JP2013543377A - 形質転換植物 - Google Patents
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Abstract
Description
従って、本発明の第二の側面によれば、硝酸塩輸送体活性を有するポリペプチドをコードするコード配列と動作可能に連結するカーネーションエッチドリングウイルス(CERV)プロモーター又はエンドウ豆プラストシアニンプロモーターのいずれかを含む遺伝的構築物が提供される。
(配列番号1)
AGCTTGCATGCCTGCAGGTCGAGCTTTTAGGATTCCATAGTGATAAGATATGTTCTTATCTAAACAAAAAAGCAGCGTCGGCAAACCATACAGCTGTCCACAAAAAGGAAAGGCTGTAATAACAAGCGGACCCAGCTTCTCAGTGGAAGATACTTTATCAGACACTGAATAATGGATGGACCCTACCACGATTAAAGAGGAGCGTCTGTCTAAAGTAAAGTAGAGCGTCTTT
従って、本発明の構築物における前記プロモーターは、実質的に配列番号1で示されるヌクレオチド配列、又はその機能的変異体若しくは機能的断片を含んでいてもよい。CERVプロモーターは、カリオウイルス(cauliovirus)、又はカリオウイルスの形跡を示すDianthus caryophyllus(すなわち、カーネーション)等の植物種から得ることができる。前記プロモーターがCERVプロモーターである態様においては、当然のことながらこのプロモーターは、配列番号1の塩基1〜232のそれぞれを含む。しかし、前記プロモーターの機能的変異体又は機能的断片も、本発明の遺伝的構築物において用いることができる。
(配列番号2)
TATGCAACTTACAACGTGCACTCGCGGAGGATTGGACGTGTGCAACTTACAACGTACGCATTGTTCGTTCATACAATAGTGTAGAATTGGACATGTGCAACTTACAACATGTGCAACTTACAACGTGCGCTCGCGGAGGAATGTGAAGTTGAACACGTACAACTTACGTCATTTGTGCATGCAGAAGCATAGAGCTGAGCACACAATTCATAATTTGAAGGACACATGATTTGCTATAAAGAACTCTTTAGAAGTACCACAACTTTGACTGAGTTTGATATAGCTAATAAAGATGGAGCTCATTATAATTTGAATGGCATAATCAAGCTAAACGAACAAGCTTAGTTAATCATGTTAAACAACAATTCTTTGTAATAATAAATTGTCTTTCAACTAGTCCAAGTTTATGAGTTGATTCTTCGGAATAAATTAGAAAATATCTTAGATTTTATACTTCATTGATTATTTCATAGAGCAAGTAGGAGAAATAAAAATATACTAGTATTATTTACTAAAAAAAATCTAAGCCACGTCGGAGGATAACATCCAACCCAGCCAATCACAGCAATGTTCATCAGATAACCCACTTTAAGCCCACGCACTCTGTGGCACATCTACATTATCTAAATCACATATTCTTCCACACATCTTAGCCACACAAAAACCCAATCCACATCTTTATCATCCATTCTATAAAAAATCACCTTCTGTGTGTCTCTCTTTCGATTCCCTTCAAACACATACAAATTCAGTAGAGAAGAAACTCATTACTCTTGAGAAAAA
従って、本発明の構築物における前記プロモーターは、実質的に配列番号2で示されるヌクレオチド配列、又はその機能的変異体若しくは機能的断片を含んでいてもよい。エンドウ豆プラストシアニンプロモーターは、Pisum sativum(すなわち、エンドウ豆)等のエンドウ属から得ることができる。
(配列番号3)
ATGGAGCCATCTCAACGCAACACCAAACCGCCGTCGTTTTCAGATTCCACTATCCCGGTTGATTCCGATGGTCGAGCCACCGTCTTCCGACCATTCTCTCTCTCCTCGCCACACTCACGAGCCTTTCACCTAGCTTGGCTCTCACTCTTCTCATGCTTCTTCTCCACCTTCTCCATCCCTCCTCTGGTCCCCGTCATCTCCTCCGACCTCAACCTCTCTGCCTCCACCGTATCCGCCGCCGGAATCGCTTCCTTCGCTGGCTCCATCTTCTCTCGCCTCGCTATGGGACCACTCTGTGATCTCATCGGACCACGTACTTCCTCAGCGATTCTCTCTTTTCTCACCGCTCCTGTAATCCTCTCCGCCTCACTCGTCTCCTCTCCGACGTCCTTCATCCTCGTCCGTTTCTTCGTCGGCTTCTCGCTCGCTAATTTCGTAGCCAATCAATACTGGATGTCCTCCATGTTCTCCGGTAACGTCATTGGTCTCGCTAACGGTGTCTCAGCCGGTTGGGCTAACGTCGGCGCCGGTATCTCTCAGCTCCTTATGCCTCTCATATACTCCACCATAGCCGAATTCCTTCCACGCGCCGTCGCCTGGCGCGTGTCCTTCGTATTTCCCGCCATTTTTCAGGTTACAACGGCCGTCCTCGTTCTCCTCTACGGCCAAGATACTCCCCACGGTAACAGAAAAAACTCGAACCAGAACAAACTCACAATTCCTGAAGAAGAAGAAGTACTAGTAGTTGAAGAAGACGAACGTTCCAGTTTCGTCGAGATCCTAATCGGCGGACTTGGAAATTACAGAGCGTGGATCTTAGCGCTGCTCTACGGATACTCGTACGGCGTCGAGCTAACGACGGACAACGTGATCGCCGGATATTTCTACGAGAGATTTGGAGTGAATCTGGAGGCGGCGGGGACGATCGCGGCGAGTTTCGGGATATCGAACATTGCGTCGCGACCGGCGGGAGGGATGATATCGGATGCGCTGGGGAAGAGATTCGGTATGAGAGGGAGGCTGTGGGGGCTATGGATCGTGCAATCGGTGGCTGGGTTGTTGTGCGTGTTACTCGGACGAGTCAACTCGCTCTGGGGATCAATCCTCGTCATGTGGGTCTTCTCTGTTTTCGTTCAAGCTGCTTCTGGCCTTGTATTTGGCGTGGTCCCTTTCGTCTCCACGCGGTTAGTTTAAAGTCTACCAATCCGGTTTTTGCTAATAATTTCGGTTTGGTTTTAATTTGGTTTTGTTTATAATGACAGATCGTTAGGAGTGGTGGCGGGAATTACGGGAAGCGGCGGTACGGTTGGTGCGGTGGTGACGCAGTTTCTGTTGTTTTCCGGTGATGATGTTCGAAAACAGAGAAGCATTTCACTTATGGGTTTGATGACTTTTGTGTTTGCTCTTTCTGTTACATCAATTTACTTTCCACAATGGGGTGGAATGTGTTGTGGGCCTTCGTCATCTTCCGAAGAAGAAGATATTTCTCGGGGACTCCTTGTAGAAGACGAAGATGAAGAAGGTAAAGTGGTTAGTGGTAGTCTACGTCCCGTTTGTTGA
(配列番号4)
ATGGAGCCATCTCAACGCAACACCAAACCGCCGTCGTTTTCAGATTCCACTATCCCGGTTGATTCCGATGGTCGAGCCACCGTCTTCCGACCATTCTCTCTCTCCTCGCCACACTCACGAGCCTTTCACCTAGCTTGGCTCTCACTCTTCTCATGCTTCTTCTCCACCTTCTCCATCCCTCCTCTGGTCCCCGTCATCTCCTCCGACCTCAACCTCTCTGCCTCCACCGTATCCGCCGCCGGAATCGCTTCCTTCGCTGGCTCCATCTTCTCTCGCCTCGCTATGGGACCACTCTGTGATCTCATCGGACCACGTACTTCCTCAGCGATTCTCTCTTTTCTCACCGCTCCTGTAATCCTCTCCGCCTCACTCGTCTCCTCTCCGACGTCCTTCATCCTCGTCCGTTTCTTCGTCGGCTTCTCGCTCGCTAATTTCGTAGCCAATCAATACTGGATGTCCTCCATGTTCTCCGGTAACGTCATTGGTCTCGCTAACGGTGTCTCAGCCGGTTGGGCTAACGTCGGCGCCGGTATCTCTCAGCTCCTTATGCCTCTCATATACTCCACCATAGCCGAATTCCTTCCACGCGCCGTCGCCTGGCGCGTGTCCTTCGTATTTCCCGCCATTTTTCAGGTTACAACGGCCGTCCTCGTTCTCCTCTACGGCCAAGATACTCCCCACGGTAACAGAAAAAACTCGAACCAGAACAAACTCACAATTCCTGAAGAAGAAGAAGTACTAGTAGTTGAAGAAGACGAACGTTCCAGTTTCGTCGAGATCCTAATCGGCGGACTTGGAAATTACAGAGCGTGGATCTTAGCGCTGCTCTACGGATACTCGTACGGCGTCGAGCTAACGACGGACAACGTGATCGCCGGATATTTCTACGAGAGATTTGGAGTGAATCTGGAGGCGGCGGGGACGATCGCGGCGAGTTTCGGGATATCGAACATTGCGTCGCGACCGGCGGGAGGGATGATATCGGATGCGCTGGGGAAGAGATTCGGTATGAGAGGGAGGCTGTGGGGGCTATGGATCGTGCAATCGGTGGCTGGGTTGTTGTGCGTGTTACTCGGACGAGTCAACTCGCTCTGGGGATCAATCCTCGTCATGTGGGTCTTCTCTGTTTTCGTTCAAGCTGCTTCTGGCCTTGTATTTGGCGTGGTCCCTTTCGTCTCCACGCGGTCGTTAGGAGTGGTGGCGGGAATTACGGGAAGCGGCGGTACGGTTGGTGCGGTGGTGACGCAGTTTCTGTTGTTTTCCGGTGATGATGTTCGAAAACAGAGAAGCATTTCACTTATGGGTTTGATGACTTTTGTGTTTGCTCTTTCTGTTACATCAATTTACTTTCCACAATGGGGTGGAATGTGTTGTGGGCCTTCGTCATCTTCCGAAGAAGAAGATATTTCTCGGGGACTCCTTGTAGAAGACGAAGATGAAGAAGGTAAAGTGGTTAGTGGTAGTCTACGTCCCGTTTGTTGA
従って、硝酸塩輸送体活性を有するポリペプチドをコードするコード配列は、実質的に配列番号3若しくは配列番号4で示される核酸配列、又はその機能的変異体若しくは断片を含んでいてもよい。本発明者らは、前記イントロンが前記構築物のインビボでの安定性を上昇させ得ると考えている。それ故、前記構築物は、配列番号4、すなわちシロイヌナズナの硝酸塩輸送体をコードするcDNAを含んでいてもよい。
(配列番号5)
MEPSQRNTKPPSFSDSTIPVDSDGRATVFRPFSLSSPHSRAFHLAWLSLFSCFFSTFSIPPLVPVISSDLNLSASTVSAAGIASFAGSIFSRLAMGPLCDLIGPRTSSAILSFLTAPVILSASLVSSPTSFILVRFFVGFSLANFVANQYWMSSMFSGNVIGLANGVSAGWANVGAGISQLLMPLIYSTIAEFLPRAVAWRVSFVFPAIFQVTTAVLVLLYGQDTPHGNRKNSNQNKLTIPEEEEVLVVEEDERSSFVEILIGGLGNYRAWILALLYGYSYGVELTTDNVIAGYFYERFGVNLEAAGTIAASFGISNIASRPAGGMISDALGKRFGMRGRLWGLWIVQSVAGLLCVLLGRVNSLWGSILVMWVFSVFVQAASGLVFGVVPFVSTRSLGVVAGITGSGGTVGAVVTQFLLFSGDDVRKQRSISLMGLMTFVFALSVTSIYFPQWGGMCCGPSSSSEEEDISRGLLVEDEDEEGKVVSGSLRPVC
従って、硝酸塩輸送体活性を有するポリペプチドは、実質的に配列番号5で示されるアミノ酸配列、又はその機能的変異体若しくは断片を含んでいてもよい。
(i)第1又は第2の側面の遺伝的構築物、又は第3の側面のベクターで植物細胞を形質転換する工程;及び
(ii)該形質転換細胞から植物を再生する工程。
この実験で用いられたシロイヌナズナの硝酸塩輸送体遺伝子はAtNRT2.7であった。
シロイヌナズナ由来の硝酸塩輸送体2.7をコードする全長ゲノム配列を特定した(この配列の受入番号は:T15N1−60であった)。ゲノム配列を単離するためにPCRで用いられるプライマーを設計し、それは、4bpのスペーサーと適切な制限酵素認識部位を5’末端に有している。断片の5’末端にSacI及びBamHI制限酵素認識部位を生成し、3’末端にKpnI及びSacI制限酵素認識部位を生成し、前記断片を適切なベクターにクローニングすることができるようにした。これらのプライマーの配列を以下に示す。
AtNRT2.7(T15F) ATC GAG CTC GGA TCC ATG GAG CCA TCT CAA CGC AAC ACC[配列番号6]
AtNRT2.7(T15R) ATC GAG CTC GGT ACC ACA AAC GGG ACG TAG ACT ACC[配列番号7]
当然のことだが、当業者はプライマーと他の制限酵素認識部位の必要な特徴を組み込んで、他のPCRプライマーを設計することができるであろう。
シロイヌナズナコロンビア変異種(var.Columbia)のゲノムDNAを、Qiagen DNA Easyミニプレップ抽出キットを用いて、発芽3ヶ月の植物のロゼット葉から抽出した。手短に言えば、製造業者の使用説明書に従い、QIAGEN DNeasy Plant DNA抽出キット(カタログ番号69106)(QIAGEN Ltd.,クローリー、イギリス)を用い、葉試料からゲノムDNAを抽出した。この方法により、遺伝子単離及びクローニング戦略に適した非常にきれいな遺伝子が大量に得られる。前記キットの原理は、高塩濃度条件下でDNAはシリカゲルをベースとする膜に特異的に吸収されるが、タンパク質、炭水化物、ポリフェノール及び他の植物代謝産物等の混入物は洗い流されることを利用する。
シロイヌナズナNRT2.7のゲノム配列は1893塩基対の長さである(受入番号T15N1−60)。シロイヌナズナNRT2.7のゲノムを、T15F (配列番号6)とT15R(配列番号7)のプライマー対を用いて増幅し、断片の5’末端にSacI及びBamHI制限酵素認識部位を、3’末端にKpnI及びSacI制限酵素認識部位を生成した。
25μLの反応容量に、0.5μLのプルーフリーディングTAQポリメラーゼ;0.5μLのTAQエクステンダー;0.5μLのシロイヌナズナゲノムDNA;0.25μLのフォワードプライマー;0.25μLのリバースプライマー;2.5μのTAQエクテンダー緩衝液;2.5μLのdNTPs;18μLの水を加え、55℃でアニーリングし、72℃で2分間伸長し、これを30サイクル繰り返した。
1μLのTOPOを、1μLの塩溶液と4μLのPCR反応液と一緒にした。混合物を室温に30分静置した。2μLの連結反応混合物をTOP10大腸菌細胞と一緒にした後、30分間氷上で静置した。前記細胞に42℃で30秒間熱ショックを与えた後、氷上に5分間静置した。次いで、前記細胞を250μLのSOC培地中、37℃で30分間インキュベートした。次いで、前記細胞を、カナマイシンを含む寒天プレートに載せ、37℃で一晩静置した。プラスミドを含む細胞がコロニーに成長し、約50個のコロニーについて各遺伝子配列を観察した。ゲノムDNA断片がうまく挿入されているpTOPOベクターを含む個々のクローンを選択するためにコロニーPCRを用いた。
予想される大きさのPCR断片を含む各配列について3つのコロニーを選択した。次いで、個々のコロニーを増殖し、配列分析のためにプラスミドDNAを抽出した。
いくつかの独立したpTOPOクローン中に存在する硝酸塩輸送体DNA断片の配列決定をした。この配列の分析から、前記クローンが硝酸塩輸送体2.7遺伝子を含んでいることが判明した。
AtNRT 2.7をコードするゲノムDNAの、NRT 2.7遺伝子を含むバイナリーベクターpTOPOプラスミドへのクローニングは、Kpn1とBamHIで消化してNRT2.7遺伝子断片を単離した後、Kpn1とBamHIでも消化してあるpBNPバイナリーベクター(pBNP−PPC−nosT)にクローニングし、その後大腸菌エレクトロコンピテントセルに形質転換した。pBNPベクターは、pBNPバイナリーベクター(van Engelenら、1995,Transgenic Research,4:288−290)から作成した自家製ベクターで、PPCプロモーターとノパリンシンターゼターミネーターを含む。プラスミドを含む細胞をカナマイシンプレートで選択した。次いで、次いで、クローンを単離し、DNAを抽出し、制限消化により分析し、配列決定した。
1986年にHullらにより単離及び特徴付けされ、CaMVの特徴であるが(Hullら、1986)、CaMV 35Sプロモーターとわずかな配列類似性を有している(図23を参照されたい)。
(i)pBNP036AtNRT2.7001(図5aを参照されたい):エンドウ豆プラストシアニンプロモーター:Nrt2.7 cDNA:Nosターミネーター;及び
(ii)pBNPCRVAtNRT2.7(図5bを参照されたい):カーネーションエッチドリングウイルス(CERV)プロモーター:Nrt2.7 cDNA:Nosターミネーター。
タバコ栽培品種Vir40とタバコ栽培品種バーレー52を、Horschら(Science 227:1229−1231,1985)に開示されている通り、リーフディスク共栽培法を用いて、pBNP036AtNRT2.7001又はpBNPCRVAtNRT2.7で形質転換した。最も若い伸長する2枚の葉を、発芽7週間のタバコ植物から得、Domestosの8%溶液で10分間表面殺菌し、滅菌蒸留水で6回洗浄した。次いで、リーフディスクを、6番のコルクボーラーを用いて切断し、アグロバクテリウム懸濁液内に約2分間置いた。次いで、前記ディスクを、滅菌ろ紙の2枚のシートの間にそっとブロットした。10枚のディスクを、LS3%ショ糖+2μM BAP+0.2μM NAAを含むプレートに載せた後、培養室内で2日間インキュベートした。次いで、ディスクを、500g/Lのクラフォランと100g/Lのカナマイシンを添加した、LS+3%ショ糖+2μM BAP+0.2μM NAAを含むプレートに移した。
再生タバコ形質転換体の分析
再生タバコ植物から葉材料を得、ゲノムDNAを単離した。1枚の大きいタバコの葉(約30mg)を、インビトロで栽培した植物から切除し、1.5mLのエッペンドルフチューブに入れた。小さい乳棒を用いて前記組織を均質化し、400μLの抽出緩衝液(200mM Tris HCL pH 8.0;250mM NaCl;25mM EDTA;0.5% SDS;40μg/ml Rnase A)を加え、再度注意深く粉末にし、完全に混合した。試料をボルテックスで約5秒間混合した後、10,000rpmで5分間遠心分離した。得られた上清の一定量、350μLを新しいエペンドルフチューブに入れ、350μLのクロロホルムを加えた。混合した後、試料を5分間静置した。次いで、これを10,000rpmで5分間遠心分離した。上清の一定量、300μLを新しいエッペンドルフチューブに移した。これに300μLのプロパン−2−オールを加え、エッペンドルフを数回転倒することによって混合した。試料を10分間整地した。沈殿したDNAを、10,000rpmで10分間遠心分離することによって集めた。上清を捨て、沈殿を空気乾燥した。DNAの沈殿物を50μLの蒸留水に再懸濁し、定量PCRの鋳型として用いた。各構築物/変異型の30個の植物を定量PCRにより分析し、形質転換事象を確認した。
pBNP036AtNRT2.7001:バージニア種 9個の単一コピー
pBNP036AtNRT2.7001:バーレー種 7個の単一コピー
pBNPCRVAtNRT2.7:バーレー種 10個の単一コピー
RTPCRによりアッセイしたmRNAレベル
Ambion RNAqueousキット(Ambion Inc.,カナダ)を用いて、タバコリーフディスクから総RNAを単離した。全ての凍結試料を液体窒素で粉砕し、tissuelyserを用いて微粉とした。4℃、13,000rpmで5分間遠心分離することにより、細胞外膜、多糖類、及び高分子量DNAを沈殿させた。上清を、キットに付属のフィルターカートリッジに移し、RNAを洗浄及び精製するために遠心分離した後、溶出緩衝液で溶出した。更に使用するまでにRNA試料を−80℃に保存した。
GCGCCGGTATCTCTCAGCTCCTTA=RTPCRプライマー配列RTP0068F2(配列番号8)。
ATATCATCCCTCCCGCCGGT=RTPCRプライマー配列RTP0068R2(配列番号9)
AtNRT2.7のT0表現型(pBNP036AtNRT2.7001:バーレー種)は、その植物が発芽約12週間の時に、最も古い葉に退緑斑点を示した。これらの退緑斑点は、葉の老化と同時に、植物の上部の葉で徐々に増加した。植物の主茎に沿って、褐色の染みも観察された。表現型は形質転換体の70%で観察された。この表現型は、T1個体群とT2個体群でも観察された。
植物組織中の硝酸塩の検出
植物組織中の硝酸塩濃度を測定する方法は、Masclauxの論文(Planta(2000)211,pp510−518)を含む、いくつかの論文に開示されている。この方法は、高度な酸性条件下における植物抽出物中での硝酸塩によるサリチル酸のニトロ化、及び410nmで最大吸収を形成する複合体に依存する。生成した発色団は5−ニトロサリチル酸である。この方法は高感度であり、塩化物、亜硝酸塩及びアンモニウムイオンからわずかな干渉を受ける(Cataldo D.A.,Community Soil Science and Plant Analysis,6(1),pp71−80,1975)。
抽出緩衝液:50mMリン酸緩衝液 pH7.5;アッセイ溶液:サリチル酸の濃硫酸溶液(5%濃度)であり;2N水酸化ナトリウムも必要である。
図10〜27に示すTSNAの結果は、AtNrt2.7構築物の結果として、総TSNA濃度(すなわち、NAT、NNK及びNNN)の相当な減少を示す。これは、収穫期にそれほど残っていない葉の硝酸塩と関連すると仮定される。硝酸塩は、乾燥されたタバコの葉の中のTSNA生産のための主な前駆体の1つである(Staafら、2005,Contributions to Tobacco Research,21:321−330;de Rotonら、2005,Contributions to Tobacco Research,21:305−320)。従って、T0及びT1個体群に見られるように、葉の中の硝酸塩のレベルの低下は、乾燥された葉の中のTSNAのレベルの低下をもたらすであろう。特に、バーレー種は、畑で栽培された時に高レベルのNNNを含み、NNNのレベルが下がっていることが示された。
Claims (36)
- 硝酸塩輸送体活性を有するポリペプチドをコードするコード配列に動作可能に連結するプロモーターを含む遺伝的構築物であって、該プロモーターがカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターでない遺伝的構築物。
- 該プロモーターが、構成的、非構成的、組織特異的、発生学的に調節された、又は誘導性/抑制性プロモーターである、請求項1記載の遺伝的構築物。
- 該プロモーターが、カーネーションエッチドリングウイルス(CERV)プロモーター、エンドウ豆プラストシアニンプロモーター、ルビスコプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、クロロフィルa/b結合プロモーター、高分子量グルテニンプロモーター、α,β−グリアジンプロモーター、ホルデインプロモーター、パタチンプロモーター、又は配列特異的プロモーターである、請求項1又は2記載の遺伝的構築物。
- 該プロモーターが、CERVプロモーター又はエンドウ豆プラストシアニンプロモーターである、請求項3記載の遺伝的構築物。
- 硝酸塩輸送体活性を有するポリペプチドをコードするコード配列に動作可能に連結する、カーネーションエッチドリングウイルス(CERV)プロモーター又はエンドウ豆プラストシアニンプロモーターのいずれかを含む遺伝的構築物。
- 該プロモーターが、実質的に配列番号1で示されるヌクレオチド配列、又はその機能的変異体若しくは機能的断片を含む、請求項1〜5のいずれか1項記載の遺伝的構築物。
- 該プロモーターが、実質的に配列番号2で示されるヌクレオチド配列、又はその機能的変異体若しくは機能的断片を含む、請求項1〜5のいずれか1項記載の遺伝的構築物。
- 硝酸塩輸送体活性を有するポリペプチドをコードするコード配列が、シロイヌナズナ種、イネ属種、ポプラ属種又はタバコ属種に由来する、請求項1〜7のいずれか1項記載の遺伝的構築物。
- 該コード配列が、シロイヌナズナ、タバコ、コメ又はヨーロッパヤマナラシに由来し、好ましくはシロイヌナズナに由来する、請求項1〜8のいずれか1項記載の遺伝的構築物。
- 硝酸塩輸送体活性を有するポリペプチドをコードするコード配列が、実質的に配列番号3若しくは配列番号4で示される核酸配列、又はその機能的変異体若しくは断片を含む、請求項1〜9のいずれか1項記載の遺伝的構築物。
- 硝酸塩輸送体活性を有するポリペプチドが、実質的に配列番号5で示されるアミノ酸配列、又はその機能的変異体若しくは断片を含む、請求項1〜10のいずれか1項記載の遺伝的構築物。
- 請求項1〜11のいずれか1項記載の遺伝的構築物を含有する組換えベクター。
- 実質的に図5a及び5bに示される、請求項12記載のベクター。
- 試験植物の葉の硝酸塩濃度を、同一条件で栽培した野生型植物の葉の対応する硝酸塩の濃度よりも低濃度に下げる方法であって、試験植物の植物代謝を変化させ、植物の葉の硝酸塩輸送体の濃度を上昇させることを含む方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項記載の遺伝的構築物、又は請求項12若しくは13記載のベクターで、該試験植物細胞を形質転換することを含む、請求項14記載の方法。
- 下記工程を含む、同一条件で栽培した、対応する野生型植物よりも高い割合で硝酸塩を葉の外に輸送する形質転換植物を製造する方法:
(i)請求項1〜11のいずれか1項記載の遺伝的構築物、又は請求項12若しくは13記載のベクターで、植物細胞を形質転換する工程;及び
(ii)該形質転換細胞から植物を再生する工程。 - 修飾されていない植物に、硝酸塩輸送体をコードする外来遺伝子を導入することを含む、形質転換植物を製造する方法であって、該外来遺伝子によりコードされる硝酸塩輸送体の発現により、修飾されていない植物の葉の硝酸塩濃度と比較して、形質転換植物の葉の硝酸塩濃度を下げる方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項記載の遺伝的構築物、又は請求項12若しくは13記載のベクターを含有する形質転換植物。
- 硝酸塩輸送体をコードする外来遺伝子を含有する形質転換植物であって、該形質転換植物の葉の硝酸塩濃度が、修飾されていない植物の葉の硝酸塩濃度と比較して低い、形質転換植物。
- 外来核酸配列を用いた植物の形質転換により、植物の葉の硝酸塩濃度を下げるための、硝酸塩輸送体をコードする外来核酸配列の使用。
- 外来核酸配列を用いた植物の形質転換により、試験植物の老化又は老化表現型を誘導するための、硝酸塩輸送体をコードする外来核酸配列の使用。
- 該外来遺伝子が、実質的に配列番号3若しくは配列番号4で示されるヌクレオチド配列、又はその機能的変異体若しくは断片を含み、又は実質的に配列番号5で示されるアミノ酸配列、又はその機能的変異体若しくは断片を含む硝酸塩輸送体をコードする、請求項17記載の方法、請求項18若しくは19記載の形質転換植物、又は請求項20若しくは21記載の使用。
- 請求項1〜11のいずれか1項記載の遺伝的構築物、又は請求項12若しくは13記載のベクターを含む宿主細胞。
- 該細胞が植物細胞である、請求項23記載の宿主細胞。
- 該植物が、アブラナ科、例えばアブラナ属に由来し、好ましくはセイヨウアブラナ(菜種)である、請求項14〜17のいずれか1項記載の方法、請求項18若しくは19記載の形質転換植物、又は請求項20若しくは21記載の使用。
- 該植物が、イネ目、例えば、コムギ連、好ましくはコムギ属(小麦)に由来する、請求項14〜17のいずれか1項記載の方法、請求項18若しくは19記載の形質転換植物、又は請求項20若しくは21記載の使用。
- 該植物が、ナス科、例えばチョウセン朝顔、ナスビ、マンドレイク、セイヨウハシリドコロ(ベラドンナ)、唐辛子(パプリカ、チリペッパー)、ジャガイモ又はタバコに由来する、請求項14〜17のいずれか1項記載の方法、請求項18若しくは19記載の形質転換植物、又は請求項20若しくは21記載の使用。
- 該植物が、タバコ属に由来し、好ましくはタバコである、請求項14〜17のいずれか1項記載の方法、請求項18若しくは19記載の形質転換植物、又は請求項20若しくは21記載の使用。
- 請求項17、18又は請求項25〜28のいずれか1項記載の形質転換植物から得られる植物繁殖産物。
- 該繁殖産物が、請求項1〜11のいずれか1項記載の遺伝的構築物、請求項12若しくは13記載のベクター、又は請求項22に定義された外来遺伝子を含む、請求項29記載の植物繁殖産物。
- 同一条件で栽培した、野生型植物から得られた収穫された葉の対応する硝酸塩濃度よりも低濃度の硝酸塩を含む、収穫された葉であって、該葉が、請求項18、19又は25〜28のいずれか1項記載の形質転換植物から収穫されているか、又は請求項16若しくは請求項17記載の方法により生産されている、収穫された葉。
- 変異体タバコ植物から得られた、硝酸塩が少ないタバコを含むタバコ製品であって、変異体がその葉の硝酸塩濃度を下げることができる、タバコ製品。
- タバコ製品のタバコが由来する変異体タバコ植物が、請求項1〜11のいずれか1項記載の遺伝的構築物、請求項12若しくは13記載のベクター、又は請求項22に定義された外来遺伝子を含む、請求項32記載のタバコ製品。
- 該タバコ製品が、無煙タバコ製品、例えば嗅ぎタバコ、又は口で供給可能な口腔タバコ製品、例えば、スヌース、又は喫煙物品である、請求項32又は33記載のタバコ製品。
- 変異体タバコ植物から得られる、硝酸塩が減少したタバコを含む喫煙物品であって、変異体が、その葉の硝酸塩濃度を下げることができるものである喫煙物品。
- タバコ製品のタバコが由来する変異体タバコ植物が、請求項1〜11のいずれか1項記載の遺伝的構築物、請求項12若しくは13記載のベクター、又は請求項22に定義された外来遺伝子を含む、請求項35記載の喫煙物品。
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JPN6015040845; Russian Journal of Plant Physiology Vol.55, No.5, 2008, pp.687-693 * |
JPN6015040847; Plant Cell Vol.19, No.5, 2007, pp.1590-1602 * |
JPN6015040849; Plant Cell. Vol.21, No.9, 2009, pp.2750-2761 * |
JPN6015040850; Plant Molecular Biology Vol.29, No.3, 1995, pp.621-626 * |
Cited By (4)
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---|---|---|---|---|
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