CN112048498B - 一种提高β-环糊精得率的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种提高β环糊精得率的制备方法，属于环糊精生产技术领域，通过使用可逆溶解性pH敏感高分子载体Eudragit S‑100制备固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，并以制得的固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌生产β‑环糊精，实现了酶及菌与产物的分离，以及提高了酶与菌的稳定性和可重复利用性，另外反应体系中添加环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，可利用酶反应所产生的葡萄糖，并产生乙醇，抑制环糊精葡萄糖基转移酶的偶合反应和水解反应，促进其环化反应，同时环糊精葡萄糖基转移酶环化反应与环糊精葡萄糖基转移酶产生菌生长产生环糊精葡萄糖基转移酶相协同，提高p一环糊精的得率。

Description

一种提高β-环糊精得率的制备方法
技术领域
本发明涉及环糊精生产技术领域，尤其涉及一种提高β-环糊精得率的制备方法。
背景技术
环糊精是由D-毗喃葡萄糖通过。-1,4-糖普键连接而成的环状化合物，其中以6,7和8个葡萄糖单元所构成的α-、β-和γ-环糊精最为常见。环糊精能与许多疏水性分子形成包合物，从而改变它们的理化性质，因此，在食品、医药、化工、农业等领域中有着广泛的应用。α、β和γ三种环糊精均为白色晶体粉末，其中β-环糊精的水溶解度最低，因此它易于结晶和提纯，因此目前工业上生产和广泛应用的是β-环糊精。
环糊精的工业化生产主要采用酶法工艺，即在环糊精葡萄糖基转移酶催化作用下通过环化反应转化淀粉所合成，一般采用两种方式:非控制过程和控制过程。这两种工艺的主要区别是，非控制过程的酶反应体系中不添加有机溶剂作为复合剂，而控制过程的反应体系中添加有机溶剂作为复合剂。有机溶剂的添加虽可降低产物抑制，增加环糊精得率，但由于其具有毒性和危险性，在一定程度上限制了环糊精的工业应用。而且，环糊精葡萄糖基转移酶同时具有催化环化、偶合和水解的作用，环化作用生成环糊精，偶合是环化的副反应，小分子糖是偶合反应的底物，水解作用是指当环化作用不占主导作用时环糊精会被水解，小分子糖的存在抑制环化反应并促进偶合和水解反应，从而影响最终收率。另外，酶法工艺存在游离酶一次使用、无法回收再利用，且游离酶与产物混合在一起，增加分离纯化负担等缺点。有必要提供一种酶重复利用率高、产物得率及纯度高的β-环糊精制备方法。
发明内容
本发明目的在于提供一种提高β-环糊精得率的制备方法，其酶重复利用率高、产物得率及纯度高。
为达此目的，本发明提供一种提高β-环糊精得率的制备方法，包括以下步骤：
1)固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌制备:
用乙醇溶液溶解Eudragit S-100，Eudragit S-100浓度为15～30g/L，按体积比1:4的比例，加入含有50～70U/mL的环糊精葡萄糖基转移酶和5～10cfu/mL环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，混合均匀，在25～35℃、PH6.0～8.0的条件下，温育1～3h；温育后，用PH调节剂调节溶液pH＜6.0，静置得悬浮液，6000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球：加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再6000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，置于4℃保存备用；
2)制备β-环糊精：
淀粉与蒸馏水混合进行淀粉调浆，得到淀粉浓度为20％～30％的淀粉乳，进行预处理后，用氨水调节PH为6.0～8.0，加入步骤1)制备的固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，得到反应液，控制反应液温度为30℃，反应10～20h；反应后，加入PH调节剂调节溶液pH＜6.0，静置的悬浮液，6000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球：加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再6000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到回收的固定化环糊精葡萄糖基转移酶，置于4℃保存备用；上清液经分离纯化得到β-环糊精。
进一步优选的，所述环糊精葡萄糖基转移酶产生菌包括熊艳军、宿玲恰、王蕾、吴敬及陈晟等人的“环糊精葡萄糖转移酶的酿酒酵母表面展示及其生产2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸”中公开的重组酿酒酵母EBY100-pYD1-cgt。
进一步优选的，所述PH调节剂为硝酸弱碱盐或强酸铵盐。
进一步优选的，所述PH调节剂为硝酸铵。
进一步优选的，所述预处理为在80～100℃下搅拌20～30min。
进一步优选的，所述步骤2)加入的固定化环糊精葡萄糖基转移酶的添加量为1～5U/g干淀粉，固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌浓度为3～10cfu/mL。
进一步优选的，所述分离纯化包括所述分离纯化包括将上清液三次依次经过冷却结晶、溶解水洗及离心分离得到β-环糊精一和三次的离心液，将三次的离心液混合进行5倍浓缩，结晶离心后再三次依次经过冷却结晶、溶解水洗及离心分离得到β-环糊精二，将β-环糊精一和β-环糊精二混合、干燥及粉碎得到成品β-环糊精。
有益效果：本发明在反应体系中添加环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，在环糊精葡萄糖基转移酶产生菌生长过程可以利用酶反应所产生的葡萄糖作为碳源，以含氮PH调节剂及氨水作为氮源，并产生乙醇，反应体系中葡萄糖含量的减少可以在一定程度上抑制环糊精葡萄糖基转移酶的偶合反应和水解反应，乙醇的产生能促进其环化反应，从而提高p一环糊精的得率。同时环糊精葡萄糖基转移酶产生菌在生长过程中产生环糊精葡萄糖基转移酶促进环化反应产生β-环糊精，环糊精葡萄糖基转移酶环化反应与环糊精葡萄糖基转移酶产生菌生长产生环糊精葡萄糖基转移酶相协同，提高p一环糊精的得率。另外，使用固定化环糊精葡萄糖基转移酶与环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，使得在酶与菌均可多次回收利用，提高酶与菌利用率的同时，避免造成后期β-环糊精分离纯化的负担，提高了β-环糊精的纯度。
且本发明制得的固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌稳定性好及重复利用性高。
附图说明
图1-5是实施例1-5制得的固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌的重复利用性评价。
具体实施方式
下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种提高β-环糊精得率的制备方法，包括以下步骤：
1)固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌制备:
用乙醇溶液溶解Eudragit S-100，Eudragit S-100浓度为15～30g/L，按体积比1:4的比例，加入含有50～70U/mL的环糊精葡萄糖基转移酶和5～10cfu/mL环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，混合均匀，在25～35℃、PH6.0～8.0的条件下，温育1～3h；温育后，用PH调节剂调节溶液pH＜6.0，静置得悬浮液，6000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球：加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再6000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，置于4℃保存备用；
2)制备β-环糊精：
淀粉与蒸馏水混合进行淀粉调浆，得到淀粉浓度为20％～30％的淀粉乳，在80～100℃下搅拌20～30min后，用氨水调节PH为6.0～8.0，加入步骤1)制备的固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，加入的固定化环糊精葡萄糖基转移酶的添加量为1～5U/g干淀粉，固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌浓度为3～10cfu/mL，得到反应液，控制反应液温度为30℃，反应10～20h；反应后，加入PH调节剂调节溶液pH＜6.0，静置的悬浮液，6000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球：加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再6000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到回收的固定化环糊精葡萄糖基转移酶，置于4℃保存备用；将上清液三次依次经过冷却结晶、溶解水洗及离心分离得到β-环糊精一和三次的离心液，将三次的离心液混合进行5倍浓缩，结晶离心后再三次依次经过冷却结晶、溶解水洗及离心分离得到β-环糊精二，将β-环糊精一和β-环糊精二混合、干燥及粉碎得到成品β-环糊精。
所述环糊精葡萄糖基转移酶产生菌包括熊艳军、宿玲恰、王蕾、吴敬及陈晟等人的“环糊精葡萄糖转移酶的酿酒酵母表面展示及其生产2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸”中公开的重组酿酒酵母EBY100-pYD1-cgt。所述PH调节剂为硝酸弱碱盐或强酸铵盐。
实施例1
本实施提供一种提高β-环糊精得率的制备方法，包括以下步骤：
1)固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌制备:
用乙醇溶液溶解Eudragit S-100后，Eudragit S-100浓度为15g/L，按体积比1:4的比例，加入含有50U/mL的环糊精葡萄糖基转移酶和10cfu/mL环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，混合均匀，在25～35℃、PH6.0～8.0的条件下，温育1～3h；温育后，用硫酸铵溶液调节溶液pH＜6.0，静置得悬浮液，6000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球：加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再6000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，置于4℃保存备用；
2)制备β-环糊精：
淀粉与蒸馏水混合进行淀粉调浆，得到淀粉浓度为20％的淀粉乳，在80～100℃下搅拌20～30min后，用氨水调节PH为6.0～8.0，加入步骤1)制备的固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，加入的固定化环糊精葡萄糖基转移酶的添加量为5U/g干淀粉，固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌浓度为2cfu/mL，得到反应液，控制反应液温度为30℃，反应10～20h；反应后，加入PH调节剂调节溶液pH＜6.0，静置的悬浮液，6000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球：加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再6000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到回收的固定化环糊精葡萄糖基转移酶和固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，置于4℃保存备用；将上清液三次依次经过冷却结晶、溶解水洗及离心分离得到β-环糊精一和三次的离心液，将三次的离心液混合进行5倍浓缩，结晶离心后再三次依次经过冷却结晶、溶解水洗及离心分离得到β-环糊精二，将β-环糊精一和β-环糊精二混合、干燥及粉碎得到成品β-环糊精。
实施例2
本实施例提供一种提高β-环糊精得率的制备方法，包括以下步骤：
1)固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌制备:
用乙醇溶液溶解Eudragit S-100，Eudragit S-100浓度为20g/L，按体积比1:4的比例，加入含有58U/mL的环糊精葡萄糖基转移酶和9cfu/mL环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，混合均匀，在25～35℃、PH6.0～8.0的条件下，温育1～3h；温育后，用硝酸铵调节溶液pH＜6.0，静置得悬浮液，6000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球：加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再6000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，置于4℃保存备用；
2)制备β-环糊精：
淀粉与蒸馏水混合进行淀粉调浆，得到淀粉浓度为24％的淀粉乳，在80～100℃下搅拌20～30min后，用氨水调节PH为6.0～8.0，加入步骤1)制备的固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，加入的固定化环糊精葡萄糖基转移酶的添加量为4U/g干淀粉，固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌浓度为5cfu/mL，得到反应液，控制反应液温度为30℃，反应10～20h；反应后，加入PH调节剂调节溶液pH＜6.0，静置的悬浮液，6000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球：加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再6000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到回收的固定化环糊精葡萄糖基转移酶，置于4℃保存备用；将上清液三次依次经过冷却结晶、溶解水洗及离心分离得到β-环糊精一和三次的离心液，将三次的离心液混合进行5倍浓缩，结晶离心后再三次依次经过冷却结晶、溶解水洗及离心分离得到β-环糊精二，将β-环糊精一和β-环糊精二混合、干燥及粉碎得到成品β-环糊精。
实施例3
本实施例提供一种提高β-环糊精得率的制备方法，包括以下步骤：
1)固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌制备:
用乙醇溶液溶解Eudragit S-100，Eudragit S-100浓度为25g/L，按体积比1:4的比例，加入含有63U/mL的环糊精葡萄糖基转移酶和7cfu/mL环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，混合均匀，在25～35℃、PH6.0～8.0的条件下，温育1～3h；温育后，用硫酸铵溶液调节溶液pH＜6.0，静置得悬浮液，6000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球：加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再6000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，置于4℃保存备用；
2)制备β-环糊精：
淀粉与蒸馏水混合进行淀粉调浆，得到淀粉浓度为27％的淀粉乳，在80～100℃下搅拌20～30min后，用氨水调节PH为6.0～8.0，加入步骤1)制备的固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，加入的固定化环糊精葡萄糖基转移酶的添加量为2U/g干淀粉，固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌浓度为7cfu/mL，得到反应液，控制反应液温度为30℃，反应10～20h；反应后，加入PH调节剂调节溶液pH＜6.0，静置的悬浮液，6000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球：加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再6000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到回收的固定化环糊精葡萄糖基转移酶，置于4℃保存备用；将上清液三次依次经过冷却结晶、溶解水洗及离心分离得到β-环糊精一和三次的离心液，将三次的离心液混合进行5倍浓缩，结晶离心后再三次依次经过冷却结晶、溶解水洗及离心分离得到β-环糊精二，将β-环糊精一和β-环糊精二混合、干燥及粉碎得到成品β-环糊精。
实施例4
本实施例提供一种提高β-环糊精得率的制备方法，包括以下步骤：
1)固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌制备:
用乙醇溶液溶解Eudragit S-100，Eudragit S-100浓度为30g/L，按体积比1:4的比例，加入含有70U/mL的环糊精葡萄糖基转移酶和5cfu/mL环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，混合均匀，在25～35℃、PH6.0～8.0的条件下，温育1～3h；温育后，用PH调节剂调节溶液pH＜6.0，静置得悬浮液，6000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球：加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再6000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，置于4℃保存备用；
2)制备β-环糊精：
淀粉与蒸馏水混合进行淀粉调浆，得到淀粉浓度为30％的淀粉乳，在80～100℃下搅拌20～30min后，用氨水调节PH为6.0～8.0，加入步骤1)制备的固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，加入的固定化环糊精葡萄糖基转移酶的添加量为1U/g干淀粉，固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌浓度为10cfu/mL，得到反应液，控制反应液温度为30℃，反应10～20h；反应后，加入硝酸铵溶液调节溶液pH＜6.0，静置的悬浮液，6000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球：加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再6000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到回收的固定化环糊精葡萄糖基转移酶，置于4℃保存备用；将上清液三次依次经过冷却结晶、溶解水洗及离心分离得到β-环糊精一和三次的离心液，将三次的离心液混合进行5倍浓缩，结晶离心后再三次依次经过冷却结晶、溶解水洗及离心分离得到β-环糊精二，将β-环糊精一和β-环糊精二混合、干燥及粉碎得到成品β-环糊精。
实施例5
本实施例提供一种提高β-环糊精得率的制备方法，包括以下步骤：
1)固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌制备:
用乙醇溶液溶解Eudragit S-100，Eudragit S-100浓度为23g/L，按体积比1:4的比例，加入含有60U/mL的环糊精葡萄糖基转移酶和8cfu/mL环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，混合均匀，在25～35℃、PH6.0～8.0的条件下，温育1～3h；温育后，用硝酸铵溶液调节溶液pH＜6.0，静置得悬浮液，6000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球：加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再6000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，置于4℃保存备用；
2)制备β-环糊精：
淀粉与蒸馏水混合进行淀粉调浆，得到淀粉浓度为25％的淀粉乳，在80～100℃下搅拌20～30min后，用氨水调节PH为6.0～8.0，加入步骤1)制备的固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，加入的固定化环糊精葡萄糖基转移酶的添加量为3U/g干淀粉，固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌浓度为6cfu/mL，得到反应液，控制反应液温度为30℃，反应10～20h；反应后，加入PH调节剂调节溶液pH＜6.0，静置的悬浮液，6000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球：加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再6000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到回收的固定化环糊精葡萄糖基转移酶，置于4℃保存备用；将上清液三次依次经过冷却结晶、溶解水洗及离心分离得到β-环糊精一和三次的离心液，将三次的离心液混合进行5倍浓缩，结晶离心后再三次依次经过冷却结晶、溶解水洗及离心分离得到β-环糊精二，将β-环糊精一和β-环糊精二混合、干燥及粉碎得到成品β-环糊精。
对比例1
本对比例提供一种提高β-环糊精得率的制备方法，与实施例5提供的提高β-环糊精得率的制备方法不同之处在于，步骤1)中未添加环糊精葡萄糖基转移酶产生菌制备固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，步骤2)中未添加固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌。
对比例2
本对比例提供一种提高β-环糊精得率的制备方法，与实施例5提供的提高β-环糊精得率的制备方法不同之处在于，不包括步骤1)，步骤2)中添加的是游离环糊精葡萄糖基转移酶且未添加环糊精葡萄糖基转移酶产生菌。
对比例3
本对比例提供一种提高β-环糊精得率的制备方法，与实施例5提供的提高β-环糊精得率的制备方法不同之处在于，上清液分离纯化步骤为将上清液经过一次冷却结晶、溶解水洗、离心分离、干燥及粉碎得到成品β-环糊精。
对比例4
本对比例提供一种提高β-环糊精得率的制备方法，与实施例5提供的提高β-环糊精得率的制备方法不同之处在于，不包括步骤1)，步骤2中添加的是游离环糊精葡萄糖基转移酶和环糊精葡萄糖基转移酶产生菌。
各实施例及对比例结果数据如表1所示。表中所示回收率为环糊精葡萄糖基转移酶及环糊精葡萄糖基转移酶产生菌的回收率。
表1各实施例及对比例结果数据
β-环糊精得率/％ β-环糊精纯度/％ 回收率/％
实施例1 68.4 95.8 98.3
实施例2 67.8 95.3 98.1
实施例3 69.2 96.6 99.2
实施例4 67.9 95.2 98.7
实施例5 70.1 97.5 99.6
对比例1 47.6 92.8 97.5.
对比例2 43.9 85.4 0
对比例3 61.3 83.6 97.8
对比例4 63.4 83.7 0
实施例1～5所得的固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌在5℃、PH5.0条件下储存两个月后的酶活比如表2所示，所述酶活比为储存两个月的酶活/初始酶活。
表2酶活力数据
重复利用性测定：
以5％(干基，w/v)淀粉乳为底物，加入实施例1～5制得的固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶9产生菌1％(w/v)进行反应12h，分离出底物，进行清洗，后重新加入新的底物进行反应。以12h为反应周期，每周期取样，得上清液进行产物分析，根据β-环糊精的产量进行重复性评价，以第一次β-环糊精产量为100％，计算相对活性，以使用次数为横坐标，相对活性为纵坐标作曲线，以评价其重复利用性，如图1～5所示。
由表1可知，各实施例所得的β-环糊精得率及纯度均高于对比例所得的β-环糊精得率及纯度，尤其是实施例5所得的β-环糊精得率是对比例1的147％、是对比例2的159.7％、是对比例3的114.3％。本发明在反应体系中添加环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，在环糊精葡萄糖基转移酶产生菌生长过程可以利用酶反应所产生的葡萄糖作为碳源，以含氮PH调节剂及氨水作为氮源，并产生乙醇，反应体系中葡萄糖含量的减少可以在一定程度上抑制环糊精葡萄糖基转移酶的偶合反应和水解反应，乙醇的产生能促进其环化反应，从而提高p一环糊精的得率。同时环糊精葡萄糖基转移酶产生菌在生长过程中产生环糊精葡萄糖基转移酶促进环化反应产生β-环糊精，环糊精葡萄糖基转移酶环化反应与环糊精葡萄糖基转移酶产生菌生长产生环糊精葡萄糖基转移酶相协同，提高p一环糊精的得率。另外，使用固定化环糊精葡萄糖基转移酶与环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，使得在酶与菌均可多次回收利用，提高酶与菌利用率的同时，避免造成后期β-环糊精分离纯化的负担，提高了β-环糊精的纯度。
由表2可知，实施例1～5所得的固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌在5℃、PH5.0条件下储存两个月后的酶活比仍高于95％，说明，本发明制得的固定化环糊精葡萄糖基转移酶与环糊精葡萄糖基转移酶产生菌稳定性好。由图1～5可知，实施例1～5所得的固定化环糊精葡萄糖基转移酶与固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，重复利用6次以后仍具有高于90％的相对活性，说明，本发明制得的固定化环糊精葡萄糖基转移酶与环糊精葡萄糖基转移酶产生菌重复利用性高。
以上所揭露的仅为本发明几种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明申请专利范围所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (6)

1.一种提高β-环糊精得率的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌制备:
用乙醇溶液溶解Eudragit S-100，Eudragit S-100浓度为15～30g/L，按体积比1:4的比例，加入含有50～70U/mL的环糊精葡萄糖基转移酶和5～10cfu/mL环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，混合均匀，在25～35℃、PH6.0～8.0的条件下，温育1～3h；温育后，用PH调节剂调节溶液pH＜6.0，静置得悬浮液，6000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球：加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再6000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，置于4℃保存备用；
2)制备β-环糊精：
淀粉与蒸馏水混合进行淀粉调浆，得到淀粉浓度为20％～30％的淀粉乳，进行预处理后，用氨水调节PH为6.0～8.0，加入步骤1)制备的固定化环糊精葡萄糖基转移酶及固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌，得到反应液，控制反应液温度为30℃，反应10～20h；反应后，加入PH调节剂调节溶液pH＜6.0，静置的悬浮液，6000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球：加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再6000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到回收的固定化环糊精葡萄糖基转移酶，置于4℃保存备用；上清液经分离纯化得到β-环糊精；
所述分离纯化包括将上清液三次依次经过冷却结晶、溶解水洗及离心分离得到β-环糊精一和三次的离心液，将三次的离心液混合进行5倍浓缩，结晶离心后再三次依次经过冷却结晶、溶解水洗及离心分离得到β-环糊精二，将β-环糊精一和β-环糊精二混合、干燥及粉碎得到成品β-环糊精。
2.如权利要求1所述的提高β-环糊精得率的制备方法，其特征在于，所述环糊精葡萄糖基转移酶产生菌包括熊艳军、宿玲恰、王蕾、吴敬及陈晟等人的“环糊精葡萄糖转移酶的酿酒酵母表面展示及其生产2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸”中公开的重组酿酒酵母EBY100-pYD1-cgt。
3.如权利要求1所述的提高β-环糊精得率的制备方法，其特征在于，所述PH调节剂为硝酸弱碱盐或强酸铵盐。
4.如权利要求3所述的提高β-环糊精得率的制备方法，其特征在于，所述PH调节剂为硝酸铵。
5.如权利要求1所述的提高β-环糊精得率的制备方法，其特征在于，所述预处理为在80～100℃下搅拌20～30min。
6.如权利要求1所述的提高β-环糊精得率的制备方法，其特征在于，所述步骤2)加入的固定化环糊精葡萄糖基转移酶的添加量为1～5U/g干淀粉，固定化环糊精葡萄糖基转移酶产生菌浓度为3～10cfu/mL。
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