、
ホモジナイズ等通常用いられる手段にて破砕し、得られ
る無細胞抽出液をそのまま、本発明の酸化方法に用いる
ことができる。あるいは、該無細胞抽出液を塩析、イオ
ン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等のそれ自体既知
の分離、精製方法〔例えば日本生化学会編 生化学実験
講座第１巻「タンパク質の化学Ｉ分離精製」東京化学同
人刊、１〜３３４頁；堀尾武一、山下仁平編「蛋白質・
酵素の基礎実験法」南江堂刊、１〜３７９頁等参照〕に
付することによりＮＡＤＨオキシダーゼを部分精製また
は、完全精製した後に、本発明の酸化方法に用いること
もできる。
の全段階を嫌気条件下又は好気条件下の一条件下で行な
う必要はなく、培養途中で嫌気条件から好気条件に、あ
るいは好気条件から嫌気条件に変更することにより、両
者の条件を組み合わせて培養するのもまた好ましい方法
である。かくして培養される菌体は、ＮＡＤＨオキシダ
ーゼをその菌体内に含有しているので、取得菌体をその
まま、または取得菌体を例えば超音波処理、酵素処理、
ホモジナイズ等通常用いられる手段にて破砕し、得られ
る無細胞抽出液をそのまま、本発明の酸化方法に用いる
ことができる。あるいは、該無細胞抽出液を塩析、イオ
ン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等のそれ自体既知
の分離、精製方法〔例えば日本生化学会編 生化学実験
講座第１巻「タンパク質の化学Ｉ分離精製」東京化学同
人刊、１〜３３４頁；堀尾武一、山下仁平編「蛋白質・
酵素の基礎実験法」南江堂刊、１〜３７９頁等参照〕に
付することによりＮＡＤＨオキシダーゼを部分精製また
は、完全精製した後に、本発明の酸化方法に用いること
もできる。
【００１０】以上に述べた如くして製造されるＮＡＤＨ
オキシダーゼの酵素学的及び理科学的性質を示せば以下
のとおりである。 （１）作用：本酵素は以下の反応式で示される如くＮＡ
ＤＨを酸化してＮＡＤ+と過酸化水素を生成する。 ＮＡＤＨ＋Ｈ+ ＋Ｏ2 → ＮＡＤ+ ＋Ｈ2 Ｏ2 （２）至適ｐＨ：酢酸緩衝液、トリス緩衝液、炭酸緩衝
液を用いて測定すると、本酵素はｐＨ８〜９付近に至適
ｐＨを有する。 （３）至適温度及び熱安定性：リン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）を用いて測定すると、本酵素は約３７℃に至適温度
を有する。 （４）温度安定性：本酵素を上記（３）にて用いたと同
じ緩衝液に懸濁し３７℃にて保存した場合、１００時間
経過後も０時間におけると略々同等の活性を有する。 （５）一価陽イオンの要求：無細胞菌体抽出液を５０ｍ
Ｍトリス緩衝液にて透析して得た酵素液のＮＡＤＨオキ
シダーゼ活性を１００とした場合、該酵素液に２０ｍＭ
濃度となるようにＫ+ 、Ｎａ+ 、ＮＨ4 + を添加したと
きの活性はそれぞれ、３１０、１８０、３１０である。 （６）ＮＡＤＨオキシダーゼは無細胞抽出液を１００，
０００×ｇで１時間超遠心処理した上清画分に存在す
る。
オキシダーゼの酵素学的及び理科学的性質を示せば以下
のとおりである。 （１）作用：本酵素は以下の反応式で示される如くＮＡ
ＤＨを酸化してＮＡＤ+と過酸化水素を生成する。 ＮＡＤＨ＋Ｈ+ ＋Ｏ2 → ＮＡＤ+ ＋Ｈ2 Ｏ2 （２）至適ｐＨ：酢酸緩衝液、トリス緩衝液、炭酸緩衝
液を用いて測定すると、本酵素はｐＨ８〜９付近に至適
ｐＨを有する。 （３）至適温度及び熱安定性：リン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）を用いて測定すると、本酵素は約３７℃に至適温度
を有する。 （４）温度安定性：本酵素を上記（３）にて用いたと同
じ緩衝液に懸濁し３７℃にて保存した場合、１００時間
経過後も０時間におけると略々同等の活性を有する。 （５）一価陽イオンの要求：無細胞菌体抽出液を５０ｍ
Ｍトリス緩衝液にて透析して得た酵素液のＮＡＤＨオキ
シダーゼ活性を１００とした場合、該酵素液に２０ｍＭ
濃度となるようにＫ+ 、Ｎａ+ 、ＮＨ4 + を添加したと
きの活性はそれぞれ、３１０、１８０、３１０である。 （６）ＮＡＤＨオキシダーゼは無細胞抽出液を１００，
０００×ｇで１時間超遠心処理した上清画分に存在す
る。
【００１１】前記の如くして得られるそのＮＡＤＨオキ
シダーゼは、種々のＮＡＤ+ を補酵素とする脱水素酵素
と共役させることにより、対応する基質の脱水素反応に
利用することができ、それにより種々の化学物質の生産
及び生化学反応への応用が可能である。本発明のＮＡＤ
Ｈオキシダーゼと共役させうる脱水素酵素としては、例
えば、以下のものを挙げることができる。 （１）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．
３８、ＥＣｌ．１．１．３９）
シダーゼは、種々のＮＡＤ+ を補酵素とする脱水素酵素
と共役させることにより、対応する基質の脱水素反応に
利用することができ、それにより種々の化学物質の生産
及び生化学反応への応用が可能である。本発明のＮＡＤ
Ｈオキシダーゼと共役させうる脱水素酵素としては、例
えば、以下のものを挙げることができる。 （１）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．
３８、ＥＣｌ．１．１．３９）
【００１２】
【化１】
【００１３】（２）アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ
１．１．１．１）
１．１．１．１）
【００１４】
【化２】
【００１５】（３）グリセロールデヒドロゲナーゼ（Ｅ
Ｃ １．１．１．６）
Ｃ １．１．１．６）
【００１６】
【化３】
【００１７】（４）乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．
１．１．２７）
１．１．２７）
【００１８】
【化４】
【００１９】（５）３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナー
ゼ（ＥＣ １．１．１．３０）
ゼ（ＥＣ １．１．１．３０）
【００２０】
【化５】
【００２１】（６）イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ
Ｃ １．１．１．４１）
Ｃ １．１．１．４１）
【００２２】
【化６】
【００２３】（７）ガラクトースデヒドロゲナーゼ（Ｅ
Ｃ １．１．１．４８）
Ｃ １．１．１．４８）
【００２４】
【化７】
【００２５】（８）テストロン１７β−デヒドロゲナー
ゼ（ＥＣ １．１．１．６３）
ゼ（ＥＣ １．１．１．６３）
【００２６】
【化８】
【００２７】（９）ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ
（ＥＣ １．２．１．１）
（ＥＣ １．２．１．１）
【００２８】
【化９】
【００２９】（１０）ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ
１．２．１．２） 反応：ギ酸＋ＮＡＤ+ →ＣＯ2 ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+ （１１）アラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．
１．１）
１．２．１．２） 反応：ギ酸＋ＮＡＤ+ →ＣＯ2 ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+ （１１）アラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．
１．１）
【００３０】
【化１０】
【００３１】（１２）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
（ＥＣ １．４．１．２）
（ＥＣ １．４．１．２）
【００３２】
【化１１】
【００３３】以上の例示は、本発明で用いるＮＡＤＨオ
キシダーゼと共役して有用物質の生産に用いうる脱水素
酵素について、具体的な認識を得る一助としてのみ挙げ
たものであり、これによって本発明の範囲は何ら限定さ
れるものではない。
キシダーゼと共役して有用物質の生産に用いうる脱水素
酵素について、具体的な認識を得る一助としてのみ挙げ
たものであり、これによって本発明の範囲は何ら限定さ
れるものではない。
【００３４】本発明のＮＡＤＨの酸化反応方法は、通常
緩衝液中で行なわれ、用いうる緩衝液は、特に厳密に限
定されるものではないが、ＮＡＤＨオキシダーゼと共役
しうる脱水素酵素反応の反応平衡は、アルカリ側におい
て、ＮＡＤ+ →ＮＡＤＨの方向に移り、アルカリ側に至
適ｐＨを有する本発明で用いるＮＡＤＨオキシダーゼと
共役させることにより基質の脱水素反応が容易に進行す
るから、アルカリ領域の緩衝液、好ましくはｐＨ８〜
９．５の緩衝液が望ましい。アルカリ領域の緩衝液とし
ては、トリス緩衝液、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液を挙げ
ることができる。
緩衝液中で行なわれ、用いうる緩衝液は、特に厳密に限
定されるものではないが、ＮＡＤＨオキシダーゼと共役
しうる脱水素酵素反応の反応平衡は、アルカリ側におい
て、ＮＡＤ+ →ＮＡＤＨの方向に移り、アルカリ側に至
適ｐＨを有する本発明で用いるＮＡＤＨオキシダーゼと
共役させることにより基質の脱水素反応が容易に進行す
るから、アルカリ領域の緩衝液、好ましくはｐＨ８〜
９．５の緩衝液が望ましい。アルカリ領域の緩衝液とし
ては、トリス緩衝液、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液を挙げ
ることができる。
【００３５】反応に使用する前記ＮＡＤＨオキシダーゼ
の量、及び脱水素酵素と共役反応させる場合の該酵素の
量は、それぞれ、通常０．０５〜１０単位、好ましくは
０．１〜５単位の範囲内とすることができる。反応温度
は通常２０〜４０℃の範囲内であり、また反応時間は１
〜６時間程度とすることができる。補酵素は通常１〜２
００μＭ、好ましくは５〜１００μＭの範囲内で用いる
ことができる。
の量、及び脱水素酵素と共役反応させる場合の該酵素の
量は、それぞれ、通常０．０５〜１０単位、好ましくは
０．１〜５単位の範囲内とすることができる。反応温度
は通常２０〜４０℃の範囲内であり、また反応時間は１
〜６時間程度とすることができる。補酵素は通常１〜２
００μＭ、好ましくは５〜１００μＭの範囲内で用いる
ことができる。
【００３６】反応系中に添加することができるエチレン
ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）もしくはその塩の量は特に
限定されないが、通常０．３〜１０ｍＭ、さらに好まし
くは０．５〜１．０ｍＭとすることができる。また、Ｅ
ＤＴＡの塩としては、ナトリウム、カリウム等のアルカ
リ金属塩；カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類
金属塩；アンモニウム塩、リチウム塩等を挙げることが
できる。
ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）もしくはその塩の量は特に
限定されないが、通常０．３〜１０ｍＭ、さらに好まし
くは０．５〜１．０ｍＭとすることができる。また、Ｅ
ＤＴＡの塩としては、ナトリウム、カリウム等のアルカ
リ金属塩；カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類
金属塩；アンモニウム塩、リチウム塩等を挙げることが
できる。
【００３７】
【実施例】次に、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。しかしながら、下記の実施例は本発明につい
て具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであ
り、これによって本発明の範囲は何ら限定されるもので
はない。
説明する。しかしながら、下記の実施例は本発明につい
て具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであ
り、これによって本発明の範囲は何ら限定されるもので
はない。
【００３８】実施例１：ＮＡＤＨオキシダーゼの調製 Ｋ2 ＨＰＯ4 １ｇ、硝酸アンモニウム２ｇ、ＭｇＳＯ
4 ・７Ｈ2 Ｏ ２００ｍｇ、ＭｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ５
ｍｇ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ５ｍｇ、ＣａＣｌ2 ・２
Ｈ2 Ｏ ７００ｍｇ、酵母エキス３ｇ、ポリペプトン３
００ｍｇ、キシラン１０ｇ及びレサズリン１ｍｇを蒸留
水９００ｍｌに溶解し、９０ｍｌずつ１００ｍｌ容血清
ビンに分注した。煮沸脱気し、還元銅カラムを通過して
調製した無酸素窒素ガスを通気後ブチル栓をかぶせ、ア
ルミキャップにて封じ１２０℃１５分殺菌を行なった。
この培地に１２０℃、１５分滅菌済みの１０％炭酸ナト
リウム水溶液（ｐＨ１０．６）を１０ｍｌ添加し、培地
のｐＨを１０とした。さらに、還元剤としてサイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第１９４巻１１６５〜１１６６頁記
載のＡ．Ｊ．Ｂ．Ｚｅｈｎｄｅｒ ＆ Ｋ．Ｗｕｈｒｍ
ａｎｎらの方法に準じて調製したチタニウム（III)クエ
ン酸溶液を最終濃度０．１３ｍＭとなるように添加し
た。本培地に好アルカリ性通性嫌気性細菌Ｅｐ０１株
（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７４４）を接種し、４０℃、２０
時間静置培養を行なったものを種培養液とした。
4 ・７Ｈ2 Ｏ ２００ｍｇ、ＭｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ５
ｍｇ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ５ｍｇ、ＣａＣｌ2 ・２
Ｈ2 Ｏ ７００ｍｇ、酵母エキス３ｇ、ポリペプトン３
００ｍｇ、キシラン１０ｇ及びレサズリン１ｍｇを蒸留
水９００ｍｌに溶解し、９０ｍｌずつ１００ｍｌ容血清
ビンに分注した。煮沸脱気し、還元銅カラムを通過して
調製した無酸素窒素ガスを通気後ブチル栓をかぶせ、ア
ルミキャップにて封じ１２０℃１５分殺菌を行なった。
この培地に１２０℃、１５分滅菌済みの１０％炭酸ナト
リウム水溶液（ｐＨ１０．６）を１０ｍｌ添加し、培地
のｐＨを１０とした。さらに、還元剤としてサイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第１９４巻１１６５〜１１６６頁記
載のＡ．Ｊ．Ｂ．Ｚｅｈｎｄｅｒ ＆ Ｋ．Ｗｕｈｒｍ
ａｎｎらの方法に準じて調製したチタニウム（III)クエ
ン酸溶液を最終濃度０．１３ｍＭとなるように添加し
た。本培地に好アルカリ性通性嫌気性細菌Ｅｐ０１株
（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７４４）を接種し、４０℃、２０
時間静置培養を行なったものを種培養液とした。
【００３９】キシラン１０ｇをグルコース１０ｇに変え
た他は同組成の培地４５０ｍｌを５００ｍｌ容血清ビン
に分注し、同様の操作を行ない１２０℃、１５分殺菌
後、１０％炭酸ナトリウム水溶液５０ｍｌ、チタニウム
（III)クエン酸溶液を最終濃度０．１３ｍＭとなるよう
に添加した。前記種培養液１０ｍｌを接種し、４０℃、
２４時間静置培養した。培養終了後培養液１００ｍｌ
を、１，０００×ｇ、２０分遠心し得られた菌体を５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液に懸濁後、遠心集菌し洗浄菌
体を得た。この菌体を同上緩衝液５ｍｌに懸濁後、超音
波処理により菌体を破壊し、遠心分離（１２，０００ｒ
ｐｍ，２０分間）して得られた上澄を酵素液とした。
た他は同組成の培地４５０ｍｌを５００ｍｌ容血清ビン
に分注し、同様の操作を行ない１２０℃、１５分殺菌
後、１０％炭酸ナトリウム水溶液５０ｍｌ、チタニウム
（III)クエン酸溶液を最終濃度０．１３ｍＭとなるよう
に添加した。前記種培養液１０ｍｌを接種し、４０℃、
２４時間静置培養した。培養終了後培養液１００ｍｌ
を、１，０００×ｇ、２０分遠心し得られた菌体を５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液に懸濁後、遠心集菌し洗浄菌
体を得た。この菌体を同上緩衝液５ｍｌに懸濁後、超音
波処理により菌体を破壊し、遠心分離（１２，０００ｒ
ｐｍ，２０分間）して得られた上澄を酵素液とした。
【００４０】実施例２：ＮＡＤＨオキシダーゼによるＮ
ＡＤＨの酸化 ＮＡＤＨオキシダーゼによるＮＡＤＨの酸化は、次のよ
うにして行った。すなわち、５０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液１．９ｍｌ、実施例１で調製した酵素液０．０５
ｍｌからなる反応液に、ＥＤＴＡを各々０．５ｍＭ、１
ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭになるように添加した
反応液を３７℃にて予め保持した後、５ｍＭ ＮＡＤＨ
０．０５ｍｌを加え反応を開始し、３４０ｎｍにおけ
る吸光の減少を測定した。吸光度の変化より、単位時間
あたりのＮＡＤＨの減少量を求め、酵素活性の指標とし
た。その結果を第１表に示す。表中において、酵素活性
は、ＥＤＴＡを０．５ｍＭ添加した時の比活性を１００
とし、各々との相対値（％）によって表した。
ＡＤＨの酸化 ＮＡＤＨオキシダーゼによるＮＡＤＨの酸化は、次のよ
うにして行った。すなわち、５０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液１．９ｍｌ、実施例１で調製した酵素液０．０５
ｍｌからなる反応液に、ＥＤＴＡを各々０．５ｍＭ、１
ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭになるように添加した
反応液を３７℃にて予め保持した後、５ｍＭ ＮＡＤＨ
０．０５ｍｌを加え反応を開始し、３４０ｎｍにおけ
る吸光の減少を測定した。吸光度の変化より、単位時間
あたりのＮＡＤＨの減少量を求め、酵素活性の指標とし
た。その結果を第１表に示す。表中において、酵素活性
は、ＥＤＴＡを０．５ｍＭ添加した時の比活性を１００
とし、各々との相対値（％）によって表した。
【００４１】 第 １ 表 ＥＤＴＡ添加濃度（ｍＭ） ０ ０．５ １．０ ２．０ ５．０ １０ 比活性（％） １０ １００ １００ ９５ ８５ ８０
【００４２】第１表から明らかなとおり、反応系にＥＤ
ＴＡを添加することにより、ＥＤＴＡ無添加時に比較し
て、ＮＡＤ+ が約１０倍の速度で生成された。
ＴＡを添加することにより、ＥＤＴＡ無添加時に比較し
て、ＮＡＤ+ が約１０倍の速度で生成された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内
Claims (1)
- 【請求項１】 アルカリ性領域に至適ｐＨを有する通性
嫌気性のＮＡＤＨオキシダーゼ生産菌に由来するＮＡＤ
Ｈオキシダーゼの存在下に還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドを酸化して酸化型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドを再生させるに際し、エチレンジア
ミン四酢酸もしくはその塩を反応系に添加することを特
徴とする還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
の酸化方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2134292A JPH05219979A (ja) | 1992-02-06 | 1992-02-06 | Ｎａｄｈの酸化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2134292A JPH05219979A (ja) | 1992-02-06 | 1992-02-06 | Ｎａｄｈの酸化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05219979A true JPH05219979A (ja) | 1993-08-31 |
Family
ID=12052429
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2134292A Pending JPH05219979A (ja) | 1992-02-06 | 1992-02-06 | Ｎａｄｈの酸化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05219979A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004303601A (ja) * | 2003-03-31 | 2004-10-28 | Sharp Corp | エネルギー回収システム |
-
1992
- 1992-02-06 JP JP2134292A patent/JPH05219979A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004303601A (ja) * | 2003-03-31 | 2004-10-28 | Sharp Corp | エネルギー回収システム |
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