HU192892B - Process for preparing 2,5-diketo-d-gluconic acid reductase - Google Patents

Process for preparing 2,5-diketo-d-gluconic acid reductase Download PDF

Info

Publication number
HU192892B
HU192892B HU844273A HU427384A HU192892B HU 192892 B HU192892 B HU 192892B HU 844273 A HU844273 A HU 844273A HU 427384 A HU427384 A HU 427384A HU 192892 B HU192892 B HU 192892B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
enzyme
diketo
gluconic acid
keto
activity
Prior art date
Application number
HU844273A
Other languages
English (en)
Inventor
Takayasu Sonoyama
Bunji Kageyama
Kobee Kobayashi
Masahiro Tanimoto
Original Assignee
Shionogi & Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shionogi & Co filed Critical Shionogi & Co
Publication of HU192892B publication Critical patent/HU192892B/hu

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02Monosaccharides
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/58Aldonic, ketoaldonic or saccharic acids
    • C12P7/602-Ketogulonic acid
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215Microorganisms
    • Y10S435/822Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/843Corynebacterium

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány tárgyát 2, 5-diketo-D-glükonsav-reduktaz előállítása képezi.
A fenti enzim redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foazfát jelenlétében katalizálja a 2, 5-diketo-D-glűkonsav redukcióját 2-keto-L-gulonsavvá, a C vitamin Biotermékévé. Az enzim katalizálja továbbá az 5-keto-D-fruktóz redukcióját L-szorbozzá.
A 2-kelo-L-gulonsav előállítását 2, 5-diketo-D-glükonsavból egy Corynebacterium nemzetséghez tartozó mikroorganizmus sejtkivonatait használva, ismerteti például a 00 88 408 számú európai szabadalmi leirás és a 2 116 549 számú brit szabadalmi leírás. Ezideig nem ismertették azonban, hogy egy tisztított enzim a fenti két enzimhatással rendelkezik és ehhez általában redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát szükséges.
A találmány célját tehát az új 2, 5-diketo-D-glükonBav-reduktáz előállítása képezi.
A találmány másik célja eljárás kidolgozása az új 2, 5-diketo-D-glükonsav-reduktáz előállítására.
A találmány szerint előáUitott 2, 5-diketo-D-glükonsav-reduktáz a kővetkező fizikai- kém iái tulajdonságokkal rendelkezik:
a) enzimaktivitás: katalizálás redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát mint koenzim jelenlétében,
i) 2, 5-diketo-D-glükonsavnak vagy BÓinak a redukciója 2-keto-L-gulonsavvá vagy megfelelő eói-. vá, és ii) 5-keto-D-fruktóz redukciója L szorbózzá,
b) fajlagosság a szubsztrátumokra: az enzim fajlagos a 2, 5-diketo-D-glükonsavra és az 5-keto-D-fruktózra, c, optimális pH-érték: pH = 6-7,
d) pH-stabilitás: pH = 5-7, e, molekulasúly: 29.000±2.000,
f) izoelektromos pont: pH = 4,4+0,3.
A találmány tárgyát képezi az eljárás az új enzim előállítására a Corynebacterium nemzetséghez tartozó mikroorganizmus feltárt sejtjeiből izolálva.
Tanulmányozva azokat az enzimeket, amelyek a 2, 5-diketo-D-glükonsvat redukálják és amelyeket számos 2-keto-L-gulonsavat termelő mikroorganizmus hordoz, a jelen találmány feltalálói azt találták, hogy a Corynebacterium nemzetséghez tartozó 2-keto-L-gulonsavat termelő törzsből előállított 2, 5-diketo-D-glükonsav-reduktáz redukált nikotinaraid-adenin-dinukleotid-foezfát jelenlétében i) redukálja a 2, 5-diketo-D-glükonsavat 2-keto-L-gulonsavvá, és ii) redukálja az 5-kelo-D-fruktózt L-szorbózzé. A feltalálók kiegészítették továbbá a találmány szerinti eljárást azzal, hogy sikerrel izolálták és tisztították az új enzimet, amely még nem ismertetett hatásokkal rendelkezik (az, hogy ősszefórhetően fejti ki mindkét hatást, kiváltképpen eddig még nem ismert felfedezés).
Az enzim bár, a 2, 5-diketo-D-glükonsavra és az 5-keto-D-fruktózra fejt ki enzimaktivitást, nem redukálja az 5-keto-D-gIűkonsavat, amelynél igencsak ketocsoport van az 5-helyzetben és ez közös a két szubsztrátumnál. Sőt, az enzim nem mutat redukáló hatást sem ketózokra, igy a D-fruktózra és L-szorbózra, amelyek a terminális alkoholos hidroxicsoporttal szomszédos ketocsoportot tartalmaznak, sem a 2-keto-L-gulonsavra vagy a 2-keto-D-glűkonsavra.
Az enzim sejten belüli enzim, amit a Corynebacterium nemzetséghez tartozó, 2-keto-L-gulonsavat termelő törzs sejtjeiből vonunk ki. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható mikroorganizmus például a Corynebacterium ep. No. 20A-77, ATCC 31 090, FERM-P 2 770, egyike a Corynebacterium nemzetséghez tartozó 2-keto-L-glükonsavat termelő törzseknek és egy ebből a törzsből származó mutáns például egy olyan mutáns, amely az 5-keto-D-glűkonsavat tökéletlenül metabolizálja, így a FERM-BP 108. A Corynebacterium sp. No. T-13, ATCC 31 089, Corynebacterium sp. No. K-106, ATCC 31 088 és az ezekből a törzsekből származó bármely mutáns ugyancsak alkalmazható enzimforrésként.
A mikroorganizmusok deponálási helye a feltalálók által: Fermentation Research Institute, Yatabe, Japán, mint FERM-Ps vagy FERM-ΒΡβ és/vagy az American Type Culture Collection, Maryland, U.S.A. mint ATCC-k, és minták kaphatók ezekből a raktárakból a budapesti szerződés rendelkezése alapján.
A No. 20A-77, T-13 és K-106 törzsek részletes taxonómiai ismertetései megtalálhatók például a 3 959 076 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, és az induktív mutáció módszerét FERM-BP 108 törzzsé az eredeti 20A-77 törzsből részletesen ismerteti például a 0 088 408 számú európai szabadalmi leírás.
A találmány szerinti 2, 5-diketo-D-glűkonsav-reduktéz előállítására szolgáló, 2-keto-L-gulonsavat termelő törzsek szaporítására használt tápközeg összetételét nem korlátozzuk különösebben. A tápközeg célszerűen tartalmazzon szénforrásokat, nitrogénforrásokat, más szervetlen sókat és a törzsek által asszimilálható más elemek nyom-mennyiségeit. Szénforrásként cukrok, így D-glűkóz és szacharóz, szerves savak, így glükonsav, glicerin és hasonlók használhatók 1-3%-os vizes közegben. Nitrogénforrásként pepton, kukoricalekvár és hasonlók alkalmazhatók 0,5-5%-ban. Használhatunk még a szaporításhoz foszfátot, amely lényeges, magnéziumáét, vitamint és más fémsók nyommennyiségeit. A táptalajt beoltjuk a fentemlített, 2-keto-L-gulonsavat termelő törzzsel, és ezt a tenyészetet a mikroorganizmus elszaporítása céljából 15-30 órán ét 25-35 °C-on inkubáljuk.
Az alábbiakban ismertetünk egy lehetséges eljárást a sejten belüli enzim kivonására a mikroorganizmusból a tenyésztés után. Először a sejteket kicentrifugáljuk a tápközegből, majd a sejteket vízzel, fiziológiás sóoldattal vagy egy megfelelő pH-órtékű pufferoldattal mossuk. A mosott sejteket egy megfelelő pH-értékű pufferoldatban szuszpendáljuk és ultrahanggal, nyomással (french-press) vagy egy enzimmel (lizozimmal) végzett kezeléeBel feltárjuk. Ezt kővetően az elegyet centrifugáljuk, igy az oldatból eltávolítjuk az ép Bejteket és a sejttörmeléket, és kapunk egy felülúszó réezt, ez a nyers enzimoldat. A nyers enzimoldathoz ammónium-BZulfátot adva az enzimet kisózzuk (30-70% telítettségű frakció).
A kisózott terméket feloldjuk egy pufferban, amit célszerűen úgy készítünk el, hogy az enzimet ne inaktiválja, és az oldatot a visszamaradt ammónium-szulfát eltávolítása céljából dialízisnek „alávetjük. Ezután az enzimoldatot tisztítási eljárásnak (vagy eljárásoknak), igy ioncserélő kromatográfiának és affinitás-kromatográfiának alávetjük, így egyetlen komponensként kapjuk a tisztított 2, 5-diketo-D-glükonsav-reduktázt.
A tisztított 2, 5-diketo-D-glükonsav-reduktáz alábbi fizikai-kémiai tulajdonságait állapítottuk meg:
1) Aktivitás
2, 5-diketo-D-glűkoneav + redukált nikotinaraid-adenin-dinukleotid-foszfát + H*
2-keto-L-gulonsav + nikotinamid-adenin-dinukleotid-foazfát (NADP')
5-keto-D-fruktóz + redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát + H' L-szorbóz + nikotinamid-adenin-dinukleotid-foezfát (NADP*)
Amint az látható a fenti reakcióban donorként a redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfótot használjuk. Redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid ugyancsak használható donorként a fenti reakcióban, de ebben az esetben a reakciósebesség 1/250 arányban vagy ennél kisebbre csökken, a redukált nikotinaraid-adenin-dinukleotid-foszfátot alkalmazó reakcióval összehasonlítva.
2) Fajlagosság a szubsztrátumokra
Az enzim fajlagosságot mutat 2, 5-diketo-D-glükoneavra és 5-keto-D-fruktózra. Az enzim azonban nem redukálja az 5-kelo-D-glükonsavat, ami a fenti két szubsztrátummal hasonlóságot mutat és nem mutat redukáló hatást olyan ketózokra, amelyek a terminális alkoholos hidroxicsoporttal szomszédos ketocsoportot tartalmaznak, mint például a D -fruktóz és L-szorbóz, valamint olyan vegyülelekre, amelyek egy ketocsoportot tartalmaznak a 2-helyzetben, mint például a 2-keto-L-gulonsav és a 2-ketoD-glükonsav.
2, 5-diketo-D-glükonsov vagy 5-keto-D-fruktóz lényeges termelését 2-keto-L-gulonsavból, illetve L-szorbózból nikotinamid-adenin-dinukleotid-foezfát vagy nikolinamid-adenin-dinukleotid jelenlétében nem tapasztaltuk.
3) Optimális pH pH = 6-7
4) pH-Stabilitás pH = 5-7 (meghatározva a maradék-aktivitások alapján, a következő kezelések után: 0,1 mólos dimetil-glutársav pufferral 4-5 pH-értéken, 0,1 mólos Good pufferral (PIPES) 6-7 pH-értéken és 0,1 mólos trisz-HCl pufferral 8-9 pH-értéken, 28 ’C-on 30 percig kezelve. 70% vagy ennél több maradék-aktivitást tapasztaltunk 5-7 pH-értéken, mig csak 30%-ot vagy ennél kevesebbet 4 pH-értéken vagy ez alatt és 8 pH-értéken vagy e felett.
5) Az enzimaktivitás mérése
Az enzimaktivitást spektrofotometriálisan mérjük az abszorpció csökkenése - alapján 340 nm-en, ami összhangban van a redukált nikotinaniid-adenin-dinukleotid-foszfát oxidációjával, mint az enzimreakció mértékével, 30 ’C-on, 0,1 mólos trisz-pufferban (pH = 7), amely 0,1 mmól redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfátot és 3,3 mmól 2, 5-dikelo-D-glükonsav-kalciumsót tartalmaz. Az enzimaktivitás egysége az a mennyiség, ami 1 perc alatt 1 μτηόΐ redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foezfátot oxidál.
6) A reakció hőmérséklettartománya 25-45 ’C
7) A pH-érték és a hőmérséklet inaktiválási körülményei
Az aktivitásnak 96%-a vagy még nagyobb része elvész, ha az enzimet 28 üŰ-on 2 órán át 4 pH-értéken vagy ez alatt vagy 8 pH-értéken vagy efelett tartjuk.
8) Inhibitorhatás, aktiválás és stabilizálás Az enzimre inhibitorhatásBal van az oxalát és kis mértékben a glicerinaldehid. Az enzim aktivitása Mg vagy Mn hozzáadására észrevehetően nem nő. Az enzimet glicerinnel nagy koncentrációban (30-50%) vagy szacharózzal (1 mólos) stabilizáljuk.
9) Molekulasúly 29.000±2.000 (SDS-poliakrilamid elektroforézissel és gélszűréssel mérve).
10) Izoelektromos pont 4,4±0,3 pH-értéken (izoelektromos pont-elektroforézisBel mérve).
11) Km-érték (Michaelis konstans)
19289
2,2±1,5 mmól (2, 5-diketo-D-glükonsav szubsztrátum 0,1 mólos trisz-pufferban (pH = 7) 30 ’C-on).
A találmány szerinti 2, 5-diketo-D-glükonsav-reduktáz igénybevehető olyan alkalmazási területeken, ahol az ismertetett enzimhatás megmutatkozik. Így 2-keto-L-gulonsav és L-szorbóz állítható elő 2, 5-diketo-D-glükonsavból, illletve 5-keto-D-fruktózból, redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát koenzim jelenlétében. 2-keto-L-gulonsav előállítása esetében például a reakció általában 25-45 ’C hőmérsékleten és 67 pH-értéken megy végbe. A reakcióban résztvevő szubsztrátum, a 2, 5-diketo-D-glükoneav moláris koncentrációja azonos hidrogén-donor, a redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfétéval, és az enzimreakciókkal kapcsolatos általános ismeretek alapján meghatározható. A reakcióhoz megfelel a 20-200) mmól moláris koncentrációtartomény.
Az enzimet a szubsztrátummal előnyösen 0,5-5,0 egység/ml koncentrációhatárok között reagáltaljuk. Az enzimet a reakcióban egy megfelelő hordozóhoz rögzített állapotban is használhatjuk. Az enzim rögzítésére általában alkalmazható a szakirodalomból ismert bármely módszer. így például az enzim közvetlenül kapcsolható egy membránhoz, funkciós csoporttal (csoportokkal) rendelkező gyanta granulátumaihoz vagy hasonlókhoz vagy kapcsolható a gyantához bifunkciós csoporttal (csoportokkal) rendelkező vegyületeken, például glutáraldehiden keresztül.
Az enzimreakció időtartamára különösebb korlátozást nem adunk meg, de 30 ’C-on 60120 perc alatt végzett reakcióban a 2, 5-diketo-D-glükoneav szubsztrátumnak 90%-a vagy ennél nagyobb része redukálható 2- ke to- L-gulqnsavvá.
A találmány szerinti eljárást közelebbről az alábbi példákkal szemléltetjük.
A példákban alkalmazott rövidítések: 25DKG = 2, 5-diketo-D-glükonsav;
5KF = 5-keto-D-fruktóz;
NADPH = redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát;
2KLG = 2-keto-L-gulonsav;
NADH = redukált nikotinamid-adenin-dinukleolid
j. példa
1) Sejttenyésztés
1) tápközeg az előtenyésztéshez ml alábbi összetételű tápközeget
500 ml-es lombikba tesszük és 120 ’C-on 15 percig sterilizáljuk:
D-glükóz 1.0%
É lesztőkivonat (Difco) 0.5%
Bacto-pepton (Difco) 0.5%
NaNOj 0.1%
KHjPO, 0.1%
MgSO«.7HjO 0.02% pH = 7
II) Tápközeg a tenyésztéshez liter alábbi összetételű tápközeget 50 ppm (rész a millióban) habzásgátlóval (polipropilénglikol P-2000) 30 literes fermentoredénybe teezűnk és 120 ’C-on 20 percig sterilizáljuk:
D-glükóz 2.0%
Kukoricalekvár 3.0%
É lesztőkivonat 0.1%
NaNOi 0.3%
KHaPO, 0.06%
pH = 7.2
III) Tenyésztés
Tíz elótenyészeti tápközeget beoltunk a No. 20A-77 Corynebacterium sp. mutánsának (FERM-BP 108) egy kacsnyi menynyiségével, és rézógépen (amplitúdó- 71 mm, 270 ford./perc) 28 ’C-on 18 órán át inkubálva rázott tenyészetet készítünk. A tíz inkubáll tápközeget étoltjuk a szaporításhoz szolgáló tápközegre, amint 28 ’C-on 22 órán át 0,5 térf./térf./perc levegőáramlás 400 ford./perc keveréssel tenyésztünk. (OD = optikai sűrűség = 19).
2) Az enzim kivonása
Az inkubált tápközegból az 1) rész szerint kapott sejteket kicentrifugáljuk (Sharpless centrifuga, 10 000 g, 10 perc) és 0.1 mólos, 7.0 pH-értékre beállított trisz-pufferral mossuk (hasonló triez-puffert használunk a továbbiakban is, ha másképpen nem jelezzük). A mosott sejteket 0,1 mólos trisz-pufferban szuszpendáljuk, ügy, hogy a szuszpenzió OD-érléke 150 legyen, és a sejteket ultrahanggal feltárjuk (160 watt/80 ml, 7 perc). Az el nem roncsolt sejteket és a sejttőrmeléket az ultrahangos feltárásnak alávetett oldatból kicentrifugáljuk (15.000 g, 30 perc), így körülbelül 1 liter felülúszó részt kapunk (protein = 10,3 mg/ml, 25DKG-reduktáz = 0,63 egység/ml).
3) Az enzim tisztítása
Az egész alábbi eljárást 4 ’C-on vagy ez elatti hőmérsékleten végezzük.
I) Frakcionális ammónium-szulfáttal
A 2) rész ezerint kapott felülúszóhoz 30%-os telítettségig ammónium-szulfátot adunk, és a kisózott terméket kicentrifugáljuk (10.000 g, 10 perc). Az így kapott felülüezóhoz 70%-os telítettségig ammónium-szulfátot adunk, jéggel körülbelül 1 órán át hűljük és a kicsapódott proteint kicentrifugáljuk (10.000 g, 10 perc). A proteint 200 ml
0,1 mólos trisz-pufferban feloldjuk és az oldatot éjszakán át 0,02 mólos trisz-pufferral dializáljuk.
II) Ioncserélő kromatográfia
A fenti i) rész ezerint kapott dializált oldatot (250 ml, 13,6 mg/ml protein) DEAE-Sepharose CL-6B oszlopra (Pharmacia Finecheraicals Co.) visszük ós az alábbi körülmények között kromatografáljuk:
oszlopméret: 1,6x30 cm, kiegyensúlyozó folyadék 0,02 mólos trisz-puffer, eluens: 0,02 mólos trisz-puffer (pH = 7,0) (200 ml)
0,15 mólos nátrium-klorid/0,02 mólos trisz-puffer (pH = 7,0) (300 ml)
0,25 mólos nátrium-klorid/0,02 mólos trisz-puffer (pH = 7,0) (200 ml).
Az eluátumból 5 ml-es frakciókat szedünk és minden egyes frakció enzimaktivitását megmérjük Ca-25DKG és 5KF szubsztrátumokra (a mérési módot az 5.)ii) részben fogjuk ismertetni). Ennek eredményeképpen mindkét szubsztrátumra észleltünk enzimaktivitást a 0,25 mólos nátrium-klorid/0,02 mólos trisz-pufferral eluált eluátum 80 ml-ében.
Ezután az eluátumhoz a protein kisózása céljából 70%-os telítettségig ammónium-szulfátot adunk, a kisózott terméket 30 ml 0,1 mólos trisz-pufferban feloldjuk és 4 ’Con éjszakán át 0,02 mólos trisz-pufferral dializáljuk.
III) Affinitás-kroraatográfia
A 3.)ii) rész ezerint kapott dializált oldatot Amicon Mátrix Gél Red A oszlopra (Amicon Far East Limited gyártmánya) viszszük, amit előzetesen 0,02 mólos trisz-pufferral (pH = 7,0) egyensúlyba hoztunk, és az alábbi körülmények között kromatografáljuk:
oszlopmáret: 1,6x19 cm, mosófolyadék:
0,4 mólos nátrium-klorid/0,02 biólos trisz-puffer (pH = 7,0) (400 ml), eluens: 0,5 mólos nátrium-klorid/0,02 mólos trisz-puffer (pH = 7,0) (450 ml)
0,7 mólos nátrium-klorid/0,02 mólos trisz-puffer (pH = 7,0) (150 ml) mólos nátriuin-klorid/0,02 mólos trisz-puffer (pH = 7,0) (300 ml).
Az enzimaktivitást megmérjük a megfelelő 5 ml-ee frakciókból a 3.)ii) részben említettek szerint. Enzimaktivitást észleltünk mindkét szubsztrátumra, vagyis a 25DKG ée 5KF szubsztráturaokra, a 0,7 mólos- 1 mólos nátrium-klorid/0,02 mólos trisz-pufferral (pH = 7,0) eluált 18 frakcióban. Az egyesített aktív frakciókhoz (90 ml) az oldat nátrium-klorid tartalmának csökkentése céljából 225 ml 0,02 mólos triaz-puffert (pH = 7,0) adunk, és a keveréket iemét Amicon Mátrix Gél Red A oszlopra (1,9x13 cm) viszzük. Az oszlopot 120 ml 0,2 mólos nátrium-klorid/0,02 mólos trisz-pufferral (pH = 7,0) mossuk és 0,5 mmól NADPH-ot és 0,2 mól nátrium-kloridot tartalmazó 150 ml 0,02 mólos trisz-pufferral (pH = 0,7) eluáljuk. Az eluátumot 5 ml-es frakciókra osztjuk és enzimaktivitásukat a fenti módon megmérjük. Ennek eredményeképpen azt találtuk, hogy a nagy enzimaktivitású frakciók (körülbelül 35 ml) azokban a frakciókban voltak (körülbelül 70 ml), amelyeket 0,5 mmól NADPH-ot és 0,2 mól nátrium-kloridot tartalmazó 0,02 mólos trisz-pufferral eluáltunk.
IV) Az enzim koncentrálása és a NADPH eltávolítása
A iii) rész szerint kapott eluátumhoz 30%-os telítettségig ammónium-szulfátot adunk és ezt követően Phenyl Sepharose CL-4B oszlopra (0,9x3 cm, Pharmacia Fine Chemicals Co. gyártmánya) visszük, amit előzetesen 30%-os telítettségig ammónium-szulfátot tartalmazó 0,02 mólos trisz-pufferral egyensúlyba hoztunk. Az oszlopot a NADPH tökéletes eltávolítása céljából 30%-os telítettségben ammónium-BZulfátot tartalmazó 0,02 mólos trisz-pufferral mossuk. Az eltávolítást a 340 nm-es mért abszorpció igazolja. Az oszlopon lévő enzimet 0,02 mólos trisz-pufferral, 1 ml-es frakciókat szedve eluáljuk. Ezeknek a frakcióknak az enzimaktivitásál megmérve, nagy aktivitást észleltünk négy frakcióban. A négy frakciót egyesítve tisztított enzimoldatot kapunk ós ezt használjuk a következő mérésekhez. Az oldat 54 egység/ml 25DKG-reduktáz aktivitást mutat, proteintarlalma 0,58 mg/ml.
4) A tisztított enzimoldal tisztasága
A 3) fejezet szerint előállított 2-5 pl tisztított enzimoldatot SDS-poliakril-amid-gélelektroforézissel (elválasztó gél: 10%-os akrilamid, az elektroforézis körülményei: 40 mA, szobahőmérsékleten, 1 órán át) analizáljuk, amikoris az enzim egyetlen sávot ad a 29.000±2.000 molekasúlynak megfelelő helyen. A továbbiakban gélszűréssel analízist végezve (Sephadex G-100), a 29.000±2.000 molekulasúlynak megfelelő frakciókban enzimaktivitást észlelünk.
Ezután 5 pl enzimoldalot izoelektromos pont-elektroforézisnek vetünk alá (a gél poliakrilamid, az elektroforézis körülményei: a) 2,5-5 pH-tartomány, anódelektrolit 0,1 mólos kénsav, katódelektrolit 0,1 mólos nátrium-hidroxid, 6 W, 2.700 Wh;
b) 4,0-6,5 pH-tartomány, anódelektrolit 0,04 mólos DL-glutaminsav, katódelektrolit 0,2 mólos nátrium-hidroxid, 25 W, 2.600 Wh, a hőmérséklet 18-20 °C. Az elektroforézis eredményeképpen az enzim egyetlen sávban vándorol, ami 4,4±0,2 pH-értéknek felel meg. A fentiekben ismertetett adatok megerősítik, hogy a tisztított enzimoldat egyedül 25DKG— -reduktázt tartalmaz.
-510 ί
5) Λ fizikai-kémiai tulajdonságok mérése
I) Enzimreakció μΐ 3) szerint kapott tisztított enzimoldatot 25 jumól szubsztrátummal (Ca-25DKG vagy 5KF) és 15 μ mól NADPH-ot tartalmazó 3,0 ml 0,01 mólos trisz-pufferral (pH = 7) keverünk, és a keveréket 30 ’C-on 60 percig reagáltatjuk. A reakció befejeződése után a reakciókeveréket papirkromatográfiával (kifejlesztő oldószer! fenol-hangyasav-viz, 75:4:25, előhívás az úgynevezett AHF-oldattal, amit úgy készítünk, hogy 0,93 g aniíint és 1,66 g ftálsavat 100 ml, vízzel telített n-butanolban feloldunk, és az oldatot r 105 C-on 2 percig melegítjük) és gázkromaJ tográfiával (oszlop: SE-52, vivögáz: hélium, minta: trimetil-szililezelt származék) analizáljuk. Az analízisek eredményeképpen mindkét kromatográfiás vizsgálatnál azt találtuk, hogy a 25DKG-ból csak 2KLG és az 5KF-ból csak L-szorbóz képződik. Az 1. táblázat a termékek gázkromatográfiás kvantitatív vizsgálatának az eredményeit tünteti fel.
1. táblázat
25DKG ás 5KF redukciója tisztított enzimoldattal
Szubeztrátum Termek A termék koncentrációja
Ca-25DKG Ca-2KLG 845 μΐ/ml
5KF L-szorbóz 795 μΐ/ml
II) Fajlagosság a szubsztrétumra
0,3 μ mól NADPH-ot tartalmazó 2,9 ml 0,1 mólos trisz-puffert (pH-7) 1 cm optikai hosszúságú kvarc küvettába teszünk és 1-5 μΐ, a 3) rész ezerint előállított enzimoldatot adunk hozzá. Az így kapott keverékhez adjuk a különböző ezubsztrátumok 0,1 mólos oldatainak 0,1 ml-ét, a reakciókeveréket 30 ’C hőmérsékleten tartva. Az enzim reaktivitását az illető szubsztrétumra a 340 nm-en mért abszorpció csökkenésének folyamatos mérésével határozzuk meg, az 1 perc alatt végbemenő csökkenés alapján. A mérés eredményeit a 2. táblázat szemlélteti.
2. táblázat
A 25DKG-reduktáz fajlagossága különböző szubsztrátumokra
Szubeztrátum
A tisztított enzimoldat (1 ml) aktivitása
Ca—25DKG 54 egység 5KF 94 egység Κ-5-keto-glükonát 0 egység D-fruktóz 0 egység L-szorbóz Q egység Ca-2-keto-D-glükonát 0 egység Na—2KLG 0 egység
A fenti táblázatból nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti enzim nagy aktivitást mutat 25DKG-ra és 5KF-ra, de egyáltalán nem gyakorol redukáló hatást 5-keto-D-glükonsavra, D-fruktózra, L-szorbózra, 2-keto-D-glükonsavra és 2KLG-ra.
III) Koenzim (hidrogén-donor)
Az 5)ii) szerinti reakciórendszerben a NADPH-ot NADH-dal helyettesítjük, és a 25DKG-reduktáz enzimaktivitását mérjük Ca-25DKG és 5KF szubsztrátumokra. Az eredményeket a 3. táblázat szemlélteti.
-612
3. táblázat
A koenzimek hatása a 25DKG-reduktáz aktivitására
Szubsztrátum E nzimaktivitás (egység/l ml tisztított enzimoldat)
Koenzim: NADPH NADH
Ca-25DKG 54 0.2>
5KF 94 0.2>
Amint az a fenti táblázatból látható, a találmány szerinti enzim 54 egység/1 ml tisztított enzimoldat enzimaktivitást mutat Ca-25DKG-ra, ha az enzimet NADPH-tal használjuk, mig csupán 0,2 egység vagy ennél kieebb enzimaktivitást mutat NADH-dal kombinálva. Hasonlóképpen csökken az 5KF-ra NADPH-tal mért 94 egység aktivitás 0,2 egységre vagy ennél kisebbre NADH-dal.
IV) Optimális pH-érték
Abból a célból, hogy tisztázzuk az őszezefüggést a 25DKG-reduktáz reakciósebessége és a pH-érték között, az enzimaktivitást az 5)ii) reakciórendszerben használt puffer helyett a következő pufferokat alkalmazva mérjük:
pH = 4,0-5,0: 0,1 mólos 3, 3-dimetil-glutársav puffer, pH - 6,0-7,0: 0,1 Mólos Good-puffer (PIPES = piperazin-N, N-bisz(2-etán)-szulfonsav), pH = 7,0-9,0: 0,1 mólos trisz-puffer.
A Ca-25DKG és 5KF szubszlrátumokra a megfelelő pH-értékeken mért enzimaktivitások eredményeit a 4. táblázat szemlélteti.
4. táblázat
A 25DKG-reduklsz aktivitása és a pH-érték az enzimreakcióban pH Puffer Enzimek tivitása> (egység/ml)
Szubsztrátum: Ca-25DKG 5KF
4.0 3, 3-dimetil-glutársav 1 2
5.0 3, 3-dimetil-glutársav 22 33
6.0 Good (PIPES) 59 96
6.5 Good (PIPES) 57 95
7.0 Good (PIPES) 53 92
7.0 Trisz 54 93
7.5 Trisz 44 68
8.0 Trisz 32 48
8.5 Trisz 11 27
9.0 Trisz 7 13
a) Enzimaktivitás: egység/l ml tisztított enzimoldat
A fenti táblázatból világosan látszik, hogy az enzim a legnagyobb enzimaktivitást
6-7 pH-értéken mutatja.
V) Az aktivitás összefüggése a hőmérséklettel
Az 5)ii) reakciórendszerben Ca-25DKG szubsztrátumot alkalmazva mérjük a rekció mértékét 15 °C és 50 °C közötti, változó hőmérsékleten. Az eredményeket az 5. táblázat szemlélteti.
5. táblázat
A 25DKG-reduktáz aktivitása és a hőmérséklet közötti összefüggés
Hőmérséklet (°C)
Enzimaktivitás* (egység/ml)
14
29
-Ί14
Hőmérséklet (’C)
Enzimaktivitás1 (ogyaég/ml)
27.5 44
54
32.5 59
64
67
44
10 * Enzimaktivitás: 1 ml tisztított enzimoldat aktivitása Ca-25DKG szubsztrátumra 7 pH-értéken.
Amint az a táblázatból kitűnik, a találmány szerinti enzim aktivitása nó a hőmérséklet növekedésével 40 ’C-ig, de növelve a hőmérsékletet 45 ’C-ra és még magasabbra, az aktivitás csökken.
VI) A Km-érték mérése
A fenti 5)ii) eljárás szerint mérjük a redukciós reakciók sebességét a Ca-25DKG különböző, 0,01 mól és 0,25 mól közötti koncentrációval, s így meghatározzuk a 25DKGKM-értékét. A mérések eredményeképpen azt találjuk, hogy a Km-érték l,8±l,0 mmól.
2. példa
1) Sejttenyésztés
I) Tápközeg a tenyésztéshez liter alábbi összetételű tépközeget 20 literes fermentor-edónybe helyezünk és 120 ’C-on 20 percig sterilizáljuk:
D-glükóz 1.0%
Kukoricalekvár 1.0%
É lszetőkivonat (Difco) 0.2%
Pepton (Difco) 0.5%
KHjPO« 0.1%
MgSO«.7HjO 0.02%
pH = 7
II) Tenyésztés 15
Az 1. példa 1) része szerinti tápközeggel és az olt ismertetett módon két-két előtenyészetet készítünk a Corynebacterium sp. No. K-106 (ATCC 31 088, rövidítve K-106) és a Corynebacterium sp. No. T-13 (ATCC 31 089, rövidítve T-13) baktériumokhoz.
A fenti elótenyészeteket átoltjuk az i) rész szerint készített tápközegbe és 0,5 térf./térf./perc levegőztetéssel és 400 ford/perc keverés mellett 28 ’C-on 18 órán át tenyésztjük. A tenyésztés végén a sejtek mennyisége optikai sűrűségben (OD) megadva, a következő: a K-106 törzsre
OD - 11,8; a T-13 törzsre OD = 12,2.
2) Az enzim kivonása
A K-106 és T-13 törzsekről 0,02 mólos trisz-pufferban (pH = 7,0) OD = 150 sürűsé55 gű sejtszuszpenziót készítünk, a tenyészetből centrifugálással elkülönített sejteket az
1. példának 2) része szerint mosva. A szuszpenziókban lévő sejteket (700 kg/cmJ) nyomást alkalmazva (French prees) elroncsoljuk. A sejteket tartalmazó oldatokat centrifugáljuk (15.000 g, 30 perc), amint azt az 1. példa 2) részében ismertettük, s így a még ép sejteket és a sejttőrmeléket eltávolítjuk. A sejtkivonatokat így a következő enzimakliviláso45 kát mutatják:
Törzs A kivonat mennyisége Protein A 25DKG reduktáz aktivitása
K-106 400 ml 10 mg/ml 2.1 egysóg/ml
T-13 400 ml 12 mg/ml 2.0 egyeég/ml
3) Az enzim tisztítása
I) Kisózás ammóniura-szulfáttal
A 30-70%-os telítettségig ammónium-szulfáttal kisózott frakcióknak megfelelő proteineket az 1. példa 3) része szerint elkülönítjük, majd 0,02 mólos trisz-pufferban feloldjuk, és az oldatokat 4 ’C-on éjszakán át 0,02 mólos trisz-pufferral dializáljuk. A dinlizált oldatok enzimaktivitása a következő:
Törzs Az enzimoldatok mennyisége Protein A 25DKG-reduktóz aktivitása
K-106 74 ml . nem vizsgáltuk 7.0 egyeég/ml
T-13 88 ml 11.1 rag/ml 4.8 egyeég/ml
-816
19289
II) Ioncserélő kromatográfia
Az enzimoldatokal az 1. példa 3)ii) részében leírt módon kezeljük. Λζ így kapott eluátumok enzimaktivit. ísa a következő:
Törzs Az enzimoldatok mennyisége Protein A 25DKG-reduktóz aktivitása
K-106 49 ml 0.60 mg/ml 2.4 egység/ml
T-13 52 ml 0.94 mg/ml 4.1 egység/ml
III) AffinitáB-kromatográfia
A fenti ii) rész szerint kapott mindkét eluátumhoz 30%-os telítettségig ammónium-szulfátot adunk, és az enzimeket az
1. példa 3)iv) részben leírtak szerint Phenyl Sepharose gól oszlopon kromatografálva koncentráljuk és sómentesítjük. A koncentrált enzimoldatokat az 1. példa 3)iii) részében leírtak szerint Amicon Mátrix Gél Red A oszlopon affinitás-kromatográfíával kétszer tisztítjuk. A mindkét törzsből származó 25DKG-reduktázt frakciókat szedve eluáljuk, az eluens 0,7-1 mólos nátrium-klorid az első kromatografálásnál és 0,5 mmöl NADPH-t tartalmazó fenti eluens a második kromatografálésnál.
Az eluátumokat az 1. példa 3)iv) részében leírtak szerint a NADPH eltávolítása után sómentesítjük és koncentráljuk. Ennek eredményeképpen a tisztított enzimoldatok a következő aktivitásokkal rendelkeznek:
Törzs Az enzimoldatok mennyisége ' Protein A 25DKG-reduktáz aktivitása
K-106 kb. 1 ml 0.25 mg/ml 23.8 egység/ml
T-13 kb. 2 ml 0.17 mg/ml 15.1 egység/ml
Az így kapott enzimoldatok 2-10 pl mennyiségeit az 1. példa 4) részében leírtak szerint SDS-poliakrilamid-gélelektroforézissel és izoelektromos pont-elektroforózissel vizsgáljuk. Mindkét enzim egyetlen sávot mutat. A tisztított enzimoldatokból a következő jellemzőket határozzuk meg.
4) Az enzimek fizikai-kémiai tulajdonságai
A fizikai-kémiai tulajdonságok mérését az 1. példa 4)-5) részei szerint végezzük.
I) Molekulasúly
A molekulasúly meghatározását SDS-poliakrilamid-gélelektroforézissel végezzük. Azl találjuk, hogy mind a K-106, mind a T-13 törzsből származó 25DKG-reduktáz molekulasúlya 29.000±2.000.
II) Izoelektromos pont
A K-106 és T-13 törzsekből ezármazó enzimek izoelektromos pont-elektroforézisének eredményeképpen az izoelektromos pontok 4,4±0,2 illetve 4,5±0,2 pH-órtéken vannak.
III) Fajlagosság a szubsztrátumra
Mindkét enzim csak Ca-2KLG-at termel
Ca-25DKG-ból és csak L-szorbózt 5KF-ból. Semmit sem termelnek az 5-keto-D-glükonsav, D-fruktóz, L-szorbóz, 2-KLG és 2-keto-Dglükonsav szubsztrátuinokból.
IV) Enzimaktivitás
A K-106 törzsből származó enzim aktivitása Ca-25DKG-ra 23,8 egység/ml (95 egység/mg protein) ée az 5KF-ra 38,3 egység/ml (152 egység/mg protein). A T-13 törzsből származó enzim aktivitása azonban Ca-25DKG45 ra 15,1 egység/ml (89 egység/mg protein) és 5KF-ra 39 egység/ml (229 egység/mg protein).
V) Koenzim (hidrogén-donor)
Mindkét enzim enzimaklivitását mérve Ca-25DKG-ra koenzimként NADH-ot használva, azt találtuk, hogy az aktivitás minden esetben 0,1 egység/ml vagy ennél kisebb.
VI) Optimális pH-érték
A K-106 éa T-13 törzsekből kapott 25DKG-reduktázok enzimaktivitásait mérjük θθ különböző, 4-9 pH közötti, változó értékeken. A szubsztrátum Ca-25DKG, a hőmérséklet 30 ’C. Az eredményeket a 6. táblázat szemlélteti.
-918
6. táblázat
A K-106 és T-13 törzsekből kapott 25DKG-reduktezok enzimaktivitásai és az enzimreakciók pH-értékei 5
pH Enziin- aktivitás K-106 (relatív aktivitás)* T-13
4.0 1 1
5.0 48 65
6.0 103 104
7.0 100 100
8.0 70 64
9.0 6 19
» Az aktivitást minden egyes pH-értéken azon az alapon definiáljuk, hogy az aktivitás = 100 7 pH-értéken és 30 °C-on.
A fenti táblázatból látható, hogy mindkét törzsből származó 25DKG-reduktáz optimális pH-értéke 6-7.
VII) Az aktivitás 3szefüggése a hőmérséklettel
A K-106 és T-13 törzsekből kapott 25DKG-reduktázok aktivitását mérjük különböző hőmérsékleteken. A szubsztrátum Ca-25DKG, pH = 7. Az eredményeket a 7. táblázat szemlélteti.
7. táblázat
A K-106 és T-13 törzsekből kapott 25DKG-reduktázok enzimaktivitása és a reakciéhömér séklet
Hőmérséklet °C Enzim- aktivitás K-106 (relatív aktivitás)* T-13
22 46 64
25 69 79
28 86 92
30 100 100
35 115 115
40 119 133
45 93 128
50 44 92
* lásd a 6. táblázatnál
A 7. táblázat adataiból kitűnik, hogy a mindkét törzsből kapott 25DKG-reduktázok aktivitása minden esetben nő a hőmérséklettel 40 °C-ig és csökken, ha a hőmérsékletet 45 °C-ra vagy ennél magasabbra növeljük.
VIII) Km-érték
Mindkét enzim Km-értékét mérjük 25DKG-ra, a K-106 és T-13 törzsekből kapott enzimek tisztított oldatait használva, így a Κτη-érték 1,7+1,0 mmól, illetve 2,6±l,0 mmól.

Claims (2)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONT
    Eljárás 2, 5-diketo-D-glükonsav-reduktáz előállítására, amely a következő fizikai-kémiai tulajdonságokkal rendelkezik:
    20 (a) enzimaktivitás: redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát, mint koenzim jelenlétében katalizálja (i) a 2, 5-diketo-D-glükonsavnak vagy sóinak redukcióját 2-keto-L-gulon25 savvá vagy megfelelő sóivá, és (ii) az 5-keto-D-fruktóz redukcióját L -szorbózzá, (b) fajlagosság a szubsztrátuinokra:
  2. 2, 5-diketo-D-glükonsavra és 5-ke20 to-D-fruktózra, (c) optimális pH-érték: pH - 6-7, (d) pH-stabilitás: pH = 5-7, (e) molekulasúly: 29.000+2.000, (f) izoelektromos pont: pH = 4,4+0,3.
    35 azzal jellemezve, hogy Corynebacterium sp. 20A-77 (ATCC 31 090), Corynebacterium sp. T-13 (ATCC 31 089) vagy Corynebacterium sp. K-106 (ATCC 31 088) mikroorganizmust vagy mutánsát szén- és nitrogénforrást és
    40 szervetlen sókat tartalmazó tápközegben tenyésztjük, a kapott sejteket elroncsolva feltárjuk, majd a mikroorganizmus feltárt sejtjeiből a 2, 5-diketo-D-glükonsav-reduktazt centrifugálással, kisózással, dialízissel, ion45 cserélő-kromatografálással vagy affinitás-kromatografálással elkülönítjük.
HU844273A 1983-11-17 1984-11-16 Process for preparing 2,5-diketo-d-gluconic acid reductase HU192892B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP58217176A JPS60118186A (ja) 1983-11-17 1983-11-17 2・5−ジケト−d−グルコン酸リダクタ−ゼ

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU192892B true HU192892B (en) 1987-07-28

Family

ID=16700049

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU844273A HU192892B (en) 1983-11-17 1984-11-16 Process for preparing 2,5-diketo-d-gluconic acid reductase

Country Status (12)

Country Link
US (1) US4748122A (hu)
EP (1) EP0142169B1 (hu)
JP (1) JPS60118186A (hu)
KR (1) KR880001944B1 (hu)
AU (1) AU569925B2 (hu)
CA (1) CA1226836A (hu)
DE (1) DE3485321D1 (hu)
DK (1) DK545484A (hu)
ES (1) ES537480A0 (hu)
GB (1) GB2151233B (hu)
HU (1) HU192892B (hu)
IE (1) IE57594B1 (hu)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3485981T2 (de) * 1983-06-28 1993-06-09 Genentech Inc Biosynthetische 2,5-diketoglukonsaeure-reduktase, verfahren, rekombinante zellen und expressionsvektoren zu deren herstellung und ihre verwendung zur herstellung von 2-keto-l-gulonsaeure.
US5004690A (en) * 1983-06-28 1991-04-02 Genetech, Inc. Ascorbic acid intermediates and process enzymes
US4755467A (en) * 1985-06-03 1988-07-05 Unisearch Limited Method for the production of sorbitol and gluconate
AU594080B2 (en) * 1985-08-02 1990-03-01 Genencor International, Inc. Production of a vitamin c precursor using genetically modified organisms
GB8519536D0 (en) * 1985-08-02 1985-09-11 Biogen Nv Vitamin c precursor
US5032514A (en) * 1988-08-08 1991-07-16 Genentech, Inc. Metabolic pathway engineering to increase production of ascorbic acid intermediates
US5376544A (en) * 1992-09-08 1994-12-27 Rutgers The State University Of New Jersey Enzymes for the production of 2-keto-L-gulonic acid
US5795761A (en) * 1996-01-11 1998-08-18 Rutgers, The State University Of New Jersey Mutants of 2,5-diketo-D-gluconic acid (2,5-DKG) reductase A
US7256027B1 (en) 1999-06-15 2007-08-14 Rutgers, The State University Of New Jersey Enzymes for the production of 2-keto-L-gulonic acid
US6979717B2 (en) * 2001-08-13 2005-12-27 Moore Eugene R Anionic process design for rapid polymerization of polystyrene without gel formation and product produced there from

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5021559B2 (hu) * 1973-03-22 1975-07-23
JPS5135487A (en) * 1974-09-20 1976-03-25 Shionogi Seiyaku Kk 22 keto ll guronsan no seizohoho
JPS5135485A (en) * 1974-09-20 1976-03-25 Shionogi Seiyaku Kk 22 keto ll guronsan no seizohoho
JPS5135486A (en) * 1974-09-20 1976-03-25 Shionogi Seiyaku Kk 22 keto ll guronsan no seizohoho
US4245049A (en) * 1980-01-21 1981-01-13 Pfizer Inc. Preparation of 2-keto-L-gulonic acid
JPS58162298A (ja) * 1982-03-05 1983-09-26 Shionogi & Co Ltd 2−ケト−l−グロン酸の製造方法
US4543331A (en) * 1982-03-05 1985-09-24 Shionogi & Co., Ltd. Fermentative or enzymatic production of 2-keto-L-gulonic acid
DE3485981T2 (de) * 1983-06-28 1993-06-09 Genentech Inc Biosynthetische 2,5-diketoglukonsaeure-reduktase, verfahren, rekombinante zellen und expressionsvektoren zu deren herstellung und ihre verwendung zur herstellung von 2-keto-l-gulonsaeure.

Also Published As

Publication number Publication date
ES8507607A1 (es) 1985-09-16
KR880001944B1 (ko) 1988-10-04
US4748122A (en) 1988-05-31
CA1226836A (en) 1987-09-15
EP0142169A2 (en) 1985-05-22
GB8428615D0 (en) 1984-12-19
DE3485321D1 (de) 1992-01-16
IE842913L (en) 1985-05-18
KR850003731A (ko) 1985-06-26
JPS60118186A (ja) 1985-06-25
ES537480A0 (es) 1985-09-16
DK545484A (da) 1985-05-18
EP0142169B1 (en) 1991-12-04
AU3561284A (en) 1985-05-23
AU569925B2 (en) 1988-02-25
GB2151233B (en) 1987-04-29
JPH0335B2 (hu) 1991-01-07
EP0142169A3 (en) 1987-03-04
IE57594B1 (en) 1993-01-13
GB2151233A (en) 1985-07-17
DK545484D0 (da) 1984-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3590647B2 (ja) アルコール/アルデヒド脱水素酵素
JP4566000B2 (ja) ビタミンcを産生する方法
HU192892B (en) Process for preparing 2,5-diketo-d-gluconic acid reductase
KR100701819B1 (ko) 알데하이드 탈수소효소
EP0649465B1 (en) Morphinone reductase for the preparation of hydromorphone and hydrocodone
JP3086301B2 (ja) L−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素
Moonmangmee et al. Purification and characterization of membrane-bound quinoprotein cyclic alcohol dehydrogenase from Gluconobacter frateurii CHM 9
JP2726826B2 (ja) 酵素およびその製造方法
EP0790301B1 (en) Aldehyde Dehydrogenase
JPH02268679A (ja) 1,5―アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼの製造法
EP1476544B1 (en) Enone reductase
JPH0928375A (ja) トレハロースホスホリラーゼおよびその調製法
JP2006503551A5 (hu)
JP3150868B2 (ja) 6ホスホグルコン酸脱水素酵素とその製造法
Maldonado et al. Methanol utilization by a strain of Aspergillus niger: influence on the synthesis and activity of pectinases
JP2006503551A (ja) アルデヒド脱水素酵素ii
JP3188576B2 (ja) 6ホスホグルコン酸脱水素酵素を産生する細菌株と、その大量増殖方法
JPH07255471A (ja) キノン依存性グルコース脱水素酵素
JPH04349890A (ja) モノアセチルポリアミンの製造方法
JP2002095469A (ja) エンド−β−1,3−マンナナーゼとその製造方法
JPS6344359B2 (hu)
JPH09313174A (ja) 耐熱性グルコ−ス−6−リン酸デヒドロゲナ−ゼ及びその製造法
JPS6244913B2 (hu)

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee