CN113913316B - 一种高产肌醇酿酒酵母工程菌的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高产肌醇酿酒酵母工程菌的构建方法，属于生物工程技术领域。本发明公开的一种高产肌醇酿酒酵母工程菌的构建方法，首先敲除酿酒酵母BY4741中的肌醇生物合成转录抑制子基因opi1，再进一步敲除pgi1基因和zwf1基因，阻断糖酵解和戊糖磷酸途径，同时过表达肌醇‑3‑磷酸合成酶基因ino1，构建了生物安全性的产肌醇基因工程菌株。该工程菌株利用蔗糖作为碳源，分解形成的果糖用于自身的生长代谢，而葡萄糖用于生产肌醇。本发明工程菌株摇瓶水平肌醇产量可达5.65g/L，采用高密度发酵培养方法，在15L发酵罐中肌醇产量可达41.7g/L，对于肌醇的工业化生产具有重要的应用意义。

Description

一种高产肌醇酿酒酵母工程菌的构建方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，更具体的说是涉及一种高产肌醇酿酒酵母工程菌的构建方法。
背景技术
肌醇又名环已六醇，是水溶性维生素族中的一种。肌醇存在于动植物、微生物体内，具有诸多生理功能，是细胞膜的组成成分之一，在膜磷脂平衡中扮演着重要的角色，在医药、食品、饲料工业领域等具有很大的实用价值。近年来，随着对肌醇作用和潜力认识的深化，国际市场对肌醇的需求逐年增加。
目前肌醇的生产方法主要是提取米糠、麸皮等底物中的植酸钙，进行加压水解制备，该方法存在产率低、污染环境、成本投入高等缺点，因此非常有必要通过其他有效途径来解决肌醇供求之间的矛盾。生物法制备肌醇因其诸多优势越来越受到研究者的重视，主要包括微生物酶催化法产肌醇和微生物发酵法产肌醇。目前微生物发酵法生产肌醇所用的菌株有酵母菌、大肠杆菌以及枯草芽孢杆菌等。大肠杆菌易受到噬菌体的污染，枯草芽孢杆菌难以达到较高的菌体密度，因此酵母菌是最适合工业化发酵生产肌醇的微生物。
酵母中肌醇的生物合成途径基本明晰，其中肌醇-3-磷酸合成酶是关键酶，其编码基因是ino1。目前有将含有ino1的质粒转化于肌醇营养缺陷型粟酒裂殖酵母菌内，使其成为肌醇原养型，其中Sch.P944菌株的肌醇分泌量达到816mg/L。还有对不具有内源肌醇合成途径的Escherichia coli进行代谢改造，得到工程菌株AKC-016-G22，其肌醇产量为2.31g/L。
酿酒酵母具有遗传背景清楚、食品级安全、抗逆性强以及发酵条件容易控制等许多优良特性，因此被广泛用作食品、医药以及化工工业的生产菌株。尽管现在已经有部分关于酿酒酵母表达肌醇的报道，但表达量明显偏低，远远不能满足日益增长的市场需求。
因此，提供一种高产肌醇酿酒酵母工程菌的构建方法，继续提高酿酒酵母肌醇产量是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种高产肌醇酿酒酵母工程菌的构建方法，进一步提高酿酒酵母的肌醇产量。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种高产肌醇酿酒酵母工程菌的构建方法，具体步骤如下：
(1)以酿酒酵母BY4741为出发菌株，敲除肌醇生物合成转录抑制子基因opi1，获得敲除opi1基因的工程菌BY4741-△opi1；
opi1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
(2)敲除工程菌BY4741-△opi1的糖酵解关键基因pgi1，获得敲除pgi1基因的工程菌BY4741-△opi1-△pgi1；
pgi1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；
(3)敲除工程菌BY4741-△opi1-△pgi1的戊糖磷酸途径关键基因zwf1，获得敲除zwf1基因的工程菌BY4741-△opi1-△pgi1-△zwf1；
zwf1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示；
(4)在工程菌BY4741-△opi1-△pgi1-△zwf1中过表达肌醇-3-磷酸合成酶基因ino1，构建BY4741-△opi1-△pgi1-△zwf1(ino+)高产肌醇酿酒酵母工程菌；
ino1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.16所示。
进一步，步骤(4)的具体操作步骤如下：
(1)以酿酒酵母BY4741提取的基因组为模板，PCR分别扩增带Kpn I酶切位点的TEF1启动子序列、ino1基因序列和带EcoR I酶切位点的CYC1终止子序列；将上述3段基因进行重叠PCR，得到TEF1+ino1+CYC1基因片段；
(2)将TEF1+ino1+CYC1基因片段与YEplac181质粒分别进行双酶切，连接，获得重组表达质粒YEplac181-ino1；
(3)将重组表达质粒YEplac181-ino1电转化进入酿酒酵母菌株BY4741-△opi1-△pgi1-△zwf1，经筛选获得BY4741-△opi1-△pgi1-△zwf1(ino+)高产肌醇酿酒酵母工程菌。
进一步，所述高产肌醇酿酒酵母工程菌在制备含有肌醇产品中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种高产肌醇酿酒酵母工程菌的构建方法，首先敲除酿酒酵母BY4741中的肌醇生物合成转录抑制子基因opi1，再进一步敲除pgi1基因和zwf1基因，阻断糖酵解和戊糖磷酸途径，同时过表达肌醇-3-磷酸合成酶基因ino1，构建了生物安全性的高产肌醇酿酒酵母基因工程菌株。该工程菌株利用蔗糖作为碳源，分解形成的果糖用于自身的生长代谢，而葡萄糖用于生产肌醇。本发明工程菌株摇瓶水平肌醇产量可达5.65g/L，采用高密度发酵培养方法，在15L发酵罐中肌醇产量可达41.7g/L，为代谢工程改造酿酒酵母生产肌醇的工业化奠定了基础，具有很好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明PCR验证的酿酒酵母BY4741中opi1基因已敲除的核酸凝胶电泳图；
其中，M为DNA Marker；CK为野生型BY4741基因组PCR产物；1-3分别为菌落PCR筛选获得的阳性克隆基因组PCR产物；
图2附图为本发明PCR验证的酿酒酵母BY4741中pgi1基因已敲除的核酸凝胶电泳图；
其中，M为DNA Marker；CK为野生型BY4741基因组PCR产物；1为菌落PCR筛选获得的阳性克隆基因组PCR产物；
图3附图为本发明PCR验证的酿酒酵母BY4741中zwf1基因已敲除的核酸凝胶电泳图；
其中，M为DNA Marker；CK为野生型BY4741基因组PCR产物；1为菌落PCR筛选获得的阳性克隆基因组PCR产物；
图4附图为本发明重组质粒YEplac181-ino1酶切鉴定结果；
其中，M为DNA Marker；1-3分别为重组质粒YEplac181-ino1双酶切产物；
图5附图为本发明重组质粒YEplac181-ino1的构建流程。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1敲除酿酒酵母BY4741的肌醇生物合成转录抑制子基因opi1
具体操作如下：
(1)PCR构建敲除组件：敲除组件引物设计时其5’端45个碱基与opi1基因(opi1基因的核苷酸序列见SEQ ID NO.1)进行同源重组。以质粒pUG6为模板，用引物对BOG-F和BOG-R进行PCR反应。PCR反应体系：10×Buffer5μL；DNTP Mixture(2.5mM each)4μL；BOG-F(10μM)1μL；BOG-R(10μM)1μL；模板1μL；Fast pfu polymerse(5U/uL)1μL；ddH2O补足至50μL。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火20s，72℃延伸3min，35个循环；72℃延伸5min；4℃保温。电泳后的PCR产物利用胶回收试剂盒回收，作为opi1基因敲除用的敲除组件。
BOG-F和BOG-R的引物序列如下：
BOG-F：5’-GCGTGTGTATCAGGACAGTGTTTTTAACGAAGATACTAGTCATTGTGCAGGTCGACAACCCTTAAT-3’；SEQ ID NO.2；
BOG-R：5’-TATTATTACTGGTGGTAATGCATGAAAGACCTCAATCTGTCTCGGTAGTGGATCTGATATCACCTA；SEQ ID NO.3。
(2)电转化及PCR验证：
1)将酿酒酵母BY4741的单菌落接种于5ml YPD培养基中，30℃过夜培养；
2)取上述培养物以1％的接种量转接到50mL新鲜YPD液体培养基中，于30℃剧烈振摇，直到细胞密度达1*108(OD600约为1.3-1.5)；
3)于4℃4,000r/min离心5min收集菌体；
4)弃上清，加入已预冷的30mL超纯水洗涤菌体一次；
5)4℃4,000r/min离心5min收集菌体，用15mL 1mol/L山梨醇重复洗涤菌体二次；
6)离心收集菌体，加入200μL 1mol/L山梨醇重悬菌体，取100μL的菌悬液至1.5mL离心管中；
7)在制得的菌悬液中加入小于等于100ng待转化的DNA片段(体积小于10μl)，轻轻混匀后冰浴10min；
8)将冰浴后的菌悬液转入已预冷的电转杯中，1,500V电击5ms；
9)加入1ml冰冷的1mol/L山梨醇将电转后的菌悬液从电转杯中洗出，取200μL涂布含有G418的YPD平板；
10)30℃培养3天挑选转化子；通过菌落PCR筛选阳性克隆，并提取基因组用引物对opi12-F和opi12-R进行PCR验证；PCR验证结果见图1，CK为野生型BY4741基因组PCR产物；1-3分别为菌落PCR筛选获得的阳性克隆基因组PCR产物；opi1基因若未敲除条带大小为1295bp，若被敲除条带大小为1693bp；其中泳道3为验证正确的opi1基因敲除菌株BY4741-△opi1+G418。
其中，opi12-F和opi12-R的引物序列如下：
opi12-F：5’-TTAAAGCGTGTGTATCAGGACAG-3’；SEQ ID NO.4；
opi12-R：5’-TAATGCATGAAAGACCTCAATCTG-3’；SEQ ID NO.5。
(3)G418筛选标记的敲除：
1)根据Cre/loxP系统敲除原理，将pSH47质粒转化BY4741-△opi1+G418，利用YPG液体培养基诱导培养，经半乳糖诱导表达产生Cre重组酶切除G418；
2)将所得菌液在YPD平板上划线，待菌落长出后挑同一单菌落分别转接到YPD和含有G418的YPD平板的对应位置上，30℃下恒温培养2天；
3)将YPD上生长而含有G418的YPD上不生长的菌落挑出来，在YPD液体培养基中连续传代10-15代丢失质粒pSH47，影印URA3平板筛选，筛选获得敲除了opi1基因的工程菌BY4741-△opi1。
实施例2敲除工程菌BY4741-△opi1的糖酵解关键基因pgi1
具体操作如下：
(1)PCR构建敲除组件：敲除组件引物设计时其5’端45个碱基与pgi1基因(pgi1基因的核苷酸序列见SEQ ID NO.6)进行同源重组。以质粒pUG6为模板，用引物对BPG-F和BPG-R进行PCR反应。PCR反应体系：10×Buffer5μL；DNTP Mixture(2.5mM each)4μL；BPG-F(10μM)1μL；BPG-R(10μM)1μL；模板1μL；Fast pfu polymerse(5U/uL)1μL；ddH2O补足至50μL。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火20s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸5min；4℃保温。电泳后的PCR产物利用胶回收试剂盒回收，作为pgi1基因敲除用的敲除组件。
BPG-F和BPG-R的引物序列如下：
BPG-F：5’-TCTAGTCTTGCAAAATCGATTTAGAATCAAGATACCAGCCTAAAAGTACGCTGCAGGTCGACAAC-3’；SEQ ID NO.7；
BPG-R：5’-ATATAGCTTTAATGTTCTTTAGGTATATATTTAAGAGCGATTTGTCACTAGTGGATCTGATATC-3’；SEQ ID NO.8。
(2)电转化及PCR验证：
1)将酿酒酵母菌株BY4741-△opi1接种于5mlYPD培养基中，30℃过夜培养；
2)取上述培养物以1％的接种量转接到50mL新鲜YPD液体培养基中，于30℃剧烈振摇，直到细胞密度达1*108(OD600约为1.3-1.5)；
3)于4℃4,000r/min离心5min收集菌体；
4)弃上清，加入已预冷的30mL超纯水洗涤菌体一次；
5)4℃4,000r/min离心5min收集菌体，用15mL1mol/L山梨醇重复洗涤菌体二次；
6)离心收集菌体，加入200μL 1mol/L山梨醇重悬菌体，取100μL的菌悬液至1.5mL离心管中；
7)在制得的菌悬液中加入小于等于100ng待转化的DNA片段(体积小于10μl)，轻轻混匀后冰浴10min；
8)将冰浴后的菌悬液转入已预冷的电转杯中，1,500V电击5ms；
9)加入1ml冰冷的1mol/L山梨醇将电转后的菌悬液从电转杯中洗出，取200μL涂布含有G418的YPD平板；
10)30℃培养3天挑选转化子。通过菌落PCR筛选阳性克隆，并提取基因组用引物对pgi1U-F和G418M-R进行PCR验证；PCR验证结果见图2，由于pgi1基因与G418条带大小相仿，故设计G418内部引物进行PCR验证，pgi1基因若未敲除则扩不出条带，若被敲除条带大小为731bp；CK为野生型BY4741基因组PCR产物；泳道1为验证正确的pgi1敲除菌株BY4741-△opi1-△pgi1+G418。
其中，pgi1U-F和G418M-R的引物序列如下：
pgi1U-F：5’-CATATTCCTCTAGTCTTGCAAAATCG-3’；SEQ ID NO.9；
G418M-R：5’-CAGCCAGTTTAGTCTGACCATC-3’；SEQ ID NO.10。
(3)G418筛选标记的敲除：
1)根据Cre/loxP系统敲除原理，将pSH47质粒转化BY4741-△opi1-△pgi1+G418，利用YPG液体培养基诱导培养，经半乳糖诱导表达产生Cre重组酶切除G418；
2)将所得菌液在YPD平板上划线，待菌落长出后挑同一单菌落分别转接到YPD和含有G418的YPD平板的对应位置上，30℃下恒温培养2天；
3)将YPD上生长而含有G418的YPD上不生长的菌落挑出来，在YPD液体培养基中连续传代10-15代丢失质粒pSH47，影印URA3平板筛选，筛选获得敲除了opi1基因的工程菌BY4741-△opi1-△pgi1。
实施例3敲除工程菌BY4741-△opi1-△pgi1的戊糖磷酸途径关键基因zwf1
具体操作如下：
(1)PCR构建敲除组件：敲除组件引物设计时其5’端45个碱基与zwf1基因(zwf1基因的核苷酸序列见SEQ ID NO.11)进行同源重组。以质粒pUG6为模板，用引物对BZG-F和BZG-R进行PCR反应。PCR反应体系：10×Buffer5μL；DNTP Mixture(2.5mM each)4μL；BZG-F(10μM)1μL；BZG-R(10μM)1μL；模板1μL；Fast pfu polymerse(5U/uL)1μL；ddH2O补足至50μL。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火20s；72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸5min；4℃保温。电泳后的PCR产物利用胶回收试剂盒回收，作为zwf1基因敲除用的敲除组件。
BZG-F和BZG-R的引物序列如下：
BZG-F：5’-ACAGAAAGAGTAAATCCAATAGAATAGAAAACCACATAAGGCAAGGTACGCTGCAGGTCGACAA；SEQ ID NO.12；
BZG-R：5’-AAAATTTCAGTGACTTAGCCGATAAATGAATGTGCTTGCATTTTTCACTAGTGGATCTGATATCA；SEQ ID NO.13。
(2)电转化及PCR验证：
1)将酿酒酵母菌株BY4741-△opi1-△pgi1接种于5ml YPD培养基中，30℃过夜培养；
2)取上述培养物以1％的接种量转接到50mL新鲜YPD液体培养基中，于30℃剧烈振摇，直到细胞密度达1*108(OD600约为1.3-1.5)；
3)于4℃4,000r/min离心5min收集菌体；
4)弃上清，加入已预冷的30mL超纯水洗涤菌体一次；
5)4℃4,000r/min离心5min收集菌体，用15mL 1mol/L山梨醇重复洗涤菌体二次；
6)离心收集菌体，加入200μL 1mol/L山梨醇重悬菌体，取100μL的菌悬液至1.5mL离心管中；
7)在制得的菌悬液中加入小于等于100ng待转化的DNA片段(体积小于10μl)，轻轻混匀后冰浴10min；
8)将冰浴后的菌悬液转入已预冷的电转杯中，1,500V电击5ms；
9)加入1ml冰冷的1mol/L山梨醇将电转后的菌悬液从电转杯中洗出，取200μL涂布含有G418的YPD平板；
10)30℃培养3天挑选转化子。通过菌落PCR筛选阳性克隆，并提取基因组用引物对G418M-F和zwf1-R进行PCR验证；PCR验证结果见图3，由于zwf1基因与G418条带大小相仿，故设计G418内部引物进行PCR验证，zwf1基因若未敲除则扩不出条带，若被敲除条带大小为754bp；CK为野生型BY4741基因组PCR产物；泳道1为验证正确的zwf1敲除菌株BY4741-△opi1-△pgi1-△zwf1+G418。
其中，G418M-F和zwf1-R的引物序列如下：
G418M-F：5’-TCACGAATGAATAACGGTTTG-3’；SEQ ID NO.14；
zwf1-R：5’-AGCTTGCAAGATAAAATCACTCG-3’；SEQ ID NO.15。
(3)G418筛选标记的敲除：
1)根据Cre/loxP系统敲除原理，将pSH47质粒转化BY4741-△opi1-△pgi1-△zwf1+G418，利用YPG液体培养基诱导培养，经半乳糖诱导表达产生Cre重组酶切除G418；
2)将所得菌液在YPD平板上划线，待菌落长出后挑同一单菌落分别转接到YPD和含有G418的YPD平板的对应位置上，30℃下恒温培养2天；
3)将YPD上生长而含有G418的YPD上不生长的菌落挑出来，在YPD液体培养基中连续传代10-15代丢失质粒pSH47，影印URA3平板筛选，筛选获得敲除了opi1基因的工程菌BY4741-△opi1-△pgi1-△zwf1。
实施例4 BY4741-△opi1-△pgi1-△zwf1(ino+)工程菌的构建
(1)重组质粒的构建：
1)以酿酒酵母BY4741提取的基因组为模板，分别用引物对TE-F和TE-R、TI-F和TI-R、CY-F和CY-RPCR扩增带KpnI酶切位点的TEF1启动子序列、ino1基因序列(ino1基因的核苷酸序列见SEQ ID NO.16)、带EcoR I酶切位点的CYC1终止子序列。PCR反应体系：10×Buffer5μL；DNTP Mixture(2.5mM each)4μL；Primer-F(10μM)1μL；Primer-R(10μM)1μL；模板1μL；Fast pfu polymerse(5U/uL)1μL；ddH2O补足至50μL。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火20s，72℃延伸2min/kb，35个循环；72℃延伸5min；4℃保温。
将上述3段序列用引物对TE-F和CY-R进行重叠PCR(重叠延伸PCR技术由于采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来)连在一起，PCR反应体系：10×Buffer 5μL；DNTPMixture(2.5mM each)4μL；TE-F(10μM)1μL；CY-R(10μM)1μL；模板3μL；Fast pfu polymerse(5U/uL)1μL；ddH2O补足50μL。反应程序：95℃预变性5min；95℃变性35s，60℃退火30s，72℃延伸4min，35个循环；72℃延伸5min；4℃保温；得到TEF1+ino1+CYC1基因片段。
TE-F和TE-R、TI-F和TI-R、CY-F和CY-R的引物序列如下：
TE-F：5’-GGGGTACCATAGCTTCAAAATGTTTCTACTCCTTTTTTACTCTTCCAG-3’；SEQ IDNO.17；
TE-R：5’-GCAATATTATCTTCTGTCATTTTGTAATTAAAACTTAGAT-3’；SEQ ID NO.18；
TI-F：5’-ATCTAAGTTTTAATTACAAAATGACAGAAGATAATATTGC-3’；SEQ ID NO.19；
TI-R：5’-TGACATAACTAATTACATGATTACAACAATCTCTCTTCGA-3’；SEQ ID NO.20；
CY-F：5’-GAAGAGAGATTGTTGTAATCATGTAATTAGTTATGTCA-3’；SEQ ID NO.21；
CY-R：5’-CGGAATTCGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTCCCAAAACCTTCTCAAGC-3’；SEQ IDNO.22。
2)YEplac181质粒和TEF1+ino1+CYC1基因片段分别用KpnI和EcoRI限制性内切酶进行双酶切处理；
3)将双酶切产物分别进行胶回收，T4 DNA连接酶16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后涂含有氨苄的平板，挑取阳性克隆，提质粒进行双酶切验证；酶切鉴定结果见图4。
4)将双酶切验证正确的菌液送生工测序。测序正确的重组表达质粒命名为YEplac181-ino1。重组表达质粒YEplac181-ino1的构建流程见图5。
(2)电转化及PCR验证：
1)将酿酒酵母菌株BY4741-△opi1-△pgi1-△zwf1接种于5ml YPD培养基中，30℃过夜培养；
2)取上述培养物以1％的接种量转接到50mL新鲜YPD液体培养基中，于30℃剧烈振摇，直到细胞密度达1*108(OD600约为1.3-1.5)；
3)于4℃4,000r/min离心5min收集菌体；
4)弃上清，加入已预冷的30mL超纯水洗涤菌体一次；
5)4℃4,000r/min离心5min收集菌体，用15mL 1mol/L山梨醇重复洗涤菌体二次；
6)离心收集菌体，加入200μL 1mol/L山梨醇重悬菌体，取100μL的菌悬液至1.5mL离心管中；
7)在制得的菌悬液中加入小于等于100ng待转化的YEplac181-ino1重组质粒(体积小于10μl)，轻轻混匀后冰浴10min；
8)将冰浴后的菌悬液转入已预冷的电转杯中，1,500V电击5ms；
9)加入1ml冰冷的1mol/L山梨醇将电转后的菌悬液从电转杯中洗出，取200μL涂布于不含亮氨酸的SC平板30℃培养3天；
10)用引物对TE-F和CY-R进行菌落PCR筛选阳性克隆，得到酿酒酵母工程菌BY4741-△opi1-△pgi1-△zwf1(ino+)。
实施例5工程菌摇瓶培养及肌醇含量的检测
挑取野生型BY4741、BY4741-△opi1、BY4741-△opi1-△pgi1、BY4741-△opi1-△pgi1-△zwf1、BY4741-△opi1-△pgi1-△zwf1(ino+)单菌落分别接种到5mLSC-Leu培养基中，在30℃、220r/min条件下培养20h。然后按1％的接种量接种至含有100mL以蔗糖为碳源的无肌醇发酵培养基(磷酸二氢钾6g/L，磷酸氢二铵8g/L，硫酸镁3g/L，硫酸钾12g/L，蔗糖20g/L，组氨酸12mg/L，甲硫氨酸8mg/L，尿嘧啶30mg/L)的500mL三角瓶中，30℃、220r/min培养60h后，将上述发酵液进行离心(10000r/min，2min)，取上清液稀释100倍，过0.22μm滤膜，用Waters高效液相色谱仪检测肌醇含量。色谱柱为Sugar-PakTM(6.5×300mm)；柱温：70℃；流动相：水；流速：0.5mL/min；进样量：20μL。上述不同菌株的肌醇产量见表1。
表1不同菌株的肌醇产量
菌株 肌醇产量(g/L)
BY4741 0
BY4741-△opi1 0.357
BY4741-△opi1-△pgi1 0.589
BY4741-△opi1-△pgi1-△zwf1 0.874
BY4741-△opi1-△pgi1-△zwf1(ino+) 5.65
实施例6 15L发酵罐发酵生产肌醇
将酿酒酵母工程菌BY4741-△opi1-△pgi1-△zwf1(ino+)接种于SC-Leu液体培养基，培养至OD600为2.0左右。按10％接种量将上述种子液接种于含10L发酵培养基(磷酸二氢钾6g/L，磷酸氢二铵8g/L，硫酸镁3g/L，硫酸钾12g/L，蔗糖20g/L，组氨酸12mg/L，甲硫氨酸8mg/L，尿嘧啶30mg/L)的15L发酵罐中，用35％的NaOH调节控制pH5.5，开始发酵，控制发酵液的温度为30℃，罐压0.12Mpa，设定发酵罐的溶氧为20％，溶氧的调节与发酵罐的搅拌子串联调控。当发酵培养基中的蔗糖耗尽时，补加体积百分比为30％的蔗糖以及100ml微量元素溶液/L(微量元素和蔗糖分开灭菌后再将微量元素加入到蔗糖溶液中一块补加)(微量元素配方：氯化铁1.95g/L，氯化钙0.35g/L，氯化锰0.55g/L，硫酸锌0.2g/L，氯化钴0.05g/L，氯化镍0.05g/L，钼酸钠0.05g/L)。补加蔗糖的方法是：0-8h补加8ml/h、9-16h补加16ml/h、17h之后按24ml/h补加，当溶氧回升时停止蔗糖的补加。发酵结束后取少量发酵液进行离心(10000r/min，5min)，上清液过0.22μm滤膜，使用Waters高效液相色谱仪检测肌醇产量可达41.7g/L。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 山东福洋生物科技股份有限公司
<120> 一种高产肌醇酿酒酵母工程菌的构建方法
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1215
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atgtctgaaa atcaacgttt aggattatca gaggaagagg tagaagcggc tgaagtactt 60
ggggtgttga aacaatcatg cagacagaag tcgcagcctt cagaggacgt ctcacaagct 120
gacaaaatgc cggcaagtga gtcgtctacg acgccgctaa acattttgga tcgcgtaagt 180
aacaaaatta tcagtaacgt agtgacattc tacgatgaaa taaacaccaa caagaggcca 240
ctgaaatcaa tagggaggct gctagacgat gacgatgacg agcatgatga ttacgactac 300
aacgacgatg agttcttcac caacaagaga cagaagctgt cgcgggcgat tgccaagggg 360
aaggacaact tgaaagagta caagctgaac atgtccatcg agtctaagaa gaggcttgta 420
acgtgcttgc atcttttaaa gctggccaat aagcagcttt ccgataaaat ctcgtgttta 480
caggaccttg ttgaaaagga gcaggtgcat cctttgcaca agcaagatgg aaatgctagg 540
acgaccactg gagctggcga ggacgagaca tcgtcagacg aagacgacga cgatgaggag 600
ttttttgatg cctcagagca ggtcaacgcc agcgagcagt ctattgtggt gaaaatggag 660
gtggtcggca cagtcaagaa agtctactcg ctgatatcga agttcacagc aaattcgctg 720
ccggagcccg caagatctca ggttcgggaa agtcttctaa acttacccac aaattggttc 780
gacagcgtcc acagtacatc actgccgcat catgcttcgt ttcattatgc caactgtgaa 840
gaacaaaaag tggagcaaca gcaacagcaa cagcaacagc agcagcagca gcaacttttg 900
cagcagcaac tcctgcaaca gcaacagcaa aaaaggaaca aggatggcga cgactcagcc 960
tcgccgtcct cctccgtaac tgcgaatggg aaagtactca ttctcgccaa agaatccctg 1020
gaaatggtga gaaatgtcat gggcgtagtc gactccacgt tgggcaaggc tgaagaatgg 1080
gtgaagcaga aacaggaggt aaaagaaatg atcagggagc gtttcttgca acagcagcaa 1140
cagtacaggc agcaacagca gaaggatggc aattacgtaa agccctctca ggacaacgtg 1200
gatagcaagg actaa 1215
<210> 2
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gcgtgtgtat caggacagtg tttttaacga agatactagt cattgtgcag gtcgacaacc 60
cttaat 66
<210> 3
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tattattact ggtggtaatg catgaaagac ctcaatctgt ctcggtagtg gatctgatat 60
caccta 66
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ttaaagcgtg tgtatcagga cag 23
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
taatgcatga aagacctcaa tctg 24
<210> 6
<211> 1665
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
atgtccaata actcattcac taacttcaaa ctggccactg aattgccagc ctggtctaag 60
ttgcaaaaaa tttatgaatc tcaaggtaag actttgtctg tcaagcaaga attccaaaaa 120
gatgccaagc gttttgaaaa attgaacaag actttcacca actatgatgg ttccaaaatc 180
ttgttcgact actcaaagaa cttggtcaac gatgaaatca ttgctgcatt gattgaactg 240
gccaaggagg ctaacgtcac cggtttgaga gatgctatgt tcaaaggtga acacatcaac 300
tccactgaag atcgtgctgt ctaccacgtc gcattgagaa acagagctaa caagccaatg 360
tacgttgatg gtgtcaacgt tgctccagaa gtcgactctg tcttgaagca catgaaggag 420
ttctctgaac aagttcgttc tggtgaatgg aagggttata ccggtaagaa gatcaccgat 480
gttgttaaca tcggtattgg tggttccgat ttgggtccag tcatggtcac tgaggctttg 540
aagcactacg ctggtgtctt ggatgtccac ttcgtttcca acattgacgg tactcacatt 600
gctgaaacct tgaaggttgt tgacccagaa actactttgt ttttgattgc ttccaagact 660
ttcactaccg ctgaaactat cactaacgct aacactgcca agaactggtt cttgtcgaag 720
acaggtaatg atccatctca cattgctaag catttcgctg ctttgtccac taacgaaacc 780
gaagttgcca agttcggtat tgacaccaaa aacatgtttg gtttcgaaag ttgggtcggt 840
ggtcgttact ctgtctggtc ggctattggt ttgtctgttg ccttgtacat tggctatgac 900
aactttgagg ctttcttgaa gggtgctgaa gccgtcgaca accacttcac ccaaacccca 960
ttggaagaca acattccatt gttgggtggt ttgttgtctg tctggtacaa caacttcttt 1020
ggtgctcaaa cccatttggt tgctccattc gaccaatact tgcacagatt cccagcctac 1080
ttgcaacaat tgtcaatgga atctaacggt aagtctgtta ccagaggtaa cgtgtttact 1140
gactactcta ctggttctat cttgtttggt gaaccagcta ccaacgctca acactctttc 1200
ttccaattgg ttcaccaagg taccaagttg attccatctg atttcatctt agctgctcaa 1260
tctcataacc caattgagaa caaattacat caaaagatgt tggcttcaaa cttctttgct 1320
caagctgaag ctttaatggt tggtaaggat gaagaacaag ttaaggctga aggtgccact 1380
ggtggtttgg tcccacacaa ggtcttctca ggtaacagac caactacctc tatcttggct 1440
caaaagatta ctccagctac tttgggtgct ttgattgcct actacgaaca tgttactttc 1500
actgaaggtg ccatttggaa tatcaactct ttcgaccaat ggggtgttga attgggtaaa 1560
gtcttggcta aagtcatcgg caaggaattg gacaactcct ccaccatttc tacccacgat 1620
gcttctacca acggtttaat caatcaattc aaggaatgga tgtga 1665
<210> 7
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tctagtcttg caaaatcgat ttagaatcaa gataccagcc taaaagtacg ctgcaggtcg 60
acaac 65
<210> 8
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
atatagcttt aatgttcttt aggtatatat ttaagagcga tttgtcacta gtggatctga 60
tatc 64
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
catattcctc tagtcttgca aaatcg 26
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
cagccagttt agtctgacca tc 22
<210> 11
<211> 1518
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
atgagtgaag gccccgtcaa attcgaaaaa aataccgtca tatctgtctt tggtgcgtca 60
ggtgatctgg caaagaagaa gacttttccc gccttatttg ggcttttcag agaaggttac 120
cttgatccat ctaccaagat cttcggttat gcccggtcca aattgtccat ggaggaggac 180
ctgaagtccc gtgtcctacc ccacttgaaa aaacctcacg gtgaagccga tgactctaag 240
gtcgaacagt tcttcaagat ggtcagctac atttcgggaa attacgacac agatgaaggc 300
ttcgacgaat taagaacgca gatcgagaaa ttcgagaaaa gtgccaacgt cgatgtccca 360
caccgtctct tctatctggc cttgccgcca agcgtttttt tgacggtggc caagcagatc 420
aagagtcgtg tgtacgcaga gaatggcatc acccgtgtaa tcgtagagaa acctttcggc 480
cacgacctgg cctctgccag ggagctgcaa aaaaacctgg ggcccctctt taaagaagaa 540
gagttgtaca gaattgacca ttacttgggt aaagagttgg tcaagaatct tttagtcttg 600
aggttcggta accagttttt gaatgcctcg tggaatagag acaacattca aagcgttcag 660
atttcgttta aagagaggtt cggcaccgaa ggccgtggcg gctatttcga ctctataggc 720
ataatcagag acgtgatgca gaaccatctg ttacaaatca tgactctctt gactatggaa 780
agaccggtgt cttttgaccc ggaatctatt cgtgacgaaa aggttaaggt tctaaaggcc 840
gtggccccca tcgacacgga cgacgtcctc ttgggccagt acggtaaatc tgaggacggg 900
tctaagcccg cctacgtgga tgatgacact gtagacaagg actctaaatg tgtcactttt 960
gcagcaatga ctttcaacat cgaaaacgag cgttgggagg gcgtccccat catgatgcgt 1020
gccggtaagg ctttgaatga gtccaaggtg gagatcagac tgcagtacaa agcggtcgca 1080
tcgggtgtct tcaaagacat tccaaataac gaactggtca tcagagtgca gcccgatgcc 1140
gctgtgtacc taaagtttaa tgctaagacc cctggtctgt caaatgctac ccaagtcaca 1200
gatctgaatc taacttacgc aagcaggtac caagactttt ggattccaga ggcttacgag 1260
gtgttgataa gagacgccct actgggtgac cattccaact ttgtcagaga tgacgaattg 1320
gatatcagtt ggggcatatt caccccatta ctgaagcaca tagagcgtcc ggacggtcca 1380
acaccggaaa tttaccccta cggatcaaga ggtccaaagg gattgaagga atatatgcaa 1440
aaacacaagt atgttatgcc cgaaaagcac ccttacgctt ggcccgtgac taagccagaa 1500
gatacgaagg ataattag 1518
<210> 12
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
acagaaagag taaatccaat agaatagaaa accacataag gcaaggtacg ctgcaggtcg 60
acaa 64
<210> 13
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
aaaatttcag tgacttagcc gataaatgaa tgtgcttgca tttttcacta gtggatctga 60
tatca 65
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
tcacgaatga ataacggttt g 21
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
agcttgcaag ataaaatcac tcg 23
<210> 16
<211> 1602
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
atgacagaag ataatattgc tccaatcacc tccgttaaag tagttaccga caagtgcacg 60
tacaaggaca acgagctgct caccaagtac agctacgaaa atgctgtagt tacgaagaca 120
gctagtggcc gcttcgatgt aacgcccact gttcaagact acgtgttcaa acttgacttg 180
aaaaagccgg aaaaactagg aattatgctc attgggttag gtggcaacaa tggctccact 240
ttagtggcct cggtattggc gaataagcac aatgtggagt ttcaaactaa ggaaggcgtt 300
aagcaaccaa actacttcgg ctccatgact caatgttcta ccttgaaact gggtatcgat 360
gcggagggga atgacgttta tgctcctttt aactctctgt tgcccatggt tagcccaaac 420
gactttgtcg tctctggttg ggacatcaat aacgcagatc tatacgaagc tatgcagaga 480
agtcaagttc tcgaatatga tctgcaacaa cgcttgaagg cgaagatgtc cttggtgaag 540
cctcttcctt ccatttacta ccctgatttc attgcagcta atcaagatga gagagccaat 600
aactgcatca atttggatga aaaaggcaac gtaaccacga ggggtaagtg gacccatctg 660
caacgcatca gacgcgatat ccagaatttc aaagaagaaa acgcccttga taaagtaatc 720
gttctttgga ctgcaaatac tgagaggtac gtagaagtat ctcctggtgt taatgacacc 780
atggaaaacc tcttgcagtc tattaagaat gaccatgaag agattgctcc ttccacgatc 840
tttgcagcag catctatctt ggaaggtgtc ccctatatta atggttcacc gcagaatact 900
tttgttcccg gcttggttca gctggctgag catgagggta cattcattgc gggagacgat 960
ctcaagtcgg gacaaaccaa gttgaagtct gttctggccc agttcttagt ggatgcaggt 1020
attaaaccgg tctccattgc atcctataac catttaggca ataatgacgg ttataactta 1080
tctgctccaa aacaatttag gtctaaggag atttccaaaa gttctgtcat agatgacatc 1140
atcgcgtcta atgatatctt gtacaatgat aaactgggta aaaaagttga ccactgcatt 1200
gtcatcaaat atatgaagcc cgtcggggac tcaaaagtgg caatggacga gtattacagt 1260
gagttgatgt taggtggcca taaccggatt tccattcaca atgtttgcga agattcttta 1320
ctggctacgc ccttgatcat cgatctttta gtcatgactg agttttgtac aagagtgtcc 1380
tataagaagg tggacccagt taaagaagat gctggcaaat tcgagaactt ttatccagtt 1440
ttaaccttct tgagttactg gttaaaagct ccattaacaa gaccaggatt tcacccggtg 1500
aatggcttaa acaagcaaag aaccgcctta gaaaattttt taagattgtt gattggattg 1560
ccttctcaaa acgaactaag attcgaagag agattgttgt aa 1602
<210> 17
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ggggtaccat agcttcaaaa tgtttctact ccttttttac tcttccag 48
<210> 18
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
gcaatattat cttctgtcat tttgtaatta aaacttagat 40
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
atctaagttt taattacaaa atgacagaag ataatattgc 40
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
tgacataact aattacatga ttacaacaat ctctcttcga 40
<210> 21
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
gaagagagat tgttgtaatc atgtaattag ttatgtca 38
<210> 22
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
cggaattcgc aaattaaagc cttcgagcgt cccaaaacct tctcaagc 48

Claims (3)

1.一种高产肌醇酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)以酿酒酵母BY4741为出发菌株，敲除肌醇生物合成转录抑制子基因opi1，获得敲除opi1基因的工程菌BY4741-△opi1；
(2)敲除工程菌BY4741-△opi1的糖酵解关键基因pgi1，获得敲除pgi1基因的工程菌BY4741-△opi1-△pgi1；
(3)敲除工程菌BY4741-△opi1-△pgi1的戊糖磷酸途径关键基因zwf1，获得敲除zwf1基因的工程菌BY4741-△opi1-△pgi1-△zwf1；
(4)在工程菌BY4741-△opi1-△pgi1-△zwf1中过表达肌醇-3-磷酸合成酶基因ino1，构建BY4741-△opi1-△pgi1-△zwf1(ino+)高产肌醇酿酒酵母工程菌；
其中，所述opi1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示，所述pgi1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO .6所示，所述zwf1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO .11所示，所述ino1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO .16所示。
2.根据权利要求1所述的一种高产肌醇酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(4)的具体操作步骤如下：
(1)以酿酒酵母BY4741提取的基因组为模板，PCR分别扩增带Kpn I酶切位点的TEF1启动子序列、ino1基因序列和带EcoR I酶切位点的CYC1终止子序列；将上述3段基因进行重叠PCR，得到TEF1+ino1+CYC1基因片段；
(2)将TEF1+ino1+CYC1基因片段与YEplac181质粒分别进行双酶切，连接，获得重组表达质粒YEplac181-ino1；
(3)将重组表达质粒YEplac181-ino1电转化进入酿酒酵母菌株BY4741-△opi1-△pgi1-△zwf1，经筛选获得BY4741-△opi1-△pgi1-△zwf1(ino+)高产肌醇酿酒酵母工程菌。
3.权利要求1或2所述一种高产肌醇酿酒酵母工程菌在制备含有肌醇产品中的应用。
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