CN112322628B

CN112322628B - 调控棉花对黄萎病和干旱抗性的转录因子GhWRKY1-like基因及应用

Info

Publication number: CN112322628B
Application number: CN202011029736.3A
Authority: CN
Inventors: 胡琴; 张献龙; 朱龙付; 杜雪竹; 盛锋
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2020-09-27
Filing date: 2020-09-27
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2040-09-27
Also published as: CN112322628A

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及调控棉花对黄萎病和干旱抗性的转录因子GhWRKY1‑like基因及应用。对陆地棉接种黄萎病菌后不同时间点RAN‑Seq数据进行分析，筛选得到受黄萎病诱导表达的转录因子基因GhWRKY1‑like，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示。利用VIGS体系，在棉花中沉默GhWRKY1‑like后接种黄萎病菌，快速证实该基因对棉花黄萎病抗性具有正向调控作用。利用GhWRKY1‑like超量表达的棉花和拟南芥材料，进一步验证该基因在黄萎病和干旱抗性中的正向调控功能，即超量表达该基因能够显著提高植物对黄萎病菌和干旱的抗性。

Description

调控棉花对黄萎病和干旱抗性的转录因子GhWRKY1-like基因及应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及到一个调控棉花对黄萎病和对干旱抗性的转录因子GhWRKY1-like基因及应用。对陆地棉YZ1接种黄萎病(Verticilliumdahliae)V991后不同时间点RAN-Seq数据进行分析，筛选到了一系列受黄萎病诱导表达的WRKY转录因子。通过VIGS体系，在棉花中沉默相应的基因，进一步接种黄萎病菌，快速鉴定其在棉花黄萎病抗性中的功能。其中，鉴定到的GhWRKY1-like基因能够正调控棉花对黄萎病的抗性，即沉默该基因，能够显著提高棉花对黄萎病菌的抗性。在棉花和拟南芥中超量表达该基因，转基因材料能明显提高棉花和拟南芥对黄萎病菌以及对干旱的抗性。

背景技术

随着农业环境的日益恶化，黄萎病等生物逆境的发生连年加重，严重制约了棉花的可持续发展。黄萎病素有棉花“癌症”之称，严重危害棉花的产量和纤维品质。近些年，黄萎病连年发生，对我国棉花生产常年造成减产10-20％，部分地区发病严重时高达70％，已成为制约我国棉花高产稳产的主要障碍之一。研究表明陆地棉对黄萎病的抗性基本表现为感病或耐病，其携带有的抗病位点也多是微效多基因位点，且受环境影响大，难以进行聚合，因此生产上还没有高抗棉花黄萎病的品种大面积推广应用(王升正等，抗黄萎病新品系中植棉KV-3抗性遗传特性研究.棉花学报,2010，22(5):501-504)。随着淡水资源的日益缺乏，干旱等极端自然环境的频繁发生，农业生产上对农作物耐旱性需求日益明显。而我国现有的棉花抗旱种质资源比较狭窄，多年来，人们采用传统选育方法解决棉花品种的抗旱问题，但往往耗资大、周期长，而且选择效率不高。因此，进一步提高棉花的综合抗性(抗黄萎病和抗旱)能力，对棉花绿色可持续生产有着重要的意义。

WRKY转录因子是植物特有的一类转录因子，在其氨基酸序列的N端一般都有保守的WRKY结构域，起到DNA绑定的作用，C端一般含有非典型的亲水锌指结构域。研究表明，WRKY类转录因子广泛参与植物生长发育的各个方面，比如对生物逆境和非生物逆境的响应、叶片的衰老、种子休眠、花药发育、表皮毛发生以及开花调控等。此外，许多WRKY类转录因子还表现出多效性。大麦HvWRKY1不仅参与对冷害、干旱的响应，同时还能调控种子休眠以及对病原菌的免疫反应；水稻OsWRKY13参与对干旱胁迫和病原菌的响应；棉花GbWRKY1参与对黄萎病的防御反应以及开花期调控。由此可见，WRKY类转录因子在调控植物对生物和非生物逆境胁迫响应中扮演着重要的角色。

病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术近年来发展迅速，其优势在于操作简单，且可以同时操作多个基因，越来越多的研究者利用该体系来快速鉴定基因的功能。本发明提出之前，申请人通过对陆地棉YZ1接种黄萎病(Verticilliumdahliae)V991病菌后对不同时间点RAN-Seq数据进行分析，筛选到了一系列受黄萎病诱导表达的WRKY转录因子。通过VIGS体系鉴定得到GhWRKY1-like基因，发现该基因正调控棉花对黄萎病的抗性；沉默该基因，能够显著提高棉花对黄萎病菌的抗性。本发明又发现在棉花和拟南芥中超量表达GhWRKY1-like基因，发现转基因材料能明显提高棉花和拟南芥对黄萎病菌以及对干旱的抗性。该研究为利用基因工程提高棉花的综合抗性能力提供了理论基础和及基因资源。

发明内容

本发明的目的在于提供一个棉花WRKY类转录因子基因GhWRKY1-like，该基因从棉花接种黄萎病菌V991的RNA-Seq数据中筛选鉴定并克隆出来，GhWRKY1-like基因具有如SEQID NO：1所示的核苷酸序列，或至少50％同源性的序列，以及上述DNA片段编码的蛋白或经过改造修饰的具有相同功能的蛋白。

本发明的另一个目的是在于提供了一个棉花转录因子GhWRKY1-like在参与棉花抗黄萎病和抗旱方面的应用，通过GhWRKY1-like基因，SEQ ID NO：1或与其功能等同的同源基因在棉花植株中超量表达。本发明分离一种蛋白质，其具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少50％同源性的序列，来达到调控棉花对黄萎病和干旱抗性的目的，从而应用于棉花抗黄萎病和抗旱品系的培育，同时可作为黄萎菌抗性和干旱抗性棉花的标记基因。

本发明通过对陆地棉YZ1接种黄萎病(Verticillium dahliae)V991病菌后不同时间点RAN-Seq数据进行分析，筛选得到一系列受黄萎病诱导表达的WRKY类转录因子。通过VIGS体系，在棉花中沉默相应的基因，进一步接种黄萎病菌，快速鉴定本发明克隆的基因在棉花黄萎病抗性中的功能。其中，鉴定到的GhWRKY1-like基因，在棉花对黄萎病和干旱的抗性中起到正调控调控的作用，即超量表达该基因，能够显著提高棉花对黄萎病菌和干旱的抗性。本发明还涉及含有该基因或者其同源基因片段的载体和设计该基因或其功能类似物增强植物对黄萎病和干旱抗性在农业生产中的应用。

本发明的技术方案如下：

申请人通过基因克隆技术得到一种调控棉花对黄萎病菌和对干旱抗性的棉花WRKY类转录因子基因GhWRKY1-like(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)。

上述调控棉花黄萎病和干旱抗性的棉花转录因子GhWRKY1-like基因编码的蛋白质序如SEQ ID NO:2所示。

本发明的GhWRKY1-like基因可在调控棉花对黄萎病菌和干旱抗性中的应用。

本发明的GhWRKY1-like基因编码序列可在调控棉花对黄萎病菌和对干旱抗性中的应用。

申请人制备了一种抑制表达载体TRV:GhWRKY1-like，所述载体含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之一的核苷酸片段。所述的表达载体为病毒介导的基因沉默载体，即通过瞬时转化的方法获得基因沉默的植株。申请人制备了一种超量表达载体pGWB417-GhWRKY1-like，该载体含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之一的核苷酸序列。所述的表达载体为农杆菌介导的棉花遗传转化载体，通过转基因的方法获得基因超量表达的植株。

本发明提供了一种快速鉴定基因功能的方法，所述方法为将上述抑制表达载体导入宿主细胞，快速地使目标基因沉默。

更详细的技术方案如下所述。

申请人的前期工作是对陆地棉YZ1接种黄萎病(Verticillium dahliae)V991菌株后不同时间点RAN-Seq数据进行分析，筛选得到一系列受黄萎病诱导表达的WRKY转录因子。通过VIGS体系，在棉花中沉默相应的基因，进一步接种黄萎病菌，快速鉴定GhWRKY1-like基因在棉花黄萎病抗性中的功能。其中，GhWRKY1-like基因能够正向调控棉花对黄萎病的抗性，即沉默该基因，能够显著提高棉花对黄萎病菌的抗性。在棉花和拟南芥中超量表达GhWRKY1-like基因，发现转基因材料能明显提高棉花和拟南芥对黄萎病菌以及对干旱的抗性。选取其他有代表性植物进行进化树分析和生物信息学分析，结果表明SEQ ID NO:1所述的序列与亚洲棉(Gossypium arboretum)GaWRKY95和GaWRKY1-like同源性最高(见图1)。从陆地棉‘YZ1’中提取叶片总RNA(Deng F,Tu L,Tan J,et al.GbPDF1 is involved incotton fiber initiation via the core cis-element HDZIP2ATATHB2.Plant Physiol,2012,158:890-904)，通过反转录酶SuperscriptⅢ(购自Invitrogen公司，美国)将其反转录合成cDNA，反应条件为：65℃，5min；50℃，60min；70℃，10min。利用陆地棉TM-1的基因组信息，合成扩增引物GhWRKY1-like-F(5’ATGGTTCCGTCAGGGGAGTGTG 3’)和GhWRKY1-like-R(5’TCAAGGACCTGATATAGGTGCA 3’)扩增出GhWRKY1-like基因的cDNA全长(1215bp)。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃，0sec；59℃，0sec；72℃，1min 50sec，32个循环；72℃延伸7min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司，美国)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的基因ORF，一种分离的基因的ORF，其序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。通过BlastX(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)确定ORF所对应的404个氨基酸的蛋白质序列是与GaWRKY1-like蛋白同源，该蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

根据GhWRKY1-like的ORF设计引物，并在引物两端分别加上BamHI和KpnI酶切位点的infusion重组序列，分别将该引物命名为VGhWRKY1-like-F(5'AGAAGGCCTCCATGGGGATCCCAACGGGAGTAACTGTTCATTC3')和VGhWRKY1-like-R(5'GAGACGCGTGAGCTCGGTACCTCAACTCCAATACCCCAAATAG 3')，以GhWRKY1-like基因的cDNA为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物为343bp，通过infusion重组反应构建到pTRV2上，具体方法参考文献(Gao X,Wheeler T,LiZ,Kenerley CM,He P,Shan L.Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromises cottonresistance to Verticillium wilt.Plant journal.2011,66:293-305)，从而获得VIGS的载体。

利用引物qGhWRKY1-like-F(5'AGACTCCCTCTCTGTTGCCTGG 3')和qGhWRKY1-like-R(5'TGTCAATCATTTTCCCATCGTG 3')对GhWRKY1-like基因进行组织表达模式分析(见图2)，结果表明该基因在棉花的各个组织中均有表达。进一步地，进行诱导表达模式分，得到如图3所述的结果。利用病原菌诱导表达模式表明，GhCPK33基因受到黄萎病菌诱导上调表达(见图3中的A图；病原菌诱导表达模式表明GhCPK33受水杨酸抑制表达，受茉莉酸诱导上调表达，对过氧化氢没有明显响应(见图3中的B图至D图)。

利用农杆菌介导的植物转化，用注射法将构建好的VIGS载体(目标基因菌株为TRV:CPK33，对照菌株为TRV:00，以及沉默效应指示菌株为TRV:CLA1(见图4)，导入到陆地棉品种YZ1的子叶中，注射VIGS载体两周后，检测GhWRKY1-like的表达量，确认VIGS效应已经产生(图5)。采用伤根接菌的方法，接种黄萎病菌V991孢子液(浓度约为10⁵个/ml)。一般接种7d后开始发病，并在发病后统计病情指数。具体方法参考马平等报道的棉花黄萎病抗性鉴定方法(马平等，一种新的棉花黄萎病快速接种技术及其在病原菌致病力和寄主抗病性鉴定上的应用，植物病理学报，2004，34(6):536-541)。病指统计结果表明TRV:GhWRKY1-like的植株抗性明显低于对照(见图6)。

利用引物OE-GhWRKY1-like-F(5'GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCGATGGTTCCGTCAGGGGAGTGTG 3')和RT-GhWRKY1-like-R(5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTCAAGGACCTGATATAGGTGCA 3')，以GhWRKY1-like基因的cDNA为模板进行PCR扩增，将PCR产物通过Gateway技术重组到表达载体pGWB417上，构建得到超量表达载体pGWB417-GhWRKY1-like，电击转化农杆菌GV3101，保存阳性菌株。采用农杆菌介导的遗传转化，参照Jin等建立的棉花高效转化体系(Identification of a novel elite genotype for invitro culture and genetic transformation of cotton.Biologia Plantarum,2006,50:519-524；An efficient grafting system for transgenic plant recovery incotton(Gossypium hirsutum L.).Plant Cell,Tissue and Organ Culture,85:181-185,2006；Factors affecting stable transformation and plant regeneration duringtransforming embryogenic callus of Upland cotton(Gossypium hirsutum L.)将构建好的pGWB417-GhWRKY1-like载体导入棉花材料YZ1和野生型(即非转基因)拟南芥中。农杆菌介导的花器浸醮法转化拟南芥方法和程序参照(Zhang等，Agrobacterium-mediatedtransformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.NatureProtocols,2006.1:641-646)。获得转基因材料后，对转基因材料的抗病性和抗旱性鉴定后发现，超量表达GhWRKY1-like的棉花材料能够提高棉花对黄萎病菌V991的抗性(图7)。超量表达GhWRKY1-like的拟南芥材料能够提高拟南芥对干旱的抗性(图8)，干旱处理后，超量表达GhWRKY1-like的拟南芥材料无论是地上部分的大小、鲜重以及脯氨酸含量都明显高于对照(非转基因，即野生型拟南芥)材料，由此可见GhWRKY1-like正向调控植物对干旱的抗性(见图8中的C图至F图)。超量表达GhWRKY1-like的拟南芥材料接种黄萎病菌V991后发现，接种14天后，转基因拟南芥的发病率以及病症程度都明低于对照材料，说明在拟南芥中异源表达棉花GhWRKY1-like同样能够提高植物对黄萎病菌的抗性(图8)。以上结果说明，GhWRKY1-like能够作为基因工程的靶标基因，提高植物对干旱和对黄萎病菌的广谱抗性，因此本发明克隆的GhWRKY1-like基因的应用对培育棉花抗病品系和抗旱品系具有重要的意义。

本发明的优点：

(1)本发明通过对陆地棉YZ1接种黄萎病(Verticillium dahliae)V991菌株后不同时间点RAN-Seq数据进行分析，结合VIGS技术，筛选克隆并鉴定了GhWRKY1-like基因是棉花抗黄萎病和抗旱性的正调控因子。利用农杆菌介导的遗传转化可获得抗黄萎病和抗旱的棉花新品系，也可以作为棉花抗性材料的标志基因。

(2)虽然在拟南芥中已经克隆了多个WRKY基因，并对其进行了功能验证，但目前在棉花中对WRKY的研究报道还很少，也很少有文献支撑棉花中WRKY能够同时参与到植物的免疫反应和抗旱响应中，本发明克隆的GhWRKY1-like基因丰富了棉花中对这类基因的研究。

(3)超量表达GhWRKY1-like的棉花和拟南芥显著增强了棉花对于黄萎病和干旱的抗性。说明GhWRKY1-like基因参与到了植物对黄萎病菌和干旱的抗性响应中，并扮演着重要的角色。通过调控GhWRKY1-like基因的表达能够调节植物体内抗性因子的积累，从而提高植物对黄萎病菌的抗性。

(4)选育抗黄萎病和抗旱的棉花材料一直为棉花育种家所重视，GhWRKY1-like的发现和利用将有助于解决生产上棉花抗黄萎病和抗旱育种资源的稀缺。由于目前生产上黄萎病和干旱造成的棉花产量损失巨大，使得选育抗病品种显得尤为重要，应用GhWRKY1-like基因将有助于培育高抗黄萎病和抗旱的棉花新品种。

附图说明

图1：GhWRKY1-like基因进化树分析图。选取其他有代表性植物进行进化树分析和生物信息学分析，结果表明该序列与亚洲棉(Gossypium arboreum)的GaWRKY1-like和GaWRKY95最为同源。参考最新的陆地棉基因组信息，申请人将这个基因命名为GhWRKY1-like基因。

图2：GhWRKY1-like基因在棉花各个组织中的表达模式分析。GhWRKY1-like在棉花各个组织中均有表达。附图标记说明：图2中的各组织依次为：根(root)；茎(stem)；叶片(leaf)；花瓣(flower)；花药(anther)；开花后5天的胚珠(5d ovule)。GhUB7为内参基因。

图3：GhWRKY1-like基因诱导表达模式分析。附图标记说明：图3中的A图为GhWRKY1-like基因在接种黄萎病菌6h、24h、48h以及72h后，与对照相比，受到明显的诱导表达。图3中的B图为GhWRKY1-like基因受茉莉酸处理诱导上调表达。图3中的C图为GhWRKY1-like基因受水杨酸处理诱导表达不明显。图3中的D图为GhWRKY1-like基因对过氧化氢处理诱导表达不明显。

图4：VIGS载体构建示意图。附图标记说明：LB，T-DNA左边界；35S，花椰菜病毒35S启动子；Cp,衣壳蛋白；RdRP，RNA依赖型RNA聚合酶；Mp，转运蛋白；16K，16-kD富含半胱氨酸蛋白；MCS，多克隆位点；T，终止子；RB，在T-DNA右边界。

图5：VIGS两周后GhWRKY1-like表达量检测。附图标记说明：在VIGS后两周后，选用幼嫩叶片和根系为材料，提取RNA，检测目标基因的表达量。GhUB7为内参基因。

图6：TRV:GhWRKY1-like植株对黄萎病的抗性鉴定。附图标记说明：确定GhWRKY1-like成功沉默后，接种黄萎病菌V991，TRV:GhWRKY1-like的植株发病程度明显高于对照(TRV:00，图6中的A图)，说明抑制GhWRKY1-like的表达后，植株对黄萎病菌的抗性削弱。剖杆结果(见图6中的B图)和病指统计结果(图6中的C图)与表型观察相符。

图7：GhWRKY1-like超量表达棉花材料对黄萎病的抗性鉴定结果。附图标记说明：图7中的A图表示对不同转基因株系中GhWRKY1-like的表达量分析。结果表明相对于对照材料(WT),转基因材料OE-4、OE-18和OE-27中GhWRKY1-like表达量显著提高。图7中的B图表示对照材料和转基因材料接种黄萎病菌V991两周之后的发病情况(水平视角)，结果表明超量表达GhWRKY1-like的转基因材料明显提高了对黄萎病的抗性。图7中的C图表示对照材料和转基因材料接种黄萎病菌V991两周之后的发病情况。结果表明超量表达GhWRKY1-like的转基因材料明显提高了对黄萎病的抗性。

图8：GhWRKY1-like超量表达拟南芥材料对干旱的抗性鉴定。图8中的A图表示对不同转基因株系中GhWRKY1-like的表达量分析。结果表明相对于对照材料(WT),转基因材料OE-1和OE-7中GhWRKY1-like表达量显著提高。图8中的B表示对照材料和转基因材料正常条件下的生长情况，结果表明转基因材料和对照材料再在生长发育方面没有明显差异。图8中的C表示对照材料和转基因材料干旱处理两周之后的情况，结果表明超量表达GhWRKY1-like的转基因材料明显提高了对干旱的耐受性。图8中的D图表示对照材料和转基因材料干旱处理两周之后植株的大小，结果表明在干旱条件下，超量表达GhWRKY1-like的转基因材料长势明显优于对照材料。图8中的E图表示对照材料和转基因材料干旱处理两周之后植株地上部分的鲜重。图8中的F图表示对照材料和转基因材料干旱处理两周之后植株地上部分中抗旱关键因子脯氨酸的含量测定。

图9：GhWRKY1-like超量表达拟南芥材料对黄萎病的抗性鉴定结果。附图标记说明：图9中的A图表示接种前对照材料和转基因材料的生长情况。图9中的B图表示对照材料和转基因材料接种黄萎病菌V991两周之后的发病情况，结果表明超量表达GhWRKY1-like的转基因拟南芥材料明显提高了对黄萎病的抗性。

具体实施方式

对序列表的说明：

序列表SEQ ID NO:1是本发明克隆GhWRKY1-like基因的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO:2是GhWRKY1-like基因编码的蛋白质序列。

以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离克隆包含有GhWRKY1-like基因完整编码区段的DNA片段，以及验证GhWRKY1-like基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。

实施例1：GhWRKY1-like基因分离克隆

1、基因序列获得

本申请人前期工作是通过分析陆地棉YZ1(陆地棉YZ1品种来自中国农业科学院棉花研究所)接种黄萎病菌V991后的表达谱数据，结合VIGS方法，鉴定到了一个正调控棉花黄萎病抗性的基因。在NCBI数据库中进行序列比对，发现该基因与亚洲棉(Gossypiumarboretum)和陆地棉(Gossypium hirsutum)中的GaWRKY1-like和GaWRKY95基因高度同源，同时参考最新陆地棉基因组注释，将所分离的基因命名为GhWRKY1-like(该基因进化树分析见图1)。

利用引物GhWRKY1-like-F(5’ATGGTTCCGTCAGGGGAGTGTG 3’)和GhWRKY1-like-R(5’TCAAGGACCTGATATAGGTGCA 3’)，用陆地棉YZ1的cDNA作为模板克隆GhWRKY1-like的全长序列。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，59℃30sec，72℃1min 50sec，32个循环；72℃延伸7min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司)，筛选得到阳性克隆并测序，获得所需的基因ORF(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)通过BlastX(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)确定ORF所对应404个氨基酸的蛋白质序列(如SEQ ID NO：2所示)。

2、表达分析

a.利用定量PCR方法来检测GhWRKY1-like在陆地棉的各个组织中的表达情况(结果见图2)。以陆地棉YZ1为材料，提取以下6个不同组织的RNA，用定量PCR的方法检测GhWRKY1-like的表达水平。选取的6个组织分别是：根(root)；茎(stem)；叶片(leaf)；花瓣(flower)；花药(anther)；5天胚珠(5d ovule)。棉花总RNA的提取方法根据Deng等(Deng F,Tu L,Tan J,et al.GbPDF1 is involved in cotton fiber initiation via the corecis-element HDZIP2ATATHB2.Plant Physiol,2012,158:890-904)发表的文献，RNA提取完成后后用DNaseI(购自Promega公司)处理，RNA完整性通过1.2％(w/v)琼脂糖胶(EtBr)电泳检测(5V/cm)。核酸浓度的测定在Beckman DU800 spectrophotometer上进行。RNA 260/280比值在1.9到2.1之间，260/230比值大于2.0的RNA用于下一步的分析。cDNA的合成是以3μg总RNA为模版，与1μl 500μg/ml oligo-dT(15)引物(购自Promega公司)，DEPC-water混合，总体积15μl；70℃变性5min，放于冰上骤冷5min；再加入5×M-MLV buffer 5μL，

Ribonuclease Inhibitor(Promega)1μL，M-MLV-RTase 1μL，1.25μL10mM dNTP，DEPC-water1.75μL混合，总体积为25μL；混合均匀后42℃70min，70℃10min，每份cDNA稀释到250μL后于-20℃下保存待用。以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物qGhWRKY1-like-F(5'AGACTCCCTCTCTGTTGCCTGG 3')和qGhWRKY1-like-R(5'TGTCAATCATTTTCCCATCGTG 3')对GhWRKY1-like基因进行特异性的PCR扩增，同时用引物UB7-F(5'GAAGGCATTCCACCTGACCAAC3')和UB7-R(5'CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG3')对棉花GhUB7(GenBank登陆号：DQ116441)基因做特异扩增(扩增产物长198bp)作为内参，进行定量PCR，分析GhWRKY1-like基因的组织表达模式和受黄萎病及各种激素处理的诱导表达模式。

b.申请人以棉花黄萎菌感病品种‘YZ1’作为研究对象，因为考虑到土培拔苗时会对幼苗根部有一定的伤害，所以选择水培。对陆地棉种子进行催芽，待其长出幼根1-2cm时种植到蛭石中，待其刚破土时，将其移至营养液(常规营养液)中。在幼苗生长至两片真叶完全平展后，接种活化好的V991孢子液(10⁵个/mL)，对照用同样的体积的蒸馏水处理，然后在接种后0h、6h、24h、48h和72h取样。按照上述方法提取根系的总RNA，用于GhWRKY1-like基因的黄萎病菌诱导表达分析(结果见图3中的A图)。定量PCR结果显示，GhWRKY1-like基因受到黄萎病菌的诱导上调表达。

c.水杨酸、茉莉酸以及过氧化氢在植物对抗病原菌的过程中起着非常重要作用，介导细胞内的信号转导以及下游抗性物质的积累。因此分析GhWRKY1-like基因对这些物质的响应情况，能够预先推测GhWRKY1-like可能参与的信号路径。用对照及不同激素处理(处理浓度：200μM茉莉酸甲酯，2mM水杨酸和1mM过氧化氢)后植株根系作为样品，取样时间点设为0h、1h、2h和3h，按照上述方法提取根系总RNA。GhWRKY1-like激素处理后表达结果分析表明，GhWRKY1-like基因受茉莉酸处理诱导上调表达，对水杨酸和过氧化氢处理没有明显响应。

实施例2：采用VIGS方法进行基因沉默

1.温室育苗

选取籽粒饱满的棉花品系YZ1种子，用25℃的温水浸泡2h，然后平铺在放在浸湿的纱布上，上面再覆盖一层湿润的纱布，放在28℃的培养箱中催芽。待种子根长至1-2cm时，便可移栽到在营养土(体积比，营养土：蛭石＝3:1)中种植。将种子的幼根轻轻放入营养土中，上面再覆盖1-2cm厚的营养土，然后用保鲜膜覆盖，光下培养，设定培养温度为28℃，光照时间为16h，待苗子破土后，揭膜。当苗子的子叶完全展开时即可进行农杆菌注射，进行VIGS试验。

2.农杆菌的活化与保存

2.1准备：

农杆菌菌株为GV3101，准备无菌三角瓶，LB(固体和液体)培养基(含卡那霉素50mg/L)，灭菌甘油，无菌枪头，无菌1.5mL离心管。

2.2操作：

2.2.1活化，悬浮：

在对棉花幼苗进行VIGS处理前2天，分别取保存于-70℃的辅助载体pTRV1(荷兰Bart P.H.J.Thomma实验室提供)，空载体pTRV2(荷兰Bart P.H.J.Thomma实验室提供)和该基因TRV重组载体菌液50μL，置于2ml无菌离心管中，并向离心管中加入500μL灭菌LB(含50μg/mL的卡那霉素和利福平)培养液，于28℃摇床200r/min活化培养。将活化好的菌株接种于含50mL LB培养液(含50μg/mL的卡那霉素和利福平)的灭菌三角瓶中，并置于28℃，200r/min摇床培养16h。摇床培养农杆菌菌液至OD₆₀₀值为0.8左右时，将菌液收集于灭菌处理过的10mL离心管中，于3000r/min离心10min。去除离心管中的上清液后，使用VIGS重悬液重新调整菌液OD₆₀₀值至1.0，并将各基因TRV重组载体和pTRV2空载体的重悬菌液分别与辅助载体pTRV1重悬菌液等体积混匀，室温下放置3h或置于28℃摇床200r/min活化培养1h。重悬液配方(体积按1L计)：氯化镁2.03g；吗啉乙磺酸2.135g；乙酰丁香酮0.03g。

2.2.2菌株的保存：

从培养皿内挑取单菌落接于LB液体培养基中，于150r/min，28℃活化48h，加入适量甘油，使甘油终浓度为20％，-70℃保存。

2.3.浸染，共培养：

在进行VIGS处理时，首先用1mL枪头在棉花幼苗子叶背面，轻微点3-4个小孔。然后用1mL注射器将处理好的菌液延着小孔注射到棉花子叶，直至整个子叶呈现出水渍状。待幼苗VIGS处理完毕后，统一浇水，并用黑色塑料膜将处理好的棉花幼苗覆盖，避光培养24h。用VIGS处理幼苗子叶第二天，将黑色塑料膜揭开，保持培养条件为25℃，光照120μEM-2/S(16h光照/8h黑暗)。

3.GhCPK33基因沉默效果的检测

棉花幼苗经VIGS处理10天左右，即当阳性对照TRV:GbCLA的叶片出现失绿叶片白化时，分别取对照空载体TRV:00和TRV:GhWRKY1-like植株的幼嫩叶片，作为检测基因。PCR检测结果显示，VIGS处理后第14天时，GhWRKY1-like在干涉植株的表达量明显低于对照，因此GhWRKY1-like在陆地棉叶片中的表达已成功被抑制(图6)。

4.黄萎病菌的活化与培养

将黄萎病菌置PDA平板上(配方如下：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000mL煮沸15min，纱布过滤，再加15g葡萄糖和7g琼脂，充分溶解后趁热用纱布过滤，按常规方法在121℃，103.4kPa下用高压蒸汽灭菌15min。于25℃暗培养箱活化培养一周，再用接种针取菌块用ddH₂O震荡悬浮，然后取1mL菌液平铺到新的PDA平板上，五天后用ddH₂O从平板上洗下孢子，并把菌液浓度调至10⁵个/mL。

5.黄萎病菌接种

待棉花幼苗长到二叶一心时，选取生长一致的幼苗，用剪刀剪去少量根系，做伤根处理，再将根系浸泡在浓度为10⁵个/mL黄萎病菌(V991)孢子液中1min，然后将接种过的植株移栽到营养土中，每钵种植4株。

6.病情调查

接菌后一周左右按照棉花黄萎病苗期分级标准调查并记载病情级数、计算病情指数，其中病情级数按温室棉苗发病的5级制记录(张兴华等，棉花抗枯、黄萎病研究进展及其抗性鉴定方法；江西农业学报，2008，20(3)：43-49)。具体分级标准如下：

0级：外表无病状。

1级：病株叶片25％以下显病状。

2级：叶片25％-50％显病状。

3级：叶片50％以上显病状，有少数叶片凋落。

4级：叶片全枯或脱落，生产力很低。

病株率(％)＝(发病总株数÷调查总株数)×100％。

病指(病情指数)＝[各级病株数分别乘以相应级数之和÷(调查总株数×最高级数)]×100。

接菌结果表明TRV:GhWRKY1-like的株系较对照材料TRV:00发病表型、病指和病原菌含量显著降低(见图7)，说明GhWRKY1-like基因能够参与调控棉花对黄萎病的抗病反应，并起到负调控的作用。

实施例3：农杆菌介导的棉花和拟南芥的遗传转化

根据GhWRKY1-like的ORF设计引物，并在引物两端分别加上attB1和attB2的重组交换位点，利用引物OE-GhWRKY1-like-F(5'GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCGATGGTTCCGTCAGGGGAGTGTG 3')和RT-GhWRKY1-like-R(5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTCAAGGACCTGATATAGGTGCA 3')，再以GhWRKY1-like基因的cDNA为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物通过Gateway重组反应构建到pGWB417载体上，从而获得超表达载体。所述的过量表达载体含有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，以及植物表达载体pGWB417。采用农杆菌GV3101(Roger等，A guide to Agrobacterium binary Ti vectors.Trends in plantscience.2000.5,1360-1385)介导的遗传转化棉花的方法和程序参照Jin等建立的高效转化体系(Identification of a novel elite genotype for in vitro culture andgenetic transformation of cotton.Biologia Plantarum,2006,50:519-524；Anefficient grafting system for transgenic plant recovery in cotton(Gossypiumhirsutum L.).Plant Cell,Tissue and Organ Culture,85:181-185,2006；Factorsaffecting stable transformation and plant regeneration during transformingembryogenic callus of Upland cotton(Gossypium hirsutum L.)via Agrobacteriumtumefaciens,Plant Cell,Tissue and Organ Culture,81:229-237,2005)，将构建好的超量表达载体导入棉花材料‘YZ1’和野生型拟南芥。农杆菌介导的花器浸醮法转化拟南芥的转化方法和程序参照文献报道的方法(Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana using the floral dip method.Nature Protocols,2006.1:641-646)。具体方法和流程如下：

1.无菌苗的培养

将将棉花品系YZ-1(参见Identification of a novel elite genotype for invitro culture and genetic transformation of cotton.Biologia Plantarum,2006,50:519-524)棉籽壳去掉，用0.1％升汞溶液灭菌10min，无菌水冲洗三遍，接种于无菌苗培养基上(配方：1/2MS大量元素+葡萄糖15g/L+植物胶phytagel(购自sigma公司，美国)2.5g/L)，在28℃暗培养3-6天。

2.农杆菌的活化和保存

2.1准备：

农杆菌GV3101，制备含卡那霉素50mg/L的MGL液体培养基(配方：胰化蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，MgSO₄.7H₂O 0.1g/L,KH₂PO₄ 0.25g/L，甘露醇5g/L，甘氨酸1.0g/L，调培养基的pH至7.0)，无菌三角瓶，LB(固、液)培养基(含卡那霉素50mg/L)，灭菌甘油，无菌枪头，无菌1.5mL离心管。

2.2活化，悬浮：

从超低温冰箱内取出保存的含有目标基因的GV3101菌株的甘油管在冰上融化，LB平皿上划线，28℃暗培养36-48h，待皿内长出清晰的单菌落，挑取单菌落在另外的LB平皿划线，28℃暗培养36-48h，待皿内长出足够的菌落时结束培养，把培养基表面菌落刮入三角瓶内的MGL培养基中，28℃，200r/min摇2h，使OD值在0.5-1.5之间即可用于侵染。

3.浸染，共培养：

3.1准备：

暗培养5天左右幼嫩健壮的棉花YZ-1幼苗，经活化的农杆菌，无菌培养皿和无菌滤纸等。

3.2操作：

无菌条件下将YZ-1幼苗下胚轴用锋利的刀片切成0.5-1cm长的切段，转入到经活化的农杆菌菌液中，搅匀，静置5-10min，倒掉菌液，滤纸吸干残余菌液，吹5min使表面稍为干燥，分散布于垫有滤纸的共培养培养基中(配方：MS无机盐+B5有机物+2,4-D 0.1mg/L+激动素(KT)0.1mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel 2.5g/L,培养基pH 7.0)，20℃暗培养38-42h。

4.愈伤组织的诱导

将侵染共培养后的下胚轴切段接种于诱导培养基上(配方：MS无机盐+B5有机物+2,4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel 2.5g/L,培养基pH 5.8)。

5、非胚性愈伤组织的增殖

非胚性愈伤组织的增殖培养基如下所示：MS无机盐(硝酸钾用量加倍，硝酸铵用量减半)+B5有机物+2,4-D 0.05mg/L+KT 0.1mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel 2.5g/L，培养基pH5.8。

6、愈伤组织的分化

愈伤组织经继代(一个月继代一次)几次后，有的愈伤组织转成米粒状颗粒，将其转入分化培养基上(配方：MS基本培养基+B5有机物+激动素(KT)0.15mg/L+吲哚丁酸(IBA)0.5mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel 2.5g/L，培养基调pH至5.8)，进一步分化成胚状体。

7、胚性愈伤组织的继代

胚性愈伤组织的继代培养基如下所示：MS无机盐(其中硝酸钾用量加倍，硝酸铵用量减半)+B5有机物+激动素(KT)0.15mg/L+IBA 0.5mg/L+Gln(谷胺酰胺)1.0mg/L+天冬酰胺(Asn)0.5mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel 2.5g/L,pH 5.8。

8、成苗生根培养

将分化出的小苗继代到1/2MS培养基中成苗生长培养基上(配方：1/2MS无机盐+B5有机物+葡萄糖15g/L+phytagel 2.5g/L，培养基pH 5.8)。

9、炼苗移栽

将生根良好的小苗揭开三角瓶封口膜，炼苗2-3天，然后移栽到小土钵中，遮荫缓苗一周左右移栽大田。

拟南芥转化采用的受体材料为野生型Col，农杆菌介导的花器浸醮法转化拟南芥的转化方法和程序参照(Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana using the floral dip method.Nature Protocols,2006.1:641-646)报道的方法。

附：MS培养基母液配制：

1.配制大量元素时各种药品分别称量，分别充分溶解再逐一加到容量瓶中(最后加入CaCl2否则容易产生沉淀)，定容到一升。

2.配制微量元素时几种极微量药品先可以配成一级母液(浓缩10000倍)，再稀释成二级母液(浓缩100倍)，母液配制完毕后放置于室温(20-25℃，以下相同)下10h以上，看是否有沉淀产生，然后才能使用。

3.配制铁盐时，两种盐用热水分别溶解,然后混合，放置于室温下10h以上看是否有沉淀产生，然后才能使用。

4.各种生长激素一般可以用1mol/L的NaOH或HCl溶解后，再用双蒸水定容至1L。

5.配制B5有机物时要用无菌水来配制，一次不要配太大体积，及时用完以防污染

6.各种母液配制好后应存放在4℃冰箱中，发现有沉淀后，不得使用。

大量元素母液(20倍)(以g/L计)

微量元素母液(100倍)(以g/L计)

铁盐母液(100倍)(以g/L)

FeSO₄·7H₂O 2.78；

Na₂EDTA 3.73；

B₅有机物(mg/L)

实施例4：拟南芥干旱抗性鉴定试验

(1)营养土准备：

提前一天，将蛭石分装到9cm的方形钵子中。配置适量1/2MS培养液，让蛭石吸足营养液，为播种做准备。

(2)播种

取适量的拟南芥种子，用0.1％琼脂重悬种子，放在4℃冰箱内进行春化处理，两天后将春化的拟南芥种子播种到营养土中，覆盖塑料薄膜，待种子萌发，子叶平展现绿后，揭去塑料薄膜。

(3)移栽

待拟南芥幼苗长出两片真叶后进行移栽，及时浇定根水，然后覆上塑料薄膜，保持湿度。覆膜3-4天，待移栽的拟南芥长出新叶后，揭去塑料薄膜。

(4)干旱处理

对照材料按照正常的管理模式，定期浇水，保证拟南芥的正常生长。待干旱处理的材料正常生长3周后进行断水处理，直至出现明显的干旱表型。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 调控棉花对黄萎病和干旱抗性的转录因子GhWRKY1-like基因及应用

<141> 2020-09-27

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1215

<212> DNA

<213> 棉花(Gossypium hirsutum)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1215)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1215)

<400> 1

atg gtt ccg tca ggg gag tgt gta act gat gaa gtt ggt aaa gat aaa 48

Met Val Pro Ser Gly Glu Cys Val Thr Asp Glu Val Gly Lys Asp Lys

1 5 10 15

tta cgg agc cca gat gct ggg agt cat gca ttg caa cat aac act gat 96

Leu Arg Ser Pro Asp Ala Gly Ser His Ala Leu Gln His Asn Thr Asp

20 25 30

ggt aaa att ccc tcg tca caa tct gat cag gga gga gaa acc ccc ttg 144

Gly Lys Ile Pro Ser Ser Gln Ser Asp Gln Gly Gly Glu Thr Pro Leu

35 40 45

att aaa tca gag aaa gac cca ctt tca cag tcg gag aaa tta gga aat 192

Ile Lys Ser Glu Lys Asp Pro Leu Ser Gln Ser Glu Lys Leu Gly Asn

50 55 60

gct tcc tct gtg ata acc aag cag act ccc tct ctg ttg cct ggt atg 240

Ala Ser Ser Val Ile Thr Lys Gln Thr Pro Ser Leu Leu Pro Gly Met

65 70 75 80

gaa gga agc agt cct gta gca cgt gag aga gca tcg cag gat gga tat 288

Glu Gly Ser Ser Pro Val Ala Arg Glu Arg Ala Ser Gln Asp Gly Tyr

85 90 95

aac tgg cgt aaa tat ggg cag aaa ctt gtt aaa gga aat gaa ttt gtt 336

Asn Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Leu Val Lys Gly Asn Glu Phe Val

100 105 110

cga agt tat tac aaa tgc aca cat cca aac tgc cga gcg aaa aag caa 384

Arg Ser Tyr Tyr Lys Cys Thr His Pro Asn Cys Arg Ala Lys Lys Gln

115 120 125

cta gaa cgt tca cac gat ggg aaa atg att gac act gtt tat gtt ggt 432

Leu Glu Arg Ser His Asp Gly Lys Met Ile Asp Thr Val Tyr Val Gly

130 135 140

cag cat gat cat cca aag cca ctg aac ctt cca cta gct gtt ggt ttt 480

Gln His Asp His Pro Lys Pro Leu Asn Leu Pro Leu Ala Val Gly Phe

145 150 155 160

gct gtg tct gtt gtt gaa gag cga cca gat aag tca ttg caa att gtt 528

Ala Val Ser Val Val Glu Glu Arg Pro Asp Lys Ser Leu Gln Ile Val

165 170 175

gtc aaa gac aag tca ttg cat tcg caa atg cct cac caa att gag cca 576

Val Lys Asp Lys Ser Leu His Ser Gln Met Pro His Gln Ile Glu Pro

180 185 190

aga agt ggt tct caa cct tta tct agt gct gtc agt gaa gat gtt aag 624

Arg Ser Gly Ser Gln Pro Leu Ser Ser Ala Val Ser Glu Asp Val Lys

195 200 205

ggt aca gct tca aaa tca aat aag att cag aat gtt gcc gac agt gat 672

Gly Thr Ala Ser Lys Ser Asn Lys Ile Gln Asn Val Ala Asp Ser Asp

210 215 220

gat gat cat ctc gtc tca aaa cga agg aag aaa gaa aat agc aat gct 720

Asp Asp His Leu Val Ser Lys Arg Arg Lys Lys Glu Asn Ser Asn Ala

225 230 235 240

gat gca tct cca gtg gag aag cca acc aat gac tca cgt atg gtt atc 768

Asp Ala Ser Pro Val Glu Lys Pro Thr Asn Asp Ser Arg Met Val Ile

245 250 255

aag act ttc agt gag gtt gat att gta aat gat ggg tgc cgc tgg cgc 816

Lys Thr Phe Ser Glu Val Asp Ile Val Asn Asp Gly Cys Arg Trp Arg

260 265 270

aaa tat ggg caa aag tta gtt aaa ggc aat cca aat cca agg agc tat 864

Lys Tyr Gly Gln Lys Leu Val Lys Gly Asn Pro Asn Pro Arg Ser Tyr

275 280 285

tac agg tgc tct agt cct ggg tgc cct gtc aag aaa cat gtt gag agg 912

Tyr Arg Cys Ser Ser Pro Gly Cys Pro Val Lys Lys His Val Glu Arg

290 295 300

gcc tcg cat gat gca aaa ttg gtt ata act act tat gag gga caa cat 960

Ala Ser His Asp Ala Lys Leu Val Ile Thr Thr Tyr Glu Gly Gln His

305 310 315 320

gac cat gat ttg cct cca acc agg agt gtt acc cac aat aca acg gga 1008

Asp His Asp Leu Pro Pro Thr Arg Ser Val Thr His Asn Thr Thr Gly

325 330 335

gta aat gtt cat tcg gca gct cat agt ggc gaa tca agg acc aag gta 1056

Val Asn Val His Ser Ala Ala His Ser Gly Glu Ser Arg Thr Lys Val

340 345 350

gaa gaa agt gag acc atc tgc ctc gac atg gtt gtt tat ttt ggt tct 1104

Glu Glu Ser Glu Thr Ile Cys Leu Asp Met Val Val Tyr Phe Gly Ser

355 360 365

gta gct gag aat aaa tca agt gag caa ttg aat gga gag ttg aga acc 1152

Val Ala Glu Asn Lys Ser Ser Glu Gln Leu Asn Gly Glu Leu Arg Thr

370 375 380

aag tca gat ttt agc ggt act gtt tgc gtc agt ctg ata gat gca cct 1200

Lys Ser Asp Phe Ser Gly Thr Val Cys Val Ser Leu Ile Asp Ala Pro

385 390 395 400

ata tca ggt cct tga 1215

Ile Ser Gly Pro

<210> 2

<211> 404

<212> PRT