CN1471577A - 含有可改变蛋白含量的分子诱导物的转基因植物 - Google Patents

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Abstract

本申请描述含Nic基因产物反应性元件的分离核酸，及其以下用途，用于生产降低水平烟碱和/或TSNA的转基因烟草植物、以及所含相关蛋白水平改变的其它植物或宿主细胞的方法，这是由于其中包括顺式作用诱饵元件。

Description

含有可改变蛋白含量的分子诱导物的转基因植物
相关申请
本申请要求2000年8月30日递交的临时申请序列号60/229,198的权益，其全部公开在此引作参考。
技术领域
本发明描述一种生产转基因植物，如转基因烟草的方法，这种植物的蛋白含量被改变，从而导致表型改变，如烟碱水平降低，以及照此产生的转基因植物和这种植物的种子。
背景技术
考虑到烟碱的成瘾性，生产烟碱水平降低的烟草受到关注。另外，作为表达商业价值产品的转基因的接受体来说，例如药物、化妆品成分或食品添加剂，产生极低水平烟碱或不产生烟碱的烟草植物很有诱惑力。已经设计了多种去除烟草中烟碱的方法。然而，大多数这些方法除了去除烟碱之外，还从烟草中去除了其它成分，因此对烟草有不利影响。与野生型烟草植物相比，传统育种方法已经产生低烟碱水平(约8％)的烟草。期望可以得到烟碱含量进一步降低的烟草植物和烟草。
烟碱主要在烟草植物根部形成，随后运送到叶子并在此储存(Tso，Physiology and Biochemistry of Tobacco Plants，pp.233-34，Dowden，Hutchinson & Ross，Stroudsburg，Pa.(1972))。烟碱由两种前体，烟酸和N-甲基吡咯啉缩合产生。它们来自两个不同的生物合成途径(见图1)(Bush and Saunders(1977)Proc.Am.Chem.Soc.Symp.，New Orleans，pp.389-425；Hashimoto and Yamada(1994)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.45，257-285；Waller andDermer(1981)In：The Biochemistry of Plants：A ComprehensiveTreatise，P.K.Stumpf and E.E.Conn，eds.Academia Press，pp.317-395)。其中N-甲基吡咯啉阳离子由鸟氨酸或精氨酸通过腐胺合成(Leete(1980)In：Encyclopedia of Plant Physiology，SecondaryPlant Products，Vol.8，E.A.Bell and B.V.Charlwood，eds，Springer-Verlag，pp.65-91；Tiburcio and Galston(1986)Phytochemistry，25，107-110)。相互移植试验表明，烟碱在根部合成并经过木质部运送到叶子和其它植物器官(Dawson(1941)Science，94，396397)。
两个调节座位(Nic1和Nic2)调节烟碱生成。Legg等((1969)JHered，60，213-217)将来自低生物碱含量的古巴雪茄栽培种中的基因转入Burley 21栽培种。他们发现，低生物碱品系与标准栽培种在两个座位Nic1(以前称为A)和Nic2(以前称为B)上不同。这两个座位不连锁，基因作用为半显性且主要是累加性的(Legg等(1969)JHered.，60，213217)。Collins等((1974)Crop Sci.，14，77-80)制备了这四个生物碱基因型的加倍型单倍体烟草繁殖系。标准培养种的基因型是Nic1/Nic1 Nic2/Nic2，低烟碱品系的基因型是nic1/nic1nic2/nic2。Nic1/Nic1 nic2/nic2是高中间体型，nic1/nic1 Nic2/Nic2是低中间体型(Legg and Collins(1971)Can.J.Genet.Cytol.13，287-291)。这些品系在花期、叶数、叶大小和植株高度上相似。单和双Nic突变体根部酶分析显示，喹啉酸磷酸核糖转移酶(quinolinate phosphoriboxyl transferase)(QPTase)和腐胺甲基转移酶(putrescence methyl transferase(PMTase))(PMTase)，两种酶的活性与烟碱生物合成水平成正比(Saunders and Bush(1979)Plant Physiol 64：236)。Nic1和Nic2都影响根部PMTase和QPTase活性并调节烟碱合成(Leete(1983)In：Alkaloids：Chemical andBiological Perspectives，S.W.Pelletier，ed.John Wiley & Sons，pp.85152)。Hibi等((1994)Plant Cell，6，723-735)分离了编码PMTase、PMT的cDNA，并显示PMT转录水平受Nic1和Nic2调节。
已经分离出QPTase cDNA和基因组克隆(NtQPT1)，NtQPT1的转录水平也受Nic1和Nic2调节(Song，W.，Mendu，N.，and Conkling，M.A..(1999)Plant Cell，待发表)。因此这显示，Nic基因通过调节编码两个限速酶PMTase和QPTase基因的转录水平，从而调节烟碱含量。进一步显示，Nic1和Nic2是NtQPT1转录的正调节子，其转录起始位点上游的启动子序列包含NtQPT1转录Nic基因产物活化必需的顺式作用序列。因为QPTase和PMTase表达受Nic基因产物的共同调节，可能Nic基因产物也直接调节PMT基因转录。
降低生物学产物如烟碱水平的途径之一，是降低导致该产物生物合成途径中所需酶(即QPTase和PMTase)的量。如果受影响的酶以限速量(相对于途径中所需的其它酶而言)天然存在，该酶丰度的任何降低将导致最终产物的生成减少。如果正常情况下酶量不在限速水平，为减少途径的产出必须将细胞中其含量降低到限速水平。反之，如果该酶的天然存在量在限速水平，该酶活性的任何增加将导致生物合成途径终产物的增加。通过反义调节腐胺甲基转移酶(PMTase)的表达改变烟草植物中烟碱水平在Nakatani和Malik的美国专利5,369,023和5,260,205中已经给出。Wahad和Malik的PCT申请WO94/28142描述了编码PMT的DNA以及正义和反义PMT构造物的用途。另外，Conkling等的PCT申请WO98/56923描述了编码植物喹啉酸磷酸核糖转移酶(QPRTase)的DNA、含这种DNA的构造物以及改变QPRTase表达以增加或降低植物烟碱生成的方法。尽管有以前的努力和成功，仍然需要降低植物中基因产物(例如，烟碱)生成的新方法。
发明内容
本发明的一个方面是分离的核酸分子(例如质粒)，其中含有顺式作用调节元件，或基本上由其组成或由其组成，以及这种分离核酸在生产转基因植物或宿主细胞上的用途，其中这些转基因对象中插入蛋白的水平改变(例如水平增加或降低)。具体的例子是Nic基因产物反应性元件(例如，结合到Nic基因产物的DNA序列)如(a)具有根据SEQ ID NO：1的序列或其片段的分离核酸，期望基本上由至少20-455个连续核苷酸组成或由其组成，并优选至少30-400个连续核苷酸，更优选50-350个连续核苷酸，最优选100-300或200-400个连续核苷酸；和(b)与SEQ ID NO：1互补序列杂交并结合或对Nic基因产物反应的分离核酸(即增加或降低操作性连接基因的转录并因而增加或降低宿主细胞中相关蛋白的水平)。
Nic基因反应性元件也可从美国专利5,459,252中公开的序列中获得，在此以其全部内容引作参考。在一些实施方案中，Nic基因产物反应性元件位于NtQPT1启动子-1000和-600或-700bp之间，其序列在美国专利5,459,252中公开。因此，一些实施方案涉及NtQPT1的300-400个核苷酸长的片段，正如美国专利5,459,252中公开，它们对应NtQPT1启动子-1000和-600或-700bp之间的序列。
本发明另一方面是重组核酸构造物，其中含有/包含顺式作用调节元件如上述Nic基因产物反应元件，以及这种重组核酸在生产此处所述转基因植物或宿主细胞中的用途。构造物可以是载体，如轰击型核酸转移颗粒或农杆菌载体。包含这种构造物、并优选含其多拷贝的植物细胞也是本发明的内容。
本发明进一步的方面是制造低烟碱含量和/或烟草特异性亚硝胺(TSNA)的转基因烟草植物的方法。该方法包括将含如上述Nic基因产物反应元件的外源核酸构造物导入所述至少一个烟草植物细胞，以产生至少一个转化烟草植物细胞。与缺少该外源核酸植物中的烟碱和/或TSNA水平相比，这至少一个转化烟草植物细胞包含外源核酸的量或拷贝数足以降低由该细胞或这些细胞再生的烟草植物中烟碱和/或TSNA水平。该方法可进一步包括由转化植物细胞产生烟草植物，以及(可选的)收集该烟草植物的烟叶、茎或种子。因而，由所述方法产生的烟草植物，包括其叶、茎和种子，也是本发明的内容。
本发明进一步的方面是烟碱和/或TSNA水平降低的烟草植物，该植物含有含外源核酸的细胞，该外源核酸含有上述Nic基因产物反应元件。与缺少该外源核酸的植物中的烟碱水平相比，该外源核酸包含在细胞中的拷贝数足以降低该烟草植物的烟碱水平。另外，该植物的叶、茎和种子，也是本发明的内容。
由所述转基因烟草植物制备的烟草产品，包括但不限于吸烟用物质(例如香烟、雪茄、烟斗烟草)、鼻烟、嚼烟、烟胶、烟糖，也是本发明的实施方案。优选这些烟草产品由收获的烟叶和茎制造，它们根据烟草制备中的常规方法已经切割、干燥、熏制和/或发酵。然而，也可使用改进的熏制和烟草加工方法以进一步降低TSNA水平。在一些实施方案中，实质上无烟碱和/或TSNA的烟草由多种Burley烟草(例如Burley 21)、东方烟草或烤烟制造。然而可以理解，用此处描述的实施方案，大多数烟草类型可以制成无烟碱和/或TSNA型。
其它实施方案包括经仔细混合以获得预期烟碱和/或TSNA水平的烟草产品。例如，如上制备的低烟碱和/或TSNA水平的烟草可以与常规烟草混合以获得几乎任意量的烟碱和/或TSNA。进一步，可以混合两或多种低烟碱和/或TSNA水平的烟草，以获得预期量的烟碱和/或TSNA。以此方式，可以逐步调节类型、香型以及烟碱和/或TSNA量的差异。这些混合型烟草产品可用于戒烟套装和计划，以降低或消除烟碱依赖和致癌性。这种套装和计划也是本发明的实施方案。
本发明更多的实施方案涉及降低烟草产品致癌性的方法，包括香烟、雪茄、鼻烟、嚼烟和含烟胶及含烟糖。一些方法，例如，涉及制备低烟碱和/或TSNA量的烟草和制造含所述烟草的烟草产品。
因此，上述转基因烟草植物被收获熏制和加工成烟草产品。这些烟草产品致癌性降低，因为它们由低烟碱和/或TSNA量的烟草制备。
然而，本发明的另一方面涉及降低吸、消费或其它摄入烟草的人的TSNA及其代谢物的量。这种方法的实施是通过向所述人们提供上述的低烟碱和/或TSNA量的烟草产品，因而降低这种产品对所述人们的致癌性。
更进一步，本发明提供增加或降低相关蛋白含量的植物的方法，其中相关蛋白受选自下组的顺式作用元件调节：(i)结合活化化合物的顺式作用活化元件，该活化化合物增加所述相关蛋白在所述植物中的表达，和(ii)结合抑制化合物的顺式作用抑制元件，该抑制化合物降低所述相关蛋白在所述植物中的表达。该方法包括将含所述顺式作用元件的外源核酸构造物导入至少一个植物细胞，以产生至少一个转化植物细胞，与缺少所述外源核酸的植物中的相关蛋白量相比，至少一个转化植物细胞所含外源核酸拷贝数足以增加或降低由所述细胞再生植物中的所述相关蛋白的水平。
因而，一般来说本发明提供相关蛋白水平增加或降低的植物(和其部分)，该植物含有含外源核酸的细胞，该外源核酸含有选自下组的顺式作用元件：(i)结合活化化合物的顺式作用活化元件，该活化化合物增加所述相关蛋白在所述植物中的表达，和(ii)结合抑制化合物的顺式作用抑制元件，该抑制化合物降低所述相关蛋白在所述植物中的表达；与缺少所述外源核酸的植物中的相关蛋白量相比，含外源核酸的细胞中其拷贝数足以增加或降低植物中相关蛋白的水平。
因而，本发明提供降低(原核或真核)宿主细胞中相关蛋白表达的一般方法，其中相关蛋白的转录被增强，这是通过结合活化化合物的顺式作用活化元件实现，该活化化合物增加该宿主细胞中该相关蛋白的表达。该方法含有以下步骤：(a)提供含该顺式作用活化元件的诱导性重组核酸构造物；和(b)将诱导构造物导入宿主细胞，导入量足以结合该活化化合物并降低相关蛋白的表达。
进一步，本发明提供增加宿主细胞中相关蛋白表达的一般方法，其中相关蛋白的转录被降低，这是通过结合抑制化合物的顺式作用抑制元件实现，该抑制化合物降低该宿主细胞中该相关蛋白的表达。该方法含有以下步骤：(a)提供含该顺式作用抑制元件的诱导性重组核酸构造物；和(b)将诱导构造物导入宿主细胞，导入量足以结合该抑制化合物并增加相关蛋白的表达。
在此处的附图以及下面的说明书中更详细解释了本发明的前述以及其它方面。
附图简述
图1描述导致烟碱生物合成的生物合成途径。已知通过Nic1和Nic2调节的酶活性是QPTase(喹啉酸磷酸核糖转移酶)和PMTase(腐胺甲基转移酶)。在烟碱生物合成中QPTase和PMTase是限速酶催化步骤，烟碱水平与QPTase和PMTase活性成正比。
图2表示NtQPT1基因和NtQPT1启动子-uidA嵌合体的代表性示意图。转录起始位点标作(+1)，箭头表示NtQPT的转录本。十个外显子用斜线阴影条表示。启动子系列缺失也表示为从启动子5’端缩短的实心线。融合到uidA基因的启动子片段大小以千碱基对(kb)表示(即Δ2.0，Δ1.4等)，uidA编码3-葡糖苷酸酶(GUS)。嵌合型NtQPT1启动子-uidA融合体克隆到pBI101。
图3表示在转基因烟草植物根、叶和茎中的β-葡糖苷酸酶(GUS)活性，这些转基因植物携带CaMV 35S启动子(CaMV35S)、无启动子的GUS(pBI101)和与GUS融合的5’巢式缺失的TobRD2(编码NtQPT1基因)启动子。与uidA基因融合的启动子片段大小以千碱基对(kb)表示(即Δ2.0，Δ1.4等)。每种构造物测试至少20个独立的转化体。
优选实施方案详述
此处所用的术语“植物”指维管植物。植物实例包括但不限于玉米，油菜，紫花苜蓿，水稻，油菜，黑麦，高梁，向日葵，小麦，大豆，烟草，马铃薯，花生，棉花，甘薯，木薯，咖啡，椰子，菠萝，柑桔，可可，茶，香蕉，鳄梨，无花果，番石榴，芒果，橄榄，番木瓜，腰果，澳大利亚坚果，杏，甜菜，苹果，黑莓，草莓，胡桃，葡萄，樱桃，桃，李子，梨，西瓜，浮萍，燕麦，大麦，蔬菜，观赏植物，针叶树和草(例如用于观赏、娱乐或草料)。蔬菜包括茄属物种(例如番茄)，莴苣，胡萝卜，花椰菜，芹菜，茄子，芦笋，绿豆，豌豆，Cucurbita属成员，Butternut squash，南瓜，弯茎南瓜，黄瓜，哈密瓜和musk melon。观赏植物包括杜鹃花，八仙花，芙蓉，玫瑰，郁金香，水仙，矮牵牛，康乃馨，猩猩木，和松菊，它们可用于实施本发明，包括，例如松树如火炬松，沼泽松，黑松，和辐射松；红杉；真枞如银枞和香枞；和雪松如西方铅笔柏和阿拉斯加花柏，草包括但不限于结缕草，梗草，酥油草，圣奥斯丁草，百慕大草，水牛草，黑麦草和鸭茅。也包括主要用作实验模型的植物，例如拟南荠。用于本发明的优选植物包括但不限于豆类，茄属(例如番茄)，叶菜如莴苣和卷心菜，草和农作物(例如，烟草，小麦，高梁，大麦，黑麦，水稻，玉米，棉花，木薯等)，和实验室植物(例如拟南荠)。任何其它植物都可用于实施本发明，而烟草植物特别优选。
可以从本发明植物收集的植物部件(例如，割或收获)包括，例如，果、花、种、根、块茎、叶、茎、树皮、木材等。需要注意，当以植物中特定蛋白的增加或减少作参考时，该蛋白的量可以在整个植物中改变，或仅在该植物的特定部件中改变。
总的来说，在本发明例证性实施方案中，通过缩合烟酸和N-甲基吡咯啉阳离子而在烟草植物中生成烟碱。导致烟碱生成的生物合成途径示例于图1。两个调节座位(Nic1和Nic2)起烟碱生成的共显性调节子作用。单和双Nic突变体的根部酶分析表明，两种酶，喹啉酸磷酸核糖转移酶(QPTase)和腐胺甲基转移酶(PMTase)的活性与烟碱生物合成水平成正比。烟碱合成能力不同的烟草组织(根和愈伤组织)中酶活性比较表明QPTase和PMTase活性与烟碱含量紧密相关(Wagner和Wagner，Planta 165：532(1985))。Saunders和Bush(PlantPhysiol 64：236(1979)表明，低烟碱突变体根部QPTase水平与叶子的烟碱水平成正比。
在一个优选实施方案中，本发明基于一种分离核酸(例如SEQ ID NO：1或其片段，该片段期望由至少20-450个连续核苷酸组成，优选至少30-400个连续核苷酸组成，更优选50-350个连续核苷酸组成，最优选100-300或200-400个连续核苷酸组成)，该分离核酸是或包含一个顺式作用调节元件，它存在于植物喹啉酸磷酸核糖转移酶(QPTase)和腐胺甲基转移酶(PMTase)编码序列上游。
另一个实施例是美国专利5,459,252公开序列中获得的Nic基因产物反应元件，其全部内容在此引作参考。在一些实施方案中，Nic基因产物反应元件位于NtQPT启动子-1000和-600或-700bp之间。因此，一些实施方案涉及NtQPT1启动子的300-400个核苷酸长度的片段，正如美国专利5,459,252公开，它对应NtQPT1启动子-1000和-600或-700之间的序列。因而，在一些实施方案中，示例性核酸的结构促进与一或多个转录因子(例如Nic1和Nic2)的相互作用，它们参与QPTase和/或PMTase的转录起始。
因此，所述核酸被称为是或包含至少一个转录因子(例如Nic1和Nic2)结合序列，也称为“顺式作用调节元件”。通过向植物细胞导入多拷贝的这些顺式作用调节元件(例如，与Nic1和Nic2相互作用的序列)，可以降低或抑制转录因子起始靶基因转录的能力。
因为QPTase和PMTase活性与烟碱含量紧密相关，如上述，植物根部QPTase或PMTase水平降低(与野生型植物中的水平相比)的转基因烟草植物的构造导致烟碱水平降低的植物。不需联系任何专门理论，预期创建烟碱量降低的烟草植物、烟草和烟草产品也将导致TSNA量降低。也就是说，通过去除烟草植物、烟草和烟草产品中的烟碱，可以有效去除形成TSNA的生物碱来源。
已经发现，烟草中烟碱降低与TSNA降低直接相关。出乎意料的是，此处描述的方法不仅产生成瘾性降低的烟草，而且随之产生致癌性降低的烟草。
需要强调，短语“降低的量”意思是指转基因烟草植物、烟草或烟草产品中烟碱或TSNA的量，它少于来自以相同方式加工的同种烟草中的烟草植物、烟草或烟草产品中发现的量。它们没有经过转基因以降低烟碱和/或TSNA。因而，在某些情况下，以相同方式加工的同种野生型烟草用作对照，以测量通过此处所述的发明方法获得的烟碱和/或TSNA是否降低。
根据其种类和生长、收获及熏制方式，野生型烟草中TSNA和烟碱的量变化很大。例如，Burley烟叶含烟碱30,000ppm和TSNA 8,000ppb；烤烟型Burley烟叶含烟碱20,000ppm和TSNA 300ppb；东方熏制烟叶含烟碱10,000ppm和TSNA 100ppb。根据本发明，烟碱和/或TSNA量降低的烟草植物或其部分中也可含检测不到量的烟碱和/或TSNA，或者可以含可检测量的一或多种TSNA和/或烟碱，只要烟碱和/或TSNA的量少于同种对照植物中的量即可。也就是说，本发明含烟碱量降低的Burley烟叶实例可含烟碱量0到30,000ppm和TSNA量0到8,000ppb，期望含烟碱量0到20,000ppm和TSNA量0到6,000ppb，更期望含烟碱量0到10,000ppm和TSNA量0到5,000ppb，优选含烟碱量0到5,000ppm和TSNA量0到4,000ppb，更优选含烟碱量0到2,500ppm和TSNA量0到2,000ppb，最优选含烟碱量0到1,000ppm和TSNA量0到1,000ppb。由此处所述方法制备的Burley烟叶实例也可含烟碱量0到1,000ppm和TSNA量0到500ppb，一些由此处所述方法制备的Burley烟叶实例几乎没有可检测量的烟碱或TSNA。
与之相似，烟碱量降低的本发明烤烟叶实例可含烟碱量0到20,000ppm和TSNA量0到300ppb，期望含烟碱量0到15,000ppm和TSNA量0到250ppb，更期望含烟碱量0到10,000ppm和TSNA量0到200ppb，优选含烟碱量0到5,000ppm和TSNA量0到150ppb，更优选含烟碱量0到2,500ppm和TSNA量0到100ppb，最优选含烟碱量0到1,000ppm和TSNA量0到50ppb。由此处所述方法制备的烤烟实例也可含烟碱量0到500ppm和TSNA量0到25ppb，一些由此处所述方法制备的烤烟实例几乎没有可检测量的烟碱或TSNA。
进一步，本发明降低烟碱量的东方熏制烟实例可含烟碱量0到10,000ppm和TSNA量0到100ppb，期望含烟碱量0到7,000ppm和TSNA量0到75ppb，更期望含烟碱量0到5,000ppm和TSNA量0到50ppb，优选含烟碱量0到3,000ppm和TSNA量0到25ppb，更优选含烟碱量0到1,500ppm和TSNA量0到10ppb，最优选含烟碱量0到500ppm和不含TSNA。由此处所述方法制备的东方熏制烟实例也可含烟碱量0到250ppm和不含TSNA，一些由此处所述方法制备的东方熏制烟实例几乎没有可检测量的烟碱或TSNA。
本发明提供生产这种转基因植物的方法和核酸构造物，以及这种转基因植物。这种方法包括开发降低(或消除)烟碱生物合成的转基因盒。烟草植物用过量DNA序列(顺式作用元件)转化，它们来自基因启动子，这些基因编码但不限于在烟碱生物合成中受调节的QPTase和PMTase。这些顺式作用元件优选整合入植物基因组，以向下一代转移。典型地，与这些顺式作用DNA序列相互作用的Nic1和Nic2 DNA结合蛋白在细胞中表达水平相当低，因此过量的转基因顺式作用元件将与和基因相连的内源性元件竞争，这些基因编码QPTase和PMTase但不限于此，它们对应可用的Nic1和Nic2。因此，这些顺式作用DNA序列(及其它顺式作用元件)在此称为“诱饵”或“分子诱饵”。竞争降低反式作用DNA结合蛋白在其对应顺式作用元件上的结合，因而下调烟碱生物合成酶的合成。
本发明也提供QPTase或PMTase顺式作用元件的DNA分子，含有这些DNA分子的载体，以及用这些DNA分子和载体转化的转基因植物细胞和植物。
本发明转基因烟草细胞和植物的特征在于与未转化对照烟草细胞和植物相比更低的烟碱含量。
作为表达商业价值产品如药物、化妆品成分或食品添加剂的转基因的接受体，烟碱生成水平低、或实际上无烟碱生成的烟草植物是有吸引力的。烟草是有吸引力的作为编码期望产品转基因的受体植物，因为烟草容易用遗传工程改造并产生每英亩非常大的生物量；烟草植物用于烟碱生成的资源减少，从而有更多资源用于生产转基因产品。用生产期望产品的转基因转化烟草的方法本领域已知；任何适用的方法可用于本发明的低烟碱烟草植物。
根据本发明，QPTase和PMTase表达降低和烟碱水平降低的烟草植物期望用于生产低烟碱和/或TSNA含量的烟草产品。此处所述的烟草植物适用常规生长和收获方法(例如，除顶或不除顶，花装袋或不装袋，培养于富含肥料的土壤或无肥料的土壤)，且收获的叶和茎适用任何传统烟草产品，包括但不限于烟斗、雪茄和香烟烟草，和嚼烟，可以是任何形式包括叶烟、烟丝或生切烟丝。
期望此处所述的低烟碱和/或TSNA的烟草可与常规烟草一起加工和混合，以创建其中含烟碱和/或亚硝胺量可以变化的广泛的烟草产品。
这些混合型烟草产品可用于戒烟计划，以使消费者慢慢从高烟碱和TSNA产品转向低烟碱和TSNA产品。例如，吸烟者可以从吸含10mg烟碱和1.5mg亚硝胺的香烟开始该计划，逐渐转向吸含7mg烟碱和1mg亚硝胺的香烟，接着含5.0mg烟碱和0.5mg亚硝胺的香烟，接着含2.0mg烟碱和0.25mg亚硝胺的香烟，接着含1.0mg烟碱和无亚硝胺的香烟，直至消费者决定只吸几乎不含烟碱和亚硝胺的香烟或完全不再吸烟。因此，此处所述的混合型香烟提供以逐步方式降低对人致癌性方法的基础。1.编码顺式作用元件如Nic基因产物反应元件的核酸。
根据本发明的具体应用，多种顺式作用元件的任一种可用于实施本发明。
以单独或互相组合方式，可用于实施本发明的顺式作用元件(和对应转录因子)的实例包括但不限于，AS-1和ASF-1(见美国专利4,990,607和5,223,419)、AATT重复元件和PABF(见美国专利5,834,236和6,191,258)、马铃薯的创伤反应顺式作用元件(Bustos等，Plant Cell 1：839-853(1989))、来自烟草RB7启动子的根特异性顺式作用元件(美国专利5,459,252和Yamamoto等，Plant Cell 3：371382(1991))、poly(dA-dT)正调节元件和结合蛋白和CCCAA重复负调元件和结合蛋白(Wang等，Mol.Cell Biol.12：3399-3406(1992))、来自烟草光敏色素A1启动子的根尖调节元件(Adam等，PlantMol Biol 29：983-993(1995))、来自玉米3-磷酸甘油醛脱氢酶4基因的无氧反应性元件(Geffers等，Plant Mol Biol 43：11-21(2000))、和来自拟南荠油质蛋白基因的种子特异性调节区(见美国专利5,792,922)，所有此处表述文献以其全部内容引作参考。
本领域发展状况如下，大数据库列出已鉴定的顺式作用调节区(例如，植物顺式作用调节元件，″PLACE″，有大约1,340条，见http：//www.dna.affrc.gojp/hotdocs/PLACE/，和植物顺式作用调节元件″PlantCARE″，其中列出约159个植物启动子，见http：//sphinx.rug.ac.be：8080/PlantCARE/)。这些数据库中列出的顺式作用调节元件和Raumbauts等，Nucleic acids Research 27：295-296(1999)和Higo等，Nucleic acids Research 27：297-300(1999)提供的顺式作用调节元件可用于本发明实施方案。因此，以上数据库和参考文献在此以其全部内容引作参考。可用于本发明实施方案的顺式作用调节区域的其它实例包括，Lacombe E，Van Doorsselaere J，Boerjan W，Boudet AM，Grima-Pettenati J，，Characterization of ciselementsrequired for vascular expression of the cinnamoyl CoA reductasegene and for protein-DNA complex formation Plant J 23：663-676(2000)；Tilly JJ，Allen DW，Jack T The CArG boxes in the promoterof the Arabidopsis floral organ identity gene APETALA 3 mediatediverse regulatory effects Development 125：1647-1657(1998)；Cordes S.，Deikman J.，Margossian L.J.，Fischer R.L.Interaction of a developmentally regulated DNA-binding factorwith sites flanking two different fruit-ripening genes fromtomato Plant Cell 1(10)：1025-1034(1989)；Hagen G.，Martin G.，Li Y.，Guilfoyle T.Auxin-induced expression of the soybean GH 3promoter in transgenic tobacco plants″Plant Mol.Biol.17：567-569(1991)；Pastuglia M.，Roby D.，Dumas C.，Cock J.M.，Rapidinduction by wounding and bacterial infection of an S gene familyreceptor-like kinase in Brassica oleracea，Plant Cell 9：1-13(1997)；Grierson C，Du JS，Zabala MT，Beggs K，Smith C，HoldsworthM，Bevan M Separate cis sequences and trans factors directmetabolic and developmental regulation of a potato tuber storageprotein gene Plant J 5：815-826(1994)；MBSI，Petunia hybridaMYB binding site involved in flavonoid biosynthetic generegulation，Koes R.E.，Spelt C.E.，van Den Elzen P.J.M.，MolJ.N.M.Cloning and molecular characterization of the chalconesynthase multigene family of Petunia hybrida，Gene 81：245-257(1989)；Inaba T.，Nagano Y.，Sakakibara T.，Sasaki Y.，Identification of a cis-regulatory element involved inphytochrome down-regulated expression of the pea small GTPasegene pra2，Plant Physiol.120：491-499(1999)；DRE，Arabidopsisthaliana cis-acting element involved in dehydration，low-temperature，salt stresses，Yamaguchi Shinozaki K.，ShinozakiK.，Arabidopsis DNA encoding two desiccation-responsive rd29genes，Plant Physiol.101：1119-1120(1993)；Rushton P.J.，Torres J.T.，Parniske M.，Wernert P.，Hahlbrock K.，SomssichI.E.，Interaction of elicitor-induced DNAbinding proteins withelicitor response elements in the promoters of parsley PR1 genes，EMBO J.15(20)：5690-5700(1996)；MSA-like cis-acting elementinvolved in cell cycle regulation，Ito M.，Criqui M.C.，SakabeM.，Ohno T.，Hata S.，Kouchi H.，Hashimoto J，Fukuda H.，KomamineA.，Watanabe A.Cell-cycle regulated transcription of A-andB-type plant cyclin genes in synchronous cultures，Plant J.11：983-992(1997)。所有在此表述的文献以其全部内容引作参考。一般来说，优选元件是对维持宿主细胞生存非关键性的(例如，不与对基本细胞功能必需的“管家基因”结合的元件)，但与导致植物非致死性表型改变的基因或基因家族的转录调节功能性结合的元件。
可通过以此处所述相同的方式筛选被Nic基因产物转录活化的基因的启动子区域分离Nic基因产物反应元件，或者可以通过下述方式与此处SEQ ID NO：1杂交及随后筛选结合Nic基因产物的能力来鉴定。
用于实施本发明的核酸序列包括与SEQ ID NO：1相似的天然存在的或合成片段或其中期望至少20-455个连续核苷酸组成的片段，优选至少30-400个连续核苷酸，更优选50-350个连续核苷酸，最优选100-300或200-400个连续核苷酸。该限定含义包括SEQ ID NO：1 DNA的天然等位基因变体或所述片段。因而，与SEQ ID NO：1 DNA杂交的DNA序列或其互补形式也可用于实施本发明。优选实施方案包括SEQ ID NO：1的片段，或仍保留结合Nic基因产物能力的其它Nic基因产物反应元件(即结合SEQ ID NO：1互补形式的元件)。
一般来说，这种片段是至少20、40或60个核苷酸长度的天然存在构造物的连续片段或其部分。允许与SEQ ID NO：1有序列相似性的其它DNA序列的条件可以常规方式确定。例如，这种序列的杂交可在低严谨度或平均严谨条件下(例如，用标准原位杂交试验和此处给出的SEQ ID NO：1序列，用0.3 M NaCl，0.03M柠檬酸钠，0.1％SDS在60℃或甚至70℃洗涤DNA的严谨度代表的条件。见J.Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(2d Ed.1989)(Cold SpringHarbor Laboratory))。一般来说，这种序列与此处给出的SEQ ID NO：1序列至少有65％相似性、75％相似性、80％相似性、85％相似性、90％相似性或甚至95％相似性或更高相似性。两个序列相似性的确定用最大匹配度比对进行；在最大化匹配中允许匹配两序列中任一个中的间隙。优选间隙长度为10或更小，更优选间隙长度为5或更小，甚至更优选间隙长度为2或更小。
本发明的DNA序列可实质上由此处提供的序列(SEQ ID NO：1)组成，或由代表等位基因或这些基因的多态性变体、或其编码区的等价核苷酸序列组成。
本说明书和权利要求书中使用短语“实质序列相似性”意思是，与此处公开和要求的实际序列有轻微和无后果型序列变化的DNA、RNA或氨基酸序列。在这点上，“轻微和无后果型序列变化”意思是“相似”序列(即与此处公开和要求的DNA、RNA或蛋白质有实质序列相似性)与本发明公开和要求的序列在功能上等价。
功能等价序列以实质上相同的方式发挥功能，产生与此处公开和要求的核酸和氨基酸组合物实质上相同的组合物。
用于本发明的其它核酸序列包括Nic基因产物反应元件，它可以从美国专利5,459,252中公开的序列获得，在此以其全部内容引作参考。在一些实施方案中，Nic基因产物反应元件位于NtQPT1启动子-1000和-600或-700bp之间。因此，一些实施方案涉及NtQPT1的300-400个核苷酸长的片段，正如美国专利5,459,252中公开，它们对应NtQPT1启动子-1000和-600或-700之间的序列。
如下讨论，此处提供的DNA序列可以转化入多种宿主细胞。具有期望生长和处理特性的、多种适用的宿主细胞在本领域容易获得。
本说明书和权利要求书中使用短语“分离的”或“基本纯的”作为DNA、RNA、多肽或蛋白的修饰成分意思是，如此称呼的DNA、RNA、多肽或蛋白已经通过人为努力从其体内细胞环境中分离。如此处所用，“天然DNA序列”或“天生DNA序列”意思是从非转基因细胞或组织中分离的DNA序列。天然DNA序列未经人工改变，如定点突变。一旦鉴定了天然DNA序列，具有天然DNA序列的DNA分子可以化学合成或用重组DNA方法产生，这在本领域已知。如此处所用，天然植物DNA序列分离自非转基因植物细胞或组织。如此处所用，天然烟草DNA序列分离自非转基因烟草细胞或组织。2.核酸构造物和转移载体
本发明的核酸构造物或“盒”包括顺式作用元件如上述Nic基因产物反应元件，典型地线性或环状核酸的重组构造物，其起转移载体作用以将Nic基因产物导入植物细胞。
构造物或盒可以是也有至少一个复制系统的DNA构造物。为方便起见，常见具有在E.coli发挥功能的复制系统，如ColE1、pSC101、pACYC184等。
以此方式，在每步操作后的每个阶段，可对所得构造物克隆、测序，并由此确定操作的正确性。此外，或取代E.coli复制系统，可使用广泛宿主范围的复制系统，如P-1不相容质粒复制系统，例如pRK290。除了复制系统外，经常至少有一个标记，它可用于一或多种宿主中，或者不同宿主用不同标记。也就是说，一种标记可用于原核宿主中的选择，另一种标记可用于真核宿主，特别是植物宿主中的选择。标记可用于抗生物杀灭剂，如抗生素、毒素、重金属等；可提供营养补充，通过给予营养缺陷型宿主以原养性；或者可以通过在植物中产生新化合物提供可见表型。
本发明的核酸构造物可包括一或多种基质连接区，定位于顺式作用元件的5’、3’之一或5’和3’都有，以增强其稳定性和/或可遗传性，这在以下有描述：美国专利Thompson等的5,773,689，Thompson等的5,773,695，Michalowski等的6,245,974，Thompson等的6,239,328，Thompson等的6,100,448和Thompson等的6,037,525，该公开的全部内容在此引作参考。
通过适当复制系统的限制性酶切和将特定构造物或片段插入可用位点，可连续导入含有多种构造物、盒、标记等的多种片段。经连接和克隆之后，可分离DNA构造物供进一步操作。所有这些方法在文献中有详细说明，例如J.Sambrook等，Molecular Cloning，ALaboratory Manual(2d Ed.1989)(Cold Spring HarborLaboratory)。
可用于将本发明核酸构造物转化植物组织的载体包括轰击型载体(ballistic vectors)和农杆菌载体，以及适于DNA介导转化的载体。这些在下面将详细讨论。
用于产生本发明转化细胞和植物的核酸构造物分子和载体可进一步含有显性选择标记基因。适用于烟草的显性选择标记包括但不限于，抗生素抗性基因如编码新霉素磷酸转移酶(NPTII)、潮霉素磷酸转移酶(HPT)和氯霉素乙酰转移酶(CAT)。适于烟草的另一种熟知的显性选择标记是突变型二氢叶酸还原酶基因，它编码抗氨甲喋呤的二氢叶酸还原酶。含合适抗生素抗性基因的DNA载体、以及对应的抗生素都可从商业途径得到。3.植物转化、再生和繁殖
将混合细胞群落放置于含适当浓度抗生素(或通常对细胞有毒的其它化合物)的培养基上，所选显性选择标记基因产物给予相应的抗性，从而从周围未转化细胞的环境中选择出转化细胞。因此，只有那些已经被转化的植物细胞可以存活和增殖。
制造本发明重组植物的方法一般涉及：首先提供可再生的植物细胞(典型地位于可再生组织的植物细胞)，然后用含本发明核酸盒的DNA构造物(如此处所述)转化植物细胞并从转化植物细胞中再生重组植物。如下解释，转化步骤的实施通过本领域已知的方法，包括但不限于用携带转录盒的微颗粒轰击植物细胞，用含携带转录盒Ti质粒的根癌农杆菌感染细胞，或适于生产转基因植物的任何其它方法。
携带本发明DNA构造物的微颗粒，该微颗粒适于轰击转化植物细胞，也可用于制造本发明的转化植物。该微颗粒被打进植物细胞，产生转化植物细胞，并从该转化植物细胞再生植物。任何适用的轰击细胞转化方法和仪器可用于实施本发明。仪器和方法实例公开于Sanford和Wolf的美国专利4,945,050和Christou等的美国专利5,015,580(此处引用的所有美国专利文献公开在此引作参考)。当使用轰击转化方法时，该盒结构可引入能复制或整合到待转化细胞中的质粒中。适用于这种系统的微颗粒实例包括1到5微米(μm)金球。通过任何适用的方法如沉淀可将DNA构造物沉积于微颗粒上。
已知多种适于实施本发明的农杆菌载体。例如，美国专利4,459,355公开一种用含Ti质粒的农杆菌株转化敏感植物，包括双子叶植物的方法。用农杆菌载体转化木本植物公开于美国专利4,795,855中，进一步，Schilperoort等的美国专利4,940,838公开一种适于实施本发明的二元农杆菌载体(即其中农杆菌含一种具有Ti质粒的vir区但没有T区的质粒，和另一种具有Ti质粒的T区但没有vir区的质粒)。
典型地诱饵序列必须以高拷贝数存在于基因组中，串联拷贝的顺式作用元件可以插入农杆菌载体中，但优选的植物转化方法是通过颗粒轰击将多拷贝转基因DNA引入植物基因组中。顺式作用元件必须插入宿主细胞(及其后代或子代细胞)以获得本发明细胞和植物中相关蛋白水平增加或降低，其实际数目(无论每个元件单独存在于载体上如质粒上，或多个拷贝位于单一载体或质粒上，或两种方式组合存在)部分依赖于特定元件，但一般至少20、30或50个到500、1,000或2,000个或更多。
用本领域熟知的方法，通过DNA介导植物细胞原生质体转化及随后从转化原生质体再生植物，植物物种可以用本发明DNA构造物转化。烟草原生质体与含DNA的脂质体融合或经电穿孔融合在本领域已知(Shillito等，″Direct Gene Transfer to Protoplasts ofDicotyledonous and Monocotyledonous Plants by a Number ofMethods，Including Electroporation″，Methods in Enzymology153，313-36(1987))。
如此处所用，“转化”指将外源DNA导入细胞，以产生用外源DNA稳定转化的转基因细胞。“稳定转化”意思是外源核酸传递给初始转化细胞的子代或后代细胞，并优选通过转化细胞的后代植物传递或遗传(包括有性和无性生殖的后代植物)。
通过使用本领域熟知的细胞和组织培养方法诱导转化细胞再生完整植株。选用可与转化方法相容的植物再生方法。从转化细胞再生转基因植物后，通过传统植物繁育方法并不需过多试验，容易将引入的DNA序列转移到另一种植物变种。
例如，为分析转基因DNA的分离，再生转化植物(R0)可生长至成熟，测试其相关蛋白水平，并自交产生R1植物。一定百分比的携带转基因DNA的R1植物对转基因DNA是纯合的。为鉴定纯合R1植物，转基因R1植物生长至成熟并自交。纯合R1植物将产生R2代，其中每个后代植物携带转基因DNA；而杂合R1植物的后代将按3∶1分离。
烟碱作为天然杀虫剂帮助保护烟草免于昆虫破坏。因此可以期望另外用给予附加昆虫保护的转基因(如苏云金芽孢杆菌)来转化本发明方法产生的低或无烟碱植物。
用于本发明的优选的植物是烟草属或烟草的任一种，包括烟草，黄花烟草和花烟草。可以使用任一株或变种的烟草。
无论通过器官发生或胚胎发生，任何可随后无性繁殖的植物组织可用本发明载体转化。此处所用术语“器官发生”意思是从分生组织中心相继发育出幼芽和根的过程；此处所用术语“胚胎发生”意思是无论从体细胞或配子中，幼芽和根一起以协同方式(而非相继)发育。根据可用和最适于所转化特定物种的克隆繁殖系统可改变所选的具体组织。
靶组织实例包括叶盘、花粉、胚、子叶、胚轴、愈伤组织、已有分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根部分生组织)和诱导分生组织(例如子叶分生组织和胚轴分生组织)。
本发明植物可以有多种形式。植物可以是转化细胞和未转化细胞的嵌合体；可以是克隆转化体(例如所有细胞都已转化含转基因盒)；可以含转化和未转化组织的移植物(例如柑桔类植物中转化根状茎移植到未转化嫩枝上)。
在本发明的一些优选实施方案中，为帮助确保有足够数量的诱饵或顺式作用元件插入细胞并在很多细胞分裂中保持以产生其中蛋白水平改变的转基因植物，使用上述轰击转化方法，用环状DNA或质粒携带上述顺式作用诱饵片段，所用环状DNA或质粒相对较小(例如由少于10,000或6,000碱基对组成)，与选择标记相比，高摩尔比的顺式作用元件(例如10∶1)被插入宿主细胞。
如此处所用，农作物含有一起种植于农田中的、本发明的多种植物，且属于相同的属。“农田”意思是常见的土壤地块或温室。因此，与同种和同变种的类似未转化农作物比较，本发明提供一种生产相关蛋白水平改变的农作物的方法(例如，QPTase和PMTase活性及相应低烟碱水平)。
本发明描述降低转基因烟草中烟碱水平的方法的同时，该方法也可用于模拟反式作用转录活化因子和抑制因子突变的表型，而不需克隆其各自的基因组座位。
可用本领域已知的方法分析基因的启动子区域，以确定应答转录因子的启动子区域。典型地，这通过启动子缺失分析完成。巢式缺失的启动子与报告基因融合，检测转基因机体中报告基因的表达。用目前的技术分离转录因子非常困难；本发明避免克隆对应转录因子的必要，其中期望破坏被一或多个转录活化因子协同调节的任何基因组合。相反地，该方法将上调被一或多个转录抑制因子协同调节的任何基因组合的表达。
如上述，本发明可用于多种宿主细胞中破坏基因表达并下调顺式作用元件活化元件控制下的相关蛋白的表达，包括植物(特别是维管植物如单子叶和双子叶植物)、动物(鸟、哺乳动物)、真菌或细菌细胞，体内和体外都包括。在细菌和真菌中，多拷贝质粒可用于增加细胞中分子诱饵的拷贝数。
以下实施例用于举例说明本发明，而不应理解为对本发明的限制。
实施例1顺式作用元件在NtQPT1启动子中的定位
为表征NtQPT1顺式作用元件所需的最小序列，分离NtQPT1基因的启动子区域，5’端截短，融合到编码β-葡糖苷酸酶(GUS)的基因中，评价其作为烟碱生成特异性增强子的功能。分离并测序NtQPT1基因，通过比较TobRD2 cDNA序列和基因组座位序列确定转录起始点。位于转录起始点5’端的序列定义为启动子序列。用启动子作模板和PCR引物，在启动子5’端截短以确定最小顺式作用增强子序列(见图2)。截短片段与uidA基因融合，它编码GUS。融合基因插入载体中并用标准轰击转化方法转化入烟草Burley 21。
将植物分成根、茎和叶测试GUS活性。用研钵和研杵研碎用不同的NtQPT1截短构造物转化的每种植物组织，用NaPO4缓冲液pH7.0抽提蛋白，加入X-Glc(100ug/mL)，测试于37℃进行30分钟，在595nm测量GUS活性。每种构造物至少测试20个独立的转化体。确定平均和标准偏差。与CaMV 35S-GUS融合体和无启动子GUS对照比较截短型的GUS活性。当-586到-2000bp与uidA基因融合时得到代表NtQPT1表达的最大GUS活性(图3)。从-1到-586的更短启动子不支持高水平uidA表达。因此，NtQPT1顺式作用元件位于转录起始点5’端的-586和-2000bp之间。
实施例2Nic基因产物结合位点在NtQPT1启动子上的定位
与uidA报告基因(编码GUS)融合的NtQPT1启动子缺失系列转化入nic-/nic-纯合的烟草植物。在单座位带转基因DNA的R0转化体与nic-/nic-或Nic+/Nic+纯合植物交配，产生在相同染色体位置携带转基因(NtQPT1启动子-GUS)的纯合(nic-/nic-)和杂合(Nic+/nic-)后代。来自多个独立转化体的多个后代用于定量GUS活性，并在Nic+和nic-之间比较(表1)。大于1.5的比例被确定含应答Nic基因产物活化的顺式作用元件。表1  烟草中Nic基因产物对NtQPT1启动子指导的GUS表达的调节
启动子  独立转化体 Nic+/nic-GUS活性2 nic-/nic-GUS活性2 Nic+/nic-的GUS比例
2.0(2010)1  2 111.7(7)46.6(6) 21.2(5)11.9(8) 5.35.6
1.3(1306)1  2 92.4(6)93.9(7) 16.6(4)12.9(5) 5.57.3
1.0(1042)1  3 55.7(6)74.1(6)78.0(5) 18.3(4)27.5(7)17.2(7) 3.02.74.5
734  1 5.5(5) 3.5(5) 1.5
586  3 47.55(5)24.3(3)29.1(33) 44.9(5)16.0(36)30.3(19) 1.061.50.97
535  3 71.6(10)54.0(5)51.9(5) 50.3(5)40.7(3)67.8(5) 1.41.30.8
CaMV 35S  4 32.7(4)44.8(6)54.8(5)9.7(4) 19.6(4)47.6(3)40.6(5)8.6(3) 1.70.941.31.1
GUS活性表示为pmol MU/ug蛋白/分钟。1实际启动子大小(bp)表示于括号中。2括号中数字表示测试植物数。
通过确定Nic+/nic-和nic-/nic-植物的GUS活性，这些试验证明Nic基因产物结合位于NtQPT1启动子约-1000和-600或-700bp之间。
实施例3用分子诱饵调节NtQPT1基因表达
位于NtQPT1启动子-1000和-600或-700bp之间的核酸序列以串联阵列插入植物-农杆菌穿梭载体中，随后通过本领域已知的方法转化入烟草。
测试稳定转化所述载体的植物中NtQPT1表达水平和烟碱和/或TSNA含量。这些试验证明转化与Nic基因产物相互作用的分子诱饵的烟草表现出烟碱和/或TSNA量降低。多串联插入分子诱饵的植物中NtQPT1表达降低且烟碱水平降低，用其表达商业价值产品和生产低烟碱和/或TSNA含量的烟草产品。
实施例4用TGACG分子诱饵调节ASF-1结合
核苷酸序列TGACG以串联阵列插入植物-农杆菌穿梭载体，并通过本领域已知的方法转化入植物，如豌豆。稳定转化所述载体的植物中反式作用DNA结合因子ASF-1的结合活性降低，它识别序列基序TGACG，该基序在植物基因中发现，如组蛋白基因(Mikami等，(1987)FEBS Lett.223：273)；负责农杆碱生物合成的酶基因(Velten等，EMBOJ.3：2723-30)；章鱼肉碱合酶基因(Ellis等，EMBO J.6：3203)；和甘露碱合酶基因(DeRita和Gelvin，(1987)Mol.Gen.Genet.207：233)；以及CaMV35S基因、组蛋白H3基因和胭脂碱合酶基因。
实施例5用分子诱饵调节β-菜豆蛋白的时空表达
对应β-菜豆蛋白基因UAS1(-295到-109)的核酸序列以串联阵列插入植物-农杆菌穿梭载体中，并用本领域已知的方法转化豆类植物。稳定转化所述载体的植物中反式作用DNA结合因子PvALF的结合活性降低，它识别位于UAS1内的CATGCAAA和CATGCATG序列(Bobb等(1997)Nucleic Acids Res 25(3)：641-7)。PvALF结合降低的植物中β-菜豆蛋白种子特异性表达降低，它主要表达于子叶和幼苗分生组织(Bustos等(1991)EMBO J.10(6)：1469-1479)。
对应豌豆球蛋白-盒(GCCACCTCAA；SEQ ID NO：2)和β-菜豆蛋白基因的位点B(CACACGTCAA；SEQ ID NO：3)的核酸序列的串联阵列转化入豆类植物，导致反式作用DNA结合因子ROM1和ROM2结合活性降低，致使发生β-菜豆蛋白的成熟前表达。ROM1和ROM2蛋白功能是β-菜豆蛋白和植物血凝素L亚基表达的抑制因子，以阻断种子成熟的发生(U.S.专利6,160,202，Bustos；Chern等(1996)Plant Cell 8：305-321；Chern等(1996)Plant J 10：135-148)。
实施例6用分子诱饵调节植物基因表达
用来自烟草RB7启动子的根特异性顺式作用元件的串联阵列转化烟草植物(US专利5,459,252，Conkling等；Yamamoto等(1991)PlantCell 12：3399-3406)，它编码结构基因，导致RB7顺式作用元件的反式激活DNA结合因子的结合活性降低。
同样，以下顺式元件的类似串联阵列转化植物，以降低对应反式作用DNA结合因子的结合活性：AATT顺式作用重复元件及其对应PABF反式作用因子(见美国专利5,834,236和6,191,258)；poly(dA-dT)正调节元件及结合蛋白和CCAA重复负调节元件及结合蛋白(Wang等(1992)Mol.Cell Biol.12：3399-3406)；来自烟草光敏色素A1启动子的根尖调节元件(Adam等(1995)Plant Mol.Biol.29：983-993)；来自玉米3-磷酸甘油醛脱氢酶4基因的无氧反应元件(Geffers等(2000)Plant Mol.Biol.43：11-21)；和来自拟南荠油质蛋白基因的种子特异性调节区(见美国专利5,792,922)。
实施例7用分子诱饵产生的烟碱和/或TSNA水平降低的烟草
NtQPT1启动子的约300或400核苷酸长度片段的多个拷贝(例如，包括位于NtQPT1启动子-1000和-600或-700bp之间的核酸序列，如SEQ ID NO：1)附着于微颗粒上(如通过沉淀)，这些微颗粒适于植物细胞的轰击转化(例如，1到5μm金球)。微颗粒打入烟草植物细胞(例如Burley 21 LA)，以产生转化植物细胞，并从转化植物细胞再生植株。Burley 21 LA是Burley 21的变种，与Burley 21相比其烟碱水平有实质性降低(即Burley 21 LA中烟碱水平是Burley 21的8％，见Legg等，Can J Genet Cytol，13：287-91(1971)；Legg等，J Hered，60：213-17(1969))。
可以使用任何适用的细胞轰击转化方法和仪器。仪器和方法实例公开于Sanford和Wolf的美国专利4,945,050和Christou等的美国专利5,015,580(此处引用的所有美国专利文献公开在此引作参考)。可选地，转化核酸可包括编码选择标记的基因(例如，允许正或负选择转化体的标记)或分子诱饵可与选择标记基因共转移。以此方式，容易鉴定阳性转化体。
转化细胞、组织和幼苗生长于Murashige-Skoog(MS)培养基上(根据是否使用选择标记，其中含或不含选择化合物，例如抗生素)。将100个独立的Burley 21 LA转化体(T0)自交。自交后代(T1)发芽。用微测试方法定性测量T1后代的烟碱水平。收集约200mg新鲜烟叶并在1ml抽提溶液中磨碎(抽提溶液：100ml水中含1ml乙酸)。匀浆物在14,000×g离心5分钟，转移上清至洁净管中，向管中加入以下试剂：100uL NH4OAC(5g/100ml H2O+50uL Brij 35)；500uL溴化氰(Sigma C-6388，0.5g/100ml H2O+50uL Brij 35)；400uL苯胺(100ml NH4OAC中0.3ml苯胺的缓冲液+50uL Brij 35)。制备溶于抽提溶液中的10mg/ml的烟碱标准贮液并稀释成一系列标准溶液。观察460nm处吸光度，用标准曲线确定测试样品中烟碱浓度。
含烟碱水平小于Burley 21 LA亲代10％的T1代自交产生T2代，然后鉴定纯合T2代。用微测试方法也定性鉴定纯合和杂合T2代中烟碱水平。纯合T2代叶片样品也可送到Wilson，NC的南方研究测试实验室(Southern Research and Testing Laboratory in Wilson，NC)用气相色谱/火焰离子化检测器(GC/FID)定量分析烟碱水平。与未转化烟草相比，纯合T2代烟碱水平有实质性降低(例如～70ppm)。因为这种植物中的烟碱水平有实质性降低，这些植物中的TSNA水平也随之降低。
这些试验将证明，用与Nic基因产物相互作用的分子诱饵转化的烟草将表现出烟碱和/或TSNA量降低。具有多个串联插入的分子诱饵的植物中NtQPT1表达降低且烟碱水平降低，将其用于表达商业价值产品和生产烟碱和/或TSNA含量降低的烟草产品。
实施例8低烟碱和TSNA的混合型烟草
以下实施例描述通过混合来创制有特定量烟碱和/或TSNA的烟草产品的几种方法。一些混合方法开始于由极低量烟碱和/或TSNA变种制备的烟草。通过混合低烟碱/TSNA变种制备的烟草(例如无可检测水平的烟碱和/或TSNA)与常规烟草(例如，Burley，含30,000ppm烟碱和8,000ppb TSNA；烤烟，含20,000ppm烟碱和300ppb TSNA；和东方熏烟，含10,000ppm烟碱和100ppb TSNA)，可以制造事实上任何期望量烟碱和/或TSNA的烟草产品。不同烟碱和/或TSNA量的烟草产品可以组成戒烟套装和计划，帮助烟草使用者减少或消除对烟碱的依赖并降低致癌性。
例如，第一步烟草产品可由约25％低烟碱/TSNA烟草和75％常规烟草组成；第二步烟草产品可由约50％低烟碱/TSNA烟草和50％常规烟草组成；第三步烟草产品可由约75％低烟碱/TSNA烟草和25％常规烟草组成；第四步烟草产品可由约100％低烟碱/TSNA烟草和0％常规烟草组成。戒烟套装可含一定量的每种前述混合烟草产品，以满足消费者单月计划。也就是说，例如如果消费者是一天一包的吸烟者，单月套装提供每步7包，共28包香烟。每个戒烟套装包括一组说明书具体指导消费者一步步使用。当然，含具体量烟碱和/或TSNA的烟草产品可以做成方便的包装量(例如雪茄盒，香烟盒，鼻烟听和嚼烟袋或条)以便消费者可以选择自己期望的烟碱和/或TSNA量。用此处描述的原则有很多获得低烟碱/低TSNA混合型烟草的方法，以下只是意图指给本领域技术人员一种可能的方法。
要获得第一步烟草产品，它是25％低烟碱/TSNA混合型，由约0ppm烟碱/TSNA烟草制备的烟草可与常规Burley、烤烟或东方薰烟以25％/75％比例混合来制备，分别获得含22,500ppm烟碱和6,000ppbTSNA的Burley烟草产品，含15,000ppm烟碱和225ppb TSNA的烤烟产品，和含7,500ppm烟碱和75ppb TSNA的东方薰烟产品。与之相似，要获得第二步烟草产品，它是50％低烟碱/TSNA混合型，由约0ppm烟碱/TSNA烟草制备的烟草可与常规Burley、烤烟或东方薰烟以50％/50％比例混合来制备，分别获得含15,000ppm烟碱和4,000ppb TSNA的Burley烟草产品，含10,000ppm烟碱和150ppb TSNA的烤烟产品，和含5,000ppm烟碱和50ppb TSNA的东方薰烟产品。进一步，第三步烟草产品，它是75％低烟碱/TSNA混合型，由约0ppm烟碱/TSNA烟草制备的烟草可与常规Burley、烤烟或东方薰烟以75％/25％比例混合来制备，分别获得含7,500ppm烟碱和2,000ppbTSNA的Burley烟草产品，含5,000ppm烟碱和75ppb TSNA的烤烟产品，和含2,500ppm烟碱和25ppb TSNA的东方薰烟产品。
应该明白，烟草产品经常是很多种不同类型烟草的混合物，它们在多种生长条件下生长在世界的很多不同地方。结果就是，烟碱和TSNA量在作物之间会有差异。但是，通过使用传统方法，可以很容易确定用于创制期望混合物的每种作物的烟碱和TSNA的平均量。调节组成混合物的每种类型烟草的量，技术人员可以平衡烟碱和/或TSNA的量与其它需考虑的方面外观、香味和适吸性。以此方式，可以创制多种类型烟草产品，它们具有不同的烟碱和/或亚硝胺水平、以及外观、香味和适吸性。
前述内容举例说明本发明，而不应认为是对本发明的限制。本发明由以下权利要求、以及下面待包括的权利要求的等价条件限定。此处所有引用的参考文献都在此引作参考。
                序列表<110>M.A.康克林
 Y.李<120>含有可改变蛋白含量的分子诱导物的转基因植物<130>5051.471<150>US 60/229,198<151>2000-08-30<160>4<170>patentIn version 3.1<210>1<211>456<212>DNA<213>烟草(Nicotiana tabacum)<400>1ggaaacatat tcaatacatt gtagtttgct actcataatc gctagaatac tttgtgcctt     60gctaataaag atacttgaaa tagcttagtt taaatataaa tagcataata gattttagga     120attagtattt tgagtttaat tacttattga cttgtaacag tttttataat tccaaggccc     180atgaaaaatt taatgcttta ttagttttaa acttactata taaatttttc atatgtaaaa     240tttaatcggt atagttcgat attttttcaa tttattttta taaaataaaa aacttaccct     300aattatcggt acagttatag atttatataa aaatctacgg ttcttcagaa gaaacctaaa     360aatcggttcg gtgcggacgg ttcgatcggt ttagtcgatt ttcaaatatt cattgacact     420cctagttgtt gttataggta aaaagcagtt acagag                               456<210>2<211>10<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸序列<400>2gccacctcaa                                                             10<210>3<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>合成寡核苷酸序列<223><400>3cacacgtcaa                                                             10

Claims (73)

1.一种选自下组的分离核酸：(a)基本上由根据SEQ ID NO：1或其片段的序列组成的分离核酸，其中所述片段约20-455个连续核苷酸；和(b)与SEQ ID NO：1互补序列杂交、并对Nic基因产物应答的分离核酸。
2.根据权利要求1的分离核酸，基本上由此处给出的SEQ ID NO：1或其片段的序列组成，其中所述片段约20-455个连续核苷酸。
3.根据权利要求1的分离核酸，基本上由此处给出的SEQ ID NO：1序列组成。
4.根据权利要求1的分离核酸，其中所述核酸是DNA。
5.根据权利要求1的分离核酸，进一步含有重组核酸构造物，其中所述分离核酸与所述重组核酸构造物连接，且所述重组核酸构造物不合NtQPT1编码序列。
6.根据权利要求5的分离核酸，其中所述重组核酸构造物是线性。
7.根据权利要求5的分离核酸，其中所述重组核酸构造物是环状。
8.根据权利要求1的分离核酸，进一步含有微颗粒，其中所述分离核酸与所述微颗粒连接。
9.根据权利要求5的分离核酸，其中所述重组核酸构造物是农杆菌载体。
10.含根据权利要求1分离核酸的植物细胞。
11.一种制造烟碱含量降低的转基因烟草植物的方法，其中包括：将基本上由Nic基因产物反应元件组成的核酸导入至少一个烟草植物细胞，以产生至少一个转化烟草植物细胞，所述至少一个转化烟草植物细胞含所述核酸的拷贝数足以降低由所述细胞再生的烟草植物中的烟碱量，这是与缺乏所述核酸的植物中烟碱量相比而言；以及再生所述至少一个转化烟草植物细胞以获得所述烟草植物。
12.根据权利要求11的方法，进一步含有：收集来自所述烟草植物的叶子，所述烟草叶子含降低量的烟碱，这是与缺乏所述核酸的所述烟草植物中烟碱量相比而言。
13.根据权利要求11的方法，进一步含有：收集来自所述烟草植物的烟草种子，所述烟草种子含所述核酸的拷贝数足以降低由所述种子再生的烟草植物中的烟碱量，这是与缺乏所述核酸的所述烟草植物中烟碱量相比而言。
14.根据权利要求11的方法，其中所述Nic基因产物反应元件选自下组：(a)基本上由根据SEQ ID NO：1或其片段的序列组成的分离核酸，其中所述片段约20-455个连续核苷酸；和(b)与SEQ IDNO：1互补序列杂交、并对Nic基因产物应答的分离核酸。
15.根据权利要求11的方法，其中所述Nic基因产物反应元件由此处给出的SEQ ID NO：1序列组成。
16.根据权利要求11的方法，其中所述核酸包含于重组核酸构造物中，其中所述分离核酸与所述重组核酸构造物连接，所述重组核酸构造物不含NtQPT1编码序列，且所述重组核酸构造物是线性。
17.根据权利要求16的方法，其中所述重组核酸构造物是环状。
18.根据权利要求11的方法，其中所述核酸是DNA。
19.根据权利要求11的方法，其中所述导入步骤含轰击转化。
20.根据权利要求11的方法，其中所述导入步骤含农杆菌转化。
21.由权利要求11方法产生的烟草植物。
22.从权利要求21烟草植物收集的烟叶。
23.从权利要求21烟草植物收集的烟草种子。
24.一种烟碱含量降低的烟草植物，所述植物所含细胞包含外源核酸，其中所述外源核酸基本上由Nic基因产物反应元件组成；包含于所述细胞中的所述外源核酸的拷贝数足以降低所述烟草植物中的烟碱量，这是与缺乏所述外源核酸的所述植物中烟碱量相比而言。
25.根据权利要求24的烟草植物，其中所述Nic基因产物反应元件选自下组：(a)基本上由根据SEQ ID NO：1或其片段的序列组成的分离核酸，其中所述片段约20-455个连续核苷酸；和(b)与SEQID NO：1互补序列杂交、并对Nic基因产物应答的分离核酸。
26.根据权利要求24的烟草植物，其中所述Nic基因产物反应元件基本上由此处给出的SEQ ID NO：1序列组成。
27.根据权利要求24的烟草植物，其中所述外源核酸包含于重组核酸构造物中，其中所述分离核酸与所述重组核酸构造物连接，所述重组核酸构造物不含NtQPT1编码序列，且所述重组核酸构造物是线性。
28.根据权利要求27的烟草植物，其中所述重组核酸构造物是环状。
29.根据权利要求24的烟草植物，其中所述外源核酸是DNA。
30.从权利要求24烟草植物收集的烟叶。
31.生长成权利要求24烟草植物的烟草种子。
32.从权利要求24烟草植物收集的烟草种子。
33.一种相关蛋白含量改变的植物的制造方法，其中所述相关蛋白受顺式作用元件调节，所述方法含有步骤：将含所述顺式作用元件的外源核酸构造物导入至少一个植物细胞，以产生至少一个转化植物细胞，所述至少一个转化植物细胞含所述外源核酸的拷贝数足以增加或降低在由所述细胞再生的植物中的所述相关蛋白的水平，这是与缺乏所述外源核酸的植物中所述相关蛋白的量相比而言，并受此限制性条款约束：所述顺式作用元件不与所述相关蛋白的编码序列或其互补序列操作性连接。
34.根据权利要求33的方法，其中所述顺式作用元件是一种顺式作用活化元件，它结合活化化合物，该活化化合物增加所述相关蛋白在所述植物中的表达，且所述至少一个转化植物细胞包含的所述外源核酸的拷贝数足以降低在由所述细胞再生的植物中的所述相关蛋白的水平，这是与缺乏所述外源核酸的植物中所述相关蛋白的量相比而言。
35.根据权利要求33的方法，其中所述顺式作用元件是一种顺式作用抑制元件，它结合抑制化合物，该抑制化合物降低所述相关蛋白在所述植物中的表达，且所述至少一个转化植物细胞包含的所述外源核酸的拷贝数足以增加在由所述细胞再生的植物中的所述相关蛋白的水平，这是与缺乏所述外源核酸的植物中所述相关蛋白的量相比而言。
36.根据权利要求33的方法，进一步含有：从所述转化植物细胞产生植物。
37.根据权利要求36的方法，进一步含有：收集所述植物的种子，所述种子包含外源核酸的拷贝数足以降低在由所述种子再生的植物中的所述相关蛋白的水平，这是与缺乏所述外源核酸的植物中所述相关蛋白的水平相比而言。
38.根据权利要求33的方法，其中所述顺式作用元件选自下组：UAS-1，豌豆球蛋白盒，位点B，和烟草RB7启动子根特异性顺式作用元件。
39.根据权利要求33的方法，其中所述外源核酸是线性。
40.根据权利要求33的方法，其中所述外源核酸是环状。
41.根据权利要求33的方法，其中所述外源核酸是DNA。
42.根据权利要求33的方法，其中所述导入步骤含轰击转化。
43.根据权利要求33的方法，其中所述导入步骤含农杆菌转化。
44.由权利要求33方法产生的植物。
45.由权利要求44植物收集的叶，果，花，根或块茎。
46.由权利要求44植物收集的种子。
47.一种相关蛋白含量改变的植物，所述植物所含细胞包含外源核酸，该外源核酸含有顺式作用元件，该元件调节所述植物中所述相关蛋白的水平，所述细胞包含所述外源核酸的拷贝数足以增加或降低所述植物中相关蛋白的水平，这是与缺乏所述外源核酸的所述植物中相关蛋白量相比而言，并受此限制性条款约束：所述顺式作用元件不与所述相关蛋白的编码序列或其互补序列操作性连接。
48.根据权利要求47的植物，其中所述顺式作用元件是一种顺式作用活化元件，它结合活化化合物，该活化化合物增加所述相关蛋白在所述植物中的表达，且所述至少一个转化植物细胞包含的所述外源核酸的拷贝数足以降低在所述植物中的所述相关蛋白的水平，这是与缺乏所述外源核酸的植物中所述相关蛋白的量相比而言。
49.根据权利要求47的植物，其中所述顺式作用元件是一种顺式作用抑制元件，它结合抑制化合物，该抑制化合物降低所述相关蛋白在所述植物中的表达，且所述至少一个转化植物细胞包含的所述外源核酸的拷贝数足以增加在所述植物中的所述相关蛋白的水平，这是与缺乏所述外源核酸的植物中所述相关蛋白的量相比而言。
50.根据权利要求47的植物，其中所述外源核酸是线性。
51.根据权利要求47的植物，其中所述外源核酸是环状。
52.根据权利要求47的植物，其中所述外源核酸是DNA。
53.由权利要求47植物收集的叶，果，花，根或块茎。
54.生长成权利要求47植物的种子。
55.由权利要求47植物收集的种子。
56.一种降低宿主细胞中相关蛋白表达的方法，其中所述相关蛋白的转录被结合活化化合物的顺式作用活化元件增强，该活化化合物增加所述宿主细胞中所述相关蛋白的表达，所述方法含有以下步骤：(a)提供含有所述顺式作用活化元件的诱饵重组核酸构造物；和(b)将所述诱饵构造物导入所述宿主细胞，导入量足以结合所述活化化合物并降低所述相关蛋白的表达，并受此限制性条款约束：所述顺式作用元件不与所述相关蛋白的编码序列或其互补序列操作性连接。
57.根据权利要求56的方法，其中所述宿主细胞是原核或真核细胞。
58.根据权利要求56的方法，其中所述宿主细胞是细菌细胞。
59.根据权利要求56的方法，其中所述宿主细胞是真菌细胞。
60.根据权利要求56的方法，其中所述宿主细胞是动物细胞。
61.根据权利要求56的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
62.根据权利要求56的方法，其中所述宿主细胞是维管植物细胞。
63.根据权利要求56的方法，其中所述宿主细胞是单子叶或双子叶植物细胞。
64.根据权利要求56的方法，其中所述诱饵构造物是质粒。
65.一种增加宿主细胞中相关蛋白表达的方法，其中所述相关蛋白的转录被结合抑制化合物的顺式作用抑制元件降低，该抑制化合物降低所述宿主细胞中所述相关蛋白的表达，所述方法含有以下步骤：(a)提供含有所述顺式作用抑制元件的诱饵重组核酸构造物；和(b)将所述诱饵构造物导入所述宿主细胞，导入量足以结合所述抑制化合物并增加所述相关蛋白的表达，并受此限制性条款约束：所述顺式作用元件不与所述相关蛋白的编码序列或其互补序列操作性连接。
66.根据权利要求65的方法，其中所述宿主细胞是原核或真核细胞。
67.根据权利要求65的方法，其中所述宿主细胞是细菌细胞。
68.根据权利要求65的方法，其中所述宿主细胞是真菌细胞。
69.根据权利要求65的方法，其中所述宿主细胞是动物细胞。
70.根据权利要求65的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
71.根据权利要求65的方法，其中所述宿主细胞是维管植物细胞。
72.根据权利要求65的方法，其中所述宿主细胞是单子叶或双子叶植物细胞。
73.根据权利要求65的方法，其中所述诱饵构造物是质粒。
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