CN110157714A

CN110157714A - 红花CtXTH1基因、其编码蛋白质及应用

Info

Publication number: CN110157714A
Application number: CN201910312047.4A
Authority: CN
Inventors: 郭美丽; 贾鑫磊; 高越; 郭丹丹; 何贝轩
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2019-04-18
Filing date: 2019-04-18
Publication date: 2019-08-23
Anticipated expiration: 2039-04-18
Also published as: CN110157714B

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体是红花CtXTH1基因及其编码蛋白质在提高红花花冠长度及产量中的应用。本发明首次证实了红花CtXTH1基因能促进红花花冠伸长，CtXTH1通过转基因的方法转入红花中，可以显著提高花冠长度以及花冠产量，种子重也有增大趋势，且对红花花冠中主要黄酮类成分无显著影响。

Description

红花CtXTH1基因、其编码蛋白质及应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，是红花CtXTH1基因、其编码蛋白质及应用。

背景技术

传统中药红花(Carthami Flos)具有活血通经、散瘀止痛的功效，目前红花及其制剂多用于心脑血管疾病的防治工作。红花药效成分主要为黄酮类化合物，包括羟基红花黄色素A(HSYA)、Carthamin、山萘酚及其苷类等。但红花以花入药，其产量较低。在我国最大的红花产地新疆，每公顷产量仅约为180kg～225kg，且存在严重的品种退化问题。因此发掘与红花花冠发育相关的基因或蛋白质，并将其用于高产红花育种工作具有重要的价值。

植物细胞壁是植物细胞的一种独特结构，它为植物细胞提供基础的支撑和保护作用，同时也成为限制植物细胞大小和分裂的一个关键因素。据报道膨胀素(EXP)和木葡聚糖内切转葡糖基/水解酶(XTH)是直接作用于植物细胞壁基质多糖半纤维素的两类重要酶蛋白，影响植物细胞壁的松弛与重构，在种子萌发、根系建成、茎叶的生长、花和果实的发育成熟以及非生物胁迫响应等方面具有重要的作用。但关于红花膨胀素以及木葡聚糖内切转葡糖基/水解酶基因尚未有见报道，其对红花花冠发育以及产量是否有影响仍不清楚。

发明内容

本发明的目的在于提供红花CtXTH1基因、其编码蛋白和在提高红花花冠长度及花冠产量中的应用。

本发明的第一方面，提供一种红花CtXTH1(木葡聚糖内切转葡糖基/水解酶)基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的红花CtXTH1基因全长1176bp，其开放阅读框(ORF，Open Reading Frame)区包含了888bp，编码295个氨基酸，开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二方面，提供一种红花CtXTH1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三方面，提供红花CtXTH1基因的启动子序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

本发明的第四方面，提供一种重组表达载体、重组菌或转基因植物，所述的重组表达载体、重组菌或转基因植物含有上述红花CtXTH1基因SEQ ID NO.1或其开放阅读框SEQID NO.3。

优选的，在制备所述的重组表达载体、重组菌或转基因植物时，用于扩增红花CtXTH1基因开放阅读框的引物对分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示：

CtXTH1F：GAGCTTTCGCGGATCCGCCACCATGACATATTCGTCGA(SEQ ID NO.5)；

CtXTH1R：TCCTCGCCCTTGCTCACCATGGTGGCGGCCGCAATCCCATCCATAC(SEQ ID NO.6)。

优选的，所述的重组表达载体为植物表达载体。更优选真核表达载体pMT39。

优选的，所述的重组菌，即宿主细胞，为大肠杆菌、农杆菌等。优选为农杆菌。更优选农杆菌GV3101。

本发明的第五方面，提供上述的红花CtXTH1基因在提高红花花冠长度及花冠产量中的应用。

优选的，所述的红花CtXTH1基因显著提高红花花冠长度以及花冠产量，种子重量也有增大趋势，但对红花花冠主要药效成分无显著影响。

本发明的第六方面，提供上述的红花CtXTH1蛋白在提高红花花冠长度及花冠产量中的应用。

优选的，所述的红花CtXTH1蛋白显著提高红花花冠长度以及花冠产量，种子重量也有增大趋势，但对红花花冠主要药效成分无显著影响。

本发明的第七方面，提供一种提高红花花冠长度及花冠产量的转基因方法，所述的提高红花花冠长度及产量的转基因方法是将含有上述红花CtXTH1基因或其开放阅读框的重组菌采用农杆菌介导的花粉管通道法遗传转化红花。

花粉管通道法在1983年被我国学者周光宇第一次提出；孙毅在1999年通过超声处理花粉粒对其转化方法进行了优化；王丕武在2012年通过添加DNA保护剂对其转化方法进行了优化。目前，该技术已成功应用于玉米、水稻、棉花以及高粱等农作物转基因工作。我们在此基础上，建立了农杆菌介导的花粉管通道法并成功将其用于组织再生困难的红花遗传转化工作。([1]Zhou G,Weng J,Zeng Y,Huang J,Qian S,Liu G.Introduction ofexogenous DNA into cotton embryos.Methods Enzymol.1983,(101):433-481.[2]孙毅,王景雪,崔贵梅.超声波处理花粉介导植物基因转化方法:中国,CN99121152[P].2000-04-12.[3]:王丕武,付永平,张君,曲静,姚丹,马建,王鑫雨,单睿,关淑艳.一种改进的植物花粉管转化方法:中国,CN201210406418[P].2014-04-30.)。

优选的，包括以下步骤：

A、构建含有上述红花CtXTH1基因或其开放阅读框的重组表达载体；

B、用步骤A构建的重组表达载体转化农杆菌，得到重组菌；

C、步骤B得到的重组菌通过花粉管通道法转化盛开期的红花柱头；

D、种子成熟后，采集并种下T0代种子，采集T1代植株花器官，筛选获得转基因阳性植株。

更优选的，包括以下步骤：

I、载体构建：设计无缝克隆引物扩增CtXTH1的ORF区，扩增引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，构建真核表达载体pMT39，将扩增产物与载体连接后，生成含目的基因的重组载体pMT39-CtXTH1；

II、农杆菌介导的转化，具体操作方法为：

a.在温室中培育红花植株，温度25℃，昼夜节律为16小时光照/8小时黑暗；

b.将步骤I获得的重组载体采用液氮冻融法转入农杆菌GV3101中，在LB+卡那霉素+利福平固体培养基上进行筛选，PCR鉴定得到阳性克隆菌，在LB+卡那霉素+利福平液体培养基大摇至菌液OD600约为0.8；菌液5000rpm，离心5分钟，弃去上清；

c.用5％蔗糖溶液重悬菌体，并加入0.02％的表面活性剂silwet-77；

d.用微量注射器吸取含目的基因的重悬菌液转化盛开期的红花柱头，转化结束后，立即将花用牛皮纸密封，重复操作，直至花朵闭合，取下牛皮纸，让植株恢复原来的生长环境；

e.待种子成熟后，采集获得T0代种子，翻土施肥后，种下T0代种子，待T1代植株花盛开时采集花器官样品；

f.设计引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8进行基因组水平验证，筛选出转基因阳性植株。

本发明的第八方面，提供一种采用上述的提高红花花冠长度及花冠产量的转基因方法获得的红花转基因植株或种质。

本发明优点在于：

本发明首次证实了红花CtXTH1参与红花花冠发育，CtXTH1通过转基因方法转入红花中，可以显著增加花冠长度以及花冠产量，种子重也有增大趋势，且其对红花花冠主要药效成分无显著影响。

附图说明

图1.CtXTH1编码的氨基酸序列与红花及拟南芥中XTHs编码的氨基酸序列的同源比对结果。

图2.CtXTH1编码的氨基酸序列与红花及拟南芥中XTHs编码的氨基酸序列的系统进化树分析。

图3.CtXTH1基因启动子顺式作用元件分析

图4.红花过表达CtXTH1的载体图谱：pMT39-CtXTH1。

图5.过表达CtXTH1对红花花冠长度的影响。A：过表达CtXTH1阳性植株CtXTH1基因转录水平测定；B：过表达CtXTH1阳性植株花冠长度统计，每个过表达系与空载对照组进行比较，数据展示为mean±SD，**P<0.01；C：过表达CtXTH1阳性植株花冠示意图。CK：空载处理组；OVX：过表达CtXTH1组。

图6.过表达CtXTH1对红花农艺性状的影响。A：花(果)球数；B：花(果)球直径；C：每花球小花数；D：每花球小花重量；E：每果球种子数；F：每果球种子重量。CK：空载处理组；OVX：过表达CtXTH1组。A和B采用过表达组与空载对照组进行比较，数据展示为mean±SEM，*P<0.05；C-F为每个过表达系与空载对照组进行比较，数据展示为mean±SEM，*P<0.05。

图7.过表达CtXTH1花冠显微结构图。CK：空载处理组；OVX：过表达CtXTH1组。

图8.过表达CtXTH1植株红花花冠主要黄酮类化合物的测定。CK：空载处理组；OVX：过表达CtXTH1组。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。所使用的实验方法若未特殊说明，均为常规实验方法。

下述实施例中所使用的材料，试剂等。如无特殊说明，均可从商业途径得到。

红花为野生型云南巍山品种，种植于第二军医大学药学院温室。

SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit购自Clonetech公司。

KOD-Plus-Neo购自Toyobo。

pMD-19T simple Vector、Genome Walking Kit购自Takara。

实施例1.红花CtXTH1全长cDNA的克隆

一、设计并合成RACE引物

CtXTH1-GSP1:TCTGTCACCCTTTCCGTGGGCATACA(SEQ ID NO.9)

CtXTH1-GSP2:ATCAAACAGCTCGACGGAGGGAAGGG(SEQ ID NO.10)

Trizol法提取红花花冠总RNA，利用SMARTer^TM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒进行反转录建立5’-和3’-RACE文库。

以红花5’-和3’-RACE文库为模板，利用通用引物UPM(Universal Primer A Mix)和序列特异性引物GSP，进行PCR扩增，获得CtXTH1的5’-端序列和3’-序列，得到534bp的5’-保守片段和637bp的带polyA尾的3’-保守片段。

将CtXTH1序列测序获得的5’-，3’-cDNA片段序列和EST序列在SeqMan上进行序列拼接，获得一条cDNA全长序列。

根据这条序列的cDNA末端设计扩增全长cDNA的PCR引物5’-Full length ofCtXTH1(CATGGGATCACACAATATAATACACA，SEQ ID NO.11)和3’-Full length of CtXTH1(AACACAAGTATCAACCATAAAACCC，SEQ ID NO.12)。以红花花冠总RNA反转录的cDNA为模板，进行PCR扩增，测序获得CtXTH1基因的全长cDNA序列，总共1176bp(如SEQ ID NO.1所示)。

二、基因序列分析

CtXTH1基因全长1176bp，开放阅读框(Open Reading Frame)区包含了888bp(如SEQ ID NO.3所示)，编码295个氨基酸(如SEQ ID NO.2所示)，等电点为5.98，分子量为33623.91Da，分子式C₁₅₁₆H₂₂₆₂N₄₀₂O₄₄₁S₁₄。

Simple Modular Architecture Research Tool(SMART)分析表明CtXTH1编码的蛋白质具有三个功能结构域：在12～31为跨膜结构区；36～218糖苷水解酶家族16，其主要用于水解两种或多种碳水化合物之间或者碳水化合物与非碳水化合物部分之间的糖苷键；243～291为木葡聚糖内切转葡糖基酶(XET)的C-末端。在已知结构的蛋白质数据库中检索发现其34～291与PDB:1UN1/B具有较高相似性，e值为1e^-106，PDB:1UN1/B为欧洲白杨木葡聚糖内切转葡糖基酶的天然结构。TMHMM Server v2.0及SignaIP4.1Serves分析显示CtXTH1编码蛋白含TMhelix结构，TMhelix结构为穿膜结构，将蛋白序列划分为inside区和outside区，表明其可能为膜蛋白或膜锚定蛋白，且其在N端不包含信号肽区域。系统进化树分析表明CtXTH1属于XTHs家族中的GroupⅡ亚家族，与拟南芥AtXTH6和AtXTH7具有较高同源性(图1、图2)。

实施例2.红花CtXTH1启动子序列的克隆

一、设计并合成Genome Walking引物

CtXTH1-Promoter-SP1:TAGATCGAACGACGATGGGGTGGT(SEQ ID NO.13)

CtXTH1-Promoter-SP2:ACGTTGGGTGCAAGGGGTTTAAATGA(SEQ ID NO.14)

CtXTH1-Promoter-SP3:CTATTCCGCGAATCGAACATCACTAAG(SEQ ID NO.15)

二、Genome Walking扩增获得CtXTH1基因启动子序列

CTAB法提取红花花冠组织DNA，并以此为模板，按Genome Walking Kit试剂盒以AP2为上游引物，以CtXTH1-Promoter-SP为下游引物进行热不对称巢式PCR。胶回收第三次巢式PCR产物并使用CtXTH1-Promoter-SP3引物测序获得1315bp启动子序列(如SEQ IDNO.4所示)(图3)。

实施例3.CtXTH1农杆菌介导的花粉管通道法转化红花植株

为了进一步分析CtXTH1的功能，我们将其通过农杆菌介导的花粉管通道法转入红花中，观察过表达CtXTH1之后，对红花花冠长度及农艺性状的影响，并通过切片观察其对花冠显微结构的影响。

一、载体构建

设计无缝克隆引物扩增CtXTH1的ORF区，扩增引物为SEQ ID NO.5(GAGCTTTCGCGGATCCGCCACCATGACATATTCGTCGA)和SEQ ID NO.6(TCCTCGCCCTTGCTCACCATGGTGGGCAATCCCATCCATAC)，构建真核表达载体pMT39，将扩增产物与线性化pMT39载体连接后，生成含目的基因的重组载体pMT39-CtXTH1(图4)。

二、农杆菌介导的遗传转化

具体操作方法为：

A.在温室中培育红花植株，温度25℃，昼夜节律为16小时光照/8小时黑暗。

B.将空载对照质粒pMT39和重组载体pMT39-CtXTH1采用液氮冻融法转入农杆菌GV3101中，在LB+卡那霉素+利福平固体培养基上涂布平板，PCR扩增鉴定获得阳性克隆菌，在LB+卡那霉素+利福平液体培养基扩大培养，至菌液OD600约为0.8。菌液5000rpm，离心5分钟，弃去上清。

C.用现配的5％蔗糖溶液重悬，并加入0.02％的表面活性剂silwet-77。

D.用微量注射器吸取含目的基因的重悬菌液转化盛开的红花柱头，转化结束后，立即将花用牛皮纸密封，每日浸染两次，直至花朵闭合，取下牛皮纸，让植株恢复原来的生长环境。

E.待种子成熟后，采集获得T0代种子，翻土施肥后，种下T0代种子，待T1代植株花盛开时采集花器官样品。

三、转基因验证

设计引物进行基因组水平验证，

ID-F：GACAAGCAGAAATCACCAGTCTC(SEQ ID NO.7)；

ID-R：CCACTGAAAACACGACGTGGTG(SEQ ID NO.8)；

PCR体系是：

PCR程序是95℃热启动3min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，之后每进行5个循环退火温度下降2℃，直至退火温度下降至50℃时进行15个循环，之后72℃再延伸10min，4℃恒温。琼脂糖凝胶电泳结果显示，从19株中筛选出8株独立的转基因阳性植株。

四、过表达CtXTH1阳性植株CtXTH1基因转录水平测定及其对红花花冠长度及农艺性状的影响

使用Trizol法提取阳性转基因植株和对照植株的花冠总RNA，并反转录为cDNA。设计CtXTH1基因的荧光定量引物，引物序列如下表1所示，设置qPCR程序，95℃热启动3分钟，95℃变性10分钟，58℃退火20秒，72℃延伸35秒。在ABI7500仪器上进行实验。60S作为内参，相对定量法2^-△△Ct分析转录表达情况。

表1.CtXTH1基因荧光定量引物

在开花期，计数花球总数量作为单株花(果)球数数据，并且按其开放顺序依次选择3个花球作为花性状的采集对象。在开花后的第三天，使用镊子去除苞片后，采集小花，从采集的小花中随机选择30个小花，使用固定的直尺测量每个小花的花冠长度，并记录数据；测量完毕后，随机选择5个小花使用多聚甲醛FAA固定液固定，之后将剩余的所有小花收集装入1.5ml的EP管中，标记后置液氮中速冻，带回实验室称重，并记录数据。

待种子成熟后，收集每株植株上的果球，剥离种子并计数称重。

转录水平的定量分析结果显示(图5、图6)，过表达红花中CtXTH1的相对表达量发生明显的增加约为对照组的2～3倍；并且对其农艺性状数据的分析表明，与对照组相比，过表达组花冠长度得到极显著的增长现象(P<0.01)，尤其在OVX-7中，平均花冠长度为3.7厘米，比对照组增长10.25％；CtXH1的过表达未对每株花(果)球数量及其直径有显著影响；但过表达组在平均小花数量和花冠重量上均比对照组大，分别大15.95％～30.60％和30％～36％，且除OVX-10系外，其余各株系与对照组相比，均显示出显著差异；在每果球种子数量与种子重量上，过表达组也显示出增加的趋势，分别增加了7.27％～69％和6.09％～36％，但除OVX-4，OVX-13系在种子数量上与对照组相比具有显著差异外，其余各株系均无显著性差异。总而言之，CtXTH1基因的过表达能够有效增加红花花冠长度及花冠产量，对种子产量的增加也有一定促进作用。

五、过表达CtXTH1对红花花冠组织结构的影响

将固定的红花花冠使用石蜡包埋后，进行切片，对小花花瓣部分采用横切，对小花花冠管状部分采用纵切。使用番红-O染色后至徕卡DM2500显微镜下观察拍照。

结果显示(图7)，对CtXTH1过表达组与空载对照组红花花冠显微结构的观察发现，过表达植株花药囊无明显变化，但其花柱及花瓣裂片均表现出增大的趋势，并且在花冠管状部分的纵切切片中，过表达植株组织表现出不规则且更松散的特征。说明CtXTH1蛋白能够通过对红花花冠细胞壁主要半纤维素木葡聚糖末端葡糖基的内切/转移活性松弛和重构细胞壁，进而影响花冠组织的显微特征，这可能是其能引起花冠伸长及花冠产量提高的原因。

六、过表达CtXTH1对红花花冠主要黄酮类化合物含量的影响

Ultra-high-performance liquid chromatography coupled to electrosprayionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry(UPLCESI-QTOF-MS)系统用于分析过表达CtXTH1对红花花冠中主要黄酮类化合物的影响。

D-苯丙氨酸、黄芩素、山奈酚、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、芦丁和山奈酚-3-O-芸香糖苷购买自阿拉丁，Carthamin和羟基红花黄色素(HSYA)为本实验室自提。采用标准曲线法对样品中的化合物含量进行定量。

将红花花冠样品置于50℃烘箱中烘至恒重，磨成粉末，精密称取约5mg，置于1ml70％甲醇溶液中浸泡12小时。

超声处理40分钟，13,000rpm离心10分钟，取上清，使用纯甲醇稀释10倍、100倍后，在各浓度梯度中取70μL进行进样分析。

结果显示(图8)，和空载对照组比较，CtXTH1过表达组除植物苯丙烷类代谢途径的起始物质D-苯丙氨酸发生显著性积累，对其余7个花冠中主要的黄酮类成分无显著影响。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110> 中国人民解放军第二军医大学

<120> 红花CtXTH1基因、其编码蛋白质及应用

<130> /

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1176

<212> DNA

<213> 红花(Carthami Flos)

<400> 1

atacacatca ttcttgtaaa gtaacaatga catattcgtc gagaatgttt cctgaaaaca 60

ttctcgccag tcttttcgta gctgggtttg tgacggtact gttatctgtg gcagacgcaa 120

ggcctgctac attccttcag gattttcgta cgacgtggtc ggattcccac atcaaacagc 180

tcgacggagg gaaggggatt caactcctgc ttgaccagaa ctctggatgc gggttcgctt 240

ctaagagcaa gtatctgttt ggacgtgtaa gtatgaagat caagctcatt ccaggagact 300

ctgctggcac tgttactgcc ttttacatga attcggatac tgaccaagtg cgcgacgagc 360

ttgactttga attcttgggg aacaggactg gtcaacctta ttccgtccaa actaacgtgt 420

atgcccacgg aaagggtgac agagaacaaa gggttaacct atggttcgac cctgcggccg 480

acttccacac ctactccatc ctctggaacc accaccacgt cgtgttttca gtggatgaag 540

tgcccataag agtgtacaaa aacaatgaag ccaaaggtgt ccctttccca aagtttcaac 600

caatgggaat cttctccaca ttatgggagg cagatgattg ggcaacaaga ggtgggcttg 660

aaaagataga ttggagtaaa gcaccatttt atgcatatta taaagatttt gatattgagg 720

ggtgccctaa gcccggacca agtggttgtg aatcgaaccc gaagaatttg tgggagggct 780

cgggttacca acaactcgat gcgatggcat cacgtcgtta ccggtgggtg cggatgaacc 840

atatggttta cgattattgc accgataagc agcgatatcc ggttactcca ccggaatgta 900

tggatgggat ttaagggaat tccctttcaa gaaaacatgc atggttggag gtaaaagggg 960

ttttatggtt gatacttgtg ttttgatatg gatttttatt gtatgcatac atggttggat 1020

ggggataggg gtgaaaaagt aaattgttat tgtctgttat gggattttat ctgtatttga 1080

taaagtttgg atgacccaaa ataaactttc tgtaattatt gtgaaaatga tatgtgatat 1140

atacatttca tctccaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1176

<210> 2

<211> 295

<212> PRT

<213> 红花(Carthami Flos)

<400> 2

Met Thr Tyr Ser Ser Arg Met Phe Pro Glu Asn Ile Leu Ala Ser Leu

1 5 10 15

Phe Val Ala Gly Phe Val Thr Val Leu Leu Ser Val Ala Asp Ala Arg

20 25 30

Pro Ala Thr Phe Leu Gln Asp Phe Arg Thr Thr Trp Ser Asp Ser His

35 40 45

Ile Lys Gln Leu Asp Gly Gly Lys Gly Ile Gln Leu Leu Leu Asp Gln

50 55 60

Asn Ser Gly Cys Gly Phe Ala Ser Lys Ser Lys Tyr Leu Phe Gly Arg

65 70 75 80

Val Ser Met Lys Ile Lys Leu Ile Pro Gly Asp Ser Ala Gly Thr Val

85 90 95

Thr Ala Phe Tyr Met Asn Ser Asp Thr Asp Gln Val Arg Asp Glu Leu

100 105 110

Asp Phe Glu Phe Leu Gly Asn Arg Thr Gly Gln Pro Tyr Ser Val Gln

115 120 125

Thr Asn Val Tyr Ala His Gly Lys Gly Asp Arg Glu Gln Arg Val Asn

130 135 140

Leu Trp Phe Asp Pro Ala Ala Asp Phe His Thr Tyr Ser Ile Leu Trp

145 150 155 160

Asn His His His Val Val Phe Ser Val Asp Glu Val Pro Ile Arg Val

165 170 175

Tyr Lys Asn Asn Glu Ala Lys Gly Val Pro Phe Pro Lys Phe Gln Pro

180 185 190

Met Gly Ile Phe Ser Thr Leu Trp Glu Ala Asp Asp Trp Ala Thr Arg

195 200 205

Gly Gly Leu Glu Lys Ile Asp Trp Ser Lys Ala Pro Phe Tyr Ala Tyr

210 215 220

Tyr Lys Asp Phe Asp Ile Glu Gly Cys Pro Lys Pro Gly Pro Ser Gly

225 230 235 240

Cys Glu Ser Asn Pro Lys Asn Leu Trp Glu Gly Ser Gly Tyr Gln Gln

245 250 255

Leu Asp Ala Met Ala Ser Arg Arg Tyr Arg Trp Val Arg Met Asn His

260 265 270

Met Val Tyr Asp Tyr Cys Thr Asp Lys Gln Arg Tyr Pro Val Thr Pro

275 280 285

Pro Glu Cys Met Asp Gly Ile

290 295

<210> 3

<211> 888

<212> DNA

<213> 红花(Carthami Flos)

<400> 3

atgacatatt cgtcgagaat gtttcctgaa aacattctcg ccagtctttt cgtagctggg 60

tttgtgacgg tactgttatc tgtggcagac gcaaggcctg ctacattcct tcaggatttt 120

cgtacgacgt ggtcggattc ccacatcaaa cagctcgacg gagggaaggg gattcaactc 180

ctgcttgacc agaactctgg atgcgggttc gcttctaaga gcaagtatct gtttggacgt 240

gtaagtatga agatcaagct cattccagga gactctgctg gcactgttac tgccttttac 300

atgaattcgg atactgacca agtgcgcgac gagcttgact ttgaattctt ggggaacagg 360

actggtcaac cttattccgt ccaaactaac gtgtatgccc acggaaaggg tgacagagaa 420

caaagggtta acctatggtt cgaccctgcg gccgacttcc acacctactc catcctctgg 480

aaccaccacc acgtcgtgtt ttcagtggat gaagtgccca taagagtgta caaaaacaat 540

gaagccaaag gtgtcccttt cccaaagttt caaccaatgg gaatcttctc cacattatgg 600

gaggcagatg attgggcaac aagaggtggg cttgaaaaga tagattggag taaagcacca 660

ttttatgcat attataaaga ttttgatatt gaggggtgcc ctaagcccgg accaagtggt 720

tgtgaatcga acccgaagaa tttgtgggag ggctcgggtt accaacaact cgatgcgatg 780

gcatcacgtc gttaccggtg ggtgcggatg aaccatatgg tttacgatta ttgcaccgat 840

aagcagcgat atccggttac tccaccggaa tgtatggatg ggatttaa 888

<210> 4

<211> 1315

<212> DNA

<213> 红花(Carthami Flos)

<400> 4

gcgtgcttgg catgcctgca ggtcgacgat tgtcgagttt ggtgttacaa attcaatgga 60

tttaaaatga caaatttctt agtgatgttc gattcgcgga atagatttga tggaatcctt 120

tgaattctat tgaatttcca taatttaaag aatgcatcat ttattggctt aagtggatga 180

attgaattcc tactaaccaa atatgtgatt aaattttatt ccaattcctt agagtcaaat 240

ttcttgaatg gattccaatt ccatcaaatt tcattctgca aacaaaacac ccttaagtgt 300

cttggaaagt tttttaaaaa aatatcaatt ttatcgtttc aaaattctgc atcatttaaa 360

ccccttgcac ccaacgttat cactcccccc tcaccacccc atcgtcgttc gatctacatc 420

atcgtccata gacgtttttc gtcccaatat caatctcctt tttttatttg tctctacatg 480

ctccataaaa ttattggaaa taaggagaac cgaaagacaa taaaacgatc aaaaagagag 540

accaattggc aggggtcaac agaagcaatg gtgtgaagag cagatagaaa atgtcaaata 600

gaggatgaaa agtgtaatat taggcaaaac attgagcgtc gtgagtcgga tgcaattatt 660

tcatagttgg ggggaatgtt agatgtcaac tttctcatat cagaaggacc tgtttgatga 720

agggatacca aggggtggca aagccgaaag gaagcaatta cgttaaatgc aagggggctt 780

ggatgacata gaatttcaga atgataaaat taatctagtt tttttaatgg aaattttttt 840

ttgaacttga taatttattt actataacac taaaaacttt gataaatcaa atgaaatatt 900

ttaataattt attaatttaa aaactcttaa aatttcaaaa attcaaaaaa ttaaaagtta 960

aaaagtttac tatttttctg aacttttttc tagaaataat atttaatcct tatgtgagtt 1020

ttgttttaag tacaatccta ttgtcaaaaa agccttataa gacgatgttt ggtgagacag 1080

ctgtggggtc caattgacgg cttattgtta gctgtataga aagcgaaccg aatttacaaa 1140

taggccccct aaaataatca attatgccac aatcagtccc tctttagtcg gtaccccata 1200

ttcttcttta tctaaacttg ttctatatat aacctcattc catttctaat ttattcatca 1260

cacaatataa tacacatcat tcttgtaaag taacaatgac atattcgtcg agaat 1315

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

gagctttcgc ggatccgcca ccatgacata ttcgtcga 38

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

tcctcgccct tgctcaccat ggtggcggcc gcaatcccat ccatac 46

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

gacaagcaga aatcaccagt ctc 23

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 8

ccactgaaaa cacgacgtgg tg 22

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 9

tctgtcaccc tttccgtggg cataca 26

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 10

atcaaacagc tcgacggagg gaaggg 26

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 11

catgggatca cacaatataa tacaca 26

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 12

aacacaagta tcaaccataa aaccc 25

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 13

tagatcgaac gacgatgggg tggt 24

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 14

acgttgggtg caaggggttt aaatga 26

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 15

ctattccgcg aatcgaacat cactaag 27

Claims

1.一种红花CtXTH1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的红花CtXTH1基因，其特征在于，所述的红花CtXTH1基因的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一种红花CtXTH1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.红花CtXTH1基因的启动子序列CtXTH1-Promoter，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5.一种重组表达载体、重组菌或转基因植物，其特征在于，所述的重组表达载体、重组菌或转基因植物含有红花CtXTH1基因SEQ ID NO.1或其开放阅读框SEQ ID NO.3。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体、重组菌或转基因植物，其特征在于，在制备所述的重组表达载体、重组菌或转基因植物时，用于扩增红花CtXTH1基因开放阅读框的引物对分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

7.根据权利要求5所述的重组表达载体、重组菌或转基因植物，其特征在于，所述的重组表达载体为植物表达载体；所述的重组菌为大肠杆菌或农杆菌。

8.一种如权利要求1所述的红花CtXTH1基因在提高红花花冠长度及花冠产量中的应用。

9.一种如权利要求3所述的红花CtXTH1蛋白在提高红花花冠长度及花冠产量中的应用。

10.一种提高红花花冠长度及花冠产量的转基因方法，其特征在于，所述的提高红花花冠长度及产量的转基因方法是将含有红花CtXTH1基因SEQ ID NO.1或其开放阅读框SEQ IDNO.3的重组菌采用农杆菌介导的花粉管通道法遗传转化红花。