CN103315384A - 新型烟草组合物及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本公开描述了一种无烟烟草组合物，它包含了DVTs水平降低的熟烟，以及产生这种具有DVTs水平降低的植物品种的方法和由所述植物品种制备的熟烟。

Description

新型烟草组合物及制备方法
此案是申请日为2008年02月22日、中国申请号为200880013530.2、发明名称为“新型烟草组合物及制备方法”的发明申请的分案申请。 
相关申请的交叉引用 
本申请要求2007年2月23日提交的美国申请60/891,435和2007年11月30日提交的美国申请60/991,579的优先权，二者均以其整体引入本申请。 
技术领域
本发明公开内容涉及烟草植物(tobacco plants)和无烟烟草组合物(smokeless tobacco compositions)，更具体地涉及显示降低水平的4,8,13-杜法三烯-1,3-二醇(4,8,13-duvatriene-1,3-diols，简称DVTs)的烟草植物以及产生和使用这样的植物的方法。 
背景技术
无烟烟草制品是经口消耗的，而没有使制品燃烧。这些制品已制成各种形式，包括嚼烟(chewing tobacco)、干鼻烟(dry snuff)和湿鼻烟(moist snuff)。通常，这些类型的制品采用下述步骤，但是无特别顺序如下制成：将烟草切成或磨成合适的尺寸；用料液(casing solution)浸渍烟草或用料液对烟草进行喷雾；对加过料的烟草进行部分干燥；在容器中保持烟草一段时间；以及包装烟草。例如参见美国专利4,528,993、4,660,577和4,987,907。 
一些无烟烟草制品可具有一些消费者不喜欢的感官性质。为了提供多种具有不同风味特性的制品，常常用各种调味料(flavorants)和其它风味增强物质(flavor enhancing materials)处理嚼烟和鼻烟。然而，风味的添加可能不被某些消费者喜欢。当制备无烟烟草制品时，风味的加入几乎总是需要额外的加工步骤(参见例如美国专利申请公开2005/0115580)。因此，需要这样的烟草，该烟草可通过递送替代的风味特性(alternative flavor profile)来提供口部 满足感(oral satisfaction)。 
发明内容
本公开描述了具有降低水平的4,8,13-杜法三烯-1,3-二醇(DVTs，也称为4,8,13-西柏三烯-1,3-二醇)的烟草品种(tobacco variety)。本公开还描述了产生这样的品种的方法和使用这样的品种的方法。DVTs水平降低的品种显示可被一些消费者所喜欢的香味类型。 
在一方面，提供了一种无烟烟草组合物，其包括DVTs水平相对于称为KY14的品种的熟烟(cured tobacco，又称为调制的烟)降低的熟烟。在另一方面，提供了一种包括熟烟的无烟烟草组合物，所述熟烟是由具有低于20μg的DVTs/cm2原叶组织的原烟(green tobacco)制备的。在另一方面，提供了一种包括熟烟的无烟烟草组合物，所述熟烟来自按降低水平的DVTs进行选择的品种，该品种的植物具有低于20μg的DVTs/cm2原叶组织(green leaf tissue)。在一种实施方式中，所述熟烟来自选自下组的品种：TI1406、TI1269、GR139NS、KDH959、以及DVTs水平相对于称为KY14的品种的熟烟降低的上述品种的后代和具有低于20μg的DVTs/cm2原叶组织的上述品种的后代。 
在一种实施方式中，所述熟烟在小组感官评定中相对于称为KY14的品种的熟烟显示出显著降低的苦味。通常，该熟烟或者原烟还具有降低水平的茄酮(solanone)、茄香根酮(solavetivone)、西柏烯(cembrene)或黑松醇(thunbergol)。在某些实施方式中，所述熟烟为深色烤烟(dark fire-cured tobacco)、深色晾烟(dark air-cured tobacco)、称为TI1406的品种之外的白肋烟晾烟(Burley air-cured tobacco other than from a variety designated TI1406)、烤烟(flue-cured tobacco)或晒烟(sun-cured tobacco)。代表性的组合物包括，例如无烟湿烟草(moist smokeless tobacco)、无烟干烟草(dry smokeless tobacco)、嚼烟(chewing tobacco)、无烟卷烟(smokeless cigarette)、可食用膜(edible film)、挤出制品(extruded product)、片剂(tablet)或者涂有烟草的牙签(tobacco-coated toothpick)。 
在一方面，提供了一种产生植物品种的方法。此类方法包括下面步骤：使第一烟草植物与第二烟草植物杂交来产生后代烟草植物，其中所述第一烟草植物具有低于20μg的DVTs/cm2原叶组织；使所述后代烟草植物自花授 粉至少一代；以及在至少一代中，按烟草中相对于称为KY14的品种的烟草具有降低水平的DVTs进行选择，按低于20μg的DVTs/cm2原叶组织进行选择，或者在来自所述代的植物的烟草的小组感官评定中按显著降低的苦味进行选择，由此产生所述品种。 
在另一方面，提供了一种产生植物品种的方法。此类方法包括下面步骤：使烟草植物组织突变；通过自花授粉至少一代来繁殖源于所述突变的植物组织的植物；以及在至少一代中，按烟草中相对于称为KY14的品种的烟草具有降低水平的DVTs进行选择，按低于20μg的DVTs/cm2原叶组织进行选择，或者在来自所述代的植物的烟草的小组感官评定中按显著降低的苦味进行选择，由此产生所述品种。 
在又一方面，提供了一种产生植物品种的方法。此类方法包括下面步骤：使第一烟草植物与第二烟草植物杂交来产生后代烟草植物，所述第一烟草植物在来自所述烟草植物的烟草的小组感官评定中具有相对于称为KY14的品种的烟草显著降低的苦味；使所述后代烟草植物自花授粉至少一代；以及在至少一代中，按烟草中相对于称为KY14的品种的烟草具有降低水平的DVTs进行选择，按低于20μg的DVTs/cm2原叶组织进行选择，或者在来自所述代的植物的烟草的小组感官评定中按显著降低的苦味进行选择，由此产生所述品种。 
还提供了按本申请所公开的方法产生的烟草植物或品种。这样的植物或品种通常具有低于20μg的DVTs/cm2原叶组织。 
在一方面，提供了DVTs水平降低的调制后的N.tabacum烟草，条件是所述烟草不是由表1中所示的品种制备的。在另一方面，提供了由按在原叶组织中具有降低水平的DVTs进行选择的烟草品种的植物制备的熟烟。在又一方面，提供了由按在小组感官评定中具有显著降低的苦味进行选择的烟草品种的植物制备的熟烟。 
在一方面，提供了制备具有降低的苦味的烟草的方法。此类方法包括下列步骤：调制鲜烟；陈化调制的烟；以及用食品级溶剂洗涤鲜烟、调制的烟或者陈化且调制后的烟。代表性的食品级溶剂是乙醇。在某些实施方式中，洗过的烟草在小组感官评定中显示显著降低的苦味，以及在某些实施方式中，所述鲜烟在小组感官评定中未显示显著降低的苦味。提供了在小组感官评定中具有显著降低的苦味的熟烟，所述熟烟是通过这样的方法制备的。这 样的熟烟是由具有低于20μg的DVTs/cm2原叶组织的鲜烟制备的。 
在一方面，本发明涉及 
1.一种无烟烟草组合物，其包含DVTs水平相对于称为KY14的品种的熟烟降低的熟烟。 
2.一种包含熟烟的无烟烟草组合物，所述熟烟是由具有低于20μg的DVTs/cm2原叶组织的原烟制备的。 
3.一种包含熟烟的无烟烟草组合物，所述熟烟来自按降低水平的DVTs而选择的品种，所述品种的植物具有低于20μg的DVTs/cm2原叶组织。 
4.项1、2或3的无烟烟草组合物，其中所述熟烟在小组感官评定中相对于称为KY14的品种的熟烟显示出显著降低的苦味。 
5.项1的烟草组合物，其中所述熟烟还具有降低水平的茄酮、茄香根酮、西柏烯或黑松醇。 
6.项2的烟草组合物，其中所述原烟还具有降低水平的茄酮、茄香根酮、西柏烯或黑松醇。 
7.项1、2或3的烟草组合物，其中所述熟烟经小组感官评定确定具有显著降低的苦味。 
8.项1、2或3的烟草组合物，其中所述熟烟为深色烤烟、深色晾烟、TI1406之外的白肋烟晾烟、烤烟或晒烟。 
9.项1、2或3的烟草组合物，其中所述熟烟来自选自下组的品种：TI1406、TI1269、GR139NS、KDH959、以及DVTs水平相对于称为KY14的品种的熟烟降低的上述品种的后代和具有低于20μg的DVTs/cm2原叶组织的上述品种的后代。 
10.项1、2或3的烟草组合物，其中所述组合物为无烟湿烟草、无烟干烟草、嚼烟、无烟卷烟、可食用膜、挤出制品、片剂或者涂有烟草的牙签。 
11.一种产生植物品种的方法，包括下面步骤： 
使第一烟草植物与第二烟草植物杂交来产生后代烟草植物，其中所述第一烟草植物具有低于20μg DVTs/cm2原叶组织； 
使所述后代烟草植物自花授粉至少一代；以及 
在至少一代中，按烟草中相对于称为KY14的品种的烟草具有降低水平的DVTs进行选择，按低于20μg的DVTs/cm2原叶组织进行选择，或者在来自所述代的植物的烟草的小组感官评定中按显著降低的苦味进行 选择，由此产生所述品种。 
12.一种产生植物品种的方法，包括下面步骤： 
使烟草植物组织突变； 
通过自花授粉至少一代来繁殖源于所述突变的植物组织的植物；以及 
在至少一代中，按烟草中相对于称为KY14的品种的烟草具有降低水平的DVTs进行选择，按低于20μg的DVTs/cm2原叶组织进行选择，或者在来自所述代的植物的烟草的小组感官评定中按显著降低的苦味进行选择，由此产生所述品种。 
13.一种产生植物品种的方法，所述方法包括下面步骤： 
使第一烟草植物与第二烟草植物杂交来产生后代烟草植物，所述第一烟草植物在来自所述烟草植物的烟草的小组感官评定中具有相对于称为KY14的品种的烟草显著降低的苦味； 
使所述后代烟草植物自花授粉至少一代；以及 
在至少一代中，按烟草中相对于称为KY14的品种的烟草具有降低水平的DVTs进行选择，按低于20μg的DVTs/cm2原叶组织进行选择，或者在来自所述代的植物的烟草的小组感官评定中按显著降低的苦味进行选择，由此产生所述品种。 
14.通过项11、12或13的方法产生的烟草植物。 
15.通过项11、12或13的方法产生的植物品种。 
16.项15的植物品种，其中所述品种的植物具有低于20μg的DVTs/cm2原叶组织。 
17.DVTs水平降低的调制后的N.tabacum烟草，条件是所述烟草不是由表1中所示的品种制备的。 
18.由按在原叶组织中具有降低水平的DVTs进行选择的烟草品种的植物制备的熟烟。 
19.由按在小组感官评定中具有显著降低的苦味进行选择的烟草品种的植物制备的熟烟。 
20.一种制备具有降低的苦味的烟草的方法，其包括下列步骤： 
调制鲜烟； 
陈化调制的烟；以及 
用食品级溶剂洗涤鲜烟、调制的烟或者陈化且调制后的烟。 
21.项20的方法，其中所述食品级溶剂是乙醇。 
22.项20的方法，其中所述洗过的烟草在小组感官评定中显示显著降低的苦味。 
23.项20的方法，其中所述鲜烟在小组感官评定中未显示显著降低的苦味。 
24.在小组感官评定中具有显著降低的苦味的熟烟，所述熟烟是通过项20的方法制备的。 
25.项24的熟烟，其中所述熟烟是由具有低于20μg的DVTs/cm2原叶组织的鲜烟制备的。 
除非另外指出，本申请所用的所有的科技术语都具有本发明所属的领域的普通技术人员通常所理解的意义。尽管与本申请所述的相似或等价的方法和材料可用于本发明的实施，但是下面描述了合适的方法和材料。此外，材料、方法和实施例仅是示例性的并非限制性的。本申请提交的所有的出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过参考以其整体并入本申请。当出现冲突时，以包括定义在内的本申请说明书为准。 
在附图和下文中具体阐述了本发明的一个或多个实施方式。本发明的其它特性、目的和优点基于附图和具体说明以及基于权利要求书将是显然的。 
附图说明
图1A、图1B是来自多个烟草品种的叶面化合物(leaf surface compound)的薄层色谱(TLC)板的图像。图1A显示来自原叶的叶面化合物，而图1B显示来自初烤烟叶的叶面化合物。烟草品种在板的底部标出，箭头显示对应于DVTs的带。 
图2是GC/MS-SPME分析TI1406、KDH960和深色晾制品种的初烤烟叶组织中的DVTs的部分色谱图。 
图3显示DVT的α异构体(见3A)和β异构体(见3B)。 
图4显示α-和β-DVT的丁基硼酸衍生物(butylboronic derivatives)的校准曲线。 
图5显示在实施例的B部分中所述的品尝小组结果的图，其中1为低苦味强度而9为高苦味强度。 
图6显示在所示烟草品种中的平均α-和β-DVT浓度(μg/cm2)的图。 
图7是显示苦味与DVT水平之间的相关性的图。 
在各图中相同的标记指示相同的要素。 
具体实施方式
本公开描述了当与例如来自称为KY14的品种的烟草相比具有降低水平的4,8,13-杜法三烯-1,3-二醇(DVTs)的烟草。因此，本公开描述了DVTs水平降低的烟草品种、制备这样品种的方法、以及包含这样品种的烟草组合物。已经发现由DVTs水平降低的烟草制备的无烟烟草组合物具有独特的感官性质，因为本发明人已发现DVTs与苦味的感官特性相关。 
DVTs是西柏烷类(cembranoid)，其是一类在5种主要类型的烟草的叶面毛状体分泌物中发现的单环二萜类化合物，所述5种主要类型的烟草有：深色晾烟(dark)、弗吉尼亚型烟(Virginia)、白肋烟(Burley)、东方型烟(Oriental)和雪茄烟(cigar)。西柏烷类及其衍生物是是叶面上的毛状体的腺头(glandular head)中产生的并且是表面表皮蜡质的一部分，其中它们可与糖酯、蜡烃、酯和醇一起被发现。从烟草中已经鉴定出超过70种不同的西柏烷类，以及超过60种与西柏烷类相关的不同化合物(例如，西柏烷类的生物降解、氧化过程和逆醛醇缩合反应所产生的化合物)。除了DVTs之外，其它的西柏烷类或与西柏烷类相关的化合物包括不限于茄香根酮、西柏烯、黑松醇、茄醇(solanol)、降茄二酮(norsolanadione)和茄环丁萘酮(solanascone)。对于西柏烷类和相关的化合物的综述参见例如Wahlberg和Eklund(1992，“Cembranoids，Pseudopteranoids，and Cubitanoids of Natural Occurrence”在Herz等人编辑的Fortschritter der Chemi Organischer Natursfotte中，59:141-294，Springer Verlag，NY)以及Leffingwell(1999，“Leaf Chemistry”在Davis和Nielsen编辑的Tobacco，Production，Chemistry and Technology，第8章，Blackwell Publishing，Oxford)。 
通过Nielsen和Severson的J.Agric.Food Chem.，1990，38:467-471中描述的方法测量，DVTs水平降低的烟草和烟草品种通常显示低于20μgDVTs/cm2原叶组织(例如，低于19、18、16、15、14、12、10、8、6、5、4、3、2或1μg的DVTs/cm2)。报道有降低水平的DVTs的示例性的烟草属物种包括N.accuminata，N.africana，N.alata，N.debneyi，N.glauca，N.knightiana， N.langsdorfii，N.longiflora，N.megalosiphon，N.paniculata，N.plumbaginifolia，N.repanda，N.rustica，以及N.sanderae；而具有低于20μg的DVTs/cm2原叶组织(即，降低水平的DVTs)的代表性的烟草品种包括但不限于TI1406、GR139NS、TI1269和KDH959。适用于本申请公开的方法的其它烟草品种可在例如，USDA Nicotiana种质汇集(可在万维网上在ars-grin.gov/npgs处得到)中找到。表1显示来自USDA Nicotiana种质汇集的DVTs水平降低的代表性N.tabacum品种。 
表1：低DVT品种 
烟草 μg DVTs/cm2原叶
TI1004 14.06
TI1024 0.40
TI1029 0.31
TI1030 0.1
TI1031 0
TI1032 0.24
TI1070 8.7
TI1078 11.35
TI1112 0.19
TI1113 1.07
TI1117 0.71
TI1120 0.05
TI1123 0.04
TI1124 0.56
TI1227 9.81
TI1269 0.49
TI1349 3.06
TI1391 4.94
TI1406 0.46
TI1442 13.38
TI1448 10.7
[0069] 
TI1449 2.06
TI1524 0.17
TI1533 14.6
TI1535 8.96
TI490 10.29
TI538 0.44
TI717 11.78
TI870 0.31
TI70 0.16
KDH959 3.5
KDH950 0.7
Barinas 0.24
Badischer白肋烟E 9.33
当植物中的DVTs量相对于对照植物中的DVTs量的降低是统计上显著的时，则认为该植物中的DVTs量是降低的。DVTs的“统计上显著的”降低是指使用合适的参数统计或非参数统计例如卡方检验(Chi-square test)、学生t检验(Student's t-test)、曼-怀二氏检验(Mann-Whitney test)或者F检验(F-test)时p值低于0.10，例如p值低于0.05，p值低于0.025或者p值低于0.01。合适的对照植物是Nicotiana tabacum品种KY14(PI552477)。其它合适的对照烟草植物包括那些与KY14相当的植物、KY171、或者那些具有大于约20μg小于等于约100μg的DVTs/cm2原叶组织的DVT水平的植物。这样的对照植物是公众可得的以及可从例如，USDA Nicotiana种质汇集或国家种子贮藏实验室(Ft.Collins，CO)获得。 
DVTs可利用本领域中常规的方法获得、鉴定和/或测量。DVTs通过约15-25cm长的叶子进行分析。通常，当植物开始开花时(例如，当第一朵花开放时或者当一个或多个花蕾开放时)选择并收割约20cm长的叶子。可用溶剂例如乙腈、二氯甲烷、丙酮或氯仿等清洗叶子来从叶子表面移出DVTs。然后可利用例如GC或GC/MS对单环二萜类的三甲基甲硅基衍生物进行分离、鉴定和定量。参见Arrendale等人(1990，J.Agric.Food Chem.，38:75-85)和Severson等人(1985，J.Agric.Food Chem.，33:870-75)。通常，乙腈优先除去二萜和糖酯，而其它较低极性的溶剂除去二萜和糖酯之外还除去烃。作 为选择，在没有对DVTs进行衍生化的情况下的分离可利用HPLC进行(参见例如，Guo和Wagner(1995，Planta，197:627-32)；Guo等人(1994，Arch.Biochem.Biophys.，308:103-8))。除了GC、GC/MS和HPLC、薄层色谱(TLC)法也可用于对DVTs与其它西柏烷类进行分离或部分分离。代表性的TLC条件将公开于本申请的实施例中。 
当与DVTs水平没有降低的烟草或烟草组合物相比，DVTs水平降低的烟草品种和含这样低DVT烟草的烟草组合物在小组感官评定中显示改善的风味特性。烟草或者含有这样的烟草的烟草组合物的风味特性可通过感官评定小组利用本领域中已知的技术进行评价。例如，评定小组成员可以接受训练并根据Grub(在Ziegler和Ziegler编辑的Flavourings(1998)中第513-524页，Wiley-VCH Verlag GmbH，Weinheim，Germany)、Tamura等人(1989，Agric.Biol.Chem.，53,1625-1633)和Dunkel等人(2007，J.Agric.Food Chem.，55:6712-9)用于评价烟草的风味特性。此外，北卡州立大学感官服务中心(North Carolina State University Sensory Service Center)、锡拉丘兹大学的感官研究所(The Institute for Sensory Research at Syracuse University)、俄亥俄州立大学感官科学组(Ohio State University Sensory Science Group)、俄勒冈州立大学的感官实验室(the Sensory Laboratory at Oregon State University)和费城的蒙乃尔化学感觉中心(Monell Chemical Senses Center in Philadelphia)具有感官试验设施以及提供各种感官评定服务。 
本公开描述了DVTs水平降低的烟草和烟草品种以及产生这样的植物的方法。通过“烟草”是指烟草属的任何成员的任何部分，例如叶、花、根和茎。烟草的示例性物种包括N.rustica、N.tabacum、N.tomentosiformis、N.sylvestris和N.glauca。本申请所用的“品种”是个体之间就至少一种性状而言显示很小或者不显示基因差别的一组植物。可用于本申请所述方法中的烟草品种可以是来自明火烘烤型(fire-cured)和深色晾制型(dark air-cured)，然而，还可使用来自火管烘烤型(flue-cured)或浅色晾制型(light air-cured class)的品种。“纯系(pure line)”品种可通过几代自花授粉和选择或者通过利用组织或细胞培育技术自单一亲本进行无性繁殖来产生。一品种可基本上源自另一系或品种。如保护植物新品种的国际协定(1961年12月2日，于1972年11月10日、1978年10月23日和1991年3月19日在日内瓦修订)所定义，如果：a)某品种是主要源自最初品种，或者源自主要源自最初品种的品种，同时保持最初品种 的基因型或基因型组合所导致的基本特性的表达；b)某品种明显不同于最初品种；和c)除了由衍生作用导致的差异之外，某品种在最初品种的基因型或基因型组合所导致的基本特性的表达上与最初品种一致，则该品种是“基本上源自”最初的品种。品种可通过如下方法获得，例如通过自然突变或诱导突变的选择，最初品种的植物的变异个体，自花授粉和/或回交、转化、或者无性繁殖。 
在一种实施方式中，DVTs水平降低的烟草物种或烟草品种可通过DVTs水平降低的品种与第二品种的植物(例如一种现有的烟草品种)进行杂交来产生。例如，所述第二品种可以是例如显示例如令人期望的作物特性的农艺上的优良品种，所述令人期望的作物特性包括但不限于高产量、抗病性、耐旱性、含糖量、叶子尺寸、叶子宽度、叶子长度、叶子品质、叶子颜色、叶子红化、叶子产量、节间长度、开花时间、抗倒伏性、茎厚度、高等级指数、调制性能(curability)、调制质量(curing quality)、可机械收割性、保留能力(holding ability)、高度、成熟、茎尺寸、以及每株叶子数。植物杂交方法是本领域中众所周知的，包括但不限于来自一品种的雌性柱头与来自另一品种的花粉进行人工授粉。 
由上述的杂交形成的F1后代烟草植物可以进行回交或自花授粉。例如，可使F1后代烟草植物进行自花授粉至少一代(例如，1、2、3、4、5或6代)和/或F1后代烟草植物可与亲本之一(例如BC1、BC2、BC3和随后的各代烟草植物)进行回交。后代是指具体植物或植物品种之间的杂交的子体(descendant)，例如，在具体植物上发展的种子。后代也包括F2、F3、和随后的各代植物上形成的种子。其它育种技术也可用于产生DVTs水平降低的烟草品种。这样的方法包括不限于单颗种子后代、双单倍体生产、谱系育种和利用转基因的重组技术。可对任意上述杂交产生的后代烟草植物按DVTs水平进行筛选。参见例如Johnson等人的Crop Sci.，1988,28:241，其通过参考并入本申请。 
作为选择，一种现有的烟草品种(例如DVTs水平没有降低的烟草品种)可利用本领域中已知的方法进行突变。可通过各种诱变原(包括离子辐射、紫外辐射或者化学诱变剂)、通过感染某些与宿主基因组结合的病毒、或者通过引入先前体外诱变处理过的核酸，在活体中或在培养的细胞中诱导突变。可使由诱变处理过的植物或植物细胞再生的植物进行自花授粉，然后按 DVTs水平降低的那些植物筛选后代。 
杂交烟草品种可这样产生：阻止第一品种的母本植物(即，种子亲本)的自花授粉，允许来自第二品种的父本植物的花粉使所述母本植物受精，以及使F1杂交种子在雌性植物上形成。雌性植物的自花授粉可通过在花发育的早期对花进行去雄(emasculate)来阻止。作为选择，可利用雄性不育类型来阻止在母本植物上形成授粉。例如，可通过下面方法产生雄性不育：细胞质雄性不育(CMS)，核雄性不育、基因雄性不育、其中转基因抑制小孢子发生和/或花粉形成的分子雄性不育、或者自交不亲和性。包含CMS的母本植物是尤其有用的。 
可使用多种不同的方法来评价通过本申请所述方法(例如，育种、突变)的任一种产生的植物的DVTs和/或苦味的水平。例如，萃取和分离本申请所述的叶表面化合物来确定DVTs的水平。在一些情形时，植物中的DVTs的水平可与一种或多种对照植物直接或间接地进行比较。作为补充或作为选择，烟草叶(原叶或初烤烟叶)的苦味可通过本申请所述的感官评定小组进行评价。可选择鉴定为DVTs水平降低的植物用于进一步繁殖。 
来自已经鉴定为DVTs水平降低的烟草植物的种子可在田地上种植、收割以及利用本领域中标准方法进一步加工。例如，DVTs水平降低的原叶烟草可利用常规的方式进行调制，例如火管烘烤、明火烘烤、晾制或晒制。不同类型的调制方法的描述参见例如，Tso(在Davis和Nielsen编辑的Tobacco,Production,Chemistry and Technology(1999)中的第一章，Blackwell Publishing，Oxford)。此外，已经充分研究了不同调制方法导致的烟草化学上的变化。参见例如，Peele等人(Rec.Adv.Tob.Sci.，1996，21:81-133)和Wiernik等人(Rec.Adv.Tob.Sci.，1996，21:39-80)。 
在一些实施方式中，DVTs水平降低的熟烟可进行润叶(condition)和/或发酵。如美国公开2004/0118422或2005/0178398中所述，润叶包括例如，加热、出汗或巴氏灭菌步骤。发酵的特征通常是高的初始含湿量、产热，以及10～20%的干重损失。参见例如美国专利4,528,993、4,660,577、4,848,373和5,372,149。除了改变叶子的香气之外，发酵还可改变叶子的颜色或纹理或者两者。同样在发酵过程中，可产生气体逸出(evolution gas)；可消耗氧气；pH可变化；以及保持的水量可变化。参见例如，美国公开2005/0178398和Tso(在Davis和Nielsen编辑的Tobacco,Production,Chemistry and  Technology(1999)中的第一章，Blackwell Publishing，Oxford)。 
DVTs水平降低的调制后或者调制且发酵后的烟草可进一步进行加工(例如，剪切、膨胀、混合(blend)、碾磨或粉碎)并用于无烟烟草组合物中。参见例如美国专利4,528,993、4,660,577和4,987,907。可制备包含一种或多种具有降低水平DVTs的本申请所述烟草品种或按降低水平的DVTs进行选择的它们后代的无烟烟草组合物，例如但不限于：包括瑞典鼻烟(snus-style)制品和鼻烟制品在内的湿的或干的无烟烟草，成袋或成包的松散的烟草，嚼烟，无烟卷烟，可食用膜片(film strip)，涂有烟草的牙签和挤出的烟草制品。多种无烟烟草组合物的描述参见例如美国专利公开2005/0244521和2006/0191548。除了DVTs水平降低的烟草之外，本申请所述的无烟烟草组合物还可包含其它成分，例如粘合剂、增塑剂、稳定剂、和/或调味剂。 
在无烟烟草组合物中熟烟的100%可以是DVTs水平降低的烟草。例如，熟烟的100%可以是深色晾烟、白肋烟(称为TI1406之外的白肋烟烟草)、晾烟或深色明火烤烟。作为选择，在无烟烟草组合物中的熟烟可以是一种或多种具有低水平DVTs的烟草与一种或多种不具有低水平DVTs的烟草的共混物。示例性的不具有低水平DVTs的烟草包括但不限于LA B21、LN KY171、Basma、Galpao、Perique、Beinhart1000-1和Petico。本申请所用的共混物是指含有80%-99%(例如80%-85%，80%-90%，85%-95%，90%-99%，或者95%-99%)的低DVT烟草的烟草组合。例如，在可食用膜组合物或者无烟干或半湿烟草组合物中的熟烟的80%-100%可以来自DVTs水平降低的烟草，或者在无烟湿烟草组合物中的熟烟的40%-100%(例如40%-60%，50%-70%，或60%-80%)可以来自DVTs水平降低的烟草。 
根据本发明，可使用感官评定以及常规的植物育种、植物生物学和生理学、分子生物学、微生物学、以及本领域技术人员掌握的生化技术。在下面的实施例中将进一步说明本发明，但是这些实施例不限制权利要求书所描述的本发明范围。 
实施例 
实施例1—种子来源
0.1g的TI1406(PI408940)、KDH960(PI531523)、KDH926(PI531521)、KDH959(PI531522)、TI1068(119208)和KY14(PI552477)种子得自牛津国 家种质仓库(Oxford National Germplasm Repository，参见万维网上的ars-grin.gov/npgs/holdings.html)(USDA)并在温室和田野中繁殖。 
实施例2—温室植物生产
将烟草种子播种于容有卡罗来纳混合土(Carolina Soil Mix)的罐中。在播种的3至5周之后，将秧苗转移至其它罐中并保持在温室中直至采集叶子样品。按需要对植物进行施肥以及喷洒防虫害和防病的农药。 
实施例3—用于初烤烟叶(cured leaf)样品的叶子生产
移植生产、田野实践和调制根据针对白肋烟烟草而推荐的那些条件进行。在浮盘(float tray)中进行播种并保持在移植温室中达8周。将秧苗移植至田野并剪去植物的顶端叶子。在剪去顶端叶子的4至5周之后对植物进行砍茎，挂在仓库中晾制。在调制后，对叶子进行一级去梗(stripped in one grade)和打包(bailed)。去梗收集叶子样品，在40°C时干燥以及在Wiley碾磨机中磨碎。 
实施例4—烟草表面化合物的萃取
通过从每种烟草类型的10株植物的叶片上切下5.32cm直径的圆片来从植物中萃取出原叶的烟草表面化学物质。自其得到叶子圆片的植物生长在田野和/或温室中，当第一朵花开始开放时从约15-25cm长的叶子进行取样。 
在单个罐中将各圆片在100ml的二氯甲烷中轻洗30秒。使来自所有10片叶子的萃取物滤过无水硫酸钠床，利用N2进行蒸干以及使残渣在10ml的二氯甲烷中再生(reconstitute)。 
实施例5—烟草表面化学物质的TLC分析
对TLC板(Merck TLC硅胶60，2mm，10×20cm)在氯仿-甲醇(50:1，v/v)中进行预清洗、空气干燥以及在烘箱中通过在120°C加热30分钟来活化。利用CAMAG自动TLC上样器4将原叶萃取物(图1A)的烟草表面化学物质或初烤烟叶萃取物(图1B)的烟草表面化学物质加载(10μl)到板上。利用氯仿-甲醇(50:1，v/v)作为溶剂在溶剂室中使板展开。在通风橱中空气干燥3分钟后，用对茴香醛乙醇硫酸(AESA)溶液对板进行喷洒，用干手器(hand drier) 加热来使带的颜色展开。 
图1显示在多种不同烟草品种的原叶(A板)或初烤烟叶(B板)中观察到的DVTs的不同带强度。在TI1406中未检测到DVTs，在KDH959中检测到与KY14相比非常少的DVTs。此外，TI1068具有与KY14近似等量的DVTs，而KDH926和KDH960具有比KY14多的DVTs。 
实施例6—熟烟样品的感官评定
采用5位富有经验的品尝小组成员来评议熟烟样品的苦味感。给予每位小组成员编码的样品，并要求对样品的苦味感按1至9的等级进行打分，其中1认定为具有最低量的苦味而9认定为具有最高量的苦味。小组成员被要求用水冲洗他们的腭，并在各样品之间食用撒盐饼干。各品种的品尝小组平均结果示于表2中。 
表2中显示的DVTs水平来自Nielsen和Severson(1990，J.Agric.Food Chem.，38:467-471)。 
表2：DVT和苦味水平 
Figure BDA00003047933400151
实施例7—无烟制品的小组感官评定
对3种不同烟草品种进行两种不同味道测试，其中在这两测试会议(session)中采用相同的6位参与者。所有的6位参与者均有规律地使用无烟烟草制品以及已经参加了早先的味道测试。由于这些参与者具有先前的经历，就不进行感官上定义“苦味”的训练会议。 
在第一味道测试(表3和4)中，对烟草样品(TI1406，白肋烟和深色晾烟) 烤房调制4-8周，干燥，用薄荷味调味料略微调味(将所有的样品调味至类似的程度)，切成600微米的颗粒尺寸，再碾磨成200微米的平均干颗粒尺寸。在第二味道测试(表5和6)中，对烟草样品烤房调制4-8周，干燥，以及略微调味。对于味道测试，将TI1406和所述深色晾烟样品切成600微米的颗粒尺寸，而将白肋烟烟草样品碾磨成2毫米的平均颗粒尺寸。 
对于这两测试，均使用舌压器(tongue depressor)来计量样品，样品量由参与者判断，并且指示参与者在品尝的样品量上保持一致。参与者被要求以任何顺序品尝样品，就苦味和偏爱(preference)而言对样品在数值等级1-15进行评定，并且要求在样品之间用饼干和水清洗他们的腭。为了最小化同伴的影响，还指示参与者不要表示它们的反应(口头表示或面部表示)。 
苦味的小组感官评定的结果示于表3和5中，其中较小的数字说明所感知苦味的较少。表4和6显示小组成员对各熟烟样品的偏爱，其中较大的数字说明较高的偏爱。TI1406被品尝小组成员鉴定为具有最低量的苦味和最高的偏爱。 
表3：苦味的小组感官评定 
小组成员 深色晾制 TI1406 白肋烟
1 11 11 7
2 14.5 5 1.3
3 11 9 12
4 6 9 12
5 12 3 11
6 12.5 5.3 12.3
总额 67 42.3 55.6
表4：感官评定小组偏爱 
小组成员 深色晾制 TI1406 白肋烟
1 2 2 5
2 1.5 9.5 11.5
3 5 7 3.5
4 12 7 3
5 2 5 2
[0111] 
6 6.2 10.5 4.2
总额 28.7 41 29.2
表5：苦味的小组感官评定 
小组成员 深色晾制 TI1406 白肋烟
1 10 6 7.5
2 2 4 2
3 13.2 9.5 13.5
4 10 2 12
5 11.5 5.7 10.6
6 10 3 9
总额 56.7 30.2 54.6
表6：感官评定小组偏爱 
小组成员 深色晾制 TI1406 白肋烟
1 3 11 7.5
2 12 2 14
3 3.5 3.5 7
4 2 6 1
5 5.3 12.5 4.5
6 3 9 3
总额 28.8 44 37
实施例8—初烤烟叶样品的GC/MS-SPME分析
将1克的磨碎熟烟样品置于包含1ml的饱和NaCl溶液的40ml取样瓶中。顶部空间在水浴中于75°C平衡30分钟。使SPME纤维(Supelco，Bellafonte，PA)50/30μm DVB/Carboxen/PDMS涂层(coating)暴露于样品顶部空间15分钟用于吸附。样品在Varian仪器：装备分流-不分流进样口的Saturn2200GC/MS/MS上进行分析。SPME纤维的解吸附在不分流模式下在250°C时进行5分钟。GC柱是Phenomenex ZB-1ms：0.25mm(内径)×30m，固定 薄膜(0.25μm)。流动相为氦：在恒压下流速为1mL/min。控温箱梯度温度程序：初始温度40°C保持3分钟；以3°C增量升温至250°C再保持3分钟；以3°C增量升温至320°C再保持3分钟；总共运行时间为102.33分钟。注射之间的柱清洁通过使控温箱温度升至350°C并保持5分钟来实现。MS参数为：在70eV时电子电离；阱温度(trap temperature)为150°C；输送管(transfer line)温度为170°C，以及质量范围为40-600amu。通过使各个生成的谱图与NIST05质谱库或机器自带的标准谱图进行匹配来鉴定这些化合物。 
图2显示α-和β-DVTs(注意α-和β-DVTs共洗脱)的部分色谱图。部分色谱图说明在TI1406中其它西柏烷类或其降解产物(包括茄酮、茄香根酮、西柏烯和黑松醇)降低了。 
实施例9—材料
氯仿、二氯甲烷和粒状无水硫酸钠得自EMD Chemicals，Inc.(Merck，Darmstadt，Germany)。所有的化学物质未进行进一步纯化直接使用。干酪包布(cheesecloth)(100%纯试剂级)和滤纸得自VWR International，Inc.(West Chester，PA)。GC柱来自Phenomenex，Inc.(Torrance，CA)。柠檬酸和咖啡因(食品级)、酒石酸、硅藻土(Celite,CAFAII)来自Sigma-Aldrich(ST.Louis，MO)。甲醇HPLC等级得自Mallinckrodt Baker，Inc.(Phillipsburg，NJ)。加碘的氯化钠(Sodium chloride non-iodized)(Morton’s International)、糖(纯蔗糖颗粒，Domino Foods，Inc.)以及饼干(不加盐的)得自当地杂货店。在本试验中使用的烟草是利用正常生产技术在Winchester，KY在田野里或温室中生长的。 
实施例10—烟草叶面化学物质的萃取
通过从叶子(每株一片叶子)切下5.32cm直径的圆片来萃取原叶和调制后的叶子的烟草叶面化学物质。对从顶端的第5至第8片叶子进行取样。在田野里从每种烟草类型的10株中采集圆片。当植物处于开花期时收割原叶。在用铝箔包住的梅森食品瓶中，在100ml二氯甲烷中持续清洗每个圆片30秒。使萃取物滤过无水硫酸钠床，利用N2进行蒸干以及使残渣在10ml的二氯甲烷中再生。采取所有步骤使得萃取物最小程度地暴露于光。应注意本申 请披露的方法产生比Nielsen和Severson(1990，J.Agric.Food Chem.，38:467-471)的方法更高的DVTs产率。 
实施例11—DVTs的分离
从在温室里生长的烟草种质KDH960的毛状体分泌物中分离出DVTs，并用作在田野的烟草叶子中的DVTs定量中的参考物质。萃取步骤为Chang和Grunwald(1976，J.Lipid Res.，17:7-11)所述的那些。每组干酪包布收集成批的20个叶子样品用于萃取。干酪包布巾(cheesecloth wipe)为46cm×92cm(18”×36”)。叶子毛状体分泌物如下萃取。 
对4块干酪包布用氯仿(CHCl3)进行预萃取再空气干燥。每块布均叠成4层。将叠好的干酪包布中的两块(一块叠在另一块上)钉在两块面包板上。将每个烟草叶子置于固定的已预萃取的成套干酪包布之间，并利用对上试验板进行强力辗压。在辗压10-12次之后认真取下和替换每个叶子，其中一次辗压包括一次向前和一次向后的动作。然后在1.0L带盖的锥形瓶中用300mL氯仿萃取每组干酪包布，在环境温度下以200rpm(New Brunswick Scientific C78水浴振荡器，Edison，NJ)摇动60分钟。然后使萃取物通过硅藻土床以除去碎片，滤入1000mL回收瓶(24/40接口)中。使用200mL氯仿再萃取这些干酪包布两次。合并萃取物，在旋转蒸发仪(带真空控制器V-805的BUCHI Rotavapor，R-205，Buchi Corporation，New Castle，DE；配有水冷却器WKL230，Lauda，Germany)上浓缩至250mL，然后用100mL的1.0M酒石酸清洗。用500mL分液漏斗分出有机相，过滤通过无水粒状硫酸钠床，然后用旋转蒸发仪蒸干。将残留物转移至5mL的棕色存储瓶中，用N2向下吹气直至没有溶剂，存储到冰箱中。分析显示DVT浓度为81.61%纯，其中68%的产率为α-和β-DVTs。 
实施例12—定量
范围为100至6000μg/mL的二氯甲烷溶液的6点α-和β-DVT校准曲线(图4)由DVT分离物(81.61%纯)的母液得到。这些浓度已就分离物的纯度进行重量校正。利用500μL溶液或样品于二氯甲烷中的溶液和500μL的过量丁基硼酸于吡啶中的溶液来衍生各标准样品和烟草样品。重复制备标样和样品，每个重复样品分析两次。因为DVT响应在5μg/mL至100μg/mL以下 的范围内不是线性的，所以当需要时浓缩或稀释一些烟草样品从而MS响应落入校准范围内。 
实施例13—DVTs的GC-MS分析
样品在装备分流-不分流进样口的Varian Saturn2200GC-MS上进行分析。注射温度为250°C，以分流模式1:100。GC柱为Phenomenex ZB-5：0.25mm(内径)×30m，粘结膜(0.25μm)。流动相为超高纯度(UHP)的氦，在恒压下流速为1.0mL/min。控温箱梯度温度程序：初始温度150°C保持3.0分钟；以4°C增量升温至280°C保持10分钟；以80°C增量升温至320°C保持5.0分钟。总共的数据采集时间为47.5分钟。注射之间的柱清洁通过使控温箱温度从280°C升至320°C并保持5分钟来实现。MS参数为：在70eV时电子电离；阱温度为150°C；输送管温度为260°C，以及质量范围为33-400amu，其中扫描延迟为2.0分钟以避免色谱图的溶剂效应。 
实施例14—感官评定
品尝小组训练
如表7所示，用三种浓度的糖(甜)、NaCl(盐)、柠檬酸(酸)和咖啡因(苦)训练各小组成员(Dunkel等人的J.Agric.Food Chem.，2007，55:6712-9)。制备了浓度降低的溶液使得各溶液的浓度为前一溶液浓度的一半。在品尝各溶液之前，指令小组成员用纯净水冲洗他们的嘴并食用饼干。每种溶液以浓度升高的顺序给予小组成员(Tamura等人的Agric.Biol.Chem.，1989，53:1625-1633)。在品尝了溶液之后，评定参考烟草样品(KY14，磨碎成标准粒度)，并指定苦味得分为5。KY14随后用作所有烟草评定会议的对照。 
该小组的训练进行了8周，每周3次，利用物理参照(烟草样品)和化学参照(食品级，来自Sigma-Aldrich，Inc.)来帮助小组成员建立共同的数据点。小组成员接受训练以识别出相同浓度的参考化合物(Belitz和Grosch的Food Chemistry，1999，第33-37和763-764页)并指定为相同的得分(表7)。最低浓度得分1，中间浓度得分5和最高浓度得分9(表7)。在受训会议期间，已向小组成员解释了感官试验的目标，并且他们在专门词汇上达成一致。在10位受训的小组成员中，一位被证实不可靠，因而排除了该小组成员的数据。 
在所有训练期间，小组成员被要求在任何会议之前禁止使用烟草制品至 少1小时(ASTM标准)。小组成员被指令在测试结束之前不允许进行交谈。为了确保小组成员尽其力而为，推荐他们必须在每个受训会议和评定会议都是有空的。每周举行3个45分钟会议，每个会议10人。 
表7：化学感官参照物和评分 
品尝小组评定
味道测试设计用来确定和评定烟草叶子样品的苦味(描述性分析)。每个会议有6至9位受训的品尝小组成员(Grub(Ziegler和Ziegler编辑的Flavourings，1998，第513-524页，Wiley-VCH Verlag GmbH，Weinheim，Germany)；Tamura等人(Agric.Biol.Chem.，1989,53,1625-1633))有空评价感觉到的熟烟样品的苦味。给予各小组成员样品并要求对样品的苦味感在1至9的间隔等级内进行评分(Adams(在Bills和Mussinan编辑的Characterization and measurement of flavor compounds，1985，ACS论文集系列289，美国化学学会，华盛顿特区，第11-25页中)；Meilgaard等人(1991，Sensory evaluation techniques，第2版，CRC Press，Boca Raton，FL))。如果样品被认为苦味最低则小组成员给予得分1，而如果样品被认为苦味最高则小组成员给予得分9。小组成员被指令在样品之间等待约5-10分钟，在这段时间当中他们用水冲洗他们的腭并食用加盐饼干(Lawless和Gillette(在Bills和Mussinan编辑的Characterization and measurement of flavor compounds，1985，ACS论文集系列289，美国化学学会，华盛顿特区，第26-41页中))。 
所有的样品都编码随机的3位数，干燥并磨成标准筛目尺寸。呈现烟草样品使得样品之间的视觉差异对小组成员不是明显的，并且小组成员使用湿的牙签来品尝烟草样品。每个样品经3个连续的会议评定三次。采取各种努 力来使环境影响如气味、光线、噪音等最小化，并且所有的会议都在各天的相同时间举行(美国材料与试验学会(ASTM)，技术委员会E18，标准E18.01–E18.06)。 
品尝小组结果
图5显示测试的各烟草类型的品尝小组结果，其中1是低苦味强度而9是高苦味强度。从图5可看出，TI1406和KDH959具有最低的苦味得分，而TI1068和KDH960具有最高的苦味得分。 
实施例15—原叶中的DVT水平和来自田野生长的烟草植物的调制后烟叶中的苦味
来自品种TI1406、KDH959、HY14、KDH926、TI1068和KDH960的烟草植物根据2007肯塔基州烟草生产指南(2007Kentucky Tobacco Production Guide)在田野里生长。收割原叶，并且如上面实施例4中所述测量叶面上存在的α-和β-DVTs。图6显示了不同烟草品种的原叶中的平均DVT浓度(α-和β-DVT；μg/cm2)。可从图6中看出，在TI1406和KDH959的原叶组织中的DVTs水平是非常低的。 
如实施例14中所述，通过感官评定小组来对相同品种的熟烟叶的苦味进行评定。感官评定结果示于表8中。 
表8：烟草的感官数据 
Figure BDA00003047933400221
根据Kruskal-Wallis多重比较检验，相同字母之前的平均感官得分是无显著差异的(p<0.05水平)。 
根据Tukey’s HSD检验，相同字母之前的平均DVT水平是无显著差异 的(p<0.05水平)。 
苦味感与在原叶组织中DVTs水平的相关性示于图7中。从数据的线性可看出，在DVTs的水平与苦味感之间存在直接的统计上显著相关性(R2=0.876，p≤0.05)。 
实施例16—用食品级溶剂清洗
在原叶成熟阶段和在调制后阶段，从各烟草品种(TI1406、KY171、KDH960)采集10片叶子。叶子均纵向剪开。每片叶子的一半在没有进行任何处理的情况下在37°C进行干燥。叶子的另一半洗去包含西柏烷类以及本申请所述的其它化合物的叶面毛状体分泌物。用3批1升体积的95%纯乙醇(Everclear，Luxco Distilling Co.，St.Louis，MO)清洗叶子30秒3次。通过温和搅拌来室温清洗叶子，排出再在37°C时干燥。然后如本申请所述的训练过的感官评定小组对洗过和未洗过的干燥叶子进行评定。结果示于下表9和10。 
表9：洗过的与未洗的原烟叶的品尝小组得分 
样品 平均得分±标准偏差
洗过的  
TI1406 2.2±0.7
KY171 2.3±0.5
KDH960 2.3±0.6
未洗的  
TI1406 2.6±0.6
KY171 6.5±1.5
KDH960 8.1±0.1
表10：洗过的与未洗的熟烟叶的品尝小组得分 
样品 平均得分±标准偏差
洗过的  
TI1406 3.0±1.3
KY171 4.2±0.3
[0156] 
KDH960 4.5±1.6
未洗的  
TI1406 2.8±1.1
KY171 5.7±0.6
KDH960 8.3±0.3
如训练过的品尝小组所确定，用食品级溶剂(例如但不限于乙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、水、乙酸、丙醇、或者它们的任意组合)清洗KY171和KDH960的叶子显著降低了这些烟草的苦味得分。在TI1406、KY171和KDH960的清洗后样品之间口感不存在显著差异。此外，在清洗后的和未清洗的TI1406之间不存在显著差异。使用曼-惠特尼U检验评价统计显著性。 
实施例17—包含具有降低水平DVTs的烟草的膜片
烟草膜片可采用表11中所示的成分制备。例如，烟草膜片可通过在容有450克充分搅拌的去离子水的烧杯中混合50克的来自Dow Chemical的K-3(60%)、K-100(35%)和K4M(5%)等级的羟丙基甲基纤维素(HPMC)来制备，所述去离子水已经加热至180°F。在混合的同时，将40克磨细的烟草以及15克微晶的纤维素(FMC)、17克淀粉(B-700，来自Grain Processing Corp.)、16克甘油、0.8克聚山梨醇酯80(Unichema)和4克丙二醇单硬脂酸酯(PGMS，来自Danisco)加入上述HPMC溶液中。当温度降至低于100°F时将10克肉桂调味料和2克半乳蔗糖(人造甜料)加至溶液中。添加2克的碳酸钠将pH调至大约7.5。一旦所有的成分已经加入并且均匀分散，就将混合物置于水浴中，在持续搅拌30分钟的同时，降至65°F。按需要添加额外的水以得到在温度65°F时5000厘泊的Brookfield粘度，产生约17%w/w的溶液固体。 
然后利用固定间隙为15密耳(0.015英寸)的涂膜涂布器(draw-down blade)将一部分上述含烟草的溶液涂至玻璃板上。将该玻璃板置于预设在温度170°F的空气循环实验室烘箱中。在30分钟之后，从烘箱中取出玻璃板，冷至室温，从该玻璃板上取下厚度为2.5密耳(0.0025英寸)的干燥膜。然后将膜切成适于放入口中的小块。膜的1.0英寸×1.25英寸断片通常在1分钟内在口中碎裂，从而释放出调味料、甜料和烟草。该膜的烟草含量基于干重为25%。 
表11：烟草膜 
  示例性的(%) 优选的(%)
水溶性聚合物 10-70 20-65
烟草 1-90 20-40
调味料 1-40 5-15
甜料 0.2-6 2-5
纤维(可溶或不可溶的) 2-40 5-20
增塑剂 1-40 5-15
表面活性剂 0.01-20 0.1-1
淀粉/麦芽糖糊精 1-40 10-20
润滑剂 0.5-10 1-3
感官品尝小组用于评定含TI1406、KDH959、TI1068或KDH960烟草的单层或双层膜片。此外，评定了含烟草的膜片的DVTs的水平。 
实施例18—涂有烟草的牙签(toothpicks)
制备了涂有烟草的牙签。利用表12中所示的成分制备涂层。 
表12：牙签涂层 
成分 示例性的(%) 优选的(%)
水溶性聚合物 0-70 0.1-25
烟草 1-90 5-40
调味料 0-40 0.5-15
甜料 0-6 0.1-2
纤维(可溶和不可溶的) 0-40 0.1-20
增塑剂 1-90 10-75
淀粉/麦芽糖糊精 1-90 10-40
着色剂 0-2 0.2-1.5
简而言之，将水加至180°F，再将固体例如水溶性聚合物和烟草剧烈地混入水中。然后将其它成分例如增塑剂剧烈地混入溶液中直至固体完全溶解 和/或充分分散。使溶液冷却。如果需要的话，可在冷却后添加调味剂。在真空下保持溶液直至充分脱气再冷至80°F。 
将大约2/3至3/4的常规木质牙签或塑料牙签在含烟草的溶液中滚动、包裹在含烟草的溶液中、浸渍在含烟草的溶液中或者用含烟草的溶液涂敷，再使其干燥。 
感官品尝小组用于评定用包含TI1406、KDH959、TI1068或KDH960烟草的悬浮体涂敷的牙签。还评定了涂有烟草的牙签的DVTs的水平。 
实施例19—含烟草的片剂和挤出的制品
表13：用于片剂或挤出的制品的烟草粉末 
成分 示例性的(%) 优选的(%)
水溶性聚合物 0-70 0.1-25
烟草 1-90 20-40
调味料 0.1-40 1-15
甜料 0-25 0.1-15
增塑剂 0.1-40 1-15
淀粉/麦芽糖糊精 0-75 10-50
润滑剂 0-10 0.1-3
着色剂 0-10 2-7
含烟草的片剂和/或挤出的制品通过最初以造粒的方式混合配方成分来制备。所述造粒工艺可包括步骤：制备粘合溶液以及随后与干的成分混合。 
粘合溶液的制备
称出表13中所示的成分含量，加入单独的各容器中。将一种或多种水溶性聚合物(例如，预先水化的阿拉伯树胶)缓慢加至水中，再在不锈钢容器中在高剪切搅拌下混合。在完全溶解后，将麦芽糖糊精(M585，Grain Processing Corporation)缓慢加至水中。一旦麦芽糖糊精完全溶解，将甜料缓慢加入并充分搅拌从而确保完全溶解。将如表13中所示的调味剂的配方量(例如，胡椒薄荷和留兰香)加至粘合溶液中。用匀浆器对整个混合物进行匀浆。 
干的成分制备和随后的造粒
将如表13中所示的烟草的配方量混在一起，置于流化床室的产品碗(product bowl)中。使用流化床涂布器来将粘合溶液涂至用于形成最后颗粒的干的成分共混物。一旦干的成分在流化床中流化并达到了合适的温度，则将粘合溶液缓慢喷洒到干的成分上，从而形成颗粒。 
制品的形成
含烟草的片剂通过如下方法制备：混合颗粒状物质与适量的润滑剂，再用片剂压机等将该混合物加工成片剂形状。可通过利用片剂压机的合适压缩和填充参数来控制如此方式提供的片剂的溶解速率。 
作为选择，含有烟草的挤出制品通过如下方法制备：混合颗粒状物质与适量的增塑剂(例如，水)，再用装配合适成型的模头的挤出机将该混合物加工成挤出形状(例如，棒状)。 
实施例20—种植的烟草类型中的DVTs
表14显示了所指出的烟草类型中的DVTs的水平(利用本申请实施例4中所述的方法测定)。 
表14：商业化的烟草的DVTs 
原叶田野样品 烟草类型 平均DVT含量(μg/cm2)
KY171 深色晾烟 128.92
TN90LC 白肋烟 86.63
TN86LC 白肋烟 66.11
KT204LC 白肋烟 52.33
Beinhart1000 雪茄 45.02
NLMLC 深色晾烟 101.38
KT D6LC 深色晾烟 143.36
K326 火管烘烤 89.89
NC71 火管烘烤 85.72
Maryland609 马里兰烟 44.78
Basma 东方型烟 130.24
其它实施方式 
应理解的是：尽管已经结合本发明的具体说明来描述本发明，但是前面的说明旨在示例并非限制本发明的范围，所述范围是由所附权利要求的范围定义的。其它方面、优点和修改也落在所附权利要求的范围内。 

Claims (9)

1.一种无烟烟草组合物，其包含DVTs水平相对于称为KY14的品种的熟烟降低的熟烟。
2.权利要求1的无烟烟草组合物，其中所述熟烟在小组感官评定中相对于称为KY14的品种的熟烟显示出降低的苦味。
3.权利要求1的烟草组合物，其中所述熟烟还具有降低水平的茄酮、茄香根酮、西柏烯或黑松醇。
4.权利要求1的烟草组合物，其中所述熟烟是由具有低于20μg的DVTs/cm2原叶组织的原烟制备的和所述原烟还具有降低水平的茄酮、茄香根酮、西柏烯或黑松醇。
5.权利要求1的烟草组合物，其中所述熟烟经小组感官评定确定具有降低的苦味。
6.一种产生植物品种的方法，包括下面步骤：
使烟草植物组织突变；
通过自花授粉至少一代来繁殖源于所述突变的植物组织的植物；以及
在至少一代中，按烟草中相对于称为KY14的品种的烟草具有降低水平的DVTs进行选择，或按低于20μg的DVTs/cm2原叶组织进行选择，或者在来自所述代的植物的烟草的小组感官评定中按降低的苦味进行选择，由此产生所述品种。
7.一种产生植物品种的方法，所述方法包括下面步骤：
使第一烟草植物与第二烟草植物杂交来产生后代烟草植物，所述第一烟草植物在来自所述烟草植物的烟草的小组感官评定中具有相对于称为KY14的品种的烟草降低的苦味；
使所述后代烟草植物自花授粉至少一代；以及
在至少一代中，按烟草中相对于称为KY14的品种的烟草具有降低水平的DVTs进行选择，或按低于20μg的DVTs/cm2原叶组织进行选择，或者在来自所述代的植物的烟草的小组感官评定中按降低的苦味进行选择，由此产生所述品种。
8.由按在原叶组织中具有降低水平的DVTs进行选择的烟草品种的植物制备的熟烟。
9.由按在小组感官评定中具有降低的苦味进行选择的烟草品种的植物制备的熟烟。
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