KR20020035051A

KR20020035051A - 신균주 슈도지마 츄쿠밴시스에 의한 에리스리톨의 발효제조방법

Info

Publication number: KR20020035051A
Application number: KR1020020014975A
Authority: KR
Inventors: 김상용; 이정걸; 조창호
Original assignee: 정수련; 주식회사 바이오앤진
Priority date: 2002-03-20
Filing date: 2002-03-20
Publication date: 2002-05-09
Also published as: KR100434518B1

Abstract

본 발명은 자일리톨 제조회사의 발효 슬러지로부터 분리한 에리스리톨 생산 신균주 슈도지마 츄쿠밴시스(Pseudozyma tsukubaensis)(기탁번호 KCCM-10356호) 및 이 신균주 슈도지마 츄쿠밴시스를 이용하여 각종 배양조건 및 배지조성을 최적화 함으로써 고수율 고생산성의 에리스리톨 제조방법에 관한 것이다.

Description

신균주 슈도지마 츄쿠밴시스에 의한 에리스리톨의 발효 제조방법{Erythritol fermentation method by a novel strain, Pseudozyma tsukubaensis}

본 발명은 천연으로부터 분리한 고수율 및 고생산성으로 에리스리톨(erythritol)을 생산하는 신균주 슈도지마 츄쿠밴시스(Pseudozyma tsukubaensis) 및 이를 이용하여 포도당(glucose)으로부터 에리스리톨을 제조하는 방법에 관한 것이다.

사탄당 알코올인 에리스리톨은 올리고당이나 자일리톨과 더불어 대표적인 기능성 감미료로 자연계에 광범위하게 존재하고 있으며, 해초류와 버섯류의 저장물질이고, 멜론, 포도, 배 등과 같은 과실류에도 함유되어 있다. 에리스리톨은 세균과 효모 등 미생물에 의해서도 생산되므로 포도주나 맥주, 된장 등의 발효식품에서도 검출된다.

에리스리톨은 설탕의 70∼80%의 당도를 가지고 용해될 때 열 감소가 일어나는 특성으로 인하여 입안에서 느끼는 청량감이 크고 용해도가 낮아 결정성이 부여되며 이러한 성질들로 인하여 청량감과 결정성이 필수적인 캔디 등의 제과제품의 무설탕 원료로 사용되고 있다. 에리스리톨은 저 칼로리 감미료로 체내에서 에너지원으로 이용되지 않고 소변으로 배출되며, 충치균에 의해서 이용되지 않기 때문에 충치 예방효과도 가지고 있다.

에리스리톨은 저분자 물질이므로 빙점 강하와 끓는점 상승을 시킬 뿐 아니라 삼투압을 증가시키는 물질이다. 저 흡습성 물질과 저 점도물질과 같이 사용하면 식품의 수분 활성도의 감소와 조절에 매우 용이하다.

에리스리톨의 생산에는 추출법, 화학합성법 및 발효법이 있다. 이중 추출법은 과일이나 채소 등의 자연상태에서 극히 미량으로만 존재하기 때문에 산업적으로 경제성이 없다. 화학합성법은 원료물질이 고가이기 때문에 경제성이 없어 대량생산에 이용되고 있지 못하고 있다. 따라서 발효법은 화학합성법의 단점을 극복할 수 있는 방안으로 연구가 활발히 진행되고 있다.

발효법에 의한 에리스리톨의 생산은 주로 효모에 의해서 일어나고 지금까지보고된 효모는 토루롭시스(Torulopsis)속의 마그놀리아(magnoliae), 베라틸리스(veratilis) 및 캔디다(candida); 엔도마이콥시스 초다티(Endomycopsis chodati); 한세눌라 수펠리쿨사(Hansenula supelliculsa); 피키아 미조(Pichia miso); 몬닐리엘라 토멘토사 바 폴린리스(Monilliella tomentosa var. pollinis); 트리고놉시스 배리아빌리스(Trigonopsis variabilis); 트리코스포로노이데스(Trichosporonoides) ; 캔디다 제일라노이데스(Candida zeylanoides); 오레오바시디움(Aureobasidium) 등이 있다. 루코노스톡 오에노스(Leuconostoc oenos)와 같은 세균도 에리스리톨을 생산한다고 보고되고 있다. 이 중 몬닐리엘라 토맨토사 바 폴린리스는 포도당으로부터 41%라는 고수율로 에리스리톨을 생산하였지만 글리세롤, 리비톨이 부산물로 많이 생성되기 때문에 공업화에는 이르지 못하였다.

또한, 공업적 생산에 이용되고 있는 균주로는 오레오바시디움이 있는데 이 균주는 일본의 농림수산성 식품종합연구소와 일연화학의 공동연구에 의하여 분리 동정되었다. 자연에서 분리한 오레오바시디움 야생균주는 에리스리톨 생산성과 내당성에 있어서 만족할만하지 못했지만 이 균주를 돌연변이시켜 생산성과 내당성이 향상된 돌연변이주를 얻을 수 있었다. 이 변이주는 포화 포도당 농도(83.3%)에서도 발효가 가능하고 포도당 농도 40∼50%에서 2 g/L-h의 에리스리톨 생성속도를 보였다. 또한, 포도당으로부터 에리스리톨의 수율이 45%(w/w)로 높은 수준이었으며 부산물로는 소량의 글리세롤을 생성하였다.

대부분의 당알코올 생산 균주들이 삼투압이 높은 환경(높은 당 농도나 높은 염농도)하에서 생장할 수 있다는 사실이 알려져 있으며, 따라서 당알코올의 생산이 미생물의 생장 삼투압과 관련되어 있다는 것이 제안되고 있다. 실제로 리드 등은 글리세롤 생산균주를 삼투압이 높은 환경에서 배양하여 글리세롤의 생산성을 증가시켰다(Appl. Environ. Microbiol., 53, 2119-2133, 1987)

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 자일리톨 제조회사(주식회사 보락, 오산)의 발효 슬러지에서부터 고수율의 에리스리톨 생산 신균주 슈도지마 츄쿠밴시스(Pseudozyma tsukubaensis)를 분리 동정 개발하고, 배양 조건을 최적화 함으로써 에리스리톨을 고생산성 및 고수율로 제조하는 방법을 개발한 것이다.

본 발명은 천연슬러지에서 분리된 신균주 슈도지마 츄쿠밴시스(Pseudozyma tsukubaensis)(기탁번호 KCCM-10356호)를 종배양하고, 종배양된 균주를 포도당, 질소원을 함유하는 배지에서 발효 배양시켜 생성된 에리스리톨을 분리 정제함을 특징으로 하는 고수율 고생산성의 에리스리톨 제조방법 및 그 방법으로 제조된 에리스리톨을 제공하는 것이다.

또한 상기 발효배지는 포도당 300∼500g/L, 효모추출물 15∼25g/L 을 포함함을 특징으로 하고, 상기 발효 배양 시 교반속도는 500∼800rpm이고, 통기량은 0.3vvm이며, pH는 5.5이고, 배양온도는 30∼34℃임을 특징으로 한다.

한편, 상기 신균주 슈도지마 츄쿠밴시스의 종배양은 포도당 150∼200g/L, 효모추출물 7∼10g/L 가 함유된 배지에서 수행하고, 균체농도가 5∼7g/L로 성장할 때까지 진탕 배양시킴을 특징으로 한다.

또한 천연 슬러지의 시료를 희석한 후 포도당 200∼400g/L, 효모추출물 7∼20g/L, 아가(agar) 12∼17g/L가 포함된 평판을 이용하여 27∼35℃에서 빨리 성장하는 균주들을 중심으로 단일 군락(single colony)을 선별하고, 이들 선별된 균주들을 포도당 150∼200g/L, 효모추출물 7∼10g/L로 구성된 배지에서 발효시간 110∼120시간 후에 에리스리톨을 가장 많이 생성하는 균을 선별함을 특징으로 하는 신균주 슈도지마 츄쿠밴시스(Pseudozyma tsukubaensis)(기탁번호 KCCM-10356호)의 분리방법 및 분리된 에리스리톨 생성 신균주 슈도지마 츄쿠밴시스(Pseudozyma tsukubaensis)(기탁번호 KCCM-10356호)를 제공한다.

이하 본 발명의 신균주 슈도지마 츄쿠밴시스의 분리방법을 설명하면 다음과같다.

자일리톨 제조회사의 발효 슬러지 시료를 적당히 희석한 후 포도당 200∼400g/L, 효모추출물 7∼20g/L, 아가(agar) 12∼17g/L가 포함된 평판을 이용하여 27∼35℃에서 빨리 생장하는 균주들을 중심으로 단일 군락(single colony)을 선별하였고, 이들 선별된 균주들을 포도당을 함유하고 있는 에리스리톨 생산배지에 48시간 동안 배양한 액을 3,000 ×g로 15분간 원심분리한 후 0.1M 구연산 완충액(pH 5.5)를 첨가하여 2회 세척하였다. 세척된 균체를 0.1M 구연산 완충액(pH 5.5)로 희석하여 균체의 농도가 10⁸정도가 되게 하였다. 이 용액에 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)을 첨가하여 최종농도가 100 ㎍/mL로 되게 만들어 30분간 처리하였다.

0.1M 인산 완충액(pH 7.0)으로 두 번 세척한 후 포도당 150∼200g/L, 효모 추출물 7∼10g/L, 아가(agar) 12∼17g/L가 포함된 평판을 이용하여 30℃에서 빨리 생장하는 균주들을 중심으로 단일 군락(single colony)을 선별하였고, 이들 선별된 균주들을 포도당 150∼200g/L, 효모추출물 7∼10g/L로 구성된 배지에서 발효시간110∼120시간 후에 에리스리톨을 가장 많이 생산하는 균을 최종적으로 선별하였다.

균주의 동정은 26s rRNA의 염기서열을 분석하는 방법(Kurtzman & Robnett, 1998) 및 형태학적, 배양학적 및 생리학적 특성을 Yarrow(Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1998)의 방법에 준하여 조사하였고 Barnett 등 (Yeasts : Characteristics and identification. Cambridge university Press, London, 1983)의 분류방법에 따라 동정하였다. 선별된 균주의 26s rRNA의 염기서열 및 유사종과의 염기서열 분석결과는 각각 표 1과 표 2에 나타내었다.

에리스리톨 생성 신균주 슈도지마 츄쿠밴시스의 26s rRNA의 염기서열

5'-ATTGAAAGCTGGCGTCTTCGGCGTCCGCATTGTAATCTCAAGAAGTGTTTTCCGCTTCGGACCAAGCCTAAGTCCCCTGGAAAGGGGCATCATAGAGGGTGATAATCCCGTACATGGCTTGGAGCGCCCGTAGCTTTGTGATACACTTTCTAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAAATGGGTGGTAAATGCCATCTAAGGCTAAATATTGGGGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGTACGTGAAATTGCCAAAAGGGAAGGGTAGGAGGTCAGAGATGCGGCCTAGGATTCAGCCTTGCTTTTGCTTGGTGTTTTTCCTAGATTGCAGGCCAACGTCGGTTTTGGGCACTGGAGAAGGGTGGAAGGAACGTGGCACCTCTCGGGGTGTGTTATAGCCTTCTACTGGATACAGCGACCGAGACCGAGGACAGCAGCGTACTCGCAAGAGCGGGCCTTCGGGCACCTTTACGCTTAGGGCGTTGGCATAAT-3'

에리스리톨 생성 신균주 슈도지마 츄쿠밴시스와 유사종 간의 26s rRNA D1/D2 domain의 염기서열 유사성

Strain	Accession No.	%Similarity
Pseudozyma tsukubaensis CBS 6389T	AJ235297	100.0
Pseudozyma antarctica CBS 214.83T	AJ235302	98.47
Pseudozyma aphidis CBS 517.83T	AJ235303	98.47
Pseudozyma rugulosa CBS 170.88T	AJ235300	98.30
Ustilago affinis M.P. 692	AF133581	97.63
Pseudozyma fusiformata CBS 6951T	AJ235304	97.62
Ustilago nuda H.U.V. 17782	AJ236139	97.54
Pseudozyma flocculosa CBS 167.88T	AJ235299	97.45
Ustilago avenae GD 1292	AJ236140	97.28
Ustilago maydis NRRL Y-1639	AJ235275	96.60
Ustilago cynodontis MP 1838	AF009881	96.48
Ustilago scitaminea MP 541	AJ236138	96.44
Pseudozyma prolifica CBS 319.87T	AJ235298	96.26
Ustilago hordei 11.2C	L20286	96.17

또한 형태학적 특성, 생리학적 및 생화학적 특성은 표 3에 나타내었고, 신균주의 탄소원 대사 여부를 표 4에 나타내었다.

본 발명 신균주 슈도지마 츄쿠밴시스(KCCM-10356)의 형태적, 생리적, 생화학적 특성

특성	본 발명 신균주 (KCCM-10356호)
세포 모양	Rod-coccus
균락 색깔	연분홍색
포자생성	-
산소 요구성	호기성
운동성	-
온도별 균의 증식20℃30℃35℃40℃	+++-
비타민 제거 배지에서의 증식	-
요소분해	-
초산생성	-
전분형성	-
디아조니움 블루 B 형성	-
질산염의 이용	+

본 발명 신균주 슈도지마 츄쿠밴시스(KCCM-10356호)의 탄소원 이용

탄 소 원	증식여부	탄 소 원	증식여부
D-글루코스	+	리비톨	+
글리세롤	+	a-메틸-D-글루코사이드	-
2-케토-D-글루코네이트	-	N-아세틸-D-글루코사민	-
L-아라비노스	+	셀로비오스	-
D-자일로스	+	락토스	-
아도니톨	-	말토스	-
자일리톨	+	사카로스/수크로스	+
갈락토스	+	트레할로스	+
이노시톨	-	멜레지토스	-
솔비톨	+	라피노스	-

이상과 같은 균주의 특성을 동정한 결과 본 균주는 슈도지마 츄쿠밴시스 종의 균주로 판명되었고, 신균주 슈도지마 츄쿠밴시스(Pseudozyma tsukubaensis)를 한국미생물보존협회에 2002년 2월 27일 기탁번호 KCCM-10356호로 부다페스트조약에 의거 국제 기탁하였다.

본 발명의 에리스리톨 발효 생성법을 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 균주의 종배양을 위한 성장배지로는 포도당 150∼200g/L, 효모추출물 7∼13g/L 배지를 사용하였고, 플라스크의 발효배지로는 탄소원으로 포도당 200g/L, 질소원으로는 효모 추출물로 구성된 배지를 사용하였다. 각 성분의 양은 에리스리톨의 생산성을 높이기 위하여 변화시킬 수 있다. 발효조에서 사용한 배지는 탄소원으로 포도당을 사용하였고 배지내의 포도당 농도는 실험목적에 따라 조절하였다. 질소원으로 효모 추출물을 사용하였고 배지 내의 농도는 포도당 농도의 20:1의 비율로 조절하였다.

종배양은 냉동 보관된 균주를 포도당 200g/L, 효모추출물 10g/L 배지 75ml가 들어있는 500ml의 플라스크에 접종하여 진탕 배양기에서 240∼260rpm, 28∼32℃로 균체 농도가 6∼7g/L (약 48시간)로 성장할 때까지 수행하였다. 플라스크 배양에서는 배지의 5%에 해당되는 종배양액을 발효 배지 100ml가 들어있는 500ml의 플라스크에 접종하여 진탕 배양기에서 240∼260rpm, 30∼34℃로 하여 120시간동안 배양하였다.

발효조 배양에서는 발효초기에 100g/L의 과당이 함유된 배지 부피가 2L인 5L 발효조(한국발효기(주))를 사용하여 회분식 배양을 수행하였다. 발효과정 중에 교반속도는 500∼800rpm으로 조절하였고 통기량은 0.3vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전 과정동안 5.5로 조절하였고 배양온도는 30∼34℃이었다.

포도당, 에리스리톨의 농도는 Carbohydrate Analysis 칼럼(Waters, USA)이 장착된 HPLC의 Refractive Index Detector (Waters 2410, USA)를 이용하여 측정하였다. 이때, 용매는 아세토니트릴(acetonitrile)과 물을 8 : 2로 섞어 사용하였고, 유속은 1.5 ml/분이었다. 균체농도는 탁도계를 이용하여 600nm에서 현탁도를측정하여 미리 측정한 표준곡선을 이용하여 건조중량으로 전환하였다. 용존산소 농도는 Ingold사(Swiss, polarographic type)의 용존산소전극을 사용하여 특정하였다.

본 발명을 실시예에 따라 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

(실시예 1)

종배양 : 자일리톨 제조회사의 발효 슬러지로부터 분리한 슈도지마 츄쿠밴시스(KCCM-10356호)를 포도당 200g/L, 효모추출물 10g/L 75ml가 들어있는 500ml 플라스크에 접종하여 250rpm, 30℃로 48시간 배양하였다.

본배양 : 종 배양액을 발효배지 100ml가 함유된 500ml 플라스크에 접종한 후, 진탕배양기로 240∼260rpm에서 30∼34℃로 120시간까지 배양하였고, 배지의 pH는 조절하지 않았다. 이때 배지 성분은 포도당 200g/L, 효모추출물 10g/L이었다. 시간경과에 따른 에리스리톨의 생산을 살펴본 결과를 표 5에 나타내었다. 분리균주의 최대 비증식속도는 0.17h^-1, 최대균체량은 7.13g/L 이었고 63g/L의 에리스리톨이 생산되었다.

250 ml 플라스크에서 분리균주의 시간에 따른 에리스리톨의 생성

배양시간	균체(g/L)	에리스리톨(g/L)
0	0.05
12	0.78	0.5
24	2.91	2.8
48	4.72	10.1
72	5.84	21.3
96	6.31	43.6
120	7.13	63.5

(실시예 2)

배양방법은 실시예 1과 같고, 포도당 200g/L, 효모 추출물 10g/L의 질소 함량에 준하는 각각의 질소원으로 구성된 발효배지에서 발효시간 120시간 후 여러 가지 질소원이 에리스리톨의 생산에 미치는 영향을 살펴보았다. 여러 가지 질소원에서 배양한 결과를 표 6에 나타내었다. 에리스리톨은 효모추출물(yeast extract)과 효모질소(yeast nitrogen base)를 제외한 다른 유기 질소원에서는 낮은 농도를 나타내었고, 효모추출물이 가장 좋은 질소원이었다.

250 ml 플라스크에서 에리스리톨의 생성에 미치는 질소원의 영향

질소원	균체(g/L)	에리스리톨(g/L)
효모추출물	6.65	63.5
효모질소	6.23	51.2
트립톤	3.28	37.5
대두박	2.14	13.6
옥수수 침지액	1.84	8.3
맥아 추출물	2.02	10.2
펩톤	3.01	26.4

(실시예 3)

배양방법은 실시예 1과 같고, 본 배양에서 발효 배지를 포도당 200g/L, 효모 추출물로 하여 이 중 효모 추출물의 농도를 변화시켜 120시간 동안 배양한 결과를 표 7에 표시하였다.

500 ml 플라스크에서 효모 추출물 농도별 에리스리톨의 생성량

효모 추출물(g/L)	균체(g/L)	에리스리톨(g/L)
0	0.0	0.0
1	0.8	1.3
2	2.1	21.0
5	3.8	35.2
7	5.7	54.7
10	6.6	63.5
15	6.1	58.6
20	4.9	49.1

(실시예 4)

종배양은 실시예 1과 같고, 본 배양에서는 발효배지 3 L가 함유된 5L 발효조에 접종한 후, 교반속도는 500∼800 rpm로 용존산소가 고갈되지 않는 범위에서 조절하였고 통기량은 0.3 vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전 과정동안 5.5로 조절하였고 배양온도는 30℃이었다. 이 때, 배지성분은 포도당, 효모추출물 10g/L 이었다. 초기 포도당 농도에 따른 에리스리톨의 생산을 살펴본 결과를 표 8에 나타내었다.

5L 발효조에서 포도당 농도별 에리스리톨의 생성량

포도당 농도(g/L)	균체(g/L)	에리스리톨(g/L)	배양시간(h)
100	4.3	62.8	192
200	7.5	80.1	136
300	14.6	135.7	76
400	12.9	186.4	108
500	10.4	200.1	168

(실시예 5)

5L 발효조에서 배양온도를 30℃로 하여 여러 pH별 실험을 수행하였다. 포도당 400g/L, 효모추출물 20g/L로 구성된 3L 발효배지를 사용하였다. 교반속도는 용존산소가 고갈되지 않는 범위에서 조절하였고 통기량은 0.3 vvm으로 조절하여 pH를 변화시켜 배양한 결과를 표 9에 표시하였다.

5L 발효조에서 pH에 따른 에리스리톨의 생성량

pH	균체(g/L)	에리스리톨(g/L)	배양시간(h)
4.5	8.7	124.6	144
5.0	12.0	170.5	116
5.5	12.9	186.4	108
6.0	11.4	163.9	120
6.5	6.8	102.8	144

(실시예 6)

배양방법과 발효배지는 실시예 5와 같고, 본 배양에서는 pH는 5.5 로 하여 배양온도별 실험을 수행하였고 그 결과를 표 10에 표시하였다.

5L 발효조에서 온도별 에리스리톨 생성량

온도(℃)	균체(g/L)	에리스리톨(g/L)	수율(%)
26	8.7	103.6	25.9
28	12.0	145.1	36.3
30	18.5	186.4	46.6
32	17.6	192.7	48.2
34	14.9	213.1	53.3
36	1.40	39.5	9.9

본 발명의 효과는 천연슬러지에서 분리된 신균주 슈도지마 츄쿠밴시스(Pseudozyma tsukubaensis)를 이용하여 포도당 300~500g/L, 효모추출물 15∼25g/L를 함유하는 배지에서 배양하여 고수율·고생산성으로 에리스리톨을 생산할 수 있다. 이는 종래의 화학합성 및 발효방법에 비해 선택적, 경제적, 효과적으로 에리스리톨을 발효 생산하게 된 것으로 제품 품질 및 국제 경쟁력에서도 비교우위를 점할 수 있다.

Claims

천연슬러지에서 분리된 신균주 슈도지마 츄쿠밴시스(Pseudozyma tsukubaensis)(기탁번호 KCCM-10356호)를 종배양하고, 종배양된 균주를 포도당, 질소원을 함유하는 배지에서 발효 배양시켜 생성된 에리스리톨을 분리 정제함을 특징으로 하는 고수율 고생산성의 에리스리톨 제조방법
제 1항에 있어서, 상기 발효배지는 포도당 300∼500g/L, 효모추출물 15∼25g/L을 포함함을 특징으로 하는 에리스리톨의 제조방법
제 1항에 있어서, 상기 발효 배양 시 교반속도는 500∼800rpm이고, 통기량은 0.3vvm이며, pH는 5.5이고, 배양온도는 30∼34℃임을 특징으로 하는 에리스리톨의 제조방법
제 1항에 있어서, 상기 신균주 슈도지마 츄쿠밴시스의 종배양은 포도당 150∼200g/L, 효모추출물 7∼10g/L 함유된 배지에서 수행하고, 균체농도가 5∼7g/L로 성장할 때까지 진탕 배양시킴을 특징으로 하는 에리스리톨의 제조방법
천연 슬러지의 시료를 희석한 후 포도당 200∼400g/L, 효모추출물 7∼20g/L, 아가(agar) 12∼17g/L가 포함된 평판을 이용하여 27∼35℃에서 빨리 성장하는 균주들을 중심으로 단일 군락(single colony)을 선별하고, 이들 선별된 균주들을 포도당 150∼200g/L, 효모추출물 7∼10g/L로 구성된 배지에서 발효시간 110∼120시간 후에 에리스리톨을 가장 많이 생성하는 균을 선별함을 특징으로 하는 신균주 슈도지마 츄쿠밴시스(Pseudozyma tsukubaensis)(기탁번호 KCCM-10356호)의 분리방법
제 5항의 방법에 따라 분리된 에리스리톨 생성 신균주 슈도지마 츄쿠밴시스(Pseudozyma tsukubaensis)(기탁번호 KCCM-10356호)