HU192892B - Process for preparing 2,5-diketo-d-gluconic acid reductase - Google Patents
Process for preparing 2,5-diketo-d-gluconic acid reductase Download PDFInfo
- Publication number
- HU192892B HU192892B HU844273A HU427384A HU192892B HU 192892 B HU192892 B HU 192892B HU 844273 A HU844273 A HU 844273A HU 427384 A HU427384 A HU 427384A HU 192892 B HU192892 B HU 192892B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- enzyme
- diketo
- gluconic acid
- keto
- activity
- Prior art date
Links
- RXMWXENJQAINCC-DMTCNVIQSA-N 2,5-didehydro-D-gluconic acid Chemical compound OCC(=O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)C(O)=O RXMWXENJQAINCC-DMTCNVIQSA-N 0.000 title claims abstract description 23
- RXMWXENJQAINCC-UHFFFAOYSA-N 2,5-diketo-D-gluconic acid Natural products OCC(=O)C(O)C(O)C(=O)C(O)=O RXMWXENJQAINCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 3
- VBUYCZFBVCCYFD-NUNKFHFFSA-N 2-dehydro-L-idonic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)C(O)=O VBUYCZFBVCCYFD-NUNKFHFFSA-N 0.000 claims abstract description 17
- LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N L-(-)-Sorbose Chemical compound OCC1(O)OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N 0.000 claims abstract description 15
- AWQIYVPBMVSGCL-PHDIDXHHSA-N 5-dehydro-D-fructose Chemical compound OCC(=O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)CO AWQIYVPBMVSGCL-PHDIDXHHSA-N 0.000 claims abstract description 11
- HDBDSFLMOWWRBQ-UHFFFAOYSA-N 5-fructonose Natural products OC1C(O)C2(O)COC1(O)CO2 HDBDSFLMOWWRBQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 98
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 98
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 62
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 28
- VBUYCZFBVCCYFD-UHFFFAOYSA-N D-arabino-2-Hexulosonic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(=O)C(O)=O VBUYCZFBVCCYFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 10
- 241000186249 Corynebacterium sp. Species 0.000 claims description 8
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 2
- 238000005185 salting out Methods 0.000 claims 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 abstract description 24
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 abstract description 19
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 abstract description 7
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 97
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 35
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 35
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 26
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 26
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 26
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 10
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 8
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 6
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 5
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 5
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 5
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 5
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 5
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 5
- 229950006191 gluconic acid Drugs 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- 108091007187 Reductases Proteins 0.000 description 4
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- VBUYCZFBVCCYFD-JJYYJPOSSA-N 2-dehydro-D-gluconic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)C(O)=O VBUYCZFBVCCYFD-JJYYJPOSSA-N 0.000 description 3
- IZSRJDGCGRAUAR-MROZADKFSA-N 5-dehydro-D-gluconic acid Chemical compound OCC(=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O IZSRJDGCGRAUAR-MROZADKFSA-N 0.000 description 3
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N D-gluconic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- JGBUYEVOKHLFID-UHFFFAOYSA-N gelred Chemical compound [I-].[I-].C=1C(N)=CC=C(C2=CC=C(N)C=C2[N+]=2CCCCCC(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)CCCCC[N+]=3C4=CC(N)=CC=C4C4=CC=C(N)C=C4C=3C=3C=CC=CC=3)C=1C=2C1=CC=CC=C1 JGBUYEVOKHLFID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000000852 hydrogen donor Substances 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DUHQIGLHYXLKAE-UHFFFAOYSA-N 3,3-dimethylglutaric acid Chemical compound OC(=O)CC(C)(C)CC(O)=O DUHQIGLHYXLKAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000007976 Ketosis Diseases 0.000 description 2
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 2
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 239000000386 donor Substances 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000000174 gluconic acid Substances 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N glutamic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 150000002584 ketoses Chemical class 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 2
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-N phthalic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C(O)=O XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- -1 which is essential Chemical compound 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-triazine Chemical compound C1=CN=NN=C1 JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTUDGPVTCYNYLK-UHFFFAOYSA-N 2,2-dimethylglutaric acid Chemical compound OC(=O)C(C)(C)CCC(O)=O BTUDGPVTCYNYLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VBUYCZFBVCCYFD-YVZJFKFKSA-N 2-dehydro-L-gluconic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(=O)C(O)=O VBUYCZFBVCCYFD-YVZJFKFKSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006173 Good's buffer Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical class CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007813 chromatographic assay Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N formic acid Substances OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000004682 monohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004816 paper chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000009938 salting Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 229940075554 sorbate Drugs 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 1
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/02—Monosaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/58—Aldonic, ketoaldonic or saccharic acids
- C12P7/60—2-Ketogulonic acid
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/843—Corynebacterium
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány tárgyát 2, 5-diketo-D-glükonsav-reduktaz előállítása képezi.
A fenti enzim redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foazfát jelenlétében katalizálja a 2, 5-diketo-D-glűkonsav redukcióját 2-keto-L-gulonsavvá, a C vitamin Biotermékévé. Az enzim katalizálja továbbá az 5-keto-D-fruktóz redukcióját L-szorbozzá.
A 2-kelo-L-gulonsav előállítását 2, 5-diketo-D-glükonsavból egy Corynebacterium nemzetséghez tartozó mikroorganizmus sejtkivonatait használva, ismerteti például a 00 88 408 számú európai szabadalmi leirás és a 2 116 549 számú brit szabadalmi leírás. Ezideig nem ismertették azonban, hogy egy tisztított enzim a fenti két enzimhatással rendelkezik és ehhez általában redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát szükséges.
A találmány célját tehát az új 2, 5-diketo-D-glükonBav-reduktáz előállítása képezi.
A találmány másik célja eljárás kidolgozása az új 2, 5-diketo-D-glükonsav-reduktáz előállítására.
A találmány szerint előáUitott 2, 5-diketo-D-glükonsav-reduktáz a kővetkező fizikai- kém iái tulajdonságokkal rendelkezik:
a) enzimaktivitás: katalizálás redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát mint koenzim jelenlétében,
i) 2, 5-diketo-D-glükonsavnak vagy BÓinak a redukciója 2-keto-L-gulonsavvá vagy megfelelő eói-. vá, és ii) 5-keto-D-fruktóz redukciója L szorbózzá,
b) fajlagosság a szubsztrátumokra: az enzim fajlagos a 2, 5-diketo-D-glükonsavra és az 5-keto-D-fruktózra, c, optimális pH-érték: pH = 6-7,
d) pH-stabilitás: pH = 5-7, e, molekulasúly: 29.000±2.000,
f) izoelektromos pont: pH = 4,4+0,3.
A találmány tárgyát képezi az eljárás az új enzim előállítására a Corynebacterium nemzetséghez tartozó mikroorganizmus feltárt sejtjeiből izolálva.
Tanulmányozva azokat az enzimeket, amelyek a 2, 5-diketo-D-glükonsvat redukálják és amelyeket számos 2-keto-L-gulonsavat termelő mikroorganizmus hordoz, a jelen találmány feltalálói azt találták, hogy a Corynebacterium nemzetséghez tartozó 2-keto-L-gulonsavat termelő törzsből előállított 2, 5-diketo-D-glükonsav-reduktáz redukált nikotinaraid-adenin-dinukleotid-foezfát jelenlétében i) redukálja a 2, 5-diketo-D-glükonsavat 2-keto-L-gulonsavvá, és ii) redukálja az 5-kelo-D-fruktózt L-szorbózzé. A feltalálók kiegészítették továbbá a találmány szerinti eljárást azzal, hogy sikerrel izolálták és tisztították az új enzimet, amely még nem ismertetett hatásokkal rendelkezik (az, hogy ősszefórhetően fejti ki mindkét hatást, kiváltképpen eddig még nem ismert felfedezés).
Az enzim bár, a 2, 5-diketo-D-glükonsavra és az 5-keto-D-fruktózra fejt ki enzimaktivitást, nem redukálja az 5-keto-D-gIűkonsavat, amelynél igencsak ketocsoport van az 5-helyzetben és ez közös a két szubsztrátumnál. Sőt, az enzim nem mutat redukáló hatást sem ketózokra, igy a D-fruktózra és L-szorbózra, amelyek a terminális alkoholos hidroxicsoporttal szomszédos ketocsoportot tartalmaznak, sem a 2-keto-L-gulonsavra vagy a 2-keto-D-glűkonsavra.
Az enzim sejten belüli enzim, amit a Corynebacterium nemzetséghez tartozó, 2-keto-L-gulonsavat termelő törzs sejtjeiből vonunk ki. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható mikroorganizmus például a Corynebacterium ep. No. 20A-77, ATCC 31 090, FERM-P 2 770, egyike a Corynebacterium nemzetséghez tartozó 2-keto-L-glükonsavat termelő törzseknek és egy ebből a törzsből származó mutáns például egy olyan mutáns, amely az 5-keto-D-glűkonsavat tökéletlenül metabolizálja, így a FERM-BP 108. A Corynebacterium sp. No. T-13, ATCC 31 089, Corynebacterium sp. No. K-106, ATCC 31 088 és az ezekből a törzsekből származó bármely mutáns ugyancsak alkalmazható enzimforrésként.
A mikroorganizmusok deponálási helye a feltalálók által: Fermentation Research Institute, Yatabe, Japán, mint FERM-Ps vagy FERM-ΒΡβ és/vagy az American Type Culture Collection, Maryland, U.S.A. mint ATCC-k, és minták kaphatók ezekből a raktárakból a budapesti szerződés rendelkezése alapján.
A No. 20A-77, T-13 és K-106 törzsek részletes taxonómiai ismertetései megtalálhatók például a 3 959 076 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, és az induktív mutáció módszerét FERM-BP 108 törzzsé az eredeti 20A-77 törzsből részletesen ismerteti például a 0 088 408 számú európai szabadalmi leírás.
A találmány szerinti 2, 5-diketo-D-glűkonsav-reduktéz előállítására szolgáló, 2-keto-L-gulonsavat termelő törzsek szaporítására használt tápközeg összetételét nem korlátozzuk különösebben. A tápközeg célszerűen tartalmazzon szénforrásokat, nitrogénforrásokat, más szervetlen sókat és a törzsek által asszimilálható más elemek nyom-mennyiségeit. Szénforrásként cukrok, így D-glűkóz és szacharóz, szerves savak, így glükonsav, glicerin és hasonlók használhatók 1-3%-os vizes közegben. Nitrogénforrásként pepton, kukoricalekvár és hasonlók alkalmazhatók 0,5-5%-ban. Használhatunk még a szaporításhoz foszfátot, amely lényeges, magnéziumáét, vitamint és más fémsók nyommennyiségeit. A táptalajt beoltjuk a fentemlített, 2-keto-L-gulonsavat termelő törzzsel, és ezt a tenyészetet a mikroorganizmus elszaporítása céljából 15-30 órán ét 25-35 °C-on inkubáljuk.
Az alábbiakban ismertetünk egy lehetséges eljárást a sejten belüli enzim kivonására a mikroorganizmusból a tenyésztés után. Először a sejteket kicentrifugáljuk a tápközegből, majd a sejteket vízzel, fiziológiás sóoldattal vagy egy megfelelő pH-órtékű pufferoldattal mossuk. A mosott sejteket egy megfelelő pH-értékű pufferoldatban szuszpendáljuk és ultrahanggal, nyomással (french-press) vagy egy enzimmel (lizozimmal) végzett kezeléeBel feltárjuk. Ezt kővetően az elegyet centrifugáljuk, igy az oldatból eltávolítjuk az ép Bejteket és a sejttörmeléket, és kapunk egy felülúszó réezt, ez a nyers enzimoldat. A nyers enzimoldathoz ammónium-BZulfátot adva az enzimet kisózzuk (30-70% telítettségű frakció).
A kisózott terméket feloldjuk egy pufferban, amit célszerűen úgy készítünk el, hogy az enzimet ne inaktiválja, és az oldatot a visszamaradt ammónium-szulfát eltávolítása céljából dialízisnek „alávetjük. Ezután az enzimoldatot tisztítási eljárásnak (vagy eljárásoknak), igy ioncserélő kromatográfiának és affinitás-kromatográfiának alávetjük, így egyetlen komponensként kapjuk a tisztított 2, 5-diketo-D-glükonsav-reduktázt.
A tisztított 2, 5-diketo-D-glükonsav-reduktáz alábbi fizikai-kémiai tulajdonságait állapítottuk meg:
1) Aktivitás
2, 5-diketo-D-glűkoneav + redukált nikotinaraid-adenin-dinukleotid-foszfát + H*
2-keto-L-gulonsav + nikotinamid-adenin-dinukleotid-foazfát (NADP')
5-keto-D-fruktóz + redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát + H' L-szorbóz + nikotinamid-adenin-dinukleotid-foezfát (NADP*)
Amint az látható a fenti reakcióban donorként a redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfótot használjuk. Redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid ugyancsak használható donorként a fenti reakcióban, de ebben az esetben a reakciósebesség 1/250 arányban vagy ennél kisebbre csökken, a redukált nikotinaraid-adenin-dinukleotid-foszfátot alkalmazó reakcióval összehasonlítva.
2) Fajlagosság a szubsztrátumokra
Az enzim fajlagosságot mutat 2, 5-diketo-D-glükoneavra és 5-keto-D-fruktózra. Az enzim azonban nem redukálja az 5-kelo-D-glükonsavat, ami a fenti két szubsztrátummal hasonlóságot mutat és nem mutat redukáló hatást olyan ketózokra, amelyek a terminális alkoholos hidroxicsoporttal szomszédos ketocsoportot tartalmaznak, mint például a D -fruktóz és L-szorbóz, valamint olyan vegyülelekre, amelyek egy ketocsoportot tartalmaznak a 2-helyzetben, mint például a 2-keto-L-gulonsav és a 2-ketoD-glükonsav.
2, 5-diketo-D-glükonsov vagy 5-keto-D-fruktóz lényeges termelését 2-keto-L-gulonsavból, illetve L-szorbózból nikotinamid-adenin-dinukleotid-foezfát vagy nikolinamid-adenin-dinukleotid jelenlétében nem tapasztaltuk.
3) Optimális pH pH = 6-7
4) pH-Stabilitás pH = 5-7 (meghatározva a maradék-aktivitások alapján, a következő kezelések után: 0,1 mólos dimetil-glutársav pufferral 4-5 pH-értéken, 0,1 mólos Good pufferral (PIPES) 6-7 pH-értéken és 0,1 mólos trisz-HCl pufferral 8-9 pH-értéken, 28 ’C-on 30 percig kezelve. 70% vagy ennél több maradék-aktivitást tapasztaltunk 5-7 pH-értéken, mig csak 30%-ot vagy ennél kevesebbet 4 pH-értéken vagy ez alatt és 8 pH-értéken vagy e felett.
5) Az enzimaktivitás mérése
Az enzimaktivitást spektrofotometriálisan mérjük az abszorpció csökkenése - alapján 340 nm-en, ami összhangban van a redukált nikotinaniid-adenin-dinukleotid-foszfát oxidációjával, mint az enzimreakció mértékével, 30 ’C-on, 0,1 mólos trisz-pufferban (pH = 7), amely 0,1 mmól redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfátot és 3,3 mmól 2, 5-dikelo-D-glükonsav-kalciumsót tartalmaz. Az enzimaktivitás egysége az a mennyiség, ami 1 perc alatt 1 μτηόΐ redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foezfátot oxidál.
6) A reakció hőmérséklettartománya 25-45 ’C
7) A pH-érték és a hőmérséklet inaktiválási körülményei
Az aktivitásnak 96%-a vagy még nagyobb része elvész, ha az enzimet 28 üŰ-on 2 órán át 4 pH-értéken vagy ez alatt vagy 8 pH-értéken vagy efelett tartjuk.
8) Inhibitorhatás, aktiválás és stabilizálás Az enzimre inhibitorhatásBal van az oxalát és kis mértékben a glicerinaldehid. Az enzim aktivitása Mg vagy Mn hozzáadására észrevehetően nem nő. Az enzimet glicerinnel nagy koncentrációban (30-50%) vagy szacharózzal (1 mólos) stabilizáljuk.
9) Molekulasúly 29.000±2.000 (SDS-poliakrilamid elektroforézissel és gélszűréssel mérve).
10) Izoelektromos pont 4,4±0,3 pH-értéken (izoelektromos pont-elektroforézisBel mérve).
11) Km-érték (Michaelis konstans)
19289
2,2±1,5 mmól (2, 5-diketo-D-glükonsav szubsztrátum 0,1 mólos trisz-pufferban (pH = 7) 30 ’C-on).
A találmány szerinti 2, 5-diketo-D-glükonsav-reduktáz igénybevehető olyan alkalmazási területeken, ahol az ismertetett enzimhatás megmutatkozik. Így 2-keto-L-gulonsav és L-szorbóz állítható elő 2, 5-diketo-D-glükonsavból, illletve 5-keto-D-fruktózból, redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát koenzim jelenlétében. 2-keto-L-gulonsav előállítása esetében például a reakció általában 25-45 ’C hőmérsékleten és 67 pH-értéken megy végbe. A reakcióban résztvevő szubsztrátum, a 2, 5-diketo-D-glükoneav moláris koncentrációja azonos hidrogén-donor, a redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfétéval, és az enzimreakciókkal kapcsolatos általános ismeretek alapján meghatározható. A reakcióhoz megfelel a 20-200) mmól moláris koncentrációtartomény.
Az enzimet a szubsztrátummal előnyösen 0,5-5,0 egység/ml koncentrációhatárok között reagáltaljuk. Az enzimet a reakcióban egy megfelelő hordozóhoz rögzített állapotban is használhatjuk. Az enzim rögzítésére általában alkalmazható a szakirodalomból ismert bármely módszer. így például az enzim közvetlenül kapcsolható egy membránhoz, funkciós csoporttal (csoportokkal) rendelkező gyanta granulátumaihoz vagy hasonlókhoz vagy kapcsolható a gyantához bifunkciós csoporttal (csoportokkal) rendelkező vegyületeken, például glutáraldehiden keresztül.
Az enzimreakció időtartamára különösebb korlátozást nem adunk meg, de 30 ’C-on 60120 perc alatt végzett reakcióban a 2, 5-diketo-D-glükoneav szubsztrátumnak 90%-a vagy ennél nagyobb része redukálható 2- ke to- L-gulqnsavvá.
A találmány szerinti eljárást közelebbről az alábbi példákkal szemléltetjük.
A példákban alkalmazott rövidítések: 25DKG = 2, 5-diketo-D-glükonsav;
5KF = 5-keto-D-fruktóz;
NADPH = redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát;
2KLG = 2-keto-L-gulonsav;
NADH = redukált nikotinamid-adenin-dinukleolid
j. példa
1) Sejttenyésztés
1) tápközeg az előtenyésztéshez ml alábbi összetételű tápközeget
500 ml-es lombikba tesszük és 120 ’C-on 15 percig sterilizáljuk:
| D-glükóz | 1.0% |
| É lesztőkivonat (Difco) | 0.5% |
| Bacto-pepton (Difco) | 0.5% |
| NaNOj | 0.1% |
KHjPO, 0.1%
MgSO«.7HjO 0.02% pH = 7
II) Tápközeg a tenyésztéshez liter alábbi összetételű tápközeget 50 ppm (rész a millióban) habzásgátlóval (polipropilénglikol P-2000) 30 literes fermentoredénybe teezűnk és 120 ’C-on 20 percig sterilizáljuk:
| D-glükóz | 2.0% |
| Kukoricalekvár | 3.0% |
| É lesztőkivonat | 0.1% |
| NaNOi | 0.3% |
| KHaPO, | 0.06% |
| pH = 7.2 | |
| III) Tenyésztés |
Tíz elótenyészeti tápközeget beoltunk a No. 20A-77 Corynebacterium sp. mutánsának (FERM-BP 108) egy kacsnyi menynyiségével, és rézógépen (amplitúdó- 71 mm, 270 ford./perc) 28 ’C-on 18 órán át inkubálva rázott tenyészetet készítünk. A tíz inkubáll tápközeget étoltjuk a szaporításhoz szolgáló tápközegre, amint 28 ’C-on 22 órán át 0,5 térf./térf./perc levegőáramlás 400 ford./perc keveréssel tenyésztünk. (OD = optikai sűrűség = 19).
2) Az enzim kivonása
Az inkubált tápközegból az 1) rész szerint kapott sejteket kicentrifugáljuk (Sharpless centrifuga, 10 000 g, 10 perc) és 0.1 mólos, 7.0 pH-értékre beállított trisz-pufferral mossuk (hasonló triez-puffert használunk a továbbiakban is, ha másképpen nem jelezzük). A mosott sejteket 0,1 mólos trisz-pufferban szuszpendáljuk, ügy, hogy a szuszpenzió OD-érléke 150 legyen, és a sejteket ultrahanggal feltárjuk (160 watt/80 ml, 7 perc). Az el nem roncsolt sejteket és a sejttőrmeléket az ultrahangos feltárásnak alávetett oldatból kicentrifugáljuk (15.000 g, 30 perc), így körülbelül 1 liter felülúszó részt kapunk (protein = 10,3 mg/ml, 25DKG-reduktáz = 0,63 egység/ml).
3) Az enzim tisztítása
Az egész alábbi eljárást 4 ’C-on vagy ez elatti hőmérsékleten végezzük.
I) Frakcionális ammónium-szulfáttal
A 2) rész ezerint kapott felülúszóhoz 30%-os telítettségig ammónium-szulfátot adunk, és a kisózott terméket kicentrifugáljuk (10.000 g, 10 perc). Az így kapott felülüezóhoz 70%-os telítettségig ammónium-szulfátot adunk, jéggel körülbelül 1 órán át hűljük és a kicsapódott proteint kicentrifugáljuk (10.000 g, 10 perc). A proteint 200 ml
0,1 mólos trisz-pufferban feloldjuk és az oldatot éjszakán át 0,02 mólos trisz-pufferral dializáljuk.
II) Ioncserélő kromatográfia
A fenti i) rész ezerint kapott dializált oldatot (250 ml, 13,6 mg/ml protein) DEAE-Sepharose CL-6B oszlopra (Pharmacia Finecheraicals Co.) visszük ós az alábbi körülmények között kromatografáljuk:
oszlopméret: 1,6x30 cm, kiegyensúlyozó folyadék 0,02 mólos trisz-puffer, eluens: 0,02 mólos trisz-puffer (pH = 7,0) (200 ml)
0,15 mólos nátrium-klorid/0,02 mólos trisz-puffer (pH = 7,0) (300 ml)
0,25 mólos nátrium-klorid/0,02 mólos trisz-puffer (pH = 7,0) (200 ml).
Az eluátumból 5 ml-es frakciókat szedünk és minden egyes frakció enzimaktivitását megmérjük Ca-25DKG és 5KF szubsztrátumokra (a mérési módot az 5.)ii) részben fogjuk ismertetni). Ennek eredményeképpen mindkét szubsztrátumra észleltünk enzimaktivitást a 0,25 mólos nátrium-klorid/0,02 mólos trisz-pufferral eluált eluátum 80 ml-ében.
Ezután az eluátumhoz a protein kisózása céljából 70%-os telítettségig ammónium-szulfátot adunk, a kisózott terméket 30 ml 0,1 mólos trisz-pufferban feloldjuk és 4 ’Con éjszakán át 0,02 mólos trisz-pufferral dializáljuk.
III) Affinitás-kroraatográfia
A 3.)ii) rész ezerint kapott dializált oldatot Amicon Mátrix Gél Red A oszlopra (Amicon Far East Limited gyártmánya) viszszük, amit előzetesen 0,02 mólos trisz-pufferral (pH = 7,0) egyensúlyba hoztunk, és az alábbi körülmények között kromatografáljuk:
oszlopmáret: 1,6x19 cm, mosófolyadék:
0,4 mólos nátrium-klorid/0,02 biólos trisz-puffer (pH = 7,0) (400 ml), eluens: 0,5 mólos nátrium-klorid/0,02 mólos trisz-puffer (pH = 7,0) (450 ml)
0,7 mólos nátrium-klorid/0,02 mólos trisz-puffer (pH = 7,0) (150 ml) mólos nátriuin-klorid/0,02 mólos trisz-puffer (pH = 7,0) (300 ml).
Az enzimaktivitást megmérjük a megfelelő 5 ml-ee frakciókból a 3.)ii) részben említettek szerint. Enzimaktivitást észleltünk mindkét szubsztrátumra, vagyis a 25DKG ée 5KF szubsztráturaokra, a 0,7 mólos- 1 mólos nátrium-klorid/0,02 mólos trisz-pufferral (pH = 7,0) eluált 18 frakcióban. Az egyesített aktív frakciókhoz (90 ml) az oldat nátrium-klorid tartalmának csökkentése céljából 225 ml 0,02 mólos triaz-puffert (pH = 7,0) adunk, és a keveréket iemét Amicon Mátrix Gél Red A oszlopra (1,9x13 cm) viszzük. Az oszlopot 120 ml 0,2 mólos nátrium-klorid/0,02 mólos trisz-pufferral (pH = 7,0) mossuk és 0,5 mmól NADPH-ot és 0,2 mól nátrium-kloridot tartalmazó 150 ml 0,02 mólos trisz-pufferral (pH = 0,7) eluáljuk. Az eluátumot 5 ml-es frakciókra osztjuk és enzimaktivitásukat a fenti módon megmérjük. Ennek eredményeképpen azt találtuk, hogy a nagy enzimaktivitású frakciók (körülbelül 35 ml) azokban a frakciókban voltak (körülbelül 70 ml), amelyeket 0,5 mmól NADPH-ot és 0,2 mól nátrium-kloridot tartalmazó 0,02 mólos trisz-pufferral eluáltunk.
IV) Az enzim koncentrálása és a NADPH eltávolítása
A iii) rész szerint kapott eluátumhoz 30%-os telítettségig ammónium-szulfátot adunk és ezt követően Phenyl Sepharose CL-4B oszlopra (0,9x3 cm, Pharmacia Fine Chemicals Co. gyártmánya) visszük, amit előzetesen 30%-os telítettségig ammónium-szulfátot tartalmazó 0,02 mólos trisz-pufferral egyensúlyba hoztunk. Az oszlopot a NADPH tökéletes eltávolítása céljából 30%-os telítettségben ammónium-BZulfátot tartalmazó 0,02 mólos trisz-pufferral mossuk. Az eltávolítást a 340 nm-es mért abszorpció igazolja. Az oszlopon lévő enzimet 0,02 mólos trisz-pufferral, 1 ml-es frakciókat szedve eluáljuk. Ezeknek a frakcióknak az enzimaktivitásál megmérve, nagy aktivitást észleltünk négy frakcióban. A négy frakciót egyesítve tisztított enzimoldatot kapunk ós ezt használjuk a következő mérésekhez. Az oldat 54 egység/ml 25DKG-reduktáz aktivitást mutat, proteintarlalma 0,58 mg/ml.
4) A tisztított enzimoldal tisztasága
A 3) fejezet szerint előállított 2-5 pl tisztított enzimoldatot SDS-poliakril-amid-gélelektroforézissel (elválasztó gél: 10%-os akrilamid, az elektroforézis körülményei: 40 mA, szobahőmérsékleten, 1 órán át) analizáljuk, amikoris az enzim egyetlen sávot ad a 29.000±2.000 molekasúlynak megfelelő helyen. A továbbiakban gélszűréssel analízist végezve (Sephadex G-100), a 29.000±2.000 molekulasúlynak megfelelő frakciókban enzimaktivitást észlelünk.
Ezután 5 pl enzimoldalot izoelektromos pont-elektroforézisnek vetünk alá (a gél poliakrilamid, az elektroforézis körülményei: a) 2,5-5 pH-tartomány, anódelektrolit 0,1 mólos kénsav, katódelektrolit 0,1 mólos nátrium-hidroxid, 6 W, 2.700 Wh;
b) 4,0-6,5 pH-tartomány, anódelektrolit 0,04 mólos DL-glutaminsav, katódelektrolit 0,2 mólos nátrium-hidroxid, 25 W, 2.600 Wh, a hőmérséklet 18-20 °C. Az elektroforézis eredményeképpen az enzim egyetlen sávban vándorol, ami 4,4±0,2 pH-értéknek felel meg. A fentiekben ismertetett adatok megerősítik, hogy a tisztított enzimoldat egyedül 25DKG— -reduktázt tartalmaz.
-510 ί
5) Λ fizikai-kémiai tulajdonságok mérése
I) Enzimreakció μΐ 3) szerint kapott tisztított enzimoldatot 25 jumól szubsztrátummal (Ca-25DKG vagy 5KF) és 15 μ mól NADPH-ot tartalmazó 3,0 ml 0,01 mólos trisz-pufferral (pH = 7) keverünk, és a keveréket 30 ’C-on 60 percig reagáltatjuk. A reakció befejeződése után a reakciókeveréket papirkromatográfiával (kifejlesztő oldószer! fenol-hangyasav-viz, 75:4:25, előhívás az úgynevezett AHF-oldattal, amit úgy készítünk, hogy 0,93 g aniíint és 1,66 g ftálsavat 100 ml, vízzel telített n-butanolban feloldunk, és az oldatot r 105 C-on 2 percig melegítjük) és gázkromaJ tográfiával (oszlop: SE-52, vivögáz: hélium, minta: trimetil-szililezelt származék) analizáljuk. Az analízisek eredményeképpen mindkét kromatográfiás vizsgálatnál azt találtuk, hogy a 25DKG-ból csak 2KLG és az 5KF-ból csak L-szorbóz képződik. Az 1. táblázat a termékek gázkromatográfiás kvantitatív vizsgálatának az eredményeit tünteti fel.
1. táblázat
25DKG ás 5KF redukciója tisztított enzimoldattal
| Szubeztrátum | Termek | A termék koncentrációja |
| Ca-25DKG | Ca-2KLG | 845 μΐ/ml |
| 5KF | L-szorbóz | 795 μΐ/ml |
II) Fajlagosság a szubsztrétumra
0,3 μ mól NADPH-ot tartalmazó 2,9 ml 0,1 mólos trisz-puffert (pH-7) 1 cm optikai hosszúságú kvarc küvettába teszünk és 1-5 μΐ, a 3) rész ezerint előállított enzimoldatot adunk hozzá. Az így kapott keverékhez adjuk a különböző ezubsztrátumok 0,1 mólos oldatainak 0,1 ml-ét, a reakciókeveréket 30 ’C hőmérsékleten tartva. Az enzim reaktivitását az illető szubsztrétumra a 340 nm-en mért abszorpció csökkenésének folyamatos mérésével határozzuk meg, az 1 perc alatt végbemenő csökkenés alapján. A mérés eredményeit a 2. táblázat szemlélteti.
2. táblázat
A 25DKG-reduktáz fajlagossága különböző szubsztrátumokra
Szubeztrátum
A tisztított enzimoldat (1 ml) aktivitása
Ca—25DKG 54 egység 5KF 94 egység Κ-5-keto-glükonát 0 egység D-fruktóz 0 egység L-szorbóz Q egység Ca-2-keto-D-glükonát 0 egység Na—2KLG 0 egység
A fenti táblázatból nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti enzim nagy aktivitást mutat 25DKG-ra és 5KF-ra, de egyáltalán nem gyakorol redukáló hatást 5-keto-D-glükonsavra, D-fruktózra, L-szorbózra, 2-keto-D-glükonsavra és 2KLG-ra.
III) Koenzim (hidrogén-donor)
Az 5)ii) szerinti reakciórendszerben a NADPH-ot NADH-dal helyettesítjük, és a 25DKG-reduktáz enzimaktivitását mérjük Ca-25DKG és 5KF szubsztrátumokra. Az eredményeket a 3. táblázat szemlélteti.
-612
3. táblázat
A koenzimek hatása a 25DKG-reduktáz aktivitására
| Szubsztrátum | E nzimaktivitás (egység/l ml tisztított enzimoldat) | ||
| Koenzim: | NADPH | NADH | |
| Ca-25DKG | 54 | 0.2> | |
| 5KF | 94 | 0.2> |
Amint az a fenti táblázatból látható, a találmány szerinti enzim 54 egység/1 ml tisztított enzimoldat enzimaktivitást mutat Ca-25DKG-ra, ha az enzimet NADPH-tal használjuk, mig csupán 0,2 egység vagy ennél kieebb enzimaktivitást mutat NADH-dal kombinálva. Hasonlóképpen csökken az 5KF-ra NADPH-tal mért 94 egység aktivitás 0,2 egységre vagy ennél kisebbre NADH-dal.
IV) Optimális pH-érték
Abból a célból, hogy tisztázzuk az őszezefüggést a 25DKG-reduktáz reakciósebessége és a pH-érték között, az enzimaktivitást az 5)ii) reakciórendszerben használt puffer helyett a következő pufferokat alkalmazva mérjük:
pH = 4,0-5,0: 0,1 mólos 3, 3-dimetil-glutársav puffer, pH - 6,0-7,0: 0,1 Mólos Good-puffer (PIPES = piperazin-N, N-bisz(2-etán)-szulfonsav), pH = 7,0-9,0: 0,1 mólos trisz-puffer.
A Ca-25DKG és 5KF szubszlrátumokra a megfelelő pH-értékeken mért enzimaktivitások eredményeit a 4. táblázat szemlélteti.
4. táblázat
A 25DKG-reduklsz aktivitása és a pH-érték az enzimreakcióban pH Puffer Enzimek tivitása> (egység/ml)
Szubsztrátum: Ca-25DKG 5KF
| 4.0 | 3, 3-dimetil-glutársav | 1 | 2 |
| 5.0 | 3, 3-dimetil-glutársav | 22 | 33 |
| 6.0 | Good (PIPES) | 59 | 96 |
| 6.5 | Good (PIPES) | 57 | 95 |
| 7.0 | Good (PIPES) | 53 | 92 |
| 7.0 | Trisz | 54 | 93 |
| 7.5 | Trisz | 44 | 68 |
| 8.0 | Trisz | 32 | 48 |
| 8.5 | Trisz | 11 | 27 |
| 9.0 | Trisz | 7 | 13 |
a) Enzimaktivitás: egység/l ml tisztított enzimoldat
A fenti táblázatból világosan látszik, hogy az enzim a legnagyobb enzimaktivitást
6-7 pH-értéken mutatja.
V) Az aktivitás összefüggése a hőmérséklettel
Az 5)ii) reakciórendszerben Ca-25DKG szubsztrátumot alkalmazva mérjük a rekció mértékét 15 °C és 50 °C közötti, változó hőmérsékleten. Az eredményeket az 5. táblázat szemlélteti.
5. táblázat
A 25DKG-reduktáz aktivitása és a hőmérséklet közötti összefüggés
Hőmérséklet (°C)
Enzimaktivitás* (egység/ml)
14
29
-Ί14
Hőmérséklet (’C)
Enzimaktivitás1 (ogyaég/ml)
27.5 44
54
32.5 59
64
67
44
10 * Enzimaktivitás: 1 ml tisztított enzimoldat aktivitása Ca-25DKG szubsztrátumra 7 pH-értéken.
Amint az a táblázatból kitűnik, a találmány szerinti enzim aktivitása nó a hőmérséklet növekedésével 40 ’C-ig, de növelve a hőmérsékletet 45 ’C-ra és még magasabbra, az aktivitás csökken.
VI) A Km-érték mérése
A fenti 5)ii) eljárás szerint mérjük a redukciós reakciók sebességét a Ca-25DKG különböző, 0,01 mól és 0,25 mól közötti koncentrációval, s így meghatározzuk a 25DKGKM-értékét. A mérések eredményeképpen azt találjuk, hogy a Km-érték l,8±l,0 mmól.
2. példa
1) Sejttenyésztés
I) Tápközeg a tenyésztéshez liter alábbi összetételű tépközeget 20 literes fermentor-edónybe helyezünk és 120 ’C-on 20 percig sterilizáljuk:
| D-glükóz | 1.0% |
| Kukoricalekvár | 1.0% |
| É lszetőkivonat (Difco) | 0.2% |
| Pepton (Difco) | 0.5% |
| KHjPO« | 0.1% |
| MgSO«.7HjO | 0.02% |
| pH = 7 |
II) Tenyésztés 15
Az 1. példa 1) része szerinti tápközeggel és az olt ismertetett módon két-két előtenyészetet készítünk a Corynebacterium sp. No. K-106 (ATCC 31 088, rövidítve K-106) és a Corynebacterium sp. No. T-13 (ATCC 31 089, rövidítve T-13) baktériumokhoz.
A fenti elótenyészeteket átoltjuk az i) rész szerint készített tápközegbe és 0,5 térf./térf./perc levegőztetéssel és 400 ford/perc keverés mellett 28 ’C-on 18 órán át tenyésztjük. A tenyésztés végén a sejtek mennyisége optikai sűrűségben (OD) megadva, a következő: a K-106 törzsre
OD - 11,8; a T-13 törzsre OD = 12,2.
2) Az enzim kivonása
A K-106 és T-13 törzsekről 0,02 mólos trisz-pufferban (pH = 7,0) OD = 150 sürűsé55 gű sejtszuszpenziót készítünk, a tenyészetből centrifugálással elkülönített sejteket az
1. példának 2) része szerint mosva. A szuszpenziókban lévő sejteket (700 kg/cmJ) nyomást alkalmazva (French prees) elroncsoljuk. A sejteket tartalmazó oldatokat centrifugáljuk (15.000 g, 30 perc), amint azt az 1. példa 2) részében ismertettük, s így a még ép sejteket és a sejttőrmeléket eltávolítjuk. A sejtkivonatokat így a következő enzimakliviláso45 kát mutatják:
| Törzs | A kivonat mennyisége | Protein | A 25DKG reduktáz aktivitása |
| K-106 | 400 ml | 10 mg/ml | 2.1 egysóg/ml |
| T-13 | 400 ml | 12 mg/ml | 2.0 egyeég/ml |
3) Az enzim tisztítása
I) Kisózás ammóniura-szulfáttal
A 30-70%-os telítettségig ammónium-szulfáttal kisózott frakcióknak megfelelő proteineket az 1. példa 3) része szerint elkülönítjük, majd 0,02 mólos trisz-pufferban feloldjuk, és az oldatokat 4 ’C-on éjszakán át 0,02 mólos trisz-pufferral dializáljuk. A dinlizált oldatok enzimaktivitása a következő:
| Törzs | Az enzimoldatok mennyisége | Protein | A 25DKG-reduktóz aktivitása | |
| K-106 | 74 ml | . nem vizsgáltuk | 7.0 egyeég/ml | |
| T-13 | 88 ml | 11.1 rag/ml | 4.8 egyeég/ml |
-816
19289
II) Ioncserélő kromatográfia
Az enzimoldatokal az 1. példa 3)ii) részében leírt módon kezeljük. Λζ így kapott eluátumok enzimaktivit. ísa a következő:
| Törzs | Az enzimoldatok mennyisége | Protein | A 25DKG-reduktóz aktivitása | |
| K-106 | 49 ml | 0.60 mg/ml | 2.4 egység/ml | |
| T-13 | 52 ml | 0.94 mg/ml | 4.1 egység/ml |
III) AffinitáB-kromatográfia
A fenti ii) rész szerint kapott mindkét eluátumhoz 30%-os telítettségig ammónium-szulfátot adunk, és az enzimeket az
1. példa 3)iv) részben leírtak szerint Phenyl Sepharose gól oszlopon kromatografálva koncentráljuk és sómentesítjük. A koncentrált enzimoldatokat az 1. példa 3)iii) részében leírtak szerint Amicon Mátrix Gél Red A oszlopon affinitás-kromatográfíával kétszer tisztítjuk. A mindkét törzsből származó 25DKG-reduktázt frakciókat szedve eluáljuk, az eluens 0,7-1 mólos nátrium-klorid az első kromatografálásnál és 0,5 mmöl NADPH-t tartalmazó fenti eluens a második kromatografálésnál.
Az eluátumokat az 1. példa 3)iv) részében leírtak szerint a NADPH eltávolítása után sómentesítjük és koncentráljuk. Ennek eredményeképpen a tisztított enzimoldatok a következő aktivitásokkal rendelkeznek:
| Törzs | Az enzimoldatok mennyisége | ' Protein | A 25DKG-reduktáz aktivitása |
| K-106 | kb. 1 ml | 0.25 mg/ml | 23.8 egység/ml |
| T-13 | kb. 2 ml | 0.17 mg/ml | 15.1 egység/ml |
Az így kapott enzimoldatok 2-10 pl mennyiségeit az 1. példa 4) részében leírtak szerint SDS-poliakrilamid-gélelektroforézissel és izoelektromos pont-elektroforózissel vizsgáljuk. Mindkét enzim egyetlen sávot mutat. A tisztított enzimoldatokból a következő jellemzőket határozzuk meg.
4) Az enzimek fizikai-kémiai tulajdonságai
A fizikai-kémiai tulajdonságok mérését az 1. példa 4)-5) részei szerint végezzük.
I) Molekulasúly
A molekulasúly meghatározását SDS-poliakrilamid-gélelektroforézissel végezzük. Azl találjuk, hogy mind a K-106, mind a T-13 törzsből származó 25DKG-reduktáz molekulasúlya 29.000±2.000.
II) Izoelektromos pont
A K-106 és T-13 törzsekből ezármazó enzimek izoelektromos pont-elektroforézisének eredményeképpen az izoelektromos pontok 4,4±0,2 illetve 4,5±0,2 pH-órtéken vannak.
III) Fajlagosság a szubsztrátumra
Mindkét enzim csak Ca-2KLG-at termel
Ca-25DKG-ból és csak L-szorbózt 5KF-ból. Semmit sem termelnek az 5-keto-D-glükonsav, D-fruktóz, L-szorbóz, 2-KLG és 2-keto-Dglükonsav szubsztrátuinokból.
IV) Enzimaktivitás
A K-106 törzsből származó enzim aktivitása Ca-25DKG-ra 23,8 egység/ml (95 egység/mg protein) ée az 5KF-ra 38,3 egység/ml (152 egység/mg protein). A T-13 törzsből származó enzim aktivitása azonban Ca-25DKG45 ra 15,1 egység/ml (89 egység/mg protein) és 5KF-ra 39 egység/ml (229 egység/mg protein).
V) Koenzim (hidrogén-donor)
Mindkét enzim enzimaklivitását mérve Ca-25DKG-ra koenzimként NADH-ot használva, azt találtuk, hogy az aktivitás minden esetben 0,1 egység/ml vagy ennél kisebb.
VI) Optimális pH-érték
A K-106 éa T-13 törzsekből kapott 25DKG-reduktázok enzimaktivitásait mérjük θθ különböző, 4-9 pH közötti, változó értékeken. A szubsztrátum Ca-25DKG, a hőmérséklet 30 ’C. Az eredményeket a 6. táblázat szemlélteti.
-918
6. táblázat
A K-106 és T-13 törzsekből kapott 25DKG-reduktezok enzimaktivitásai és az enzimreakciók pH-értékei 5
| pH | Enziin- aktivitás K-106 | (relatív aktivitás)* T-13 |
| 4.0 | 1 | 1 |
| 5.0 | 48 | 65 |
| 6.0 | 103 | 104 |
| 7.0 | 100 | 100 |
| 8.0 | 70 | 64 |
| 9.0 | 6 | 19 |
» Az aktivitást minden egyes pH-értéken azon az alapon definiáljuk, hogy az aktivitás = 100 7 pH-értéken és 30 °C-on.
A fenti táblázatból látható, hogy mindkét törzsből származó 25DKG-reduktáz optimális pH-értéke 6-7.
VII) Az aktivitás 3szefüggése a hőmérséklettel
A K-106 és T-13 törzsekből kapott 25DKG-reduktázok aktivitását mérjük különböző hőmérsékleteken. A szubsztrátum Ca-25DKG, pH = 7. Az eredményeket a 7. táblázat szemlélteti.
7. táblázat
A K-106 és T-13 törzsekből kapott 25DKG-reduktázok enzimaktivitása és a reakciéhömér séklet
| Hőmérséklet °C | Enzim- aktivitás K-106 | (relatív aktivitás)* T-13 |
| 22 | 46 | 64 |
| 25 | 69 | 79 |
| 28 | 86 | 92 |
| 30 | 100 | 100 |
| 35 | 115 | 115 |
| 40 | 119 | 133 |
| 45 | 93 | 128 |
| 50 | 44 | 92 |
| * lásd a 6. | táblázatnál |
A 7. táblázat adataiból kitűnik, hogy a mindkét törzsből kapott 25DKG-reduktázok aktivitása minden esetben nő a hőmérséklettel 40 °C-ig és csökken, ha a hőmérsékletet 45 °C-ra vagy ennél magasabbra növeljük.
VIII) Km-érték
Mindkét enzim Km-értékét mérjük 25DKG-ra, a K-106 és T-13 törzsekből kapott enzimek tisztított oldatait használva, így a Κτη-érték 1,7+1,0 mmól, illetve 2,6±l,0 mmól.
Claims (2)
- SZABADALMI IGÉNYPONTEljárás 2, 5-diketo-D-glükonsav-reduktáz előállítására, amely a következő fizikai-kémiai tulajdonságokkal rendelkezik:20 (a) enzimaktivitás: redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát, mint koenzim jelenlétében katalizálja (i) a 2, 5-diketo-D-glükonsavnak vagy sóinak redukcióját 2-keto-L-gulon25 savvá vagy megfelelő sóivá, és (ii) az 5-keto-D-fruktóz redukcióját L -szorbózzá, (b) fajlagosság a szubsztrátuinokra:
- 2, 5-diketo-D-glükonsavra és 5-ke20 to-D-fruktózra, (c) optimális pH-érték: pH - 6-7, (d) pH-stabilitás: pH = 5-7, (e) molekulasúly: 29.000+2.000, (f) izoelektromos pont: pH = 4,4+0,3.35 azzal jellemezve, hogy Corynebacterium sp. 20A-77 (ATCC 31 090), Corynebacterium sp. T-13 (ATCC 31 089) vagy Corynebacterium sp. K-106 (ATCC 31 088) mikroorganizmust vagy mutánsát szén- és nitrogénforrást és40 szervetlen sókat tartalmazó tápközegben tenyésztjük, a kapott sejteket elroncsolva feltárjuk, majd a mikroorganizmus feltárt sejtjeiből a 2, 5-diketo-D-glükonsav-reduktazt centrifugálással, kisózással, dialízissel, ion45 cserélő-kromatografálással vagy affinitás-kromatografálással elkülönítjük.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58217176A JPS60118186A (ja) | 1983-11-17 | 1983-11-17 | ２・５−ジケト−ｄ−グルコン酸リダクタ−ゼ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU192892B true HU192892B (en) | 1987-07-28 |
Family
ID=16700049
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU844273A HU192892B (en) | 1983-11-17 | 1984-11-16 | Process for preparing 2,5-diketo-d-gluconic acid reductase |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4748122A (hu) |
| EP (1) | EP0142169B1 (hu) |
| JP (1) | JPS60118186A (hu) |
| KR (1) | KR880001944B1 (hu) |
| AU (1) | AU569925B2 (hu) |
| CA (1) | CA1226836A (hu) |
| DE (1) | DE3485321D1 (hu) |
| DK (1) | DK545484A (hu) |
| ES (1) | ES537480A0 (hu) |
| GB (1) | GB2151233B (hu) |
| HU (1) | HU192892B (hu) |
| IE (1) | IE57594B1 (hu) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3485981T2 (de) * | 1983-06-28 | 1993-06-09 | Genentech Inc | Biosynthetische 2,5-diketoglukonsaeure-reduktase, verfahren, rekombinante zellen und expressionsvektoren zu deren herstellung und ihre verwendung zur herstellung von 2-keto-l-gulonsaeure. |
| US5004690A (en) * | 1983-06-28 | 1991-04-02 | Genetech, Inc. | Ascorbic acid intermediates and process enzymes |
| US4755467A (en) * | 1985-06-03 | 1988-07-05 | Unisearch Limited | Method for the production of sorbitol and gluconate |
| AU594080B2 (en) * | 1985-08-02 | 1990-03-01 | Genencor International, Inc. | Production of a vitamin c precursor using genetically modified organisms |
| GB8519536D0 (en) * | 1985-08-02 | 1985-09-11 | Biogen Nv | Vitamin c precursor |
| US5032514A (en) * | 1988-08-08 | 1991-07-16 | Genentech, Inc. | Metabolic pathway engineering to increase production of ascorbic acid intermediates |
| US5376544A (en) * | 1992-09-08 | 1994-12-27 | Rutgers The State University Of New Jersey | Enzymes for the production of 2-keto-L-gulonic acid |
| US5795761A (en) * | 1996-01-11 | 1998-08-18 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Mutants of 2,5-diketo-D-gluconic acid (2,5-DKG) reductase A |
| US7256027B1 (en) | 1999-06-15 | 2007-08-14 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Enzymes for the production of 2-keto-L-gulonic acid |
| US6979717B2 (en) * | 2001-08-13 | 2005-12-27 | Moore Eugene R | Anionic process design for rapid polymerization of polystyrene without gel formation and product produced there from |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5021559B2 (hu) * | 1973-03-22 | 1975-07-23 | ||
| JPS5135487A (en) * | 1974-09-20 | 1976-03-25 | Shionogi Seiyaku Kk | 22 keto ll guronsan no seizohoho |
| JPS5135485A (en) * | 1974-09-20 | 1976-03-25 | Shionogi Seiyaku Kk | 22 keto ll guronsan no seizohoho |
| JPS5135486A (en) * | 1974-09-20 | 1976-03-25 | Shionogi Seiyaku Kk | 22 keto ll guronsan no seizohoho |
| US4245049A (en) * | 1980-01-21 | 1981-01-13 | Pfizer Inc. | Preparation of 2-keto-L-gulonic acid |
| JPS58162298A (ja) * | 1982-03-05 | 1983-09-26 | Shionogi & Co Ltd | ２−ケト−ｌ−グロン酸の製造方法 |
| US4543331A (en) * | 1982-03-05 | 1985-09-24 | Shionogi & Co., Ltd. | Fermentative or enzymatic production of 2-keto-L-gulonic acid |
| DE3485981T2 (de) * | 1983-06-28 | 1993-06-09 | Genentech Inc | Biosynthetische 2,5-diketoglukonsaeure-reduktase, verfahren, rekombinante zellen und expressionsvektoren zu deren herstellung und ihre verwendung zur herstellung von 2-keto-l-gulonsaeure. |
-
1983
- 1983-11-17 JP JP58217176A patent/JPS60118186A/ja active Granted
-
1984
- 1984-10-24 CA CA000466243A patent/CA1226836A/en not_active Expired
- 1984-10-29 US US06/665,965 patent/US4748122A/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-11-07 ES ES537480A patent/ES537480A0/es active Granted
- 1984-11-13 GB GB08428615A patent/GB2151233B/en not_active Expired
- 1984-11-13 IE IE2913/84A patent/IE57594B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-11-14 DE DE8484113750T patent/DE3485321D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1984-11-14 EP EP84113750A patent/EP0142169B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-11-16 HU HU844273A patent/HU192892B/hu not_active IP Right Cessation
- 1984-11-16 AU AU35612/84A patent/AU569925B2/en not_active Ceased
- 1984-11-16 DK DK545484A patent/DK545484A/da not_active Application Discontinuation
- 1984-11-16 KR KR1019840007209A patent/KR880001944B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES8507607A1 (es) | 1985-09-16 |
| KR880001944B1 (ko) | 1988-10-04 |
| US4748122A (en) | 1988-05-31 |
| CA1226836A (en) | 1987-09-15 |
| EP0142169A2 (en) | 1985-05-22 |
| GB8428615D0 (en) | 1984-12-19 |
| DE3485321D1 (de) | 1992-01-16 |
| IE842913L (en) | 1985-05-18 |
| KR850003731A (ko) | 1985-06-26 |
| JPS60118186A (ja) | 1985-06-25 |
| ES537480A0 (es) | 1985-09-16 |
| DK545484A (da) | 1985-05-18 |
| EP0142169B1 (en) | 1991-12-04 |
| AU3561284A (en) | 1985-05-23 |
| AU569925B2 (en) | 1988-02-25 |
| GB2151233B (en) | 1987-04-29 |
| JPH0335B2 (hu) | 1991-01-07 |
| EP0142169A3 (en) | 1987-03-04 |
| IE57594B1 (en) | 1993-01-13 |
| GB2151233A (en) | 1985-07-17 |
| DK545484D0 (da) | 1984-11-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3590647B2 (ja) | アルコール／アルデヒド脱水素酵素 | |
| JP4566000B2 (ja) | ビタミンｃを産生する方法 | |
| HU192892B (en) | Process for preparing 2,5-diketo-d-gluconic acid reductase | |
| KR100701819B1 (ko) | 알데하이드 탈수소효소 | |
| EP0649465B1 (en) | Morphinone reductase for the preparation of hydromorphone and hydrocodone | |
| JP3086301B2 (ja) | Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素 | |
| Moonmangmee et al. | Purification and characterization of membrane-bound quinoprotein cyclic alcohol dehydrogenase from Gluconobacter frateurii CHM 9 | |
| JP2726826B2 (ja) | 酵素およびその製造方法 | |
| EP0790301B1 (en) | Aldehyde Dehydrogenase | |
| JPH02268679A (ja) | １，５―アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼの製造法 | |
| EP1476544B1 (en) | Enone reductase | |
| JPH0928375A (ja) | トレハロースホスホリラーゼおよびその調製法 | |
| JP2006503551A5 (hu) | ||
| JP3150868B2 (ja) | ６ホスホグルコン酸脱水素酵素とその製造法 | |
| Maldonado et al. | Methanol utilization by a strain of Aspergillus niger: influence on the synthesis and activity of pectinases | |
| JP2006503551A (ja) | アルデヒド脱水素酵素ｉｉ | |
| JP3188576B2 (ja) | ６ホスホグルコン酸脱水素酵素を産生する細菌株と、その大量増殖方法 | |
| JPH07255471A (ja) | キノン依存性グルコース脱水素酵素 | |
| JPH04349890A (ja) | モノアセチルポリアミンの製造方法 | |
| JP2002095469A (ja) | エンド−β−１，３−マンナナーゼとその製造方法 | |
| JPS6344359B2 (hu) | ||
| JPH09313174A (ja) | 耐熱性グルコ−ス−６−リン酸デヒドロゲナ−ゼ及びその製造法 | |
| JPS6244913B2 (hu) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HU90 | Patent valid on 900628 | ||
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee | ||
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |