BR112014010259B1 - Processo para produzir uma célula de planta de tabaco transgênico; processo para produzir uma planta de tabaco transgênica tendo o perfil de sabor alterado; método para aumentar o teor de carotenoide de uma planta de tabaco; método para aumentar o teor de betadamascenona em uma planta de tabaco; artigo fumável; método para a produção de betadamascenona; e constructo, vetor ou vetor de expressão - Google Patents

Abstract

PROCESSOS PARA PRODUZIR UMA CÉLULA VEGETAL MUTANTE; MÉTODO PARA A MODULAÇÃO DO TEOR DE CAROTENOIDE DE UMA PLANTA; MÉTODO PARA MODULAR O TEOR DE BETA-DAMASCENONA EM UMA PLANTA; PROCESSO PARA PRODUZIR UMA PLANTA MUTANTE; PRODUTO DE TABACO; MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE BETA-DAMASCENONA E CONSTRUCTO. Uma célula vegetal mutante, de ocorrência não natural ou transgênica que compreende: (i) um polinucleotídeo compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência que codifica uma neoxantina sintase e tendo pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID No. 6; (ii) um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo apresentado em (i); (iii) um polipeptídeo tendo pelo menos 66 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 ou pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID No. 7; ou (iv) um constructo, vetor ou vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo isolado apresentado em (i), e em que a expressão ou a atividade da neoxantina sintase é modulada em comparação com um controle ou planta tipo selvagem.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção divulga as sequências de polinucleotídeo de neoxantina sintase, licopeno beta ciclase e 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase da Nicotiana tabacum e suas variantes, homólogos e fragmentos. Em particular, é descrita a modificação da expressão de neoxantina sintase ou a atividade da proteína assim codificada para modular a quantidade de beta-damascenona que é detectável no aerossol de tabaco aquecido resultando em novos perfis de sabor do tabaco.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A beta-damascenona é um fator de aroma no aerossol de destilação de tabaco curado. Possui um sabor frutado típico e de maçã cozida, que também pode ser observado naturalmente no Rosa damascena Mill (a Damask rose), indicando assim a existência de uma via enzimática que leva à sua síntese em algumas plantas. As flores de Rosa damascenasão famosas por sua excelente fragrância, e são comercialmente colhidas para óleo de rosa usado em perfumaria e para fabricar a água de rosas. As pétalas da flor também são às vezes utilizadas diretamente para condimentar os alimentos ou bebidas e são consideradas seguros para o consumo humano.

[003] Os carotenoides são potenciais precursores para a produção de beta-damascenona. A oxidação térmica de neoxantina leva à formação de beta-damascenona. A neoxantina é um derivado oxigenado de carotenoide que pertence à classe de xantofilas e consiste de oito unidades isoprenoides. Nas folhas senescentes e curadas, a ne- oxantina livre não está presente ou apenas é detectada em níveis muito baixos. Dentro da via de carotenoide da planta que ocorre nos plastídios - tais como cloroplastos - enzimas conhecidas de formar a neoxantina pertencem à classe das neoxantinas sintases. A neoxantina sintase catalisa a formação de neoxantina a partir da violaxantina e é codificada pelo polinucleotídeo ABA4. O licopeno beta ciclase também catalisa a formação de neoxantina a partir da violaxantina e é codificado pelo polinucleotídeo NeSy. A 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase catalisa a clivagem de cis-neoxantina em C25-alênico-apo-aldeído e xanotina e é codificada pelo polinucleotídeo NCED2.

[004] Existe uma necessidade contínua na técnica para materiais vegetais - tais como o tabaco - com perfis de sabor modificados. É um objetivo da presente invenção satisfazer esta necessidade.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] Os genes ABA4, NeSy e NCED2 foram clonados e sequenciados a partir de Nicotiana tabacum e o efeito da expressão modulada destes genes foi investigado. As enzimas codificadas pelos polinucleotídeos NeSy e NCED2 são supostas serem componentes da via biossintética de carotenoides e supra-regulação da expressão do polinucleotídeo de NeSy e a infra-regulação da expressão do polinucleotídeo NCED2 em uma planta foi observada de aumentar o teor de carotenoide. No entanto, a produção alterada de beta-damascenona não foi detectada. Surpreendentemente, os inventores descobriram que o aumento da expressão do polinucleotídeo ABA4 não só aumentou o teor de carotenoide, mas também significativamente aumentou o teor de beta-damascenona no aerossol formada após o aquecimento do tabaco curado preparado a partir de uma planta de tabaco. Esta descoberta foi ainda mais surpreendente visto que o polinucleotídeo de NeSy codifica uma enzima que atua no mesmo ponto da via biossintética de carotenoide como o polinucleotídeo de ABA4, mas o polinucleotídeo de NeSy foi observado de não ter nenhum efeito significativo sobre os níveis de beta-damascenona. Sem desejar estar ligado por qualquer teoria particular, esta descoberta sugere que um neoxantina sintase codificada pelo polinucleotídeo de ABA4 desempenha um papel central na síntese de beta-damascenona em Nicotiana tabacum. Isto permite que as plantas sejam produzidas em que os níveis de beta-damascenona são modulados e assim terão perfis de sabor alterados. As plantas podem ser planejadas em que o seu teor de carotenoide é modulado. Tais plantas podem ter benefícios nutricionais para o consumidor. Além disso, a modulação do teor de carotenoide de uma planta pode ser utilizada para gerar plantas que são resistentes a herbicidas que inibem a biossíntese de carotenoide, que podem prolongar o uso de inibidores de carotenoide como herbicidas para as culturas que são geralmente sensíveis a estes compostos. Vantajosamente, essas mudanças substancialmente não alteram a aparência visual das plantas, o que é um critério importante para a aceitação pela indústria e para maximizar os rendimentos da planta e outros mais.

ASPECTOS E MODALIDADES DA INVENÇÃO

[006] Os aspectos e as modalidades da presente invenção são apresentados nas reivindicações anexas.

[007] Em um aspecto é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo, ou consistindo essencialmente em uma sequência que codifica a neoxantina sintase e tendo pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID No. 6.

[008] Em outro aspecto é fornecido um polipeptídeo isolado codificado pelo polinucleotídeo.

[009] Em outro aspecto é fornecido um polipéptido isolado tendo pelo menos 66 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 ou pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID No. 7.

[0010] Em outro aspecto fornece-se um constructo, vetor ou vetor de expressão que compreende os polinucleotídeos isolados.

[0011] Em outro aspecto fornece-se uma célula vegetal mutante, de ocorrência não natural ou transgênica compreendendo o polinucleotídeo isolado, o polipeptídeo ou o constructo, vetor ou vetor de expressão aqui descrito, e em que a expressão ou atividade da neoxantina sintase é modulada em comparação a uma planta de controle ou tipo selvagem.

[0012] Em uma modalidade, a planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica compreende a célula vegetal.

[0013] Em outro aspecto, é fornecido um método para a modulação do teor de carotenoide de uma planta, compreendendo as etapas de: (i) modular a expressão ou atividade de uma neoxantina sintase na planta, de preferência, em que a neoxantina sintase compreende a sequência de polinucleotídeo ou a sequência de polipeptídeo aqui apresentada; (ii) medir o teor de carotenoide em pelo menos uma parte da planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica obtida na etapa (i); e (iii) identificar uma planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica, em que o seu teor de carotenoide se alterou em comparação com uma planta de controle em que a expressão ou atividade da neoxantina sintase não foi modulada.

[0014] Em uma modalidade, a expressão ou a atividade de licopeno beta ciclase ou 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase ou uma combinação destas, também é modulada na planta.

[0015] Em uma modalidade, a licopeno beta ciclase compreende a sequência de polinucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 8 ou possui pelo menos 60 % de identidade de sequência com esta, ou a sequência de polinucleotídeo compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 9, ou possui pelo menos 60 % de identidade de sequência com esta, e em que a 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase compreende a sequência de polinucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 13, ou possui pelo menos 60 % de identidade de sequência com esta.

[0016] Em outro aspecto, é fornecidos um método para a modulação do teor de beta-damascenona de uma planta, compreendendo as etapas de: (i) modular a expressão ou atividade de uma neoxantina sintase na planta, de preferência, em que a neoxantina sintase compreenda o sequência de polinucleotídeo ou a sequência de polipeptídeo aqui descrita; (ii) medir o teor de beta-damascenona em pelo menos uma parte da planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica obtida na etapa (i); e (iii) identificar um planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica, em que o teor de beta- damascenona mudou em comparação com uma planta de controle em que a expressão ou atividade de neoxantina sintase não foi modulada.

[0017] Em outro aspecto fornece-se planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica ou material vegetal derivado ou derivável desta que seja obtida ou que possa ser obtida pelos métodos aqui descritos.

[0018] Em outro aspecto é fornecido um planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica, em que a expressão de uma neoxantina sintase ou a atividade da proteína assim codificada foi aumentada; em que o teor de luteína da folha verde ou o teor de beta- caroteno ou o teor combinado de luteína e beta-caroteno da planta é mais elevado do que uma planta de controle em que a expressão ou a atividade de neoxantina sintase não foi aumentada; e em que o teor de beta-damascenona no aerossol de material vegetal curado é pelo menos 10 % maior do que o aerossol da planta de controle, de preferência, em que: (i) o teor de luteína da folha verde da planta seja pelo menos ao redor de 18 mg/100 g; (ii) em que o teor de beta-caroteno da planta seja pelo menos ao redor de 12 mg/100 g; e (iii) em que o teor de beta-damascenona no aerossol após o aquecimento da biomassa de folha da planta seja pelo menos ao redor de 1 ng/mg.

[0019] Em outro aspecto é fornecido material vegetal, incluindo a biomassa, semente ou folhas da planta aqui descrito.

[0020] Em outro aspecto, é fornecido um produto de tabaco compreendendo as células vegetais, pelo menos uma parte da planta ou material vegetal aqui descrito.

[0021] Em outro aspecto é fornecido um método para a produção de beta-damascenona compreendendo as etapas de: (a) fornecer pelo menos parte de uma planta, material vegetal ou o produto de tabaco como aqui descrito; e (b) fornecer calor a estes para produzir um aerossol compreendendo beta-damascenona.

[0022] Outros aspectos incluem o que se segue.

[0023] Um gene quimérico que compreende um ou mais dos polinucleotídeos isolados aqui descritos, operacionalmente ligado a uma ou mais sequências reguladoras.

[0024] Um constructo de polinucleotídeo compreendendo um ou mais dos polinucleotídeos isolados aqui descritos e compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em pelo menos 15 a 30 nucleotídeos, 30 a 50 nucleotídeos, 50 a 100 nucleotídeos, 100 a 150 nucleotídeos, 150 a 200 nucleotídeos, 200 a 300 nucleotídeos, 300 a 400 nucleotídeos, 400 a 500 nucleotídeos, 500 a 600 nucleotídeos ou 600 a 700 nucleotídeos.

[0025] Um produto consumível que incorpora ou utiliza o material vegetal, biomassa, semente ou folhas como aqui descrito.

[0026] Uma linhagem celular que compreende o polinucleotídeo isolado, o gene quimérico, o constructo de polinucleotídeo, o RNA de filamento duplo, o conjugado ou o vetor de expressão e outros mais, tal como aqui descrito. Um método para a modulação da expressão de um ou mais dos polinucleotídeos aqui descritos ou a atividade de um ou mais dos polipeptídeos assim codificados em uma célula, dito método compreendendo a administração do gene quimérico, da constructo de polinucleotídeo, do RNA de filamento duplo, do conjugado ou do vetor de expressão como aqui descrito.

[0027] Um método para a detecção, isolamento, amplificação ou análise de um ou mais dos polinucleotídeos aqui descritos, o método compreendendo a etapa de fornecer uma amostra que compreende um polinucleotídeo e hibridar dito polinucleotídeo com uma molécula de polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo de pelo menos 10 nucleotídeos contíguos da sequência de nucleotídeo isolada.

[0028] Um método para a modulação do teor de carotenoide e do teor de beta-damasceonona ou o teor de carotenoide ou o teor de beta- damasceonona em pelo menos uma parte de uma planta em comparação com uma planta de controle que compreende o uso de um agente que modula a expressão de um ou mais dos polinucleotídeos aqui descritos, ou a atividade da proteína assim codificada.

[0029] O uso de agente que modula a expressão de um ou mais dos polinucleotídeos aqui descritos ou a atividade da proteína assim codificada para a modulação do teor de carotenoide e do teor de beta- damasceonona ou o teor de carotenoide ou o teor de beta- damasceonona em pelo menos uma parte de uma planta em comparação com uma planta de controle.

[0030] Em uma modalidade, o agente é ou é o derivado de um gene de polinucleotídeo quimérico, um constructo de polinucleotídeo compreendendo um ou mais dos polinucleotídeos, um RNA anti-sentido, um RNA de filamento duplo, um cDNA, um conjugado que compreende um ou mais dos polinucleotídeos ou pelo menos um componente não nucleotídeo ou não polinucleotídeo nele covalentemente ligado, um ribozima, um agente mutagênico, um ligador de zinco, uma pequena molécula ou uma meganuclease.

[0031] Em uma outra modalidade, o fragmento de polinucleotídeo codifica um ácido nucleico anti-sentido, um ribozima, um RNA que executa a trans-remoção mediada por spliceossoma, um RNA interferente, um RNA guia, ou outro RNA não transladado e outros mais. E outra modalidade, o fragmento de polinucleotídeo codifica um RNA interferente.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0032] Figura 1. Versão simplificada da via de carotenoide nas plantas. Neoxantina e luteína são candidatas precursoras que contribuem para a formação de beta-damascenona nas folhas. Etapas adicionais, mas até agora não caracterizadas, incluem a formação de glicosídeo e a degradação bacteriana durante a cura, respectivamente.

[0033] Figura 2 (A) sequência de cDNA de NtABA4 amplificada a partir de K326 utilizada para planejar as plantas 35S::NtABA4; (B) sequência transladada de NtABA4; (C) Iniciadores avançados (F) e reversos (R) utilizados para amplificar a sequência de NtABA4. A sequência cacc 5’ no iniciador F é requerida para a clonagem nos vetores pENTER Gateway.

[0034] Figura 3. Clonagem e sequenciamento de uma sequência genômica de tabaco de Hicks Broadleaf que corresponde a uma cópia do gene NtABA4. (A) Esta sequência genômica com cinco exons e quatro íntrons abrange um total de 1808 pb (1792 + 16 pb fronteiras de íntron). (B) O cDNA de NtABA4 (T) e a isoforma de NIABA4 genômica clonada (CQ) não são idênticos. (C) A cópia de NIABA4 de 786 bp de comprimento deduzida da sequência genômica (Sbjct) difere em 7 aminoácidos do cDNA de N1ABA4 clonado (Query) incluindo uma serina na posição 9 no peptídeo de trânsito de cloroplasto que está ausente na cópia genômica.

[0035] Figura 4. (A) Sequência de cDNA de NtNeSy amplificada de K326 utilizado para planejar as plantas 35S::NtNeSy; (8) sequência transladada de NtNeSy; (C) Inicadores Avançados (F) e Reversos (R) utilizados para amplificar a sequência de NtNeSy. A sequência cacc 5’ no iniciador F é requerida para a clonagem nos vetores pENTER Gateway.

[0036] Figura 5. (A) Sequência de cDNA parcial de NtNCED2 utilizada para planejar as plantas de RNA interferente de NtNCED2. (B) Iniciadores avançados (F) e reversos (R) utilizados para amplificar a sequência parcial de NtNCED2. A sequência cacc 5’ no iniciador F é requerida para a clonagem nos vetores pENTER Gateway.

[0037] Figura 6. Concentrações de luteína, beta-caroteno e semi- quantificação de neoxantina nas amostras ‘verdes’ (combinações de folhas) de TN90-4, 35S:: NtNeSy-1_2 (NeSy1-2), 35S::NIABA4-2_2 (ABA4-2_2) e linhagens selecionadas de RNA-1_4 interferente de NtNCED2 (CED2-1_4).

[0038] Figura 7. Teor de beta-damascenona no aerossol (Aerossol), tabaco curado (Tabaco) e tampões de tabaco após a formação de aerossol (Tampão) das linhagens TN90-4 (controle TN90), 35S::NtNeSy-1_2 (NeSy1-2), 35S::NtABA4-2_2 (ABA4-2-2) e RNA-1_4 interferente de NtNCED2 (CED2-1_4).

[0039] A quantificação de beta-damascenona é executada em triplicata, incluindo o simulador de fumo, captura de aerossol e quantificação de beta-damascenona. A análise do teste T mostra que o teor de beta-damascenona no aerossol da linhagem NtABA4-2_2 é estatisticamente diferente de TN90-4 (P < 0,01) e que o teor de beta- damascenona no tampão da linhagem NtABA4-2_2 é estatisticamente diferente de TN90-4 (P < 0,05).

DEFINIÇÕES

[0040] Os termos e expressões técnicas utilizadas dentro do escopo deste pedido devem geralmente ser fornecidos no significado comumente aplicado a elas na técnica pertinente da biologia vegetal e molecular. Todas as seguintes definições de termos se aplicam ao conteúdo completo deste pedido. A palavra "compreendendo"não exclui outros elementos ou etapas, e o artigo indefinido "um" ou "uma"não exclui uma pluralidade. Um única etapa pode cumprir as funções de vários aspectos recitados nas reivindicações. Os termos "cerca de", "essencialmente" e "aproximadamente" no contexto de um determinado valor ou faixa enumerada, referem-se a um valor ou faixa que está dentro de 20 %, dentro de 10 %, ou dentro de 5 %, 4 %, 3 %, 2 % ou 1 % do valor ou faixa dada.

[0041] O termo "isolado" refere-se a qualquer entidade que é tomada de seu meio natural, mas o termo não indica qualquer grau de purificação.

[0042] Um "vetor" refere-se a um veículo de ácido nucleico que compreende uma combinação de componentes de ácido nucleico para permitir o transporte de ácido nucleico, constructos de ácido nucleico e conjugados de ácido nucleico e outros mais. Os vetores adequados incluem epissomas capazes de replicação extra-cromossômica tais como os plasmídeos de ácido nucleico circulares de filamento duplo; plasmídeos de ácido nucleico linearizados de filamento duplo; e outros vetores de qualquer origem.

[0043] Um "vetor de expressão" é um veículo de ácido nucleico que compreende uma combinação de componentes de ácido nucleico para permitir a expressão de ácido nucleico - tal como o polinucleotídeo de ABA4, constructos de ácido nucleico e conjugados de ácido nucleico e outros mais. Os vetores de expressão adequados incluem epissomas capazes de replicação extra-cromossômica tais como os plasmídeos de ácido nucleico circulares de filamento duplo; os plasmídeos de ácido nucleico linearizados de filamento duplo; e outros vetores de expressão funcionalmente equivalentes de qualquer origem. Um vetor de expressão compreende pelo menos um promotor posicionado a montante e operativamente ligado a um ácido nucleico, constructos de ácido nucleico ou conjugado do ácido nucleico, como definido abaixo.

[0044] O termo "constructo" refere-se a um fragmento de ácido de nucleico recombinante de filamento duplo compreendendo um ou mais polinucleotídeos. o constructo compreende um par de base de "filamento padrão"com um "sentido ou filamento de codificação"complementar. Uma dada constructo pode ser inserida em um vetor com duas orientações possíveis, na mesma orientação (ou sentido) ou na orientação reversa (ou anti-sentido) em relação à orientação de um promotor posicionado dentro de um vetor - tal como um vetor de expressão.

[0045] Um "promotor" refere-se a um elemento/sequência de de ácido nucleico, tipicamente posicionado a montante e operacionalmente ligado a um fragmento de DNA de filamento duplo. Os promotores podem ser derivados totalmente de regiões próximas de um gene nativo de interesse, ou podem ser compostos por diferentes elementos derivados de diferentes promotores nativos ou segmentos de DNA sintéticos.

[0046] Os termos "homologia, identidade ou semelhança" referem- se ao grau de semelhança de sequência entre dois polipeptídeos ou entre duas moléculas de ácido nucleico em comparação com o alinhamento de sequência. O grau de homologia entre duas sequências de ácido nucleico discretas sendo comparado é uma função do número de nucleotídeos idênticos ou correspondentes nas posições comparáveis. A identidade percentual pode ser determinada pela inspeção visual e cálculo matemático. Alternativamente, a identidade percentual de duas sequências de ácido nucleico pode ser determinada pela comparação de informação de sequência utilizando um programa de computador tal como - ClustalW, BLAST, FASTA ou SmithWaterman.

[0047] O termo "planta" se refere a qualquer planta em qualquer estágio do seu ciclo de vida ou desenvolvimento, e suas progênies. Em uma modalidade, a planta é uma "planta do tabaco" que se refere a uma planta que pertence ao gênero Nicotiana. As espécies preferidas de planta de tabaco são aqui descritas.

[0048] Uma "célula vegetal" refere-se à uma unidade estrutural e fisiológica de uma planta. A célula vegetal pode estar na forma de um protoplasto sem uma parede celular, uma única célula isolada ou uma célula cultivada, ou como parte de uma unidade organizada maior tal como, mas não limitado a estas, tecido vegetal, um órgão da planta, ou uma planta inteira.

[0049] O termo "material vegetal" refere-se a qualquer composição sólida, líquida ou gasosa, ou uma combinação desta, obtida a partir de uma planta, incluindo a biomassa, folhas, caules, raízes, flores ou partes de flores, frutas, pólen, óvulos, zigotos, sementes, mudas, secreções, extratos, culturas de células ou tecidos, ou quaisquer outras partes ou produtos de uma planta. Em uma modalidade, o material vegetal compreende ou consiste da biomassa, semente ou folhas. Em outra modalidade, o material vegetal compreende ou consiste de folhas.

[0050] O termo "variedade" refere-se a uma população de plantas que compartilham características constantes que as separam de outras plantas da mesma espécie. Embora possua um ou mais traços distintos, uma variedade é ainda caracterizada por uma variação total muito pequena entre os indivíduos dentro dessa variedade. Uma variedade é muitas vezes comercialmente vendida.

[0051] O termo "linhagem" ou "linhagem de reprodução"como aqui utilizado significa um grupo de plantas que são usadas durante a reprodução da planta. Uma linhagem é distinta de uma variedade quando ela apresenta pouca variação entre os indivíduos para um ou mais traços de interesse, embora possa haver alguma variação entre os indivíduos de outros traços.

[0052] O termo "modulação"pode referir-se à redução, inibição aumento ou de outro modo abalo da expressão ou a atividade de um polipeptídeo. O termo também pode referir-se à redução, inibição, aumento ou de outro modo abalo da atividade de um gene que codifica um polipeptídeo que pode incluir, mas não é limitado a esta, a modulação da atividade de transcrição.

[0053] O termo "reduzir" ou "reduzido" como aqui usado, refere-se à uma redução de cerca de 10 % a cerca 99 %, ou uma redução de pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98%, pelo menos 99 %, ou pelo menos 100 % ou mais de uma quantidade ou uma atividade, tal como, mas não limitado a estas, a atividade de polipeptídeo, a atividade de transcrição e a expressão da proteína.

[0054] O termo "inibir" ou "inibido" como aqui utilizado, refere-se à uma redução de cerca de 98 % a cerca 100 %, ou uma redução de pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, mas particularmente de 100 %, de uma quantidade ou uma atividade, tal como, mas não limitado a estas, a atividade de polipeptídeo, a atividade de transcrição e a expressão da proteína.

[0055] O termo "aumentar" ou "aumentado" como aqui utilizado, refere-se a um aumento de cerca de 5 % a cerca 99 %, ou um aumento de pelo menos 5 %, pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou pelo menos 100 % ou mais de uma quantidade ou uma atividade, tal como, mas não limitado a estas, a atividade de polipeptídeo, a atividade de transcrição e a expressão da proteína.

[0056] O termo "controle" no contexto de uma planta de controle significa uma planta ou célula vegetal em que a expressão ou a atividade de uma enzima não foi modificada (por exemplo, aumentada ou reduzida), e por isso pode fornecer uma comparação com uma planta em que a expressão ou a atividade da enzima foi modificada. A planta de controle pode compreender um vetor vazio. A planta de controle pode corresponder a uma planta do tipo selvagem.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0057] Em uma modalidade, é fornecidos um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de polinucleotídeo tendo pelo menos 60 % de identidade de sequência de qualquer uma das sequências aqui descritas, incluindo qualquer um dos polinucleotídeos apresentados na listagem de sequências.

[0058] Adequadamente, o polinucleotídeo isolado compreende, consiste ou consiste essencialmente de uma sequência tendo pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com esta.

[0059] Em outra modalidade, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma neoxantina sintase e tendo pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID No. 1. Adequadamente, o polinucleotídeo isolado compreende, consiste ou consiste essencialmente de uma sequência que tem pelo menos cerca de 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com a SEQ ID No. 1.

[0060] Em outra modalidade, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma licopeno beta ciclase e tendo pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID No. 8. Adequadamente, o polinucleotídeo isolado compreende, consiste ou consiste essencialmente de uma sequência tendo pelo menos cerca de 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com a SEQ ID No. 8.

[0061] Em outra modalidade, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo, ou consistindo essencialmente em uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase e tendo pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID No.13. Adequadamente, o polinucleotídeo isolado compreende, consiste ou consiste essencialmente de uma sequência que tem pelo menos cerca de 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com a SEQ ID No. 13.

[0062] Como aqui utilizado, o termo "polinucleotídeo"refere-se a um polímero de nucleotídeos, o qual pode ser ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA) não modificado ou modificado. Consequentemente, um polinucleotídeo pode ser, sem limitação, um DNA genômico, DNA complementar (cDNA), mRNA ou o RNA anti- sentido ou um fragmento deste. Além do mais, um polinucleotídeo pode ser DNA de único filamento ou filamento duplo, DNA que é uma mistura de regiões de único filamento e filamento duplo, uma molécula híbrida compreendendo DNA e RNA, ou uma molécula híbrida com uma mistura de regiões de único filamento e filamento duplo ou um fragmento destas. Além disso, o polinucleotídeo pode ser composto por regiões de filamento triplo compreendendo DNA, RNA, ou ambos ou um fragmento destes. Um polinucleotídeo pode conter uma ou mais bases modificadas, tais como fosfotioatos, e pode ser um ácido nucleico peptídico. Geralmente, os polinucleotídeos podem ser montados a partir de fragmentos isolados ou clonados de cDNA, DNA genômico, oligonucleotídeos, ou nucleotídeos individuais, ou uma combinação dos anteriores. Embora as sequências de polinucleotídeo aqui descritas sejam apresentadas como sequências de DNA, as sequências incluem as sequências de RNA correspondentes, e as suas sequências de DNA ou RNA complementares (por exemplo, completamente complementares), incluindo os seus complementos reversos.

[0063] O termo "polinucleotídeo de NtABA4", refere-se aos polinucleotídeos que codificam a neoxantina sintase de Nicotiana tabacum e inclui outros polinucleotídeos compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em polinucleotídeos com homologia substancial (isto é, similaridade de sequência) ou identidade substancial com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 6; variantes de polinucleotídeo que possuem pelo menos cerca de 60%, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 6; fragmentos do polinucleotídeo de NtABA4 incluindo fragmentos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 6; fragmentos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 6 com homologia substancial (isto é, similaridade de sequência) ou identidade substancial a estes que possuem pelo menos cerca de 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com os fragmentos correspondentes da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 6. O polinucleotídeo de NtABA4 também inclui as sequências que compreendem um grau de identidade suficiente ou substancial ou similaridade com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 6 para codificar um polipeptídeo que funciona como uma neoxantina sintase. Em uma modalidade, o termo "polinucleotídeo de NtABA4" refere-se a um polímero de nucleotídeos que compreende, consiste ou consiste essencialmente de um polinucleotídeo aqui designado como SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 6.

[0064] O termo "polinucleotídeo de NtNeSY" refere-se aos polinucleotídeos que codificam licopeno beta ciclase da Nicotiana tabacum e inclui outros polinucleotídeos compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em polinucleotídeos com homologia substancial (isto é, similaridade de sequência) ou identidade substancial com a SEQ ID NO: 8; fragmentos do polinucleotídeo de NtNeSy incluindo fragmentos da SEQ ID NO: 8; variantes de polinucleotídeo que possuem pelo menos cerca de 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96%, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 8; fragmentos da SEQ ID NO: 8 com homologia substancial (isto é, similaridade de sequência) ou identidade substancial a estes que possuem pelo menos cerca de 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com os fragmentos correspondentes da SEQ ID NO: 8; e fragmentos da SEQ ID NO: 8 com homologia substancial (isto é, similaridade de sequência) ou identidade substancial a estes que possuem pelo menos cerca de 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com os fragmentos correspondentes da SEQ ID NO: 8. O polinucleotídeo de NtNeSy também inclui as sequências que compreendem um grau de identidade suficiente ou substancial ou similaridade com a SEQ ID NO: 8 para codificar um polipeptídeo que funciona como uma licopeno beta ciclase. Em uma modalidade, o termo "polinucleotídeo de NtNeSy" refere-se a um polímero de nucleotídeos que compreende, consiste ou consiste essencialmente de um polinucleotídeo aqui designado como SEQ ID NO: 8 que possui 100 % de identidade de sequência com esta.

[0065] O termo "polinucleotídeo de NtNCED2" refere-se aos polinucleotídeos que codificam 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase de Nicotiana tabacum e inclui outros polinucleotídeos compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em polinucleotídeos com homologia substancial (isto é, similaridade de sequência) ou identidade substancial com a SEQ ID NO: 13; variantes de polinucleotídeos que têm pelo menos cerca de 60 %, 61%, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; fragmentos do polinucleotídeo de NtNeSy incluindo fragmentos da SEQ ID NO: 13; fragmentos da SEQ ID NO: 13 com homologia substancial (isto é, similaridade de sequência) ou identidade substancial com estes que possuem pelo menos cerca de 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com os fragmentos correspondentes da SEQ ID NO: 13. O polinucleotídeo de NtNCED2 também inclui sequências compreendendo um grau suficiente ou substancial de identidade ou similaridade com a SEQ ID NO: 13 para codificar um polipeptídeo que funciona como uma 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase. Em uma modalidade, o termo "polinucleotídeo de NtNCED2" refere-se a um polímero de nucleotídeos que compreende, consiste ou consiste essencialmente de um polinucleotídeo aqui designado como SEQ ID NO: 13 com 100 % de identidade de sequência com esta.

[0066] Um polinucleotídeo como foi aqui descrito geralmente conterá ligações fosfodiéster, embora em alguns casos, os análogos de polinucleotídeo estão incluídos que podem ter cadeias principais alternativas, compreendendo, por exemplo, ligações de fosforamidato, fosforotioato, fosforoditioato ou O-metifoforoamidita; e cadeias principais e ligações de peptídeo polinucleotídeo. Outros polinucleotídeos análogos incluem aqueles com as cadeias principais positivas; as cadeias principais não iônicas, e as cadeias principais não riboses. As modificações da cadeia principal ribose-fosfato podem ser feitas por uma variedade de razões, por exemplo, para aumentar a estabilidade e meia-vida de tais moléculas em ambientes fisiológicos ou como sondas em um biochip. As misturas de polinucleotídeos de ocorrência natural e análogos pode ser preparadas; alternativamente, misturas de diferentes análogos de polinucleotídeo, e misturas de polinucleotídeos de ocorrência natural e análogos podem ser preparadas.

[0067] Uma variedade de análogos de polinucleotídeo são conhecidos, incluindo, por exemplo, as ligações de fosforamidato, fosforotioato, fosforoditioato, O-metilfoforoamidita e cadeias principais e ligações de peptídeo polinucleotídeo. Outros polinucleotídeos análogos incluem aqueles com cadeias principais positivas, cadeias principais não iônicas e cadeias principais não riboses. Os polinucleotídeos contendo um ou mais açúcares carbocíclicos também são incluídos.

[0068] Outros análogos incluem polinucleotídeos de peptídeo que são análogos de polinucleotídeos de peptídeo. Estas cadeias principais são substancialmente não iônicas sob condições neutras, ao contrário da cadeia principal de fosfodiéster altamente carregada de polinucleotídeos de ocorrência natural. Isto pode resultar em vantagens.

[0069] Em primeiro lugar, a cadeia principal de polinucleotídeo de peptídeo pode apresentar cinéticos de hibridação melhorados. Os polinucleotídeos de peptídeo possuem grandes alterações na temperatura de fusão de pares de base incompatíveis contra perfeitamente compatíveis. O DNA e o RNA tipicamente apresentam uma queda de 2 a 4 °C na temperatura de fusão para uma incompatibilidade interna. Com a cadeia principal de polinucleotídeo de peptídeo não iônica, a queta é mais próxima de 7 a 9 °C. Similarmente, devido à sua natureza não iônica, a hibridação das bases ligadas a estes cadeias principais é relativamente insensível à concentração de sal. Além disso, os polinucleotídeos de peptídeo não podem ser degradados ou degradados em uma menor extensão por enzimas celulares, e assim podem ser mais estáveis.

[0070] Entre as utilizações dos polinucleotídeos divulgados, e combinações de seus fragmentos, está o uso de fragmentos como sondas em ensaios de hibridação de ácido nucleico ou iniciadores para uso em ensaios de amplificação de ácido nucleico. Tais fragmentos geralmente compreendem pelo menos cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ou mais nucleotídeos contíguos de uma sequência de DNA. Em outras modalidades, um fragmento de DNA compreende pelo menos cerca de 10, 15, 20, 30, 40, 50 ou 60 ou mais nucleotídeos contíguos de uma sequência de DNA. Assim, em um aspecto, também é fornecido um método para a detecção de um polinucleotídeo de ABA4 compreendendo o uso das sondas ou iniciadores ou ambos. Os iniciadores exemplares são apresentados nas SEQ ID NOs: 3 a 5. Em outro aspecto, é também fornecido um método para detectar um polinucleotídeo de NeSy compreendendo o uso de sondas ou iniciadores ou ambos. Os iniciadores exemplares são apresentados nas SEQ ID NOs: 10 a 12 Em outro aspecto, também é fornecido um método para a detecção de um polinucleotídeo de NCED2 qie compreende o uso das sondas ou dos iniciadores ou ambos. Os iniciadores exemplificativos são apresentados nas SEQ ID NOs: 14 a 16.

[0071] Os parâmetros básicos que afetam a escolha das condições de hibridação e orientação para o planejamento das condições adequadas são descritos por Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Utilizando o conhecimento do código genético em combinação com as sequências de aminoácido aqui descritas, conjuntos de oligonucleotídeos degenerados podem ser preparados. Tais oligonucleotídeos são úteis como iniciadores, por exemplo, nas reações de cadeia polimerase (PCR), por meio das quais os fragmentos de DNA são isolados e amplificados. Em certas modalidades, os iniciadores degenerados podem ser utilizados como sondas para bibliotecas genéticas. Tais bibliotecas podem incluir, mas não são limitados a estas, bibliotecas de cDNA, bibliotecas genômicas e ainda bibliotecas de rótulos ou DNA da sequência de expressão eletrônicas. As sequências homólogas identificadas por este método devem então ser usadas como sondas para identificar os homólogos das sequências aqui identificadas. Também de uso potencial são os polinucleotídeos e oligonucleotídeos (por exemplo, iniciadores ou sondas) que hibridizam sob condições reduzidas de severidade, tipicamente condições de severidade moderada, e normalmente condições altamente severas aos polinucleotídeos como aqui descritos. Os parâmetros básicos que afetam a escolha das condições de hibridação e a orientação para o planejamento das condições adequadas são apresentadas por Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. e podem ser facilmente determinadas por aqueles tendo habilidade prática na técnica com base, por exemplo, na extensão ou composição de base do polinucleotídeo.

[0072] Uma forma de alcançar as condições moderadamente severas envolve o uso de uma solução de pré-lavagem contendo citrato de sódio padrão 5x, sulfato de dodecila sódico a 0,5 %, ácido etilenodiaminotetracético a 1,0 mM (pH 8,0), tampão de hibridação de cerca de 50 % de formamida, citrato de sódio padrão 6x, e uma temperatura de hibridação ao redor de 55 °C (ou outras soluções de hibridação similares, tais como aquelas contendo cerca de 50 % de formamida, com uma temperatura de hibridação ao redor de 42 °C), e condições de lavagem ao redor de 60 °C, em citrato de sódio padrão 0,5 x, dodecil sulfato de sódio a 0,1 %. Geralmente, as condições altamente severas são definidas como condições de hibridação como acima, mas com lavagem em aproximadamente 68 °C, citrato de sódio padrão 0,2 x, dodecil sulfato de sódio a 0,1 %. SSPE (1 x SSPE é cloreto de sódio 0,15 M, fosfato de sódio 10 mM, e ácido etilenodiaminotetracético 1,25 mM, pH 7,4) pode ser substituído por Citrato de Sódio Padrão (citrato de sódio padrão 1x é o cloreto de sódio 0,15 M e citrato de sódio 15 mM) nos tampões de hibridação e lavagem; as lavagens são executadas durante 15 minutos logo que a hibridação estiver completa. Deve ficar entendido que a temperatura de lavagem e a concentração de sal de lavagem podem ser ajustadas como necessário para atingir um grau desejado de estringência através da aplicação dos princípios básicos que controlam as reações de hibridação e a estabilidade duplex, como é conhecida por aqueles versados na técnica e descrita mais abaixo (ver, por exemplo, Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y). Quando a hibridação de um polinucleotídeo em um polinucleotídeo alvo de sequência desconhecida, a extensão híbrida é considerada de ser aquela do polinucleotídeo de hibridação. Quando os polinucleotídeos de sequência conhecida são hibridados, a extensão híbrida pode ser determinada pelo alinhando das sequências dos polinucleotídeos e identificação da região ou regiões de complementaridade de sequência ideal. A temperatura de hibridação para híbridos antecipados de serem menor do que 50 pares de bases de comprimento deve ser de 5 a 10 °C menos do que a temperatura de fusão do híbrido, onde a temperatura de fusão é determinada de acordo com as seguintes equações. Para híbridos menores do que 18 pares de bases de comprimento, a temperatura de fusão (°C) = 2 (número de bases A + T) + 4 (número de bases G + C). Para híbridos acima de 18 pares de bases de comprimento, a temperatura de fusão (° C) = 81,5 + 16,6 (log10 [Na+]) + 0,41 (% G + C) - (600/N), onde N é o número de bases no híbrido, e [Na+] é a concentração de íons de sódio no tampão de hibridação ([Na+] para citrato de sódio padrão 1x = 0,165M). Tipicamente, cada tal polinucleotídeo de hibridação possui um comprimento que é pelo menos 25 % (normalmente pelo menos 50 %, 60 %, ou 70 %, e mais habitualmente pelo menos 80 %) do comprimento de um polinucleotídeo ao qual ele hibrida, e possui pelo menos 60 % de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) com um polinucleotídeo ao qual ele hibrida.

[0073] Ficará entendido pela pessoa versada na técnica, qye um DNA linear possui duas orientações possíveis: a direção 5’ a 3’ e a direção 3’ a 5’. Por exemplo, se uma sequência de referência for posicionada na dureção 5’ a 3’, e se uma segunda sequência for posicionada na direção 5’ a 3’ dentro da mesma molécula/filamento de polinucleotídeo, então a sequência de referência e a segunda sequência são orientadas na mesma direção, ou possuem a mesma orientação. Tipicamente, uma sequência de promotor e um gene de interesse sob a regulação do dado promotor são posicionados na mesma orientação. No entanto, no que diz respeito à sequência de referência posicionada na direção 5’ a 3’, se uma segunda sequência for posicionada na direção 3’ a 5’ dentro da mesma molécula/filamento de polinucleotídeo, então a sequência de referência e a segunda sequência são orientadas na direção anti-sentido, ou possuem a orientação anti-sentido. Duas sequências tendo orientações anti-sentido em relação entre si podem ser alternativamente descritas como tendo a mesma orientação, se a sequência de referência (direção 5’ a 3’) e a sequência complementar inversa da sequência de referência (sequência de referência posicionada na 5’ a 3’) forem posicionadas dentro da mesma molécula/filamento de polinucleotídeo. As sequências aqui apresentadas são apresentdas na direção 5’ a 3’. os constructos recombinantes aqui proporcionadas podem ser utilizadas para transformar as plantas ou células vegetais, a fim de modular a expressão de proteína ou os níveis de atividade. Um constructo de polinucleotídeo recombinante pode compreender um polinucleotídeo que codifica um ou mais polinucleotídeos como aqui descritos, ligado operativamente a uma região reguladora adequada para a expressão do polipeptídeo na planta ou célula vegetal. Assim, um polinucleotídeo pode compreender uma sequência de codificação que codifica o polipeptídeo como aqui descrito. As plantas em que os níveis de expressão ou atividade de proteína são modulados podem incluir plantas mutantes, plantas de ocorrência não natural, plantas transgênicas, plantas artificiais ou plantas geneticamente planejadas. Adequadamente, a planta transgênica compreende um genoma que foi alterado pela integração estável de DNA recombinante. O DNA recombinante inclui DNA que foi geneticamente planejado e construído fora de uma célula e inclui DNA contendo DNA ou cDNA de ocorrência natural ou DNA sintético. Uma planta transgênica pode incluir uma planta regenerada a partir de uma célula vegetal originalmente transformada e plantas transgênicas progênies das gerações posteriores ou produtos híbridos de uma planta transformada.

[0074] O polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo recombinante pode ser um polipeptídeo nativo, ou pode ser heterólogo em relação à célula. Em alguns casos, o constructo recombinante contém um polinucleotídeo que modula a expressão, operativamente ligado a uma região reguladora. Exemplos de regiões reguladoras adequadas são aqui descritas.

[0075] Vetores contendo constructos de polinucleotídeo recombinante tais como aqueles aqui descritos também são fornecidos. As cadeias principais de vetor adequadas incluem, por exemplo, aquelas utilizadas rotineiramente na técnica tais como plasmídeos, vírus, cromossomas artificiais, cromossomas artificiais bacterianos, cromossomas artificiais de levedura, ou cromossomas artificiais bacteriófagos. Os vetores de expressão adequados incluem, sem limitação, plasmídeos e vetores virais derivados de, por exemplo, bacteriófago, baculovírus e retrovírus. Numerosos vetores e sistemas de expressão são comercialmente disponíveis.

[0076] Os vetores também podem incluir, por exemplo, origens de replicação, regiões ou marcadores de ligação andaimes. Um gene marcador pode conferir um fenótipo selecionável em uma célula vegetal. Por exemplo, um marcador pode conferir resistência a biocida, tal como resistência a um antibiótico (por exemplo, canamicina, G418, bleomicina, ou higromicina), ou a um herbicida (por exemplo, glifosato, clorsulfuron ou fosfinotricina). Além disso, um vetor de expressão pode incluir uma sequência de rótulo designada para facilitar a manipulação ou a detecção (por exemplo, purificação ou localização) do polipeptídeo expresso. As sequências de rótulo, tais como as sequências de luciferase, beta-glucuronidase, proteína fluorescente verde, glutationa S-transferase, poli-histidina, c-myc ou hemaglutinina, tipicamente são expressas como uma fusão com o polipeptídeo codificado. Tais rótulos podem ser inseridos em qualquer lugar dentro do polipeptídeo, incluindo no terminal carboxila ou amino.

[0077] Uma planta ou célula vegetal pode ser transformada por ter o polinucleotídeo recombinante integrado no seu genoma para tornar- se estavelmente transformada. A planta ou célula vegetal aqui descrita pode, portanto, ser transformada de forma estável. As células transformadas de forma estável tipicamente retêm o polinucleotídeo introduzido com cada divisão celular. Uma planta ou célula vegetal também pode ser transitoriamente transformadas de tal modo que o polinucleotídeo recombinante não é integrado no seu genoma. As células transitoriamente transformadas tipicamente perdem toda ou uma parte do polinucleotídeo recombinante introduzido em cada divisão celular de tal modo que o polinucleotídeo recombinante introduzido não pode ser detectado nas células filhas após um número suficiente de divisões celulares.

[0078] Vários métodos são disponíveis na técnica para a transformação de uma célula vegetal, os quais são todos aqui incluídos, incluindo as técnicas de pistola biolística de genes, transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada pelo vetor viral e eletroporação. O sistema Agrobacterium para a integração de DNA estranho nos cromossomos de plantas tem sido amplamente estudado, modificado e explorado pela engenharia genética de plantas. As moléculas de DNA recombinantes desprotegidas compreendendo as sequências de DNA correspondentes à proteína de tabaco purificada objeto operativamente ligadas, na orientação sentido ou anti-sentido, para as sequências regulatórias são unidas às sequências de T-DNA apropriadas por métodos convencionais. Estas são introduzidas nos protoplastos de tabaco por técnicas de polietileno glicol ou por técnicas de eletroporação, ambas das quais são padrão. Alternativamente, tais vetores compreendendo as moléculas de DNA recombinantes que codificam a proteína de tabaco purificada objeto são introduzidos nas células de Agrobacterium vivas, que depois transferem o DNA para dentro das células vegetais de tabaco. A transformação por DNA desprotegido sem o acompanhamento das sequências de vetor de T- DNA pode ser executada por meio da fusão de protoplastos de tabaco com lipossomas contendo DNA ou através da eletroporação. O DNA desprotegido desacompanhado pelas sequências do vetor de T-DNA também pode ser usado para transformar as células de tabaco através de microprojéteis inertes de alta velocidade.

[0079] Se uma célula ou tecido cultivado for usado como o tecido receptor para a transformação, as plantas podem ser regeneradas a partir das culturas transformadas se desejável, por técnicas conhecidas daqueles versados na técnica.

[0080] A escolha das regiões reguladoras a serem incluídas em um constructo recombinante depende de vários fatores, incluindo, mas não limitado a estes, eficiência, seletividade, inducibilidade, nível de expressão desejado, e expressão preferencial de célula ou tecido. É uma matéria de rotina para uma pessoa de habilidade na técnica para modular a expressão de uma sequência de codificação através da seleção apropriada e posicionamento das regiões reguladoras em relação à sequência de codificação. A transcrição de um polinucleotídeo pode ser modulada de uma maneira semelhante. Algumas regiões reguladoras adequadas iniciam apenas a transcrição, ou predominantemente, em certos tipos de células. Os métodos para a identificação e caracterização das regiões reguladoras no DNA genômico das plantas são conhecidos na técnica.

[0081] Os promotores adequados incluem promotores específicos de tecido reconhecidos por fatores específicos do tecido presentes em diferentes tecidos ou tipos de célula (por exemplo, promotores específicos da raiz, promotores específicos dos brotos, promotores específicos da xilema), ou presentes durante os diferentes estágios de desenvolvimento, ou presentes em resposta às diferentes condições ambientais. Os promotores adequados incluem promotores constitutivos que podem ser ativados na maior parte dos tipos de células sem requerer indutores específicos. Exemplos de promotores adequados para o controle da produção de polipeptídeo RNAi incluem o vírus mosaico da couve-flor 35S (CaMV/35S), SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nas ou promotores de ubiquitina ou faseolina. As pessoas versadas na técnica são capazes de gerar múltiplas variações de promotores recombinantes.

[0082] Os promotores específicos do tecido são elementos de controle da transcrição que são apenas ativos em células ou tecidos particulares em momentos específicos durante o desenvolvimento de plantas, tais como em tecidos vegetativos ou tecidos reprodutivos. A expressão específica de tecido pode ser vantajosa, por exemplo, quando a expressão de polinucleotídeos em determinados tecidos é preferível. Exemplos de promotores específicos de tecidos sob controle do desenvolvimento incluem promotores que podem iniciar a transcrição apenas (ou principalmente apenas) em determinados tecidos, tais como tecidos vegetativos, por exemplo, raízes ou folhas, ou tecidos reprodutivos, tais como as frutas, óvulos, sementes, pólen, pistolas, flores ou qualquer tecido embrionário. Os promotores específicos do tecido reprodutivo podem ser, por exemplo, específicos das anteras, específicos dos óvulos, específicos do embrião, específicos do endosperma, específicos do tegumento, específicos da semente e casca da semente, específicos do pólen, específicos das pétalas, específicos das sépalas, ou suas combinações.

[0083] Os promotores específicos da folha adequados incluem piruvato, promotor de ortofosfato dicinase (PPDK), da planta C4 (milho), promotor de cab-m1Ca+2 do milho, promotor genético relacionado com Arabidopsis thaliana myb (Atmyb5), os promotores de ribulose bifosfato carboxilase (RBCS) (por exemplo, os genes RBCS1, RBCS2 e RBCS3A do tomate expressos nas folhas e mudas de cultivo com luz, RBCS1 e RBCS2 expressos no desenvolvimento dos frutos do tomateiro ou promotor da ribulose bisfosfato carboxilase expresso quase exclusivamente nas células mesófilas nas lâminas foliares e bainhas foliares em níveis elevados).

[0084] Os promotores específicos de senescência adequados incluem um promotor de tomate ativo durante o amadurecimento, senescência e abscisão de folhas, um promotor de milho do gene que codifica uma cisteína protease. Os promotores específicos das anteras adequados podem ser utilizados. Os promotores preferidos de raiz adequados conhecidos das pessoas versadas na técnica podem ser selecionados. Os promotores preferidos de sementes adequados incluem tanto os promotores específicos da semente (aqueles promotores ativos durante o desenvolvimento da semente tais como os promotores de proteínas de armazenamento da semente) e promotores de germinação da sementes (aqueles promotores ativos durante a germinação das sementes). Tais promotores preferidos de semente incluem, mas não são limitados a estes, Cim1 (mensagem induzida por citocinina); cZ19B1 (milho 19 kDa zeína); milps (mio-inositol-1-fosfato- sintase); mZE40-2, também conhecido como ZM-40; nuclc; e celA (celulose sintase). A gama-zeína é um promotor específico do endosperma. Glob-1 é um promotor específico do embrião. Para dicotiledôneas, os promotores específicos da semente incluem, mas não são limitados a estes, beta-faseolina do feijão, napina, β- conglicinina, lecitina de soja, cruciferina, e outros mais. Para as monocotiledônias, os promotores específicos de sementes incluem, mas não são limitados a estes, um promotor de milho 15 kDa zeína, um promotor de 22 kDa zeína, um promotor de 27 kDa zeína, um promotor de g-zeína, um promotor de 27 kDa gama-zeína (tal como o promotor de gzw64A, ver o número de acesso GenBank S78780), um promotor ceráceo, um promotor encolhido 1, um promotor encolhido 2, um promotor de globulina 1 (ver número de acesso GenBank L22344), um promotor de Itp2, promotor de cim1, promotores end1 e end2 do milho, promotor de nuc1, promotor de Zm40, eep1 e eep2; lec1, promotor de tiorredoxina H; promotor de mlip15, promotor de PCNA2; e o promotor encolhido 2.

[0085] Exemplos de promotores induzíveus incluem os promotores responsivos ao ataque patogênico, às condições anaeróbicas, à temperatura elevada, à luz, à estiagem, temperatura fria, ou alta concentração de sal.

[0086] Os promotores induzíveis patogênicos incluem aqueles de proteínas relacionadas com a patogênese (proteínas PR), que são induzidos após a infecção por um agente patogênico (por exemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanase, quitinase).

[0087] Além dos promotores vegetais, outros promotores adequados podem ser derivados de origem bacteriana para o exemplo, para o promotor de octopina sintetase, para o promotor de nopalina sintetase e outros promotores derivados de plasmídeos Ti), ou podem ser derivados de promotores virais (por exemplo, promotores 35S e 19S RNA do vírus do mosáico da couve-flor (CaMV), promotores constitutivos do vírus do mosáico de tabaco, promotores do vírus do mosáico da couve-flor (CaMV) 19S e 35S, ou promotor do vírus do mosáico 35S da escrofulária). O termo "polipeptídeo de NtABA4" refere- se a um polipeptídeo que codifica a assim chamada "neoxantina sintase" de Nicotiana tabacum e inclui outras variantes de polipeptídeo compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácido codificada por uma variante de polinucleotídeo com pelo menos cerca de 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou uma variante de polinucleotídeo com pelo menos cerca de 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6; uma variante de polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 ou uma variante de polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID No. 7; fragmentos do polipeptídeo de NtABA4 da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7; e fragmentos da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7, que têm pelo menos cerca de 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % a 96%, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com os fragmentos correspondentes da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7, respectivamente. O polipeptídeo de NtABA4 também inclui as sequências compreendendo um grau suficiente ou substancial de identidade ou similaridade com a SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7 para funcionar como uma neoxantina sintase. Os fragmentos do polipeptídeo de NtABA4 tipicamente retêm a atividade da neoxantina sintase. Os polipeptídeos de NtABA4 também incluem mutantes produzidos pela introdução de qualquer tipo de alterações (por exemplo, inserções, anulações ou substituições de aminoácidos; mudanças nos estados de glicosilação; mudanças que afetam a duplicação ou isomerizações, estruturas tridimensionais, ou estados de auto-associação), que podem ser deliberadamente manipuladas ou isoladas naturalmente contanto que elas ainda funcionem como uma neoxantina sintase. Os polipeptídeos de NtABA4 podem estar na forma linear ou ciclizada utilizando métodos conhecidos. O termo "polipeptídeo de NtABA4"também pode referir-se a um polipeptídeo codificado pela SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 6 que possui 100 % de identidade de sequência com ele ou um polipeptídeo compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente da sequência apresentada na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7 que possui 100 % de identidade de sequência com esta.

[0088] O termo "polipeptídeo de NtNeSy" refere-se a um polipeptídeo que codifica o licopeno beta ciclase de Nicotiana tabacum e inclui outras variantes de polipeptídeo compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácido codificada por um polinucleotídeo com pelo menos cerca de 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; uma variante de polipeptídeo que possui pelo menos 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; fragmentos do polipeptídeo de NtNeSy da SEQ ID NO: 9; e fragmentos de SEQ ID NO: 9 que possuem pelo menos cerca de 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com os fragmentos correspondentes da SEQ ID NO: 9. Os polipeptídeos de NtNeSy também incluem sequências compreendendo um grau de identidade suficiente ou substancial ou similaridade com a SEQ ID NO: 9 para funcionar como uma licopeno beta ciclase. Os fragmentos do polipeptídeo de NtNeSy tipicamente retêm a atividade licopeno beta ciclase. Os polipeptídeos de NtNeSy também incluem variantes e mutantes produzidos através da introdução de qualquer tipo de alterações (por exemplo, inserções, anulações ou substituições de aminoácidos; alterações nos estados de glicosilação; alterações que afetam a reduplicação ou isomerizações, estruturas tridimensionais ou estados de auto-associação), que podem ser deliberadamente planejadas ou isoladas naturalmente contanto que elas ainda funcionem como uma licopeno beta -ciclase. Os polipeptídeos de NtNeSy pode estar na forma linear ou ciclizada utilizando métodos conhecidos. O termo "polipeptídeo de NtNeSy"também pode referir-se a um polipeptídeo compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente da sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 com 100 % de identidade de sequência com esta.

[0089] O termo "polipeptídeo de NtNCED2" refere-se a um polipeptídeo que codifica 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase de Nicotiana tabacum e inclui um polipeptídeo compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácido codificada por um polinucleotídeo com 100 % de de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; ou uma variante de polipeptídeo compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácido codificada por um polinucleotídeo com pelo menos cerca de 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. Os fragmentos do polipeptídeo de NtNCED2 também são incluídos que tipicamente retêm a atividade de 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase. Os polipeptídeos de NtNCED2 também incluem as variantes e mutantes produzidos através da introdução de qualquer tipo de alterações (por exemplo, inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos; alterações nos estados de glicosilação; alterações que afetam o redobramento ou as isomerizações, estruturas tridimensionais, ou estados de auto- associação), que podem ser deliberadamente planejadas ou isoladas naturalmente contanto que elas ainda funcionem como uma 9-cis- epoxicarotenoide dioxigenase. Os polipeptídeos de NtNCED2 podem estar na forma linear ou ciclizada utilizando métodos conhecidos.

[0090] Em outro aspecto, é fornecido um polipeptídeo isolado compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de polinucleotídeo tendo pelo menos 60 % de identidade de sequência à qualquer das sequências aqui descritas, incluindo qualquer um dos polipeptídeos mostrados na listagem de sequências. Adequadamente, o polipeptídeo isolado compreende, consiste ou consiste essencialmente de uma sequência tendo pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com esta.

[0091] Os polipeptídeos incluem as variantes produzidas pela introdução de qualquer tipo de alterações (por exemplo, inserções, anulações ou substituições de aminoácidos; alterações nos estados de glicosilação, alterações que afetam o redobramento ou as isomerizações, estruturas tridimensionais, ou estados de auto- associação), que podem ser deliberadamente planejadas ou isoladas naturalmente. A variante pode ter alterações que produzem uma alteração silenciosa e resultam em uma proteína funcionalmente equivalente. As substituições de aminoácido deliberadas podem ser efetuadas com base na semelhança de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e a natureza anfipática dos resíduos, contanto que a atividade de ligação secundária da substância seja retida. Por exemplo, os aminoácidos negativamente carregados incluem ácido aspártico e ácido glutâmico; os aminoácidos positivamente carregados incluem lisina e arginina; e os aminoácidos com grupos superiores polares não carregados tendo valores de hidrofilicidade semelhantes incluem leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina e tirosina. As substituições conservadoras podem ser executadas, por exemplo, de acordo com a Tabela abaixo. Os aminoácidos no mesmo bloco na segunda coluna e preferivelmente na mesma linha na terceira coluna podem ser substituídos entre si:

[0092] O polipeptídeo pode ser uma proteína madura ou uma proteína imatura ou uma proteína derivada de uma proteína imatura. Os polipeptídeos podem estar na forma linear ou ciclizada usando os métodos conhecidos. Os polipeptídeos tipicamente compreendem pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, ou pelo menos 40 aminoácidos contíguos.

[0093] Em uma modalidade, é fornecido um polipeptídeo de NtABA4 isolado compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência que codifica uma neoxantina sintase e tendo pelo menos cerca 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 ou cerca de 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7.

[0094] Em outra modalidade, é fornecidos um polipeptídeo de NtNeSy isolado compreendendo, consistindo, ou consistindo essencialmente em uma sequência que codifica uma licopeno beta ciclase e tendo pelo menos cerca 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade sequência com a SEQ ID NO: 9.

[0095] Em outra modalidade, é fornecidos um polipeptídeo de NtNCED2 isolado codificado pelo polinucleotídeo de NtNCED2 que é aqui descrito.

[0096] Os fragmentos das sequências de polipeptídeo também são aqui divulgados, adequadamente, tais fragmentos retêm a atividade da sequência de comprimento total.

[0097] As variantes de polipeptídeo mutantes podem ser utilizadas para criar plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas (por exemplo, plantas mutantes, de ocorrência não natural, transgênicas, sintéticas ou geneticamente planejadas) compreendendo uma ou mais variantes de polipeptídeo mutantes. Adequadamente, as variantes de polipeptídeo mutantes retêm a atividade do polipeptídeo não modificado. A atividade da variante de polipeptídeo mutante pode ser superior, inferior ou quase a mesma como o polipeptídeo não modificado.

[0098] As mutações nas sequências de nucleotídeo e polipeptídeos aqui descritos podem incluir mutações feitas pelo homem ou mutações sintéticas ou mutações geneticamente planejadas. As mutações nas sequências de nucleotídeo e polipeptídeos aqui descritos podem ser mutações que são obtidas ou obteníveis através de um processo que inclui uma etapa de manipulação in vitro ou in vivo. As mutações nas sequências de nucleotídeo e os polipeptídeos aqui descritos podem ser mutações que são obtidas ou obteníveis através de um processo que inclui a intervenção pelo homem. Por meio de exemplo, o processo pode incluir a mutagênese utilizando produtos químicos adicionados de mofo exógeno - tais como compostos orgânicos mutagênicos, teratogênicos ou carcinogênicos, por exemplo, metanossulfonato de etila (EMS), que produzem mutações aleatórias no material genético. Por meio de outro exemplo, o processo pode incluir uma ou mais etapas de engenharia genética - tais como uma ou mais das etapas de engenharia genética que são aqui descritas ou suas combinações. A título de exemplo adicional, o processo pode incluir um ou mais etapas de cruzamento de plantas.

[0099] Como aqui utilizado, o termo ‘ocorrência não natural’ significa que a entidade - tal como o polipeptídeo, o polinucleotídeo ou a planta e outros mais não é encontrada na natureza e, portanto, expressamente exclui as entidades que existem na natureza. Tais entidades de ocorrência não natural podem ser estruturalmente modificadas, sintetizadas ou manipuladas pelo homem. Em certas modalidades, uma mutação não é uma mutação de ocorrência natural que existe naturalmente em uma sequência de nucleotídeo ou um polipeptídeo - tal como um gene ou uma proteína.

[00100] Um polipeptídeo pode ser preparado através do cultivo de células hospedeiras transformadas ou recombinantes sob condições de cultura adequadas para expressar um polipeptídeo. O polipeptídeo expresso resultante pode então ser purificado a partir de tal cultura utilizando processos de purificação conhecidos. A purificação do polipeptídeo pode incluir uma coluna de afinidade contendo agentes que se ligam ao polipeptídeo; uma ou mais etapas de coluna em tais resinas de afinidade; uma ou mais etapas que envolvem a cromatografia de interação hidrofóbica; ou cromatografia de imunoafinidade. Alternativamente, o polipeptídeo também pode ser expresso em uma forma que irá facilitar a purificação. Por exemplo, pode ser expresso como um polipeptídeo de fusão, tal como aqueles do polipeptídeo de ligação de maltose, glutationa-5-transferase ou tiorredoxina. Os kits para a expressão e purificação de polipeptídeos de fusão são comercialmente disponíveis. O polipeptídeo pode ser marcado com um epítopo e subsequentemente purificado utilizando um anticorpo específico direcionado para tal epítopo. Uma ou mais etapas de cromatografia líquida - tal como a cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa pode ser empregada para purificar ainda mais o polipeptídeo. Algumas ou todas as etapas de purificação anteriores, em várias combinações, podem ser empregadas para fornecer um polipeptídeo recombinante substancialmente homogêneo. O polipeptídeo assim purificado pode ser substancialmente livre de outros polipeptídeos e é aqui definido como um "polipeptídeo substancialmente purificado"; tais polipeptídeos purificados incluem polipeptídeos, fragmentos, variantes, e outros mais.

[00101] A Expressão, isolamento e purificação dos polipeptídeos e fragmentos podem ser executados por qualquer técnica adequada, incluindo, mas não limitada aos métodos aqui descritos.

[00102] Também é possível utilizar uma coluna de afinidade tal como um anticorpo monoclonal gerado contra polipeptídeos, para purificar por afinidade os polipeptídeos expressos. Estes polipeptídeos podem ser removidos a partir de uma coluna de afinidade utilizando técnicas convencionais, por exemplo, em um tampão de eluição de sal superior e depois submetidos a diálise em um tampão de sal inferior para uso ou através da alteração do pH ou outros componentes dependendo da matriz de afinidade utilizada, ou ser competitivamente removidos utilizando o substrato de ocorrência natural do componente de afinidade.

[00103] Um polipeptídeo também pode ser produzido pela síntese química convencional conhecida. Os métodos para o constructo dos polipeptídeos ou seus fragmentos por meios sintéticos são conhecidos daqueles versados na técnica. As sequências de polipeptídeo sinteticamente construídas, em virtude das características estruturais ou conformacionais primárias, secundárias ou terciárias de divisão com polipeptídeos nativos, podem possuir propriedades biológicas em comum entre si, incluindo a atividade biológica.

[00104] O termo "de ocorrência não natural" como aqui utilizado, descreve uma entidade (por exemplo, um polinucleotídeo, uma mutação genética, um polipeptídeo, uma planta, uma célula vegetal e material vegetal) que não é formada pela natureza ou que não existe na natureza. Tais entidades de ocorrência não natural ou entidades artificiais podem ser produzidas, sintetizadas, iniciadas, modificados, intervidas ou manipuladas por métodos aqui descritos ou que são conhecidos na técnica. Assim, por meio de exemplo, uma planta de ocorrência não natural, uma célula vegetal de ocorrência não natural ou material vegetal ocorrência não natural pode ser produzido utilizando técnicas tradicionais de reprodução de plantas - tais como retrocruzamento - ou por tecnologias de manipulação genética - tais como o RNA anti-sentido, RNA interferente, meganuclease e outros mais. A título de outro exemplo, uma planta de ocorrência não natural, uma célula vegetal de ocorrência não natural ou material vegetal de ocorrência não natural pode ser produzido pela introgressão ou através da transferência de um ou mais mutações genéticas (por exemplo, um ou mais polimorfismos) a partir de uma primeira planta ou célula vegetal em uma segunda planta ou célula vegetal (que por si só pode ser de ocorrência natural), de tal modo que a planta, célula vegetal ou material vegetal resultante ou a sua prole compreende uma constituição genética (por exemplo, um genoma, um cromossoma, ou um segmento deste) que não é formada por natureza ou que não existe na natureza. A planta, célula vegetal ou material vegetal é, portanto, artificial ou de ocorrência não natural. Consequentemente, uma planta ou célula vegetal artificial ou de ocorrência não natural pode ser produzida através da modificação de uma sequência genética em uma primeira planta ou célula vegetal de ocorrência natural, mesmo que a sequência genética resultante ocorra naturalmente em uma segunda planta ou célula vegetal que compreende uma formação genética diferente da primeira planta ou célula vegetal. Diferenças na formação genética podem ser detectadas por diferenças fenotípicas ou por técnicas de biologia molecular conhecidas na técnica - tais como o sequenciamento de ácido nucleico, a presença ou ausência de marcadores genéticos (por exemplo, marcadores microssatélites de RNA). Os anticorpos que são imunorreativos com os polipeptídeos NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 aqui descritos também são fornecidos. Os polipeptídeos, fragmentos, variantes, polipeptídeos de fusão, e outros mais, como aqui apresentados, podem ser empregados como "imunógenos" na produção de anticorpos imunorreativos com eles. Tais anticorpos podem ligar-se especificamente ao polipeptídeo através dos sítios de ligação ao antígeno do anticorpo. Especificamente os anticorpos de ligação são aquelas que irão reconhecer e se ligar especificamente com um polipeptídeo, homólogos e variantes, mas não com outras moléculas. Em uma modalidade, os anticorpos são específicos para os polipeptídeos tendo uma sequência de aminoácido como aqui apresentada e não reagem de forma tranversal com outros polipeptídeos.

[00105] Mais especificamente, os polipeptídeos, fragmentos, variantes, polipeptídeos de fusão, e outros mais contêm determinantes antigênicos ou epítopos que extraem a formação de anticorpos. Esses determinantes antigênicos ou epítopos podem ser quer lineares ou conformacionais (descontínuos). Os epítopos lineares são compostos de uma única seção de aminoácidos do polipeptídeo, enquanto que os epítopos conformacional ou descontínuos são compostos de seções de aminoácido de diferentes regiões da cadeia de polipeptídeo que são levados em proximidade após a dobradura de polipeptídeo. Os epítopos podem ser identificados por qualquer um dos métodos conhecidos na técnica. Além disso, os epítopos dos polipeptídeos podem ser utilizados como reagentes de pesquisa, em ensaios, e para purificar os anticorpos de ligação específicos das substâncias tais como soros policlonais ou sobrenadantes de hibridomas cultivados. Tais epítopos ou variantes destes podem ser produzidos utilizando técnicas conhecidas no ofício como a síntese em fase sólida, clivagem química ou enzimática de um polipeptídeo, ou utilizando a tecnologia de DNA recombinante.

[00106] Os anticorpos tanto policlonais quanto monoclonais para os polipeptídeos podem ser preparados por técnicas convencionais. As linhagens celulares de hibridoma que produzem anticorpos monoclonais específicos para os polipeptídeos também são aqui contemplados. Tais hibridomas podem ser produzidos e identificados por técnicas convencionais. Para a produção de anticorpos, vários animais hospedeiros podem ser imunizados por injeção com um polipeptídeo, fragmento, variante, ou seus mutantes. Tais animais hospedeiros podem incluir, mas não são limitados a estes, coelhos, camundongos e ratos, para designar alguns. Vários adjuvantes podem ser utilizados para aumentar a resposta imunológica. Dependendo das espécies de hospedeiro, tais adjuvantes incluem, mas não estão limitados a estes, adjuvante de Freund (completo e incompleto), géis minerais tais como hidróxido de alumínio, substâncias tensoativas tais como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões oleosas, hemocianina de lapa, dinitrofenol, e adjuvantes humanos potencialmente úteis tais como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum. Os anticorpos monoclonais podem ser recuperados por técnicas convencionais. Tais anticorpos monoclonais podem ser de qualquer classe de imunoglobulina incluindo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD e qualquer subclasse destas.

[00107] Os anticorpos também podem ser usados em ensaios para detectar a presença dos polipeptídeos ou fragmentos, in vitro ou in vivo. Os anticorpos também podem ser empregados na purificação de polipeptídeos ou fragmentos por cromatografia de imunoafinidade.

[00108] As composições que podem modular (por exemplo, aumentar) a expressão ou a atividade de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 (ou uma combinação de dois ou mais ou três ou mais destes) incluem, mas são

[00109] não são limitadas a estas, polinucleotídeos específicos da sequência que podem interferir com a transcrição de um ou mais genes endógenos; polinucleotídeos específicos da sequência que podem interferir com a translação de transcritos de RNA (por exemplo, RNAs de filamento duplo, siRNAs, ribozimas); polipeptídeos específicos da sequência que podem interferir com a estabilidade de uma ou mais proteínas; polinucleotídeos específicos da sequência que podem interferir com a atividade enzimática de uma ou mais proteínas ou a atividade de ligação de uma ou mais proteínas em relação aos substratos ou proteínas reguladoras; anticorpos que apresentam especificidade para uma ou mais proteínas; compostos de moléculas pequenas que podem interferir com a estabilidade de uma ou mais proteínas ou a atividade enzimática de uma ou mais proteínas ou a atividade de ligação de uma ou mais proteínas; proteínas ligador de zinco que ligam um ou mais polinucleotídeos; e meganucleases que têm atividade para um ou mais polinucleotídeos. As tecnologias de edição do gene, as tecnologias de edição genética e as tecnologias de edição do genoma são bem conhecidas na técnica.

[00110] A tecnologia anti-sentido é aquele método bem conhecido que pode ser utilizado para modular a expressão de um polipeptídeo. Um polinucleotídeo do gene a ser reprimido é clonado e operacionalmente ligado a uma região reguladora e uma sequência de terminação da transcrição, de modo que o filamento anti-sentido de RNA é transcrito. o constructo recombinante é então transformada em plantas e o filamento anti-sentido de RNA é produzido. O polinucleotídeo não necessita ser a sequência completa do gene para ser reprimido, mas tipicamente será substancialmente complementar a pelo menos uma parte do filamento sentido do gene a ser reprimido.

[00111] Um polinucleotídeo pode ser transcrito em uma ribozima, ou RNA catalítico, que afeta a expressão de um mRNA. As ribozimas podem ser designadas para especificamente emparelhar com praticamente qualquer RNA alvo e clivar a formação de fosfodiéster em um local específico, inativando assim funcionalmente o RNA alvo. Os polinucleotídeos heterólogos podem codificar as ribozimas designadas para clivar os transcritos particulares de mRNA, evitando assim a expressão de um polipeptídeo. As ribozimas cabeça de martelo são úteis para a destruição de mRNAs particulares, embora várias ribozimas que clivam o mRNA nas sequências de reconhecimento específicas do sítio possam ser usadas. As ribozimas cabeça de martelo clivam os mRNAs em locais ditados pelas regiões de flanqueamento que formam pares de base complementares com o mRNA alvo. O único requisito é que o RNA alvo contenha uma sequência de nucleotídeo 5’-UG-3’. o constructo e produção de ribozimas cabeça de martelo é conhecida na técnica. As sequências de ribozima cabeça de martelo podem ser incorporadas em um RNA estável tal como um RNA de transferência (tRNA) para aumentar a eficiência de clivagem in vivo.

[00112] Em uma modalidade, o polinucleotídeo específico da sequência que pode interferir com a translação dos transcritos de RNA é o RNA interferente. A interferência de RNA ou silenciamento de RNA é um processo evolutivamente conservado pelo qual os mRNAs específicos podem ser direcionados para a degradação enzimática. Um RNA de filamento duplo (RNA de filamento duplo) é introduzido ou produzido por uma célula (por exemplo, vírus de RNA de filamento duplo, ou polinucleotídeos de RNA interferentes) para iniciar a via de RNA interferente. O RNA de filamento duplo pode ser convertido em múltiplos duplex pequenos de RNA interferente de comprimento de 21 a 23 bp por RNases III, que são endonucleases específicas do RNA de filamento duplo. Os pequenos RNAs interferentes podem ser subsequentemente reconhecidos por complexos de silenciamento induzidos por RNA que promovem o desenrolamento do pequeno RNA interferente através de um processo dependente de ATP. O filamento anti-sentido desenrolado do pequeno RNA interferente orienta os complexos de silenciamento induzidos por RNA ativados para o mRNA alvo que compreende uma sequência complementar ao filamento anti- sentido de RNA interferente pequeno. O mRNA direcionado e o filamento anti-sentido podem formar uma forma de hélice A, e o sulco principal da forma de hélice A pode ser reconhecido pelos complexos de silenciamento induzidos por RNA ativados. O mRNA alvo pode ser clivada pelos complexos de silenciamento induzidos por RNA ativados em um único sítio definido pelo sítio de ligação da extremidade 5’ do filamento de RNA interferente pequeno. Os complexos de silenciamento induzidos por RNA ativados podem ser reciclados para catalisar um outro evento de clivagem.

[00113] Os vetores de expressão de RNA interferente podem compreender constructos de RNA interferente que codificam os polinucleotídeos de RNA interferente que apresentam a atividade de RNA interferente através da redução do nível de expressão de mRNAs, pré-mRNAs, ou variantes relacionadas de RNA. Os vetores de expressão podem compreender um promotor colocado a montante e operativamente ligado a um constructo de RNA interferente, como ainda aqui descrito. Os vetores de expressão de RNA interferente podem compreender um promotor núcleo mínimo adequado, um constructo de RNA interferente de interesse, uma região reguladora (5’) a montante, uma região reguladora (3’) a jusante, incluindo a terminação da transcrição e sinais de poliadenilação, e outras sequências conhecidas das pessoas versadas na técnica, tais como vários marcadores de seleção.

[00114] Os polinucleotídeos podem ser produzidos de várias formas, incluindo as estruturas de filamento duplo (isto é, uma molécula de RNA de filamento duplo compreendendo um filamento anti-sentido e um filamento de sentido complementar), estruturas como grampo de cabelo de filamento duplo, ou estruturas de único filamento (isto é, uma molécula de ssRNA compreendendo apenas um filamento anti-sentido). As estruturas podem compreender um duplex, duplex assimétrico, estrutura secundária grampo de capelo ou grampo de cabelo assimétrico, tendo filamentos sentido e anti-sentido auto- complementares. O RNA interferente de filamento duplo pode ser enzimaticamente convertido em pequenos RNAs interferentes de filamento duplo. Um dos filamentos do pequeno RNA interferente duplex pode se associar com uma sequência complementar dentro do mRNA alvo e das variantes de RNA relacionado. Os pequenos RNA/mRNA interferentes dúplices são reconhecidos por complexos de silenciamento induzidos por RNA que pode clivar os RNAs em mútiplos sítios de uma maneira dependente da sequência, o que resulta na degradação do mRNA alvo e das variantes de RNA relacionados.

[00115] As moléculas de RNA de filamento duplo podem incluir pequenas moléculas de RNA interferentes montadas a partir de um único oligonucleotídeo em uma estrutura curva da haste, em que as regiões sentidos e anti-sentidos de auto-complementares da pequena molécula de RNA interferente são ligadas por meio de um ligador com base em polinucleotídeo ou com base não polinucleotídeo, assim como o RNA de único filamento circular tendo duas ou mais estruturas curvas e uma haste compreendendo filamentos sentidos e anti-sentidoss auto- complementares, em que o RNA circular pode ser processado in vivo ou in vitro para gerar uma molécula de RNA interferente pequena ativa capaz de mediar o RNA interferente.

[00116] O uso de pequenas moléculas de RNA grampo de cabelo também é contemplado. Eles compreendem uma sequência anti- sentido específica além da sequência de complemento reverso (sentido), tipicamente separada por um espaçador ou sequência em anel. A clivagem do espaçador ou anel fornece uma molécula de RNA de único filamento e o seu complemento inverso, de tal modo que eles podem se associar para formar uma molécula de RNA de filamento duplo (opcionalmente com etapas de processamento adicionais que podem resultar na adição ou remoção de um, dois, três ou mais nucleotídeos a partir da extremidade 3’ ou 5’ de um ou ambos filamentos). O espaçador pode ser de um comprimento suficiente para permitir que as sequências anti-sentido e sentido se associem e formem uma estrutura de filamento duplo (ou tronco) antes da clivagem do espaçador (e, opcionalmente, etapas de processamento subsequentes que podem resultar na adição ou remoção de um, dois, três, quatro ou mais nucleotídeos da extremidade 3’ ou da extremidade 5’ de um ou ambos filamentos). A sequência espaçadora é tipicamente uma sequência de nucleotídeo não relacionada que está situada entre duas regiões complementares de sequências de nucleotídeo que, quando associadas em um polinucleotídeo de filamento duplo, compreendem um pequeno RNA grampo de cabelo. A sequência espaçadora geralmente compreende entre cerca de 3 e cerca de 100 nucleotídeos.

[00117] Qualquer polinucleotídeo de RNA de interesse pode ser produzido pela seleção de uma composição de sequência adequada, tamanho do anel, e comprimento da haste para produzir o duplex grampo de canelo. Uma faixa adequada para a designação de comprimentos de haste de um duplex grampo de cabelo, inclui os comprimentos de haste de pelo menos cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleotídeos - tais como cerca de 14 a 30 nucleotídeos, cerca de 30 a 50 nucleotídeos, cerca de 50 a 100 nucleotídeos, cerca de 100 a 150 nucleotídeos, cerca de 150 a 200 nucleotídeos, cerca de 200 a 300 nucleotídeos, cerca de 300 a 400 nucleotídeos, cerca de 400 a 500 nucleotídeos, cerca de 500 a 600 nucleotídeos, e cerca de 600 a 700 nucleotídeos. Uma faixa adequada para designar os comprimentos de anel de um duplex grampo de cabelo, inclui comprimentos de anel de cerca de 4 a 25 nucleotídeos, cerca de 25 a 50 nucleotídeos, ou mais longo, se o comprimento da haste do duplex grampo de cabelo for substancial. Em certas modalidades, uma molécula de RNA ou ssRNA de filamento duplo está entre cerca de 15 e cerca de 40 nucleotídeos de comprimento. Em outra modalidade, a pequena molécula de RNA interferente é um molécula de RNA ou ssRNA de filamento duplo entre cerca de 15 e cerca de 35 nucleotídeos de comprimento. Em outra modalidade, a pequena molécula de RNA interferente é uma molécla de RNA ou ssRNA de filamento duplo entre cerca de 17 e cerca de 30 nucleotídeos de comprimento. Em outra modalidade, a pequena molécula de RNA interferente é uma molécula de RNA ou ssRNA de filamento duplo entre cerca de 19 e cerca de 25 nucleotídeos de comprimento. Em outra modalidade, a pequena molécula de RNA interferente é uma molécula de RNA ou ssRNA de filamento duplo entre cerca de 21 a cerca de 23 nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, as estruturas em grampo de cabelo com regiões dúplices mais longas do que 21 nucleotídeos podem promover o silenciamento direcionado pelo pequeno RNA interferente eficaz, independente da sequência e comprimento do anel.

[00118] A sequência de mRNA alvo está tipicamente entre cerca de 14 a cerca de 50 nucleotídeos de comprimento. O mRNA alvo pode, portanto, ser varrida para as regiões entre cerca de 14 e cerca de 50 nucleotídeos de comprimento que de preferência satisfazem um ou mais dos seguintes critérios para uma sequência alvo: uma relação de A + T / G+ C entre cerca de 2:1 e cerca de 1:2; um dinucleotídeo AA ou um dinucleotídeo CA na extremidade 5’ da sequência alvo; uma sequência de pelo menos 10 nucleotídeos consecutivos únicos para o mRNA alvo (isto é, a sequência não está presente em outras sequências de mRNA da mesma planta); e nenhuma "série"de mais do que três nucleotídeos de guanina (G) consecutivos ou mais do que três nucleotídeos de citosina consecutivos (C). Estes critérios podem ser avaliados utilizando várias técnicas conhecidas no ofício, por exemplo, programas de computador tais como BLAST podem ser utilizados para pesquisar as bases de dados publicamente disponíveis para determinar se a sequência alvo selecionada é única para o mRNA alvo. Alternativamente, uma sequência alvo pode ser selecionada (e uma pequena sequência de RNA interferente designada) utilizando o software de computador disponível comercialmente (por exemplo, OligoEngine, Target Finder e o Desigin Tooç de pequeno RNA interferente estão disponíveis comercialmente).

[00119] Em uma modalidade, as sequências de mRNA alvo são selecionadas que estão entre cerca de 14 e cerca de 30 nucleotídeos de comprimento que satisfazem um ou mais dos critérios acima. Em outra modalidade, as sequências alvo são selecionadas que estão entre cerca de 16 e cerca de 30 nucleotídeos de comprimento que satisfazem um ou mais dos critérios acima. Em uma outra modalidade, as sequências alvo são selecionadas que estão entre cerca de 19 e cerca de 30 nucleotídeos de comprimento que atendem um ou mais dos critérios acima.

[00120] Em outra modalidade, as sequências alvo são selecionadas que estão entre cerca de 19 e cerca de 25 nucleotídeos de comprimento que satisfazem um ou mais dos critérios acima.

[00121] Em uma modalidade exemplar, as pequenas moléculas de RNA interferentes compreendem uma sequência anti-sentido específica que é complementar a pelo menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, ou mais nucleotídeos contíguos de qualquer uma das sequências de polinucleotídeo aqui descritas.

[00122] A sequência anti-sentido específica compreendida pela pequena molécula RNA interferente pode ser idêntica ou substancialmente idêntica ao complemento da sequência alvo. Em uma modalidade, a sequência anti-sentido específica compreendida pela pequena molécula de RNA interferente é pelo menos cerca 75%, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idêntica ao complemento da sequência de mRNA alvo. Os métodos para determinar a identidade de sequência são conhecidos na técnica e podem ser determinados, por exemplo, através do uso do programa BLASTN, do software da University of Wisconsin Computer Group (GCG) ou fornecido no website da NCBI.

[00123] A sequência anti-sentido específica das pequenas moléculas de RNA interferentes pode apresentar variabilidade através da diferenciação (por exemplo, através de substituição de nucleotídeo, incluindo transição ou transversão) em um, dois, três, quatro ou mais nucleotídeos da sequência de mRNA alvo. Quando tais substituições de nucleotídeo estão presentes no filamento anti-sentido de uma molécula de RNA de filamento duplo, o nucleotídeo complementar no filamento sentido com o qual o nucleotídeo substituto tipicamente formaria emparelhamento de base da ligação de hidrogênio pode ou não ser substituído correspondentemente. As moléculas de RNA de filamento duplo em que uma ou mais substituição de nucleotídeo ocorre na sequência sentido, mas não no filamento anti-sentido, também são contempladas. Quando a sequência anti-sentido de uma pequena molécula de RNA interferente compreende um ou mais ligações imperfeitas entre a sequência de nucleotídeo do pequeno RNA interferente e a sequência de nucleotídeo alvo, como descrito acima, as ligações imperfeitas podem ser observadas no terminal 3’, no terminal 5’ ou na parte central da sequência anti-sentido.

[00124] Em outra modalidade, as pequenas moléculas de RNA interferentes compreendem uma sequência anti-sentido específica que é capaz de seletivamente hibridar sob condições rigorosas com uma parte de um gene alvo de ocorrência natural ou mRNA alvo. Como conhecido daqueles de habilidade prática na técnica, as variações na severidade das condições de hibridação podem ser alcançadas através da alteração do tempo, temperatura e concentração das soluções utilizadas para as etapas de hibridação e lavagem. As condições adequadas também podem depender, em parte, das sequências de nucleotídeo particulares utilizadas, por exemplo, a sequência de mRNA alvo ou gene.

[00125] Um método para a indução do silenciamento de RNA de filamento duplo nas plantas é a transformação com um constructo genética que produz o RNA grampo de cabelo (ver Smith et al. (2000) Nature, 407, 319-320). Tais constructos compreendem regiões invertidas da sequência do gene alvo, separadas por um espaçador apropriado. A inserção de uma região do intron da planta funcional como um fragmento espaçador adicionalmente aumenta a eficiência da indução de silenciamento do gene, devido à geração de um RNA grampo de cabelo unido ao intron (Wesley et al. (2001) Plant J., 27, 581590). Adequadamente, o comprimento da haste é de cerca de 50 nucleotídeos a cerca de 1 quilobases de comprimento. Os métodos para a produção de RNA grampo de cabelo unido ao intron são bem descritos na técnica (ver, por exemplo, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry (2008) 72, 2, 615-617). As moléculas de RNA interferente tendo uma estrutura duplex ou de filamento duplo, por exemplo, RNA de filamento duplo ou pequeno RNA grampo de cabelo, podem ter extremidades embotadas ou podem ter projeções 3’ ou 5’. Como aqui utilizado, "projeção"refere-se ao nucleotídeo ou nucleotídeos não pareados que ressaltam a partir de uma estrutura duplex quando um terminal 3’ de um filamento de RNA se estende para além do terminal 5’ do outro filamento (projeção 3’), ou vice-versa (projeção 5’). Os nucleotídeos compreendendo a projeção podem ser ribonucleotídeos, desoxirribonucleotídeos ou suas versões modificadas. Em uma modalidade, pelo menos um filamento da molécula de RNA interferente possui uma projeção 3’ de cerca de 1 a cerca de 6 nucleotídeos de comprimento. Em outras modalidades, a projeção 3’ é de cerca de 1 a cerca de 5 nucleotídeos, de cerca de 1 a cerca de 3 nucleotídeos e de cerca de 2 a cerca de 4 nucleotídeos de comprimento.

[00126] Quando a molécula de RNA interferente compreende uma projeção 3’ em uma extremidade da molécula, a outra extremidade pode ser de terminação embotada ou ter também uma projeção (5’ ou 3’). Quando a molécula de RNA interferente compreende uma projeção em ambas as extremidades da molécula, o comprimento das projeções pode ser o mesmo ou diferente. Em uma modalidade, a molécula de RNA interferente compreende projeções 3’ de cerca de 1 a cerca de 3 nucleotídeos em ambas as extremidades da molécula. Em uma outra modalidade, a molécula de RNA interferente é um RNA de filamento duplo tendo uma projeção 3’ de dois nucleotídeos em ambas as extremidades da molécula. Em mais outra modalidade, os nucleotídeos compreendendo a projeção do RNA interferentes são dinucleotídeos TT ou dinucleotídeos UU.

[00127] Quando se determina a identidade percentual da molécula de RNA interferente compreendendo uma ou mais projeções para a sequência de mRNA alvo, as projeções podem ou não ser levadas em conta. Por exemplo, os nucleotídeos de uma projeção 3’ e até 2 nucleotídeos a partir do terminal 5’ ou 3’ do filamento duplo podem ser modificados sem perda significativa da atividade da pequena molécula de RNA interferente.

[00128] As moléculas de RNA interferentes podem compreender uma ou mais estruturas de coifa 5’ ou 3’. A molécula de RNA interferente pode compreender uma estrutura de coifa na extremidade 3’ do filamento sentido, do filamento anti-sentido, ou dos filamentos tanto sentido quanto anti-sentido; ou na extremidade 5’ do filamento sentido, do filamento anti-sentido, ou dos filamentos tanto sentido quanto anti- sentido da molécula de RNA interferente. Alternativamente, a molécula de RNA interferente pode compreender uma estrutura de coifa tanto na extremidade 3’ quanto na extremidade 5’ da molécula de RNA interferente. O termo "estrutura de coifa" refere-se a uma modificação química incorporada em cada terminal de um oligonucleotídeo, o qual protege a molécula da degradação de exonuclease, e também pode facilitar a liberação ou localização dentro de uma célula.

[00129] Outra modificação aplicável às moléculas de RNA interferentes é a ligação química na molécula de RNA interferente de um ou mais componentes ou conjugados que intensificam a atividade, distribuição celular, absorção celular, biodisponibilidade ou estabilidade da molécula de RNA interferente. Os polinucleotídeos podem ser sintetizados ou modificados por métodos bem estabelecidos na técnica. As modificações químicas podem incluir, mas não são limitadas a estas, modificações 2’, introdução de bases não naturais, ligação covalente a um ligante, e a substituição de ligações de fosfato com ligações de tiofosfato. Nesta modalidade, a integridade da estrutura duplex é reforçada por pelo menos uma, e tipicamente duas, ligações químicas. A ligação química pode ser conseguida por qualquer uma de uma variedade de técnicas bem conhecidas, por exemplo, através da introdução de ligações covalentes, iônicas ou de pontes de hidrogênio; interações hidrofóbicas, interações van der Waals ou de concentração; por meio da coordenação do íon de metal, ou através do uso de análogos de purina.

[00130] Os nucleotídeos em um ou ambos dos dois filamentos únicos podem ser modificados para modular a ativação de enzimas celulares, tais como, por exemplo, sem limitação, certas nucleases.

[00131] As técnicas para reduzir ou inibir a ativação de enzimas celulares são conhecidas na técnica incluindo, mas não limitadas a estas, modificações de 2’-amino, modificações de 2’-flúor, modificações de 2’-alquila, modificações da cadeia principal descarregada, modificações de morfolino, modificações de 2’-O-metila e fosforamidato. Assim, pelo menos um grupo de 2’-hidroxila dos nucleotídeos em uma RNA de filamento duplo é substituído por um grupo químico. Da mesma forma, pelo menos um nucleotídeo pode ser modificado para formar um nucleotídeo bloqueado. Tal nucleotídeo bloqueado contém uma ponte de metileno ou etileno que se conecta ao 2’-oxigênio de ribose com o 4’-carbono de ribose. A introdução de um nucleotídeo bloqueado em um oligonucleotídeo melhora a afinidade com relação às sequências complementares e aumenta a temperatura de fusão em vários graus.

[00132] Os ligantes podem ser conjugados à uma molécula de RNA interferente, por exemplo, para intensificar a sua absorção celular. Em certas modalidades, um ligante hidrofóbica é conjugado com a molécula para facilitar a permeação direta da membrana celular. Estas abordagens têm sido usadas para facilitar a permeação celular de oligonucleotídeos anti-sentido. Em certos casos, a conjugação de um ligante catiônico para oligonucleotídeos muitas vezes resulta em melhor resistência às nucleases.

[00133] Exemplos representativos de ligantes catiônicos incluem propilamônio e dimetilpropilamônio. Oligonucleotídeos anti-sentido podem conservar a sua alta afinidade de ligação para o mRNA, quando o ligante catiônico for disperso por todo o oligonucleotídeo.

[00134] As moléculas e os polinucleotídeos aqui descritos podem ser preparados utilizando as técnicas bem conhecidas de síntese de fase sólida. Quaisquer outros meios para tal síntese conhecido na técnica podem adicional ou alternativamente ser empregados.

[00135] Várias modalidades são direcionadas para os vetores de expressão compreendendo um ou mais dos polinucleotídeos de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 ou constructos de RNA interferente que compreendem um ou mais polinucleotídeos.

[00136] Várias modalidades são direcionadas para os vetores de expressão compreendendo um ou mais dos polinucleotídeos de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 ou uma ou mais constructos de RNA interferente.

[00137] Várias modalidades são direcionadas para os vetores de expressão compreendendo um ou mais polinucleotídeos de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 ou uma ou mais constructos de RNA interferente que codificam um ou mais polinucleotídeos de RNA interferente capazes de auto-associação para formar uma estrutura grampo de cabelo, em que o constructo compreende (a) um ou mais dos polinucleotídeos aqui descritos; (b) uma segunda sequência que codifica um elemento espaçador que forma um anel da estrutura grampo de cabelo; e (c) uma terceira sequência compreendendo uma sequência complementar reversa da primeira sequência, posicionada na mesma orientação como a primeira sequência, em que a segunda sequência é posicionada entre a primeira sequência e a terceira sequência, e a segunda sequência está operacionalmente ligada à primeira sequência e à terceira sequência.

[00138] As sequências divulgadas podem ser utilizadas para o constructo de vários polinucleotídeos de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 que não formam estruturas grampo de cabelo. Por exemplo, um RNA de filamento duplo pode ser formado por (1) transcrever um primeiro filamento do DNA através da ligação operacional a um primeiro promotor, e (2) transcrever a sequência complementar reversa do primeiro filamento do fragmento de DNA através da ligação operacional a um segundo promotor. Cada filamento do polinucleotídeo pode ser transcrito do mesmo vetor de expressão, ou de diferentes vetores de expressão. O duplex de RNA tendo atividade de interferência do RNA pode ser enzimaticamente convertido em pequenos RNAs interferentes para modular os níveis de RNA.

[00139] Assim, várias modalidades são direcionadas aos vetores de expressão que compreendem um ou mais polinucleotídeos de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 ou constructos de RNA interferente que codificam os polinucleotídeos de RNA interferente capazes de auto- associação, em que o constructo compreende (a) um ou mais dos polinucleotídeos aqui descritos; e (b) uma segunda sequência compreendendo uma sequência complementar (por exemplo, complementar reversa) da primeira sequência, posicionada na mesma orientação que a primeira sequência.

[00140] Várias composições e métodos são fornecidos para modular os níveis de expressão endógena de um ou mais dos polipeptídeos de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 (ou uma combinação de dois ou mais ou três ou mais destes) através da promoção da co-supressão da expressão genética. O fenómeno de co-supressão ocorre como um resultado da introdução de múltiplas cópias de um transgene em um hospedeiro da célula vegetal. A integração de múltiplas cópias de um transgene pode resultar na expressão modulada do transgene e do gene endógeno alvo. O grau de co-supressão é

[00141] dependente do grau de identidade de sequência entre o transgene e o gene endógeno alvo. O silenciamento tanto do gene endógeno quanto do transgene pode ocorrer através da metilação extensiva dos locais silenciados (isto é, o promotor endógeno e o gene endógeno de interesse) que podem impedir a transcrição. Alternativamente, em alguns casos, a co-supressão do gene endógeno e do transgene pode ocorrer por silenciamento do gene pós- transcricional, em que os transcritos podem ser produzidos, mas as taxas aumentadas de degradação impedem o acúmulo de transcritos. O mecanismo para a co-supressão através do silenciamento genético pós-transcricional é suposto de se parecer com a interferência de RNA, em que o RNA parece ser tanto um iniciador importante quanto um alvo nestes processos, e pode ser mediada pelo menos em parte pelo mesmo mecanismo molecular, possivelmente através da degradação guiado pelo RNA de mRNAs.

[00142] A co-supressão de ácidos nucleicos pode ser conseguida através da integração de múltiplas cópias do ácido nucleico ou seus fragmentos, como transgenes, no genoma de uma planta de interesse. A planta hospedeira pode ser transformada com um vetor de expressão compreendendo um promotor operacionalmente ligado ao ácido nucleico ou seus fragmentos. Várias modalidades são direcionadas para os vetores de expressão para a promoção da co-supressão de genes endógenos compreendendo um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo. Várias modalidades são direcionadas aos métodos para a modulação do nível de expressão de polinucleotídeos de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 (ou uma combinação de dois ou mais ou três ou mais destes) por meio da integração de múltiplas cópias dos polinucleotídeos em um genoma da planta (tabaco), que compreende: a transformação de um hospedeiro da célula vegetal com um vetor de expressão que compreende um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo.

[00143] Várias composições e métodos são fornecidos para modular o nível de expressão do gene endógeno através da modulação da translação do mRNA. Uma célula vegetal hospedeira (tabaco) pode ser transformada com um vetor de expressão compreendendo: um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo, posicionado em orientação anti-sentido em relação ao promotor para permitir a expressão de polinucleotídeos de RNA tendo uma sequência complementar à uma parte do mRNA.

[00144] Vários vetores de expressão para a modulação da translação de mRNA podem compreender: um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo em que a sequência está posicionada na orientação anti-sentido em relação ao promotor. Os comprimentos dos polinucleotídeos de RNA anti-sentido podem variar, e podem ser de cerca de 15 a 20 nucleotídeos, cerca de 20 a 30 nucleotídeos, cerca de 30 a 50 nucleotídeos, cerca de 50 a 75 nucleotídeos, cerca de 75 a 100 nucleotídeos, cerca de 100 a 150 nucleotídeos, cerca de 150 a 200 nucleotídeos, e cerca de 200 a 300 nucleotídeos.

[00145] Os métodos para a obtenção de polinucleotídeos mutantes e polipeptídeos também são fornecidos. Qualquer planta de interesse, incluindo uma célula vegetal ou material vegetal, pode ser geneticamente modificada através de vários métodos conhecidos para induzir a mutagênese, incluindo a mutagênese direcionada ao local, mutagênese direcionada ao oligonucleotídeo, mutagênese quimicamente induzida, mutagênese induzida por irradiação, mutagênese utilizando bases modificadas, mutagênese utilizando DNA duplex aberto, mutagênese de fratura de filamento duplo, mutagênese utilizando cepas hospedeiras deficientes de reparo, mutagênese através da síntese de gene total, rearranjo de DNA e outros métodos equivalentes.

[00146] Alternativamente, os genes podem ser direcionados para a inativação através da introdução de transposons (por exemplo, elementos IS) nos genomas das plantas de interesse. Estes elementos genéticos móveis podem ser introduzidos pela fertilização cruzada sexual e os mutantes de inserção podem ser submetidos a triagem com relação à perda da atividade da proteína. O gene rompido em uma planta de origem pode ser introduzido em outras plantas através do cruzamento da planta de origem com a planta não submetida à mutagênese induzida por transposon, por exemplo, fertilização cruzada sexual. Quaisquer técnicas de reprodução padrão conhecidas das pessoas versadas na técnica podem ser utilizadas. Em uma modalidade, um ou mais genes podem ser inativados pela inserção de um ou mais transposons. As mutações podem resultar em rompimento homozigótico de um ou mais genes, em rompimento heterozigótico de um ou mais genes, ou uma combinação de rompimentos tanto homozigóticos quanto heterozigóticos se mais do que um gene for rompido. Elementos transponíveis adequados incluem retrotransposons, retroposons, e elementos semelhantes a SINE. Tais métodos são conhecidos das pessoas versadas na técnica.

[00147] Alternativamente, os genes podem ser direcionados para a inativação mediante a introdução de ribozimas derivadas de vários pequenos RNAs circulares que são capazes de auto-clivagem e replicação em plantas. Estes RNAs podem replicar isoladamente (RNAs viroides) ou com um vírus auxiliar (RNAs satélites). Exemplos de RNAs adequados incluem aqueles derivados de RNAs viroides e satélites da mancha solar do abacate derivados do vírus da mancha anelar do tabaco, vírus da listra transitória da alfafa, vírus mosqueado do tabaco aveludado, vírus mosqueado solanum nodiflorum, e vírus mosqueado do trevo subterrâneo. Várias ribozimas específicas do RNA alvo são conhecidas das pessoas versadas na técnica.

[00148] Em algumas modalidades, a expressão de um polipeptídeo é modulada por meios não transgênicos, tais como a criação de uma mutação em um gene. Métodos que introduzem uma mutação aleatoriamente em uma sequência genética podem incluir a mutagênese química, a mutagênese EMS e a mutagênese de radiação. Métodos que introduzem uma ou mais mutações direcionadas em uma célula incluem, mas não são limitados a estes, tecnologia de edição do genoma, particularmente a mutagênese mediada por nucleases de ligador de zinco, cultivo (direcionamento de lesões locais induzidas nos genomas), recombinação homóloga, mutagênese direcionada ao oligonucleotídeo e mutagênese mediada por meganuclease.

[00149] Alguns exemplos não limitativos de mutações são anulações, inserções e mutações de sentido errado de pelo menos um nucleotídeo, polimorfismos de único nucleotídeo e uma repetição de sequência simples. Após a mutação, a triagem pode ser executada para identificar as mutações que criam códons de interrupção prematuros ou de outra maneira genes não funcionais. Após a mutação, a triagem pode ser executada para identificar as mutações que criam genes funcionais que são capazes de serem expressos em níveis elevados. A triagem de mutantes pode ser realizada pelo sequenciamento, ou pelo uso de uma ou mais sondas ou iniciadores específicos para o gene ou proteína. As mutações específicas em polinucleotídeos também podem ser criadas, as quais podem resultar na expressão modulada do gene, estabilidade modulada do mRNA, ou estabilidade modulada da proteína. Tais plantas são aqui referidas como plantas de "ocorrência não natural" ou "mutantes". Tipicamente, as plantas mutantes ou de ocorrência não natural irão incluir pelo menos uma parte do ácido nucleico estranho ou sintético ou produzido pelo homem (por exemplo, DNA ou RNA) que não estava presente na planta antes que fosse manipulada. O ácido nucleico estranho pode ser de um único nucleotídeo, dois ou mais nucleotídeos, dois ou mais nucleotídeos contíguos ou dois ou mais nucleotídeos não contíguas - tais como pelo menos 10, 20, 30, 40, 50,100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 ou 1500 ou mais nucleotídeos contíguos ou não contíguos.

[00150] As plantas mutantes ou de ocorrência não natural podem ter qualquer combinação de uma ou mais mutações que resulta em níveis modulados de proteína. Por exemplo, as plantas mutantes ou de ocorrência não natural podem ter uma única mutação de um gene isolado; múltiplas mutações em um gene isolado; uma única mutação em dois ou mais ou três ou mais genes; ou múltiplas mutações em dois ou mais ou três ou mais genes. Por meio de outro exemplo, as plantas mutantes ou de ocorrência não natural podem ter uma ou mais mutações em uma parte específica dos genes - tal como em uma região do gene que codifica um sítio ativo da proteína ou uma parte desta. A título de outro exemplo, as plantas mutantes ou de ocorrência não natural podem ter uma ou mais mutações em uma região fora de um ou mais genes - tal como em uma região a montante ou a jusante do gene que regula, contanto que elas modulem a atividade ou a expressão dos genes. Os elementos a montante podem incluir promotores, intensificadores ou fatores de transcrição. Alguns elementos - tais como intensificadores - podem ser posicionado a montante ou a jusante do gene que eles regulam. Os elementos não necessitam ser localizados próximo do gene que eles regulam, visto que alguns elementos foram observados localizados várias centenas de milhares de pares de bases a montante ou a jusante do gene, o qual eles regulam. As plantas mutantes ou de ocorrência não natural podem ter uma ou mais mutações localizadas dentro dos primeiros 100 nucleotídeos do gene, dentro dos primeiros 200 nucleotídeos do gene, dentro dos primeiros 300 nucleotídeos do gene, dentro dos primeiros 400 nucleotídeos do gene, dentro dos primeiros 500 nucleotídeos do gene, dentro dos primeiros 600 nucleotídeos do gene, dentro dos primeiros 700 nucleotídeos do gene, dentro dos primeiros 800 nucleotídeos do gene, dentro dos primeiros 900 nucleotídeos do gene, dentro dos primeiros 1000 nucleotídeos do gene, dentro dos primeiros 1100 nucleotídeos do gene, dentro dos primeiros 1200 nucleotídeos do gene, dentro dos primeiros 1300 nucleotídeos do gene, dentro dos primeiros 1400 nucleotídeos do gene ou dentro dos primeiros 1500 nucleotídeos do gene. As plantas mutantes ou de ocorrência não natural podem ter uma ou mais mutações localizadas dentro do primeiro, segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo, oitavo, nono, décimo, décimo primeiro, décimo segundo, décimo terceiro, décimo quarto, ou décimo quinto conjunto de 100 nucleotídeos dos genes ou as suas combinações. As plantas mutantes ou de ocorrência não natural (por exemplo, plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas e outras mais, como aqui descritas) compreendendo as variantes de polipeptídeo mutantes são divulgadas.

[00151] Em uma modalidade, as sementes de plantas são submetidas a mutagenese e depois cultivadas dentro das plantas mutantes de primeira geração. As plantas da primeira geração são então deixadas auto-polinizar e as sementes da planta de primeira geração são cultivadas nas plantas de segunda geração, que são depois submetidas a triagem quanto as mutações em seus locais. Embora o material vegetal submetido a mutagenes possa ser submetido a triagem quanto as mutações, uma vantagem da triagem das plantas de segunda geração é que todas as mutações somáticas correspondem às mutações da linha germinativa. Uma pessoa de habilidade na técnica compreenderá que uma variedade de materiais vegetais, incluindo, mas não limitado a estes, sementes, pólen, tecido vegetal ou células vegetais, pode ser submetida a mutagenese a fim de criar as plantas mutantes. No entanto, o tipo de material vegetal submetido a mutagenese pode afetar quando o ácido nucleico da planta for submetido a triagem quanto as mutações. Por exemplo, quando o pólen é submetido a mutagênese antes da polinização de uma planta não modificada, as sementes que resultam desta polinização são cultivadas em plantas de primeira geração. Todas as células das plantas da primeira geração irão conter mutações criadas no pólen; assim, estas plantas da primeira geração podem então ser submetidas a triagem quanto as mutações em vez de esperar até a segunda geração.

[00152] As mutageneses que criam principalmente mutações pontuais e anulações, inserções, transversões e/ou transições curtas, incluindo agentes mutagênicos químicos ou radiação, podem ser utilizadas para criar as mutações. Os agentes mutagênicos incluem, mas não são limitados a estes, metanossulfonato de etila, sulfonato de metilmetano, N-etil-N-nitrosouréia, trietilmelamina, N-metil-N- nitrosouréia, procarbazina, clorambucil, ciclofosfamida, sulfato de dietila, monômero de acrilamida, melfalano, mostarda de nitrogênio, vincristina, dimetilnitrosamina, N-metil N’-nitro-nitrosoguanidina, nitrosoguanidina, 2-aminopurina, 7,12-dimetil-benz(a)antraceno, óxido de etileno, hexametilfosforamida, bisulfano, diepoxialcanos (diepoxioctano, diepoxibutano, e outros mais), dicloridreto 2-metóxi-6- cloro-9[3-(etil-2-cloro-etil)aminopropilamino]acridina e formaldeído.

[00153] As mutações espontâneas no local que podem não ter sido diretamente provocadas pelo agente mutagênico também são contempladas contanto que elas resultem no fenótipo desejado. Os agentes mutagênicos adequados também pode incluir, por exemplo, a radiação ionizante - tal como raios-X, raios gama, a irradiação rápida de nêutrons e a radiação UV. Qualquer método de preparação de ácido nucleico de plantas conhecido daqueles de habilidade na técnica pode ser usado para preparar o ácido nucleico de plantas para a triagem de mutações.

[00154] O ácido nucleico preparado a partir de plantas individuais, células vegetais, ou material vegetal pode, opcionalmente, ser combinado de modo a acelerar a triagem para as mutações na população de plantas que se originam do tecidos, células ou materiais vegetais submetidos a mutagene. Uma ou mais gerações subsequentes de plantas, células vegetais ou material vegetal podem ser rastreadas. A dimensão do grupo opcionalmente reunido é dependente da sensibilidade do método de triagem utilizado.

[00155] Após as amostras de ácido nucleico serem opcionalmente reunidas, elas podem ser submetidas às técnicas de amplificação específica de polinucleotídeos, tais como a reação da cadeia polimerase. Qualquer um ou mais iniciadores ou sondas específicas do gene ou das sequências imediatamente adjacentes ao gene, podem ser utilizados para amplificar as sequências dentro da amostra de ácido nucleico opcionalmente reunida. Os iniciadores exemplares são apresentados nas SEQ ID Nos: 3 a 5, 10 a 12 e 14 a 16. Preferivelmente, os um ou mais iniciadores ou sondas foram designados para amplificar as regiões do local onde as mutações úteis são as mais prováveis. Mais preferivelmente, o iniciador é designado para detectar mutações dentro das regiões do polinucleotídeo. Adicionalmente, é preferível que os iniciadores) e as sondas evitem os sítios polimórficos conhecidos, a fim de facilitar a triagem das mutações pontuais. Para facilitar a detecção de produtos de amplificação, os um ou mais iniciadores ou sondas podem ser rotulados utilizando qualquer método de rotulagem convencional. Os iniciadores ou as sondas podem ser designados com base nas sequências aqui descritas utilizando métodos que são bem compreendidas na técnica.

[00156] Para facilitar a detecção de produtos de amplificação, os iniciadores ou as sondas podem ser rotulados utilizando qualquer método de rotulagem convencional. Estes podem ser designados com base nas sequências aqui descritas, utilizando métodos que são bem compreendidos na técnica.

[00157] Os polimorfismos podem ser identificados por meios conhecidos na técnica e alguns foram descritos na literatura.

[00158] Em um outro aspecto é fornecido um método de preparação de uma planta mutante. O método envolve fornecer pelo menos uma célula de uma planta que compreende um gene que codifica um polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 funcional (ou uma combinação de dois ou mais ou três ou mais destes). Logo depois, a pelo menos uma célula da planta é tratada sob condições eficazes para modular a atividade do polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2. A pelo menos uma célula vegetal mutante é então propagada em uma planta mutante, onde a planta mutante possui um nível modulado de polipeptídeos de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 (ou uma combinação de dois ou mais ou três ou mais destes) em comparação com aquele de uma planta controle. Em uma modalidade deste método de fabricação de uma planta mutante, a etapa de tratamento envolve submeter a pelo menos uma célula a um agente químico de mutagenese como descrito acima e sob condições eficazes para produzir pelo menos uma célula vegetal mutante. Em outra modalidade deste método, a etapa de tratamento envolve submeter a pelo menos uma célula à uma fonte de radiação sob condições eficazes para produzir pelo menos uma célula vegetal mutante. O termo "planta mutante" inclui as plantas mutantes em que o genótipo é modificado em comparação com uma planta de controle, adequadamente por meio da engenharia genética ou modificação genética diferente.

[00159] Em certas modalidades, a planta mutante, a célula vegetal mutante ou o material vegetal mutante pode compreender uma ou mais mutações que ocorreram naturalmente em outra planta, célula vegetal ou material vegetal e confere uma característica desejada. Esta mutação pode ser incorporada em outra planta, célula vegetal ou material vegetal (por exemplo, uma planta, célula vegetal ou material vegetal com uma formação genética diferente para a planta a partir da qual a mutação foi derivada) para conferir a sua característica.

[00160] Assim, por meio de exemplo, uma mutação que ocorreu naturalmente em uma primeira planta pode ser introduzida em uma segunda planta - tal como uma segunda planta com uma formação genética diferente à primeira planta. A pessoa versada é, portanto, capaz de pesquisar e identificar uma planta que carrega naturalmente no seu genoma um ou mais alelos mutantes dos genes aqui descritos que conferem uma característica desejada. Os alelos mutantes que ocorrem naturalmente podem ser transferidos para a segunda planta através de vários métodos, incluindo reprodução, retrocruzamento e introgressão para produzir linhagens, variedades ou híbridos que possuem uma ou mais mutações nos genes aqui descritos. As plantas que mostram uma característica desejada podem ser submetidas a triagem fora de uma combinação de plantas mutantes. Adequadamente, a seleção é efetuada utilizando o conhecimento das sequências de nucleotídeo tais como aqui descritas. Em consequência, é possível fazer a triagem de uma característica genética em comparação com um controle. Uma tal abordagem de triagem pode envolver a aplicação das técnicas convencionais de amplificação e/ou hibridação de ácido nucleico aqui debatidas. Assim, um outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para a identificação de uma planta mutante compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma amostra compreendendo um polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 de uma planta; e (b) determinar a sequência de ácido nucleico do polinucleotídeo, em que uma diferença na sequência do polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 em comparação com a sequência de polinucleotídeo de uma planta de controle é indicativa de que dita planta é uma planta mutante NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2. Em outro aspecto é fornecido um método para a identificação de uma planta mutante que acumula níveis aumentados de (i) de carotenoide ou beta-damascenona; ou (ii) carotenoide e beta- damascenona, em comparação com uma planta de controle compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma amostra de uma planta a ser submetida a triagem; (b) determinar se dita amostra compreende uma ou mais mutações no polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2; e (c) determinar o (i) carotenoide ou beta-damascenona; ou (ii) teor de carotenoide e beta-damascenona de dita planta; em que se dita amostra compreende uma ou mais mutações no polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 que modulam a expressão ou a atividade da proteína codificada em comparação com uma planta de controle e uma parte da planta do tabaco possui um aumento em (i) carotenoide ou beta-damascenona; ou (ii) carotenoide e beta- damascenona de pelo menos 5 % em comparação com uma planta de tabaco de controle em que a expressão ou a atividade de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 não foi modulada, é indicativo de uma planta mutante que acumula níveis aumentados de (i) carotenoide ou beta- damascenona; ou (ii) carotenoide e beta-damascenona. Em outro aspecto fornece-se um método para a preparação de uma planta mutante que acumula níveis aumentados de (i) de carotenoide ou beta- damascenona; ou (ii) carotenoide e beta-damascenona, em comparação com uma planta de controle compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma amostra a partir de uma primeira planta; (b) determinar se dita amostra compreende uma ou mais mutações no polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 que resultam no acúmulo de níveis aumentados de (i) carotenoide ou beta-damascenona; ou (ii) carotenoide e beta-damascenona; e (c) transferir a uma ou mais mutações em uma segunda planta. As mutações podem ser transferidas para a segunda planta utilizando vários métodos que são conhecidos na técnica - tais como por engenharia genética, manipulação genética, introgressão, reprodução de plantas, retrocruzamento e outros mais. Em uma modalidade, a primeira planta é uma planta de ocorrência natural. Em uma modalidade, a segunda planta possui uma formação genética diferente da primeira planta. Em outro aspecto, é fornecido um método para a preparação de uma planta mutante que acumula níveis aumentados de (i) carotenoide ou beta-damascenona; ou (ii) carotenoide e beta-damascenona, em comparação com uma planta de controle compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma amostra a partir de uma primeira planta; (b) determinar se dita amostra compreende uma ou mais mutações no polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 que resulta no acúmulo de níveis elevados de (i) carotenoide ou beta-damascenona; ou (ii) carotenoide e beta-damascenona; e (c) introduzir a uma ou mais mutações da primeira planta para uma segunda planta. Em uma modalidade, a etapa de introgressão compreende a reprodução de plantas, opcionalmente incluindo o retrocruzamento e semelhantes. Em uma modalidade, a primeira planta é uma planta de ocorrência natural. Em uma modalidade, a segunda planta possui uma formação genética diferente da primeira planta. Em uma modalidade, a primeira planta não é um cultivar ou um cultivar de elite. Em uma modalidade, a segunda planta é um cultivar ou um cultivar de elite. Um outro aspecto refere-se a uma planta mutante (incluindo um cultivar ou cultivar de elite da planta mutante) obtida ou obtenível pelos métodos aqui descritos. Em certas modalidades, as "plantas mutantes" podem ter uma ou mais mutações localizadas apenas em uma região específica da planta - tal como dentro da sequência do polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2. De acordo com esta modalidade, a sequência genômica remanescente da planta mutante será a mesma ou substancialmente a mesma como a planta antes da mutagênese.

[00161] Em certas modalidades, as plantas mutantes podem ter uma ou mais mutações localizadas em mais do que uma região da planta - tal como dentro da sequência do polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 e em uma ou mais de outras regiões do genoma. De acordo com esta modalidade, a sequência genômica remanescente da planta mutante não será o mesmo ou não será substancialmente a mesma como a planta antes da mutagênese. Em certas modalidades, as plantas mutantes podem não ter uma ou mais mutações em um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais exons do polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2; ou não podem ter uma ou mais mutações em um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais introns do polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2; ou não podem ter uma ou mais mutações em um promotor do polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2; ou não podem ter uma ou mais mutações na região não transladada 3’ do polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2; ou não podem ter uma ou mais mutações na região não transladada 5’ do polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2; ou não podem ter uma ou mais mutações na região de codificação do polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2; ou não podem ter uma ou mais mutações na região de não codificação do polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2; ou qualquer combinação de dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais; ou seis ou mais de suas partes.

[00162] Em um outro aspecto é fornecido um método de identificação de uma planta, uma célula vegetal ou material vegetal compreendendo uma mutação em um gene que codifica NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 compreendendo: (a) submeter uma planta, uma célula vegetal ou material vegetal à mutagênese; (b) obter uma amostra de ácido nucleico a partir de dita planta, célula vegetal ou material vegetal ou seus descendentes; e (c) determinar a sequência de ácido nucleico do gene que codifica NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 ou uma variante ou um fragmento deste, em que uma diferença em dita sequência é indicativa de uma ou mais mutações nesse ponto.

[00163] As proteínas do ligador de zinco podem ser usadas para modular a expressão ou a atividade de um ou mais dos polinucleotídeos de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 aqui descritos. Em várias modalidades, uma sequência de DNA genômica que compreende uma parte ou a totalidade da sequência de codificação do polinucleotídeo é modificada pela mutagênese mediada por nuclease do ligador de zinco. A sequência de DNA genômica é procurada para um único sítio para a ligação de proteína do ligador de zinco. Alternativamente, a sequência de DNA genômica é procurada para dois únicos sítios para a ligação de proteína do ligador de zinco, em que ambos os sítios estão em filamentos opostos e próximos entre si, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais pares de bases separadamente. Consequentemente, as proteínas do ligador de zinco que se ligam aos polinucleotídeos são fornecidas.

[00164] Uma proteína de ligador de zinco pode ser planejada para reconhecer um sítio alvo selecionado em um gene. Uma proteína de ligador de zinco pode compreender qualquer combinação de motivos derivados de domínios de ligação de DNA do ligador de zinco naturais e domínios de ligação de DNA de ligador de zinco não naturais por truncagem ou expansão, ou um processo de mutagênese direcionado ao sítio acoplado a um método de seleção tal como, mas não limitado a estes, seleção de apresentação fato, seleção bacteriana de dois híbridos ou seleção bacteriana de um híbrido. O termo "domínio de ligação de DNA de ligador de zinco não natural" refere-se a um domínio de ligação de DNA de ligador de zinco que se liga a uma sequência de três pares de base dentro do ácido nucleico alvo e que não ocorre na célula ou organismo compreendendo o ácido nucleico que deve ser modificado. Os métodos para o planejamento da proteína de ligador de zinco que se liga às sequências de nucleotídeo específicas que são únicas para um gene alvo são conhecidos na técnica.

[00165] Uma nuclease de ligador de zinco pode ser construída através da formação de uma fusão de um primeiro polinucleotídeo que codifica para uma proteína de ligador de zinco que se liga a um polinucleotídeo, e um segundo polinucleotídeo que codifica para uma endonuclease não específica tal como, mas não limitado a estes, aqueles de uma endonuclease Tipo IIS. Uma proteína de fusão entre uma proteína do ligador de zinco e a nuclease pode compreender um espaçador consistindo de dois pares de bases ou alternativamente, o espaçador pode consistir de três, quatro, cinco, seis, sete ou mais pares de bases.

[00166] Em várias modalidades, uma nuclease de ligador de zinco introduzir uma quebra de filamento duplo em uma região reguladora, uma região de codificação, ou uma região de não codificação de uma sequência de DNA genômica de um polinucleotídeo e leva a uma redução do nível de expressão de um polinucleotídeo, ou uma redução na atividade da proteína assim codificada. A clivagem por nucleases de ligador de zinco frequentemente resulta na anulação de DNA no sítio de clivagem seguinte ao reparo do DNA pela união da extremidade não homóloga.

[00167] Em outras modalidades, uma proteína de ligador de zinco pode ser selecionada para se ligar a uma sequência reguladora de um polinucleotídeo. Mais especificamente, a sequência reguladora pode compreender um sítio de iniciação da transcrição, um códon de partida, uma região de um exon, um limite de um exon-intron, um terminador, ou um códon de parada. Consequentemente, a invenção fornece um planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica ou células vegetais, produzidas através da mutagênese mediada pela nuclease do ligador de zinco nos arredores ou dentro de um ou mais polinucleotídeos aqui descritos, e métodos para a produção de uma tal planta ou célula vegetal através da mutagênese mediada pela nuclease do ligador de zinco. Os métodos para a liberação da proteína do ligador de zinco e da nuclease do zinco ligador à uma planta do tabaco são similares àqueles descritos abaixo para a liberação da meganuclease.

[00168] Em outro aspecto, os métodos para a produção de plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas ou de outro modo plantas geneticamente modificadas utilizando meganucleases, tais como I-Crei, são descritos. As meganucleases de ocorrência natural assim como as meganucleases recombinantes podem ser utilizadas para especificamente provocar uma quebra do filamento duplo em um único sítio ou nos sítios relativamente raros no DNA genômico de uma planta para levar em conta o rompimento de um ou mais polinucleotídeos aqui descritos. A meganuclease pode ser uma meganuclease planejada com propriedades alteradas de reconhecimento do DNA.

[00169] As proteínas meganucleases podem ser liberadas nas células vegetais por uma variedade de diferentes mecanismos conhecidos na técnica.

[00170] As invenções abrangem o uso de meganucleases para inativar um polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 (ou uma combinação de dois ou mais ou três ou mais destes) em uma célula vegetal ou planta. Particularmente, as invenções fornecem um método para a inativação de um polinucleotídeo em uma planta utilizando uma meganuclease que compreende: a) fornecer uma célula vegetal que compreende um polinucleotídeo como aqui descrito; (b) introduzir uma meganuclease ou um constructo que codifica uma meganuclease na dita célula vegetal; e (c) deixar a meganuclease substancialmente inativar os polinucleotídeos. As meganucleases podem ser usadas para clivar os sítios de reconhecimento da meganuclease dentro das regiões de codificação de um polinucleotídeo. Tal clivagem frequentemente resulta na anulação do DNA no sítio de reconhecimento da meganuclease após o reparo do DNA mutagênico através da união da extremidade não homóloga. Tais mutações na sequência de codificação do gene são tipicamente suficientes para inativar o gene. Este método para modificar uma célula vegetal envolve, em primeiro lugar, a liberação de uma cassete de expressão meganuclease à uma célula vegetal, utilizando um método de transformação adequado. Para uma maior eficiência, é desejável ligar o cassete de expressão meganuclease a um marcador de seleção e selecionar as células transformadas com sucesso, na presença de um agente de seleção. Esta abordagem irá resultar na integração do cassete de expressão meganuclease no genoma, que pode, no entanto, não ser desejável se a planta for provável de requerer a aprovação regulamentar. Em tais casos, o cassete de expressão meganuclease (e o gene marcador selecionável ligado) pode ser segregado para longe das gerações subsequentes das plantas utilizando técnicas de reprodução convencionais. Alternativamente, as células vegetais podem ser inicialmente transformadas com uma cassete de expressão meganuclease que carece de um marcador selecionável e pode ser cultivado em meios carentes de um agente de seleção. Sob tais condições, uma fração das células tratadas irá adquirir o cassete de expressão meganuclease e irá expressar a meganuclease planejada de modo transiente sem a integração do cassete de expressão meganuclease no genoma. Visto que não se é responsável pela eficiência da transformação, este último procedimento de transformação requer que um maior número de células tratadas seja submetido a triagem para se obter a modificação desejada do genoma. A abordagem acima também pode ser aplicada para modificar uma célula vegetal quando se utiliza uma proteína do ligador de zinco ou nuclease do ligador de zinco.

[00171] Após a liberação do cassete de expressão meganuclease, as células vegetais são cultivadas, inicialmente, sob condições que são típicas para o procedimento de transformação particular que foi utilizado. Isso pode significar o crescimento de células transformadas no meio em temperaturas abaixo de 26 °C, frequentemente no escuro.

[00172] Tais condições padrão podem ser utilizadas durante um período de tempo, preferivelmente de 1 a 4 dias, para permitir que a célula vegetal recupere o processo de transformação. Em qualquer ponto após este período de recuperação inicial, a temperatura de cultivo pode ser elevada para estimular a atividade da meganuclease planejada para clivar e modificar o sítio de reconhecimento da meganuclease.

[00173] Para certas aplicações, pode ser desejável remover precisamente o polinucleotídeo do genoma da planta. Tais aplicações são possíveis usando um par de meganucleases modificadas, cada um das quais cliva um sítio de reconhecimento de meganuclease em cada lado da deleção pretendida. TAL Effector Nucleases (Talens) que são capazes de reconhecer e ligar-se a um gene e introduzir uma ruptura de filamento duplo no genoma também podem ser usados. Assim, em outro aspecto, os métodos para a produção de plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas ou de outra maneira geneticamente modificadas como aqui descritos utilizando TAL Effector nucleases são contemplados.

[00174] As plantas adequadas para uso na modificação genética incluem, mas não são limitadas a estas, plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas e sistemas de células vegetais, incluindo as espécies de uma das seguintes famílias: Acanthaceae, Alliaceae, Alstroemeriaceae, Amaryllidaceae, Apocynaceae, Arecaceae, Asteraceae, Berberidaceae, Bixaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Caryophyllaceae, Cephalotaxaceae, Chenopodiaceae, Colchicaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Ephedraceae, Erythroxylaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Linaceae, Lycopodiaceae, Malvaceae, Melanthiaceae, Musaceae, Myrtaceae, Nyssaceae, Papaveraceae, Pinaceae, Plantaginaceae, Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Sapindaceae, Solanaceae, Taxaceae, Theaceae ou Vitaceae.

[00175] As espécies adequadas podem incluir membros do gênero Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, Andrographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberis, Beta, Bixa, Brassica, Calendula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catharanthus, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Datura, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Ephedra, Erianthus, Erythroxylum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galanthus, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopolia, Secale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Triticum, Uniola, Veratrum, Vinca, Vitis e Zea. As espécies adequadas podem incluir Panicum spp., Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Andropogon gerardii (big bluestem), Pennisetum purpureum (capim-elefante), Phalaris arundinacea (capim- amarelo), Cynodon dactylon (grama das Bermudas), Festuca arundinacea (festuca alta), Spartina pectinata (pradaria espartina), Medicago sativa (alfalfa), Arundo donax (junco gigante), Secale cereale (centeio), Salix spp. (salgueiro), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale (tempos de trigo centeio), bamboo, Helianthus annuus (girassol), Carthamus tinctorius (cártamo), Jatropha curcas (jatropha), Ricinus communis (mamona), Elaeis guineensis (palma), Linum usitatissimum (linho), Brassica juncea, Beta vulgaris (beterraba açucareira), Manihot esculenta (mandioca), Lycopersicon esculentum (tomate), Lactuca sativa (alface), Musyclise alca (banana), Solanum tuberosum (batata), Brassica oleracea (brócolos, couve-flor, couve de bruxelas), Camellia sinensis (chá), Fragaria ananassa (morango), Theobroma cacao (cacau), Coffe ycliseca (café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (abacaxi), Capsicum annum (pimenta e pimentão), Allium cepa (cebola), Cucumis melo (melão), Cucumis sativus (pepino), Cucurbita maxima (abóbora), Cucurbita moschata (abóbora), Spinacea oleracea (espinafre), Citrullus lanatus (melancia), Abelmoschus esculentus (quiabo), Solanum melongena (berinjela), Rosa spp. (rosa), Dianthus caryophyllus (cravo), Petunia spp. (petúnia), Poinsettia pulcherrima (poinsetia), Lupinus albus (tremoço), Uniola paniculata (aveia), bentgrass (Agrostis spp.), Populus tremuloides (álamo tremedor), Pinus spp. (pinheiro), Abies spp. (abeto), Acer spp. (bordo), Hordeum vulgare (cevada), Poa pratensis (gramíneas), Lolium spp. (azevém) e Phleum pratense (erva dos prados), Panicum virgatum (gramíneas), Sorghu yclise or (sorgo, capim sudão), Miscanthus giganteus (miscanto), Saccharum sp. (cana energética), Populus balsamifera (álamo), Zea mays (milho), Glycine max (feijão de soja), Brassica napus (canola), Triticum aestivum (trigo), Gossypium hirsutum (algodão), Oryza sativa (arroz), Helianthus annuus (girassol), Medicago sativa (alfalfa), Beta vulgaris (beterraba açucareira) ou Pennisetum glaucum (milho miúdo).

[00176] Várias modalidades são direcionadas às plantas de tabaco mutantes, às plantas de tabaco de ocorrência não natural ou plantas de tabaco transgênicas modificadas para modular os níveis de expressão do gene, produzindo assim plantas - tais como a planta de tabaco - em que o nível de expressão de um polipeptídeo é modulado dentro dos tecidos vegetais de interesse em comparação com uma planta de controle. As composições e métodos divulgados podem ser aplicados a qualquer espécie do gênero Nicotiana, incluindo N. rustica e N. tabacum (por exemplo, LA B21, LN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1, e Petico). Outras espécies incluem N. acaulis, N yclise ta, N yclise ta var. multiflora, N yclise na, N. alata, N. amplexicaulis, N. arentsii, N yclise ta, N. benavidesii, N. benthamiana, N. bigelovii, N. bonariensis, N. cavicola, N. clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forgetiana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N. gossei, N. hybrid, N. ingulba, N. kawakamii, N. knightiana, N. langsdorffii, N. linearis, N. longiflora, N yclise ma, N. megalosiphon, N. miersii, N. noctiflora, N. nudicaulis, N. obtusifolia, N. occidentalis, N. occidentalis subsp. hesperis, N. otophora, N. paniculata, N. pauciflora, N. petunioides, N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis, N. raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundifolia, N. setchellii, N. simulans, N. solanifolia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveolens, N. sylvestris, N. thyrsiflora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trigonophylla, N. umbratica, N yclise ta, N. velutina, N. wigandioides, and N. x sanderae.

[00177] O uso de cultivares de tabaco e cultivares de tabaco elite também é aqui contemplado. A planta transgênica, de ocorrência não natural ou mutante pode, portanto, ser uma variedade de tabaco ou cultivar de tabaco elite que compreende um ou mais transgenes, ou uma ou mais mutações genéticas ou uma combianação destes. As mutações genéticas (por exemplo, um ou mais polimorfismos) podem ser mutações que não existem naturalmente na variedade de tabaco individual ou cultivar tabaco (por exemplo, cultivar de tabaco elite) ou podem ser mutações genéticas que ocorrer naturalmente contanto que a mutação não ocorra naturalmente na variedade de tabaco individual ou cultivar de tabaco (por exemplo, cultivar de tabaco elite).

[00178] As variedades de Nicotiana tabacum particularmente úteis incluem os tabacos do tipo Burley, tipo escuro, tipo flue cured e tipo oriental. Exemplos não limitativos de variedades ou cultivares são: BD 64, CC 101, 200 CC, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CD 263, DF911, DT 538 LC Galpao tobacco, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, HB 04P LC, HB3307PLC, Hybrid 403LC, Hybrid 404LC, Hybrid 501 LC, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY10, KY14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KTY14xL8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, Narrow Leaf Madole LC, NBH 98, N-126, N-777LC, N-7371LC, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, PD 7302 LC, PD 7309 LC, PD 7312 LC‘ 'Periq’e' tobacco, PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA359, AA 371, B 13P, Xanthi (Mitchell-Mor), Bel-W3, 79-615, Samsun Holmes NN, KTRDC number 2 Hybrid 49, Burley 21, KY 8959, KY 9, MD 609, PG 01, PG 04, PO1, PO2, PO3, RG 11, RG 8, VA 509, AS44, Banket A1, Basma Drama B84/31, Basma I Zichna ZP4/B, Basma Xanthi BX 2A, Batek, Besuki Jember, C104, Coker 347, Criollo Misionero, Delcrest, Djebel 81, DVH 405, Galpão Comum, HB04P, Hicks Broadleaf, Kabakulak Elassona, Kutsage E1, LA BU 21, NC 2326, NC 297, PVH 2110, Red Russian, Samsun, Saplak, Simmaba, Talgar 28, Wislica, Yayaldag, Prilep HC-72, Prilep P23, Prilep PB 156/1, Prilep P12-2/1, Yaka JK-48, Yaka JB 125/3, TI-1068, KDH-960, TI-1070, TW136, Basma, TKF 4028, L8, TKF 2002, GR141, Basma xanthi, GR149, GR153, Petit Havana. As subvariedades de baixo conversor do acima, ainda que não especificamente aqui identificadas, também são contemplados.

[00179] As modalidades também são direcionadas às composições e métodos para a produção de plantas mutantes, plantas de ocorrência não natural, plantas híbridas ou plantas transgênicas que foram modificadas para modular a expressão ou a atividade de um polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 (ou uma combinação de dois ou mais ou três ou mais destes), ou um polipeptídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 (ou uma combinação de dois ou mais ou três ou mais destes). Vantajosamente, as plantas mutantes, as plantas de ocorrência não natural, as plantas híbridas ou as plantas transgênicas que são obtidos podem ser semelhantes ou substancialmente as mesmas na aparência geral para o controle das plantas. Várias características fenotípicas tais como grau de maturidade, número de folhas por planta, altura da haste, ângulo de inserção da folha, tamanho da folha (largura e comprimento), distância de entrenós, e relação de lâmina - nervura central das folhas, podem ser avaliadas através das observações de campo.

[00180] Um aspecto refere-se a uma semente de uma planta mutante, uma planta de ocorrência não natural, uma planta híbrida, ou uma planta transgênica aqui descrita. Preferivelmente, a semente é uma semente de tabaco. Um outro aspecto refere-se ao pólen ou um óvulo de uma planta mutante, uma planta de ocorrência não natural, uma planta híbrida ou uma planta transgênica que é aqui descrita. Além disso, fornece-se uma planta mutante, uma planta de ocorrência não natural, uma planta híbrida, ou uma planta transgênica tal como aqui descrita, que compreende ainda um ácido nucleico que confere esterilidade masculina.

[00181] Também se fornece uma cultura tecidual de células regeneráveis da planta mutante, da planta de ocorrência não natural, da planta híbrida, ou da planta transgênica ou parte desta conforme aqui descrito, cujo cultivo regenera as plantas capazes de expressar todas as características morfológicas e fisiológicas de origem. As células regeneráveis incluem, mas não são limitadas a estas, células de folhas, pólen, embriões, cotilédones, hipocótilos, raízes, pontas de raiz, anteras, flores e uma parte destas, óvulos, brotos, caules, talos, medula de planta e cápsulas ou calos ou protoplastos derivados desta.

[00182] Um objetivo é fornecer plantas mutantes, transgênicas ou de ocorrência não natural que apresentam níveis modulados de carotenoide ou beta-damascenona ou níveis modulados de carotenoide e beta-damascenona, enquanto mantém substancialmente a mesma aparência visual em comparação com uma planta de controle. Consequentemente, descreve-se aqui plantas ou células vegetais mutantes, transgênicas ou de ocorrência não natural que possuem níveis de modulados dos níveis de carotenoide ou beta-damascenona ou níveis modulados dos níveis de carotenoide e beta-damascenona em comparação com as células de controle ou plantas de controle. As plantas ou células vegetais mutantes, transgênicas ou de ocorrência não natural têm sido modificadas para modular a síntese ou a atividade de uma ou mais das enzimas aqui descritas através da modulação da expressão de um ou mais polipeptídeos que codificam as sequências de polinucleotídeo aqui descritas.

[00183] Um outro aspecto, refere-se a uma planta ou célula mutante, de ocorrência não natural ou transgênica, em que a expressão ou a atividade de uma ou mais das enzimas aqui descritas é modulada e uma parte da planta (por exemplo, as folhas) tem um aumento ou uma diminuição nos níveis de carotenoide de pelo menos 5 % em comparação com uma planta de controle em que a expressão ou a atividade de ditas enzimas não foi modulada. Ainda um outro aspecto, refere-se a uma planta ou célula mutante, de ocorrência não natural ou transgênica, em que a expressão da neoxantina sintase ou a atividade da proteína assim codificada é modulada, e em que os níveis de beta- damascenona em aerossol são aumentados ou reduzidos em pelo menos 5 % em comparação com o aerossol da planta de controle.

[00184] A mudança no teor de carotenoide em comparação com a planta de controle pode ser uma alteração de pelo menos cerca de 5 %, pelo menos cerca de 10 %, pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 25 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 %, ou cerca de 100 % ou mais - tal como 200 % ou 300 % ou mais.

[00185] A alteração no teor de beta-damascenona em comparação com a planta de controle pode ser uma alteração de pelo menos cerca de 5 %, pelo menos cerca de 10 %, pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 25 %, pelo menos cerca 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 %, ou cerca de 100 % ou mais - tal como 200 % ou 300 % ou mais.

[00186] Adequadamente, o teor de luteína em parte da planta (por exemplo, as folhas) é de pelo menos cerca 18 mg/100 g, adequadamente, pelo menos cerca de 18,5 mg/100 g, adequadamente pelo menos cerca de 19 mg/100 g, adequadamente pelo menos cerca de 19,5 mg/100 g, adequadamente pelo menos cerca de 20 mg/100 g, adequadamente pelo menos cerca de 25 mg/100 g ou mais.

[00187] Adequadamente, o teor de beta-caroteno em parte da planta (por exemplo, as folhas) é de pelo menos cerca de 11,5 mg/100 g de planta de material colhido (por exemplo, a folha), adequadamente pelo menos cerca de 12 mg/100 g, adequadamente pelo menos cerca de 12,5 mg/100 g, adequadamente pelo menos cerca de 13 mg/100 g, adequadamente pelo menos cerca 13,5 mg/100 g, adequadamente pelo menos 14 mg/100 g, adequadamente pelo menos cerca de 14,5 mg/100 g, ou adequadamente pelo menos cerca de 15 mg/100 g, ou mais.

[00188] Adequadamente, o teor de luteína em parte da planta (por exemplo, as folhas) é de pelo menos cerca 18 mg/100 g de material vegetal colhido (por exemplo, folha), adequadamente pelo menos cerca de 18,5 mg/100 g, adequadamente pelo menos cerca de 19 mg/100 g, adequadamente pelo menos cerca de 19,5 mg/100 g, adequadamente pelo menos cerca de 20 mg/100 g, adequadamente pelo menos cerca de 25 mg/100 g ou mais e o teor de beta-caroteno em parte da planta (por exemplo, as folhas) é de pelo menos cerca de 11,5 mg/100 g, adequadamente pelo menos cerca 12 mg/100 g, adequadamente pelo menos cerca de 12,5 mg/100 g, adequadamente pelo menos cerca de 13 mg/100 g, adequadamente pelo menos cerca de 13,5 mg/100 g, adequadamente pelo menos 14 mg/100 g, adequadamente pelo menos cerca de 14,5 mg/100 g, ou adequadamente pelo menos cerca de 15 mg/100 g, ou mais.

[00189] Apropriadamente, os níveis de beta-damascenona em aerossol de folhas queimadas ou aquecidas é de pelo menos cerca 1 ng/mg de material vegetal queimado ou colhido (por exemplo, folha), adequadamente pelo menos cerca de 1,05 ng/mg, apropriadamente pelo menos cerca de 1,1 ng/mg, apropriadamente pelo menos cerca de 1,15 ng/mg, ou adequadamente pelo menos cerca de 2 ng/mg ou mais.

[00190] Adequadamente, (i) o teor de luteína na parte da planta (por exemplo, as folhas) é de pelo menos cerca 18 mg/100 g de material vegetal colhido (por exemplo, folha), apropriadamente pelo menos cerca de 18,5 mg/100 g, adequadamente pelo menos cerca de 19 mg/100 g, adequadamente pelo menos cerca de 19,5 mg/100 g, adequadamente pelo menos cerca 20 mg/100 g; apropriadamente pelo menos cerca de 25 mg/100 g ou mais; adequadamente, (ii) o teor de beta-caroteno em parte da planta (por exemplo, as folhas) é de pelo menos cerca de 11,5 mg/100 g de material vegetal colhido (por exemplo, folha), adequadamente pelo menos cerca de 12 mg/100 g, apropriadamente pelo menos cerca de 12,5 mg/100 g,

[00191] adequadamente pelo menos cerca de 13 mg/100 g, adequadamente pelo menos cerca de 13,5 mg/100 g, apropriadamente pelo menos 14 mg/100 g, adequadamente pelo menos cerca de 14,5 mg/100 g, ou apropriadamente pelo menos cerca de 15 mg/100 g, ou mais; e (iii) adequadamente, os níveis de beta-damascenona em aerossol das folhas queimadas ou aquecidas é de pelo menos cerca de 1 ng/mg de material vegetal queimado ou colhido (por exemplo, folha), adequadamente pelo menos cerca de 1,05 ng/mg, adequadamente pelo menos cerca de 1,1 ng/mg, apropriadamente pelo menos cerca de 1,15 ng/mg, ou apropriadamente pelo menos cerca de 2 ng/mg ou mais.

[00192] A planta pode ser aquecido até 100 °C ou acima - tal como, pelo menos 125 °C, pelo menos 150 °C, pelo menos 175 °C ou pelo menos 200 °C - para liberar o aerossol.

[00193] Em mais um outro aspecto, é fornecido uma planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica, em que a expressão de uma enzima selecionada do grupo consistindo de neoxantina sintase, licopeno beta ciclase e 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase ou uma combinação de dois ou mais ou três ou mais destes (ditas combinações são aqui descritas) ou a atividade da proteína assim codificada é aumentada e (i) o teor de luteína em parte da planta (por exemplo, as folhas) é pelo menos cerca de 18 mg/100 g de material vegetal colhido (por exemplo, folha); (ii) o teor de beta-caroteno em parte da planta (por exemplo, as folhas) é de pelo menos cerca de 11,5 mg/100 g de material vegetal colhido (por exemplo, folha); e (iii) os níveis de beta- damascenona em aerossol de folhas queimadas ou aquecidas é de pelo menos cerca de 1 ng/mg material vegetal queimado ou colhido (por exemplo, folha).

[00194] Adequadamente a aparência visual de dita planta é substancialmente a mesma como a da planta de controle. Adequadamente, a planta é uma planta de tabaco.

[00195] As modalidades são também direcionadas às composições e métodos para a produção de plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas que foram modificadas para modular a expressão ou atividade de neoxantina sintase; ou expressão ou atividade de licopeno beta ciclase; ou expressão ou atividade de 9-cis- epoxicarotenoide dioxigenase que pode resultar em plantas ou componentes de plantas (por exemplo, folhas - tal como as folhas verdes ou folhas curadas) com níveis modulados de carotenoides (por exemplo, mas não limitado a estes, luteína ou beta-caroteno ou ambos) quando comparados com um controle. As modalidades também são direcionadas às composições e métodos para a produção de plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas que foram modificadas para modular a expressão ou a atividade de uma combinação de dois ou mais ou três ou mais de neoxantina sintase, licopeno beta ciclase e 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase. Assim, uma modalidade refere-se à modulação da expressão ou atividade de neoxantina sintase, licopeno beta ciclase e 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase; outra modalidade, refere-se à modulação da expressão ou atividade de neoxantina sintase e licopeno beta ciclase; outra modalidade refere-se à modulação da expressão ou atividade de neoxantina sintase e 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase; e outra modalidade refere-se à modulação da expressão ou atividade de licopeno beta ciclase e 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase ou qualquer outra combinação destas duas ou mais sequências. A modulação dos níveis de carotenoides nas plantas pode ter benefícios nutricionais para o consumidor, especialmente quando os níveis de carotenoides na planta são aumentados. A modulação dos níveis de carotenoides nas plantas pode ser utilizada para gerar plantas que são resistentes a herbicidas que inibem a biossíntese de carotenoide, especialmente quando os níveis de carotenoides na planta são aumentados. Assim, em uma modalidade específica, as composições e métodos para a produção de plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas que foram modificadas para aumentar a expressão ou a atividade dos polinucleotídeos acima mencionados e as suas combinações são fornecidos, o que pode resultar em plantas ou componentes de planta (por exemplo, as folhas - tais como as folhas verdes ou folhas curadas) com benefícios nutricionais melhorados ou resistência aumentada aos herbicidas.

[00196] As modalidades também são direcionadas às composições e métodos para a produção de plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas que foram modificadas para modular a expressão ou atividade de neoxantina sintase que pode resultar em plantas ou componentes de plantas (por exemplo, folhas curadas por aquecimento) com níveis modulados de beta-damascenona em comparação com um controle. Assim, em uma outra modalidade, as composições e métodos para a produção de plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas que foram modificadas para modular a expressão ou atividade de neoxantina sintase são fornecidas o que pode resultar em plantas ou material vegetal - tais como a folha de tabaco curada aquecida ou queimada - em que os níveis de beta- damascenona são modulados. Assim, o aumento ou a redução do teor de beta-damascenona pode resultar em material vegetal com um perfil de sabor alterado. Em uma modalidade específica, as composições e métodos para a produção de plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas que foram modificadas para aumentar a expressão ou atividade da neoxantina sintase são fornecidas, o que pode resultar em plantas ou material vegetal - tais como a folha de tabaco curada aquecida ou queimada - em que os níveis de beta- damascenona são aumentados. O aumento do teor de beta- damascenona pode resultar em material vegetal que possui um perfil de aroma com um sabor de maçã cozida. A diminuição do teor de beta- damascenona pode resultar em material vegetal que possui um perfil de sabor alterado. De acordo com certas modalidades, referência aqui à beta-damascenona também pode incluir os seus precursores. Tal modificação também pode modular o teor de carotenoide das plantas.

[00197] Vantajosamente, as plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas que são obtidas de acordo com os métodos aqui descritos são semelhantes ou substancialmente as mesmas na aparência visual com as plantas de controle. Em uma modalidade, a altura do caule das plantas mutante, de ocorrência não natural ou transgênicas é substancialmente a mesmo como as plantas de controle, por exemplo, em um, dois ou três ou mais meses após o transplante de campo ou 10, 20, 30 ou 36 ou mais dias após a cobertura. Por exemplo, a altura do caule das plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas não é menor do que a altura do caule das plantas de controle. Em outra modalidade, o teor de clorofila das plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas é substancialmente o mesmo como as plantas de controle.

[00198] Em outra modalidade, a altura da haste das plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas é substancialmente a mesma como as plantas de controle e o teor de clorofila das plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas é substancialmente o mesmo como as plantas de controle. Em outras modalidades, o tamanho ou a forma ou o número ou a coloração das folhas das plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas é substancialmente a mesma como as plantas de controle. Adequadamente, a planta é uma planta de tabaco.

[00199] Em outro aspecto, é fornecido um método para a modulação do teor de carotenoide em pelo menos uma parte de uma planta (por exemplo, as folhas), compreendendo as etapas de: (i) modular a expressão ou a atividade de uma enzima selecionada do grupo consistindo em neoxantina sintase, licopeno beta ciclase e 9-cis- epoxicarotenoide dioxigenase ou uma combinação de duas ou mais, ou três ou mais destas (ditas combinações são divulgadas acima) na planta, de preferência, em que a neoxantina sintase, licopeno beta ciclase e 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase compreendam a sequência de polinucleotídeo aqui descrita, ou a sequência de polipeptídeo aqui descrita; (ii) medir o teor de carotenoide em pelo menos uma parte (por exemplo, as folhas) da planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica obtida na etapa (i); e (iii) identificar um planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica em que o teor de carotenoide nela foi modulado em comparação com uma planta de controle. Adequadamente, o aspecto visual da dita planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica é substancialmente o mesmo como a planta de controle. Apropriadamente, a planta é uma planta de tabaco.

[00200] Em outro aspecto, fornece-se um método para aumentar o teor de carotenoide em pelo menos uma parte de uma planta (por exemplo, as folhas), compreendendo as etapas de: (i) aumentar a expressão ou a atividade de uma enzima selecionada do grupo consistindo de neoxantina sintase, licopeno beta ciclase e 9-cis- epoxicarotenoide dioxigenase ou uma combinação de duas ou mais ou três ou mais destas (ditas combinações são divulgadas acima) na planta, de preferência, em que a neoxantina sintase, licopeno beta ciclase e 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase compreende a sequência de polinucleotídeo aqui descrita ou a sequência de polipeptídeo aqui descrita; (ii) medir o teor de carotenoide em pelo menos uma parte (por exemplo, as folhas) da planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica obtida na etapa (i); e (iii) identificar um planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica em que o teor de carotenoide nela foi aumentada em comparação a uma planta de controle. Adequadamente, o aspecto visual de dita planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica é substancialmente o mesmo como a planta de controle. Adequadamente, a planta é uma planta de tabaco.

[00201] Em outro aspecto, fornece-se um método para diminuir o teor de carotenoide em pelo menos uma parte de uma planta (por exemplo, as folhas), compreendendo as etapas de: (i) reduzir a expressão ou a atividade de uma enzima selecionada do grupo consistindo de neoxantina sintase, licopeno beta ciclase e 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase ou uma combinação de duas ou mais ou três ou mais destas (ditas combinações são divulgadas acima) na planta, de preferência, em que a neoxantina sintase, a licopeno beta ciclase e a 9- cis-epoxicarotenoide dioxigenase compreendam a sequência de polinucleotídeo aqui descrita ou a sequência de polipeptídeo aqui descrita; (ii) medir o teor de carotenoide em pelo menos uma parte (por exemplo, as folhas) da planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica obtida na etapa (i); e (iii) identificar um planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica em que o teor de carotenoide nela foi diminuída em comparação com uma planta de controle. Adequadamente, o aspecto visual de dita planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica é substancialmente o mesmo como a planta de controle. Adequadamente, a planta é uma planta de tabaco.

[00202] O aumento na expressão em comparação com a planta de controle pode ser de cerca de 5 % a cerca de 100 %, ou um aumento de pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, ou 100 % ou mais - tal como 200 % ou 300 % ou mais, que inclui um aumento na atividade de transcrição ou na expressão de proteína ou ambas.

[00203] O aumento na atividade em comparação com uma planta de controle pode ser de cerca de 5 % a cerca de 100 %, ou um aumento de pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, ou 100 % ou mais - tal como 200 % ou 300 % ou mais.

[00204] A redução na expressão em comparação com a planta de controle pode ser de cerca de 5 % a cerca de 100 %, ou uma redução de pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, ou 100 %, que inclui uma redução na atividade de transcrição ou na expressão da proteína ou de ambas.

[00205] A redução na atividade em comparação com uma planta de controle pode ser de cerca de 5 % a cerca de 100 %, ou uma redução de pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, ou 100 %.

[00206] O aumento no teor de carotenoide em comparação com uma planta de controle pode ser de cerca de 5 % a cerca 100 %, ou um aumento de pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %,pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, ou até 100 % ou mais - tal como 200 % ou 300 % ou mais.

[00207] A diminuição no teor de carotenoide em comparação com uma planta de controle pode ser de cerca de 5 % a cerca de 100 %, ou uma diminuição de pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, ou até 100 %.

[00208] Em outro aspecto, é fornecido um método para modular o teor de beta-damascenona de uma planta, compreendendo as etapas de: (i) modular a expressão ou a atividade de neoxantina sintase na planta, de preferência, em que a neoxantina sintase compreende a sequência de polinucleotídeo ou a sequência de polipeptídeo aqui descrita; (ii) medir o teor de beta-damascenona em pelo menos uma parte da planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica obtida na etapa (i) ou um aerossol desta; e (iii) identificar um planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica em que o teor de beta- damascenona nela alterou em comparação com uma planta de controle em que a expressão ou a atividade de neoxantina sintase não foi modulada. Adequadamente, a aparência visual de dita planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica é substancialmente a mesmo como a planta de controle. Adequadamente, a planta é uma planta de tabaco. Apropriadamente, o teor de beta-damascenona é medido no aerossol formado após o aquecimento das folhas de tabaco curadas.

[00209] Em outro aspecto, é fornecido um método para aumentar o teor de beta-damascenona de uma planta, compreendendo as etapas de: (i) aumentar a expressão ou a atividade da neoxantina sintase na planta, de preferência, em que a neoxantina sintase compreende a sequência de polinucleotídeo ou a sequência de polipeptídeo aqui descrita; (ii) medir o teor de beta-damascenona em pelo menos uma parte da planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica obtida na etapa (i); e (iii) identificar um planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica em que o teor de beta-damascenona nela aumentou em comparação com uma planta de controle, em que a expressão ou a atividade de neoxantina sintase não foi aumentada. Adequadamente, o aspecto visual de dita planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica é substancialmente o mesmo como a planta de controle. Apropriadamente, a planta é uma planta de tabaco. Apropriadamente, o teor de beta-damascenona é medido no aerossol formado após o aquecimento das folhas de tabaco curadas.

[00210] Em outro aspecto, é fornecidos um método para reduzir ou inibir (por exemplo, substancialmente inibir) o teor de beta- damascenona de uma planta, compreendendo as etapas de: (i) reduzir ou inibir a expressão ou a atividade de neoxantina sintase na planta, de preferência, em que a neoxantina sintase compreende a sequência de polinucleotídeo ou a sequência de polipeptídeo aqui descrita; (ii) medir o teor de beta-damascenona em pelo menos uma parte da planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica obtida na etapa (i); e (iii) identificar um planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica em que o teor de beta-damascenona nela foi reduzido ou inibido em comparação com uma planta de controle, em que a expressão ou a atividade de neoxantina sintase não foi reduzida ou inibida. Adequadamente, o aspecto visual de dita planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica é substancialmente o mesmo como a planta de controle. Apropriadamente, a planta é uma planta de tabaco. Apropriadamente, o teor de beta-damascenona é medido no aerossol formado após o aquecimento das folhas de tabaco curadas.

[00211] O aumento na expressão de neoxantina sintase em comparação com a planta de controle pode ser de cerca de 5 % a cerca de 100 %, ou um aumento de pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, ou 100 % ou mais - tal como 200 % ou 300 % ou mais - que inclui um aumento na atividade de transcrição ou na expressão da proteína ou ambas.

[00212] O aumento na atividade de neoxantina sintase em comparação com uma planta de controle pode ser de cerca de 5 % a cerca de 100 %, ou um aumento de pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, ou 100 % ou mais - tal como 200 % ou 300% ou mais.

[00213] A redução na expressão de neoxantina sintase em comparação com a planta de controle pode ser de cerca de 5 % a cerca de 100 %, ou uma redução de pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, ou 100 %, que inclui uma redução na atividade de transcrição ou na expressão da proteína ou ambas.

[00214] A redução na atividade de neoxantina sintase em comparação com uma planta de controle pode ser de cerca de 5 % a cerca de 100 %, ou uma redução de pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, ou 100 % ou mais.

[00215] O aumento no teor de beta-damascenona em comparação com uma planta de controle pode ser de cerca de 5 % a cerca de 100 %, ou um aumento de pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, ou até 100 % ou mais - tal como 200 % ou 300% ou mais.

[00216] A diminuição no teor de beta-damascenona em comparação com uma planta de controle pode ser de cerca de 5 % a cerca de 100 %, ou uma diminuição de pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, ou até 100 %.

[00217] Os polinucleotídeos e os constructos recombinantes aqui descritos podem ser utilizados para modular a expressão das enzimas aqui descritas em uma espécie de planta de interesse, adequadamente tabaco.

[00218] Vários métodos com base em polinucleotídeo podem ser usados para aumentar a expressão do gene nas plantas. A título de exemplo, um constructo, vetor ou vetor de expressão que é compatível com a planta a ser transformada pode ser preparado, o que compreende o gene de interesse juntamente com um promotor a montante que é capaz de sobre-expressar o gene na planta. Os promotores exemplares são aqui descritos. Após a transformação e quando cultivado sob condições adequadas, o promotor pode acionar a expressão a fim de modular (por exemplo, aumentar) os níveis desta enzima na planta, ou em um tecido específico desta. Em uma modalidade exemplar, um vetor que carrega o polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 (ou qualquer uma das suas combinações como aqui descrito) é gerado para super-expressar o gene em uma planta. O vetor carrega um promotor adequada - tal como o prmotor do vírus mosáico da couve-flor CaMV 35S - a montante do transgene que aciona a sua expressão constitutiva em todos os tecidos da planta. O vetor também carrega um gene de resistência a antibiótico, a fim de conferir a seleção dos calos e linhagens celulares transformadas.

[00219] Várias modalidades são, portanto, direcionadas aos métodos para a modulação (por exemplo, aumento) do nível de expressão do polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 (ou qualquer uma das suas combinações como aqui descritas) através da integração de múltiplas cópias do polinucleotídeo em um genoma de planta, que compreende: a transformação de uma célula hospedeira de planta com um vetor de expressão que compreende um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2. O polipeptídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 codificado por um polinucleotídeo recombinante pode ser um polipeptídeo nativo, ou pode ser heterólogo à célula.

[00220] De acordo com a invenção, uma planta de tabaco que carrega um alelo mutante de ou NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 (ou qualquer uma das suas combinações como aqui descrito) pode ser utilizada em um programa de reprodução de plantas para criar linhagens, variedades e híbridos úteis. Em particular, o alelo mutante é incorporado nas variedades comercialmente importantes descritas acima. Assim, os métodos para a reprodução de plantas são fornecidos, que compreendem o cruzamento de uma planta mutante, uma planta de ocorrência não natural ou uma planta transgênica como aqui descrito com uma planta que compreende uma identidade genética diferente. O método pode ainda compreender o cruzamento da planta progênie com outra planta, e opcionalmente repetir o cruzamento até que uma progênie com as características genéticas desejadas ou formação genética seja obtida. Um propósito servido por tais métodos de reprodução é introduzir uma característica genética desejável em outras variedades, linhagens de reprodução, híbridos ou cultivares, particularmente aquelas que são de interesse comercial. Outro propósito é facilitar o empilhamento de modificações genéticas de diferentes genes em uma única variedade de plantas, linhagens, híbridos ou cultivares. As uniões intra-específicas assim como inter- específicoa são contempladas. As plantas progênies que surgem a partir de tais cruzamentos, também referidas como linhagens de reprodução, são exemplos de plantas de ocorrência não natural da invenção.

[00221] Em uma modalidade, um método é fornecido para a produção de uma planta de tabaco de ocorrência não natural que compreende: (a) cruzar uma planta de tabaco mutante ou transgênica com uma segunda planta de tabaco para produzir sementes de tabaco progênies; (b) cultivar a semente de tabaco progênie, sob condições de crescimento da planta, para produzir a planta de tabaco de ocorrência não natural. O método pode ainda compreender: (c) o cruzamento da planta de tabaco da geração anterior de ocorrência não natural com a própria planta de tabaco ou outra para produzir a semente de tabaco progênie; (d) o cultivo da semente de tabaco progênie da etapa (c) sob condições de cultivo da planta, para produzir plantas de tabaco de ocorrência não natural adicionais; e (e) repetir as etapas de cruzamento e cultivo de (c) e (d) várias vezes para gerar outras gerações de plantas de tabaco de ocorrência não natural. O método pode opcionalmente compreender antes da etapa (a), uma etapa de fornecimento de uma planta de origem que compreende uma identidade genética que se caracteriza e que não é idêntica à planta mutante ou transgênica. Em algumas concretizações, dependendo do programa de reprodução, as etapas de cruzamento e cultivo são repetidas de 0 a 2 vezes, de 0 a 3 vezes, de 0 a 4 vezes, de 0 a 5 vezes, de 0 a 6 vezes, de 0 a 7 vezes, de 0 a 8 vezes, de 0 a 9 vezes ou de 0 a 10 vezes, a fim de gerar as gerações de plantas de tabaco de ocorrência não natural.

[00222] O retrocruzamento é um exemplo de um tal método em que uma progênie é cruzada com um dos seus pais ou outra planta geneticamente semelhante à sua origem, a fim de obter uma planta progênie na geração seguinte que possui uma identidade genética que é mais próxima daquela de um dos pais. As técnicas para a reprodução de plantas, particularmente a reprodução da planta de tabaco, são bem conhecidos e podem ser utilizadas nos métodos da invenção. A invenção ainda fornece plantas de tabaco de ocorrência não natural produzidas por esses métodos.

[00223] Em algumas modalidades dos métodos aqui descritos, as linhagens resultantes da reprodução e triagem para os genes variantes são avaliadas no campo utilizando procedimentos padrão de campo. Os genótipos de controle incluindo o pai não submetido a mutagênese original são incluídos e as entradas são dispostas no campo em um projeto de blocos completo aleatório ou outro projeto de campo apropriado. Para o tabaco, as práticas agronômicas padrão são utilizadas, por exemplo, o tabaco é colhido, pesado e experimentado com relação aos produtos químicos e outros testes comuns antes e durante a cura. As análises estatísticas dos dados são executadas para confirmar a semelhança das linhagens selecionadas para a linhagem de origem. As análises citogenéticas das plantas selecionadas são opcionalmente executadas para confirmar o complemento cromossômico e as conexões cromossômicas em pares.

[00224] A impressão digital do DNA, o polimorfismo de nucleotídeo isolado, os marcadores microssatélites, ou tecnologias similares podem ser utilizadas em um programa de reprodução de seleção assistida por marcadores (MAS) para transferir ou reproduzir os alelos mutantes de um gene em outros tabacos, como aqui descrito. Por exemplo, um reprodutor pode criar populações segregantes de hibridação de um genótipo contendo um alelo mutante com um genótipo agronomicamente desejável. As plantas na F2 ou gerações de retrocruzamento podem ser submetidas a triagem utilizando um marcador desenvolvido a partir de uma sequência genômica ou um fragmento desta, utilizando uma das técnicas aqui listadas. As plantas identificados como tendo o alelo mutante podem ser retrocruzadas ou auto-polinizadas para criar uma segunda população a ser submetida a triagem. Dependendo do padrão de herança esperado ou a tecnologia MAS utilizada, pode ser necessário auto-polinizar as plantas selecionadas antes de cada ciclo de retrocruzamento para auxiliar a identificação das plantas individuais desejadas. O retrocruzamento ou outro procedimento de reprodução pode ser repetido até que o fenótipo desejado da origem recorrente seja recuperado.

[00225] De acordo com a divulgação, em um programa de reprodução, os cruzamentos bem sucedidos produzem plantas F1 que são férteis. As plantas F1 selecionadas podem ser cruzadas com um dos pais, e as primeiras plantas de geração por retrocruzamento são auto-polinizadas para produzir uma população que é novamente submetida a triagem com relação à expressão do gene variante (por exemplo, a versão nula do gene). O processo de retrocruzamento, a auto-polinização, e triagem é repetido, por exemplo, pelo menos 4 vezes até que a traigem final produza uma planta que é fértil e razoavelmente semelhante à origem recorrente. Esta planta, se desejável, é auto- polinizada e a progênie é posteriormente selecionada mais uma vez para confirmar que a planta apresenta a expressão do gene variante. Em algumas modalidades, uma população de plantas na geração F2 é pesquisada com relação à expressão do gene variante, por exemplo, uma planta é identificada que não consegue expressar um polipeptídeo devido à ausência do gene de acordo com os métodos padrão, por exemplo, mediante o uso um método de PCR com iniciadores baseados na informação da sequência de nucleotídeo pelos polinucleotídeos incluindo o polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 (ou qualquer um das suas combinações) como aqui descrito.

[00226] As variedades de tabaco híbridos podem ser produzidas através da prevenção de auto-polinização das plantas de origem femininas (isto é, os pais da semente) de uma primeira variedade, que permite o pólen das plantas de origem masculinas de uma segunda veriedade fertilizar as plantas de origem femininas, e que permite as sementes híbridas F1 formar nas plantas femininas. A auto-polinização das plantas femininas podem ser prevenidas por emascular as flores em um estágio precoce do desenvolvimento das flores. Alternativamente, a formação de pólen pode ser prevenida nas plantas de origem femininas que utilizam uma forma de esterilidade masculina. Por exemplo, a esterilidade masculina pode ser produzida pela esterilidade masculina citoplasmática (CMS), ou a esterilidade masculina transgênica em que um transgene inibe a microsporogênese e/ou a formação de pólen, ou a auto-incompatibilidade. As plantas de origem femininas contendo CMS são particularmente úteis. Nas modalidades em que as plantas de origem femininas são CMS, o pólen é colhido a partir das plantas masculinas férteis e aplicado manualmente nos estigmas da plantas de origem femininas de CMS, e a semente F1 resultante é colhida.

[00227] As variedades e linhagens aqui descritas podem ser utilizadas para formar híbridos F1 de tabaco único cruzamento. Em tais modalidades, as plantas das variedades de origem podem ser cultivadas como populações adjacentes substancialmente homogêneas para facilitar a polinização cruzada natural das plantas de origem femininas. A semente F1 formada nas plantas de origem femininas é seletivamente colhida através de meios convencionais. Pode-se também cultivar as duas variedades de planta de origem em grande quantidade e a colher uma mistura de semente híbrida F1 formada na origem feminina e semente formada após a origem masculina como o resultado da auto-polinização. Alternativamente, cruzamentos de três vias podem ser realizados em que um híbrido FI de um só cruzamento é utilizado como uma origem feminina e é cruzado com uma oreigem masculina diferente. Como outra alternativa, os híbridos de cruzamento duplo podem ser criado em que a progênie F1 de dois cruzamentos isolados diferentes são por si próprios cruzados.

[00228] Uma população de plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas pode ser submetida a triagem ou selecionada para aqueles membros da população que têm uma característica ou fenótipo desejado. Por exemplo, uma população de progênie de um único evento de transformação pode ser submetida a triagem para aquelas plantas tendo um nível desejado de expressão ou atividade de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 ou o polipeptídeo assim codificado. Os métodos físicos e bioquímicos podem ser utilizados para identificar os níveis de expressão ou atividade. Estes incluem a análise de Southern ou amplificação por PCR para a detecção de um polinucleotídeo; Northern blots, proteção S1 RNase, extensão de iniciador ou amplificação de RT-PCR para a detecção de transcritos de RNA; ensaios enzimáticos para a detecção de atividade de enzima ou ribozima de polipeptídeos e polinucleotídeos; e electroforese de proteína em gel, Western blot, imunoprecipitação e imunoensaios ligados a enzima para detectar os polipeptídeos. Outras técnicas tais como a hibridação in situ, manchamento de enzima, e imunomanchamento e ensaios de enzima também podem ser usadas para detectar a presença ou a expressão ou a atividade de polipeptídeos ou polinucleotídeos.

[00229] As células vegetais e plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas são aqui descritas compreendendo um ou mais polinucleotídeos recombinantes - tais como um ou mais polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 isolados (ou uma combinação de dois ou mais ou três ou mais destes), um ou mais constructos de polinucleotídeo, um ou mais RNAs de filamento duplo, um ou mais conjugados ou um ou mais vetores/vetores de expressão.

[00230] Sem limitação, as plantas aqui descritas podem ser modificadas para outros propósitos antes ou após a expressão ou atividade ter sido modulada de acordo com a presente invenção. Uma ou mais das seguintes modificações genéticas podem estar presentes nas plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas. Em uma modalidade, um ou mais genes que estão envolvidos na captação de metais pesados ou transporte de metais pesados são modificados, resultando em plantas ou partes de plantas (tais como as folhas) tendo um teor de metal pesado mais baixo do que as plantas de controle ou suas partes sem a modificação. Exemplos não limitativos incluem os genes da família de proteínas associadas com resistência a múltiplos medicamentos, a família de facilitadores da difusão de cátion (CDF), a família de proteínas semelhantes a Zrt, Irt (ZIP), a família dos trocadores de cátion (CAX), a família de transportadores de cobre (COPT), a família das ATPase do tipo metal pesado P (HMAs, como descrito na WO 2009074325), a família de homólogos de proteínas macrófagas associadas com a resistência natural (NRAMP), e a família dos transportadores do cassete de ligação de ATP (ABC), que participam no transporte de metais pesados, tais como o cádmio. O termo metal pesado como aqui utilizado inclui metais de transição. Em outra modalidade, um ou mais genes que estão envolvidos na conversão de intermediários metabólicos nitrogenosos são modificados, o que resulta em plantas ou partes de plantas (tais como as folhas) que quando aquecidas, produz níveis mais baixos de pelo menos uma nitrosamina especifica do tabaco (por exemplo, 4-(metilnitrosamino)-1- (3-piridil)-1- butanona, N-nitrosonornicotina, N-nitrosoanatabina e N- nitrosoanabasina) do que as plantas de controle ou suas ou partes. Exemplos não limitativos de genes que podem ser alterados incluem os genes que codificam uma nicotina demetilase, tais como CYP82E4, CYP82E5 e CYP82E10 que participam da conversão de nicotina em nornicotina e são descritos nas WO 2006091194, WO 2008070274, WO 2009064771 e PCT/US2011/021088.

[00231] Exemplos de outras modificações incluem a tolerância a herbicida, por exemplo, o glifosato é um ingrediente ativo de muitos herbicidas de amplo espectro. As plantas transgênicas resistentes ao glifosato foram desenvolvidas pela transferência do gene aroA (um glifosato EPSP sintetase de Salmonella typhimurium e E. coli). As plantas resistentes a sulfoniluréia foram produzidas pela transformação do gene ALS mutante (acetolactato sintetase) de Arabidopsis. A proteína OB do fotossistema II de mutante Amaranthus hybridus foi transferida para as plantas para produzir plantas transgênicas resistentes a atrazina; e plantas transgênicas resistentes a bromoxinila foram produzidas pela incorporação do gene bxn da bactéria Klebsiella pneumoniae. Outra modificação exemplar resulta em plantas que são resistentes a insetos. As toxinas de Bacillus thuringiensis (Bt) podem fornecer um meio eficaz de retardar o aparecimento de pragas resistentes Bt, como recentemente ilustrado no brócolos onde os genes cry1Ac e cry1C Bt acumulados controlaram as traças de costas em diamante resistentes à proteína isolada e significativamente retardaram a evolução dos insetos resistentes. Outra modificação exemplar resulta em plantas que são resistentes às doenças provocadas por agentes patogênicos (por exemplo, vírus, bactérias, fungos). As plantas que expressam o gene Xa21(resistência à praga das plantas bacteriana) com plantas que expressam tanto um gene de fusão Bt quanto um gene de quitinase (resistência à broca do caule amarelo e tolerância ao élitro) foram planejadas. Outra modificação exemplar resulta na capacidade reprodutiva alterada, tal como a esterilidade masculina. Outra modificação exemplares resulta em plantas que são tolerantes ao estresse abiótico (por exemplo, seca, temperatura, salinidade), e plantas transgênicas tolerantes foram produzidas através da transferência da enzima acil glicerol fosfato de Arabidopsis; genes que codificam a manitol desidrogenase e a sorbitol desidrogenase que estão envolvidas na síntese de manitol e sorbitol para melhorar a resistência à seca. Outra modificação exemplar resulta em plantas que produzem proteínas que podem ter propriedades imunogênicas favoráveis para uso em seres humanos. Por exemplo, as plantas capazes de produzir as proteínas que substancialmente carecem de resíduos de fucose alfa- 1,3-ligados, resíduos de xilose beta-1,2-ligados, ou ambos, no seu N- glicano podem ser de uso. Outras modificações exemplares pode resultar em plantas com proteínas e óleos de armazenamento melhorados, plantas com maior eficiência fotossintética, plantas com vida útil prolongada, plantas com maior teor de carboidrato e plantas resistentes a fungos; plantas que codificam uma enzima envolvida na biossíntese de alcaloides. As plantas transgênicas em que a expressão de S-adenosil-L-metionina (SAM) e/ou cistationina gama-sintase (CGS) foi modulada são também contempladas.

[00232] Uma ou mais de tais características podem ser incorporadas nas plantas de tabaco mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas a partir de um outro cultivar de tabaco ou podem ser diretamente nelas transformadas. A introgressão das características nas plantas de tabaco mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas da invenção pode ser conseguida por qualquer método de reprodução de planta conhecido na técnica, por exemplo, reprodução de raça pura, retrocruzamento, reprodução haploide dobrada, e outros mais (ver, Wernsman, E. A, and Rufty, R. C. 1987. Chapter Seventeen. Tobacco. Pages 669-698 In: Cultivar Development. Crop Species. W. H. Fehr (ed.), MacMillan Publishing Co, Inc., New York, N.Y 761 pp.). Técnicas com base em biologia molecular acima descritas, em particular, RFLP e marcadores microssatélites, podem ser utilizadas em tais retrocruzamentos para identificar as progênies tendo o maior grau de identidade genética com a origem recorrente. Isto permite que se acelere a produção de variedades de tabaco tendo pelo menos 90 %, preferivelmente pelo menos 95 %, mais preferivelmente pelo menos 99 % de identidade genética com a origem recorrente, ainda mais preferível geneticamente idêntica á origem recorrente, e que ainda compreende as características incorporadas a partir da origem doadora. Tal determinação da identidade genética pode ser baseada em marcadores moleculares conhecidos na técnica.

[00233] A última geração de retrocruzamento pode ser autopolinizada para fornecer a progênie de reprodução pura através dos ácidos nucleicos sendo transferidos. As plantas resultantes geralmente possuem essencialmente todas as características morfológicas e fisiológicas das plantas de tabacao mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas da invenção, além das características transferidas (por exemplo, uma ou mais características de um único gene). O protocolo exato de retrocruzamento dependerá da característica a ser alterada para determinar um protocolo de teste apropriado. Embora os métodos de retrocruzamento sejam simplificados quando a característica a ser transferida por um alelo dominante, um alelo recessivo também pode ser transferido. Neste caso, pode ser necessário a introdução de um teste da progênie para determinar se a característica desejada foi transferido com sucesso. Várias modalidades fornecem plantas mutantes, plantas de ocorrência não natural ou plantas transgênicas, assim como biomassa em que o nível de expressão de um polinucleotídeo NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 (ou qualquer combinação destes) é modulado para modular o teor carotenoide ou o teor de beta-damascenona no aerossol formado após o aquecimento do tabaco curado preparado a partir das plantas. Partes de tais plantas, em particular plantas de tabaco, e mais particularmente a lâmina da folha e a nervura central das folhas de plantas de tabaco, podem ser incorporadas ou utilizadas na produção de vários produtos de consumo incluindo, mas não limitados a estes, materiais de formação de aerossol, dispositivos de formação de aerossol, artigos para fumar, artigos fumáveis, produtos sem fumaça, e produtos de tabaco. Exemplos de materiais de formação de aerossol incluem, mas não são limitados a estes, composições de tabaco, tabaco, extrato de tabaco, tabaco cortado, carga cortada, tabaco curado, tabaco expandido, tabaco homogeneizado, tabaco reconstituído, e tabacos para cachimbo. Os artigos para fumar e artigos fumáveis são tipos de dispositivos de formação de aerossol. Exemplos de artigos para fumar ou artigos fumáveis incluem, mas não são limitados a estes, cigarros, cigarrilhas e charutos. Exemplos de produtos sem fumaça compreendem tabaco de mascar e rapé. Em certos dispositivos de formação de aerossol, em vez de combustão, uma composição de tabaco ou outro material de formação de aerossol é aquecido por um ou mais elementos de aquecimento elétrico para a produção de um aerossol. Em outro tipo de dispositivo de formação de aerossol aquecido, um aerossol é produzido pela transferência de calor de um elemento combustível ou fonte de calor para um material de formação de aerossol fisicamente separado, que pode estar localizado dentro, ao redor, ou a jusante da fonte de calor. Produtos de tabaco sem fumaça e vários materiais de formação de aerossol contendo tabaco podem conter tabaco em qualquer forma, incluindo como partículas secas, tiras, grânulos, pós ou pasta fluida, depositado, misturado, circundado, ou de outro modo combinado com outros ingredientes em qualquer formato, tal como flocos, películas, linquetas, espumas ou glóbulos. Como aqui utilizado, o termo "fumo"é utilizado para descrever um tipo de aerossol que é produzido por artigos para fumar, tais como cigarros, ou por combustão de um material de formação de aerossol.

[00234] Em uma modalidade, também se fornece material curado das plantas de tabaco mutantes, transgênicas e de ocorrência não natural aqui descritas. Os processos de cura das folhas de tabaco verdes são conhecidos por aqueles tendo habilidades na técnica e incluem, sem limitação, cura ao ar, cura pelo fogo, cura por fornalha e cura pelo sol. O processo de cura das folhas de tabaco verdes depende do tipo de tabaco colhido. Por exemplo, tabaco de fornalha Virginia (brilhante) é tipicamente curado por fornalha, Burley e certas cepas escuras são geralmente curadas ao ar e tabaco de cachimbo, tabaco de mascar e rapé são geralmente curados pelo fogo.

[00235] Em outra modalidade, descreve-se os produtos de tabaco incluindo os materiais de formação de aerossol contendo tabaco compreendendo as folhas, preferivelmente as folhas curadas, das plantas de tabaco mutantes, das plantas de tabaco transgênicas ou das plantas de tabaco de ocorrência não natural aqui descritas. Os produtos do tabaco aqui descritos podem ser um produto de tabaco misturado que pode ainda compreender o tabaco não modificado.

[00236] A % de carotenoide ou beta-damascenona ou a % de carotenoide e beta-damascenona nestes artigos fumáveis e produtos sem fumo e seus aerossóis, pode ser pelo menos cerca de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % e 100 % ou mais - tal como 200 % ou 300 % - ou mais elevado, quando em comparação com os produtos consumíveis derivados das contrapartes não mutantes, de ocorrência não natural ou não transgênicas.

[00237] A % de carotenoide ou a % de beta-damascenona ou a % de carotenoides e beta-damascenona nestes artigos fumáveis e produtos sem fumo e seus aerossóis pode ser pelo menos cerca de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, e 100 % mais baixo, quando comparado com os produtos consumíveis derivados das contrapartes não mutantes, de ocorrência não natural ou não transgênicas.

[00238] As plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas podem ter outras utilizações, por exemplo, na agricultura. Por exemplo, as plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas aqui descritas podem ser usadas para produzir ração animal e produtos alimentares humanos.

[00239] A invenção também fornece métodos para a produção de sementes compreendendo o cultivo da planta mutante, planta de ocorrência não natural ou planta transgênica aqui descrita, e a coleta de sementes das plantas cultivadas. As sementes das plantas aqui descritas podem ser condicionadas e ensacadas em material de embalagem através de meios conhecidos na técnica para formar um artigo de fabricação. O material de embalagem tal como papel e tecido são bem conhecidos na técnica. Um pacote de sementes pode ter um rótulo, por exemplo, um rótulo ou etiqueta fixada no material de embalagem, um rótulo impresso na embalagem que descreve nele a natureza das sementes.

[00240] Um outro aspecto refere-se a um método para a produção de beta-damascenona compreendendo as etapas de: (a) fornecer parte de uma planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica; biomassa, sementes ou folhas; ou o produto de tabaco como aqui descrito; e (b) fornecer calor.

[00241] As composições, métodos e kits para plantas de genotipagem para a identificação, seleção ou reprodução podem compreender um meio de detectar a presença de um polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 (ou uma combinação de dois ou mais ou três ou mais destes) em uma amostra de polinucleotídeo.

[00242] Consequentemente, uma composição é descrita compreendendo um ou mais iniciadores (por exemplo, um ou mais iniciadores ou sondas compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente da sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 3 a 5, 10 a 12 ou 14 a 16) para especificamente amplificar pelo menos uma parte de um ou mais dos polinucleotídeos e opcionalmente uma ou mais sondas e opcionalmente um ou mais reagentes para a condução da amplificação ou detecção.

[00243] Deste modo, os iniciadores ou sondas de oligonucleotídeo específico do gene compreendendo cerca de 10 ou mais polinucleotídeos contíguos que correspondem ao polinucleotídeo NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 são divulgados. Ditos iniciadores ou sondas podem compreender ou consistir de cerca de 15, 20, 25, 30, 40, 45 ou 50 polinucleotídeos mais contíguos que hibridam (por exemplo, especificamente hibridam) no polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2. Em algumas modalidades, os iniciadores ou sondas podem compreender ou consistir de cerca de 10 a 50 nucleotídeos contíguos, de cerca de 10 a 40 nucleotídeos contíguos, de cerca de 10 a 30 nucleotídeos contíguos ou cerca de 15 a 30 nucleotídeos contíguos que podem ser utilizados em métodos dependentes das sequências de identificação de genes (por exemplo, hibridação de Southern) ou isolamento (por exemplo, hibridação in situ de colônias bacterianas ou placas bacteriófagas) ou a detecção do gene (por exemplo, como um ou mais iniciadores de amplificação na amplificação ou detecção de ácido nucleico). O um ou mais iniciadores ou sondas específicos podem ser designados e utilizados para amplificar ou detectar uma parte ou a totalidade do polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2. Por meio de exemplo específico, dois iniciadores podem ser utilizados em um protocolo de reação da cadeia polimerase para amplificar um fragmento de ácido nucleico que codifica o ácido nucleico NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 - tal como DNA ou RNA. A reação da cadeia polimerase também pode ser realizada utilizando um iniciador que é derivado da sequência de ácido nucleico NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 e um segundo iniciador que hibrida em uma sequência a montante ou a jusante da sequência de ácido nucleico NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 - tal como uma sequência promotora de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2, a extremidade 3’ do precursor de mRNA ou uma sequência derivada de um vetor. Exemplos de técnicas térmicas e isotérmicas úteis para a amplificação in vitro de polinucleotídeos são bem conhecidas no ofício. A amostra pode ser ou pode ser derivada de uma planta, uma célula vegetal ou material vegetal ou um produto de tabaco produzido ou derivado da planta, da célula vegetal ou do material vegetal como aqui descrito.

[00244] Em um outro aspecto, também se fornece um método de detecção de um polinucleotídeo de NtABA4 ou NtNeSy ou NtNCED2 (ou uma combinação de dois ou mais ou três ou mais destes), em uma amostra que compreende a etapa de: (a) fornecer uma amostra compreendendo, ou suspeita de compreender, um polinucleotídeo; (b) colocar em contato dita amostra com um ou mais iniciadores ou uma ou mais sondas para detectar especificamente pelo menos uma parte dos polinucleotídeos; e (c) detectar a presença de um produto de amplificação, em que a presença de um produto de amplificação é indicativa da presença dos polinucleotídeos na amostra. Em um outro aspecto, também é fornecido o uso de um ou mais iniciadores ou sondas para detectar especificamente pelo menos uma parte dos polinucleotídeos. Kits para a detecção de pelo menos uma parte dos polinucleotídeos também são fornecidos, os quais compreendem um ou mais iniciadores ou sondas para especificamente detectar pelo menos uma parte dos polinucleotídeos. O kit pode compreender reagentes para a amplificação de polinucleotídeo - tais como PCR - ou reagentes para a tecnologia de hibridação-detecção de sondas - tais como Southern Blots, Northern Blots, hibridação in situ, ou micro-disposições. O kit pode compreender reagentes para a tecnologia para ligação-detecção de anticorpos tais como Western Blot, ELISA, espectrometria de massa SELDI ou tiras de teste. O kit pode compreender reagentes para o sequenciamento de DNA. O kit pode compreender reagentes e instruções para a determinação de carotenoides (por exemplo, luteína ou beta-caroteno; ou luteína e beta-caroteno) e teor de beta- damascenona ou teor de beta-damascenona. O kit pode compreender reagentes e instruções para a determinação de carotenoides (por exemplo, luteína ou beta-caroteno; ou luteína e beta-caroteno) e teor de beta-damascenona ou teor de beta-damascenona.

[00245] Em algumas modalidades, um kit pode compreender instruções para um ou mais dos métodos descritos.

[00246] Os kits descritos podem ser úteis para a determinação da identidade genética, estudos filogenéticos, genotipagem, haplotipagem, análise de raça pura ou reprodução de plantas particularmente com a pontuação co-dominante. A presente invenção também fornece um método de genotipagem de uma planta, uma célula vegetal ou material vegetal compreendendo um polinucleotídeo como aqui descrito. A genotipagem fornece um meio de distinguir os homólogos de um par de cromossomas e pode ser utilizada para diferenciar segregantes em uma população de plantas.

[00247] Métodos de marcadores moleculares podem ser utilizados para estudos filogenéticos, que caracteriza as conexões genéticas entre as variedades de culturas, que identifica cruzamentos ou híbridos somáticos, que localiza segmentos cromossômicas que afetam as características monogênicas, clonagem baseada em mapa, e o estudo de herança quantitativa. O método específico de genotipagem pode empregar qualquer número de técnicas analíticas de marcador molecular incluindo polimorfismos do comprimento de fragmentos de amplificação (AFLPs). Os AFLPs são o produto de diferenças alélicas entre os fragmentos de amplificação provocadas pela variabilidade das sequências de nucleotídeo. Assim, a presente invenção ainda fornece um meio para seguir a segregação de um ou mais genes ou ácidos nucleicos, assim como sequências cromossômicas geneticamente ligadas a esses genes ou ácidos nucleicos utilizando técnicas como a análise de AFLP.

[00248] Em uma modalidade, também se fornece material curado a partir das plantas mutantes, transgênicas e de ocorrência não natural aqui descritas. Por exemplo, os processos de cura das folhas de tabaco verdes são conhecidos por aqueles tendo habilidades na área e incluem sem limitação cura ao ar, cura pelo fogo, cura por fornalha e cura pelo sol. O processo de cura das folhas de tabaco verdes depende do tipo de tabaco colhido. Por exemplo, o tabaco de fornalha Virginia (brilhante) é tipicamente curado em fornalha, Burley e certas cepas escuras são geralmente curados ao ar, e o tabaco de cachimbo, tabaco para mascar e rapé são geralmente curados pelo fogo.

[00249] Em outra modalidade, descreve-se os produtos de tabaco incluindo os produtos de tabaco compreendendo as folhas, as folhas preferivelmente curadas, das plantas mutantes, transgênicas e de ocorrência não natural aqui descritas ou que são produzidas pelos métodos descritos neste documento. Os produtos do tabaco aqui descritos podem ainda compreender tabaco não modificado.

[00250] Em outra modalidade, é descrito os produtos do tabaco compreendendo o material vegetal, de preferência folhas - tais como folhas curadas, a partir das plantas mutantes, transgênicas e de ocorrência não natural aqui descritas. Por exemplo, o material vegetal pode ser adicionado no interior ou exterior do produto de tabaco e assim após a queima um aroma desejável é liberado. O produto de tabaco de acordo com esta modalidade pode ainda ser um tabaco não modificado ou um tabaco modificado. O produto de tabaco de acordo com esta modalidade pode ainda ser derivado de uma planta mutante, transgênica ou de ocorrência não natural que possui modificações em um ou mais genes diferentes dos genes aqui divulgados.

[00251] Um outro aspecto refere-se a um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo, ou consistindo essencialmente em uma sequência que codifica uma licopeno beta ciclase e tendo pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8. Um outro aspecto refere-se a um polipeptídeo isolado codificado por este polinucleotídeo. Um outro aspecto refere-se a um polipeptídeo isolado tendo pelo menos 87 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9. Um outro aspecto refere-se a um constructo, vetor ou vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo isolado. Um outro aspecto refere-se a uma célula vegetal mutante, de ocorrência não natural ou transgênica compreendendo o polinucleotídeo isolado, o polipeptídeo ou o constructo, vetor ou vetor de expressão e em que a expressão ou atividade de licopeno beta ciclase é modulada em comparação com uma planta de controle ou tipo selvagem, de preferência, em que a expressão ou atividade de neoxantina sintase ou 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase; ou neoxantina sintase e 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase também é modulada. Um outro aspecto refere-se a um planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica compreendendo a célula vegetal. Um outro aspecto refere-se a um método para a modulação do teor de carotenoides de uma planta, compreendendo as etapas de: (i) modular a expressão ou a atividade do licopeno beta ciclase na planta, de preferência, em que o licopeno beta ciclase compreende a sequência de polinucleotídeo ou sequência de polipeptídeo aqui descrita; (ii) medir o teor de carotenoide em pelo menos uma parte da planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica obtida na etapa (i); e (iii) identificar um planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica em que o teor de carotenoide nela mudou em comparação com uma planta de controle em que a expressão ou a atividade de licopeno beta ciclase não foi modulada. Em uma modalidade, a expressão ou a atividade do licopeno beta ciclase ou 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase; e a licopeno beta ciclase e a 9- cis-epoxicarotenoide dioxigenase também são moduladas. Um outro aspecto refere-se a uma planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica ou ou material vegetal derivado ou derivável desta que é obtido ou obtenível por este método. Um outro aspecto refere-se a uma planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica, em que a expressão de licopeno beta ciclase ou a atividade da proteína assim codificada foi aumentada; em que o teor de luteína da folha verde ou o teor de beta-caroteno ou o teor combinado de planta é maior do que uma planta de controle, em que a expressão ou a atividade do licopeno beta ciclase não foi aumentada, de preferência, em que: (i) o teor de luteína da folha verde da planta é pelo menos cerca de 17 mg/100 g (por exemplo, pelo menos cerca de 17,5 mg/100 g; pelo menos cerca de 18 mg/100 g, pelo menos cerca de 18,5 mg/100 g ou pelo menos cerca de 19 mg/100 g) e (ii) o teor de beta-caroteno da planta é pelo menos cerca de 10 mg/100 g (por exemplo, pelo menos cerca de 10,5 mg/100 g; pelo menos cerca de 11 mg/100 g, pelo menos cerca de 11,5 mg/100 g ou pelo menos cerca de 12 mg/100 g). Um outro aspecto refere-se ao material vegetal incluindo a biomassa, semente ou folhas compreendendo as células ou tecidos da planta. Um outro aspecto refere-se a um produto de tabaco compreendendo as células vegetais, pelo menos uma parte da planta ou material vegetal. Um outro aspecto refere-se a um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo, ou consistindo, essencialmente de uma sequência que codifica 9-cis- epoxicarotenoide dioxigenase e tendo pelo menos 60 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. Um outro aspecto refere-se a um polipeptídeo isolado codificado por este polinucleotídeo. Um outro aspecto refere-se a um constructo, vetor ou vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo isolado. Um outro aspecto refere-se a uma célula vegetal mutante, de ocorrência não natural ou transgênica compreendendo o polinucleotídeo isolado, o polipeptídeo ou o constructo vetor ou vetor de expressão e em que a expressão ou a atividade de 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase é modulada em comparação com uma planta de controle ou tipo selvagem, de preferência, em que a expressão ou a atividade de neoxantina sintase ou licopeno beta ciclase; ou neoxantina sintase e licopeno beta ciclase também é modulada. Um outro aspecto refere-se a um planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica compreendendo a célula vegetal. Um outro aspecto refere-se a um método para a modulação do teor de carotenoide de uma planta, compreendendo as etapas de: (i) modular a expressão ou a atividade de 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase na planta, de preferência, em que a 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase compreende a sequência de polinucleotídeo ou a sequência de polipeptídeo aqui descrita; (ii) medir o teor de carotenoide em pelo menos uma parte da planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica obtida na etapa (i); e (iii) identificar uma planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica em que o teor de carotenoide nela mudou em comparação com uma planta de controle, em que a expressão ou a atividade de 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase não foi modulada. Em uma modalidade, a expressão ou a atividade de neoxantina sintase ou licopeno beta ciclase; e neoxantina sintase e licopeno beta ciclase também é modulada. Um outro aspecto refere-se a uma planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica ou material vegetal derivado ou derivável desta que é obtido ou obtenível por este método. Um outro aspecto refere-se a um planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica, em que a expressão de 9-cis- epoxicarotenoide dioxigenase ou a atividade da proteína assim codificada foi aumentada; em que o teor de luteína da folha verde ou o teor de beta-caroteno ou o teor combinado da planta é maior do que uma planta de controle em que a expressão ou a atividade de 9-cis- epoxicarotenoide dioxigenase não foi aumentada, de preferência, em que: (i) o teor de luteína da folha verde da planta é de pelo menos cerca de 15 mg/100 g (por exemplo, pelo menos cerca de 15,5 mg/100 g; pelo menos cerca de 16 mg/100 g, pelo menos cerca de 16,5 mg/100 g ou pelo menos cerca de 17 mg/100 g); e (ii) o teor de beta-caroteno da planta é de pelo menos cerca de 11 mg/100 g (por exemplo, pelo menos cerca de 11,5 mg/100 g; pelo menos cerca de 12 mg/100 g, pelo menos cerca de 12,5 mg/100 g ou pelo menos cerca 13 mg/100 g). Um outro aspecto refere-se ao material vegetal incluindo biomassa, semente ou folhas compreendendo as células ou tecidos da planta. Um outro aspecto refere-se a um produto de tabaco compreendendo as células vegetais, pelo menos uma parte da planta ou material vegetal.

[00252] A invenção é ainda descrita nos Exemplos abaixo, que são fornecidos para descrever a invenção com mais detalhes. Estes exemplos, que apresentam um modo preferido atualmente contemplado para a realização da invenção, destinam-se para ilustrar e não para limitar a invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1: Clonagem de ABA4 de Nicotinia tabacum

[00253] Uma sequência de codificação de Nicotinia tabacum homóloga a ABA4 é expressa ectopicamente. O gene é chamado Nicotinia tabacum ABA4 (NtABA4) com base nas homologias de sequências com A. thaliana ABA4. O NtABA4 é um gene que pertence à "família"prolongada das enzimas neoxantina sintase que catalisa a formação de trans-neoxantina de violaxantina. O produto do gene é muito provável de ser localizado nos plastídios através da analogia com AtABA4 e de acordo com as análises WoLFPSORT. Uma sequência de codificação de comprimento completo de 663 kb foi identificada e amplificada utilizando o cDNA da folha K326 como molde de PCR, clonada em um vetor pENTR Gateway (Invitrogen), sequenciada e transferida para o vetor pK2WG7 (vetor Gateway obtido do Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology, Gent, Belgium) para a expressão constitutiva em Nicotinia tabacum. As sequências de nucleotídeo e aminoácido de NtABA4 são apresentadas na SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente, e na figura 2. O NtABA4 apresenta 65 % de identidade no nível de aminoácido com a proteína de Arabidopsis AtABA4, Atlg67080. A amplificação de PCR que parte do gDNA de Hicks Broadleaf como modelo, nos permitiu identificar um homólogo de NtABA4 de 1808 pb. Ao comparar as sequências de cDNA e de gDNA, a estrutura do gene foi deduzida para demonstrar que o NtABA4 possui 4 introns e 5 exons (Figura 3A). As diferenças entre as isoformas K326 e Hicks BL NtABA4 existem (Figura 3B). A sequência de aminoácido de NtABA4 de Hicks Broadleaf possui 97 % de identidade com a sequência de K326 que devido a uma diferença de 6 aminoácidos e uma serina ausente na posição 9 (Figura 3C). Como indicado pelas comparações de rótulo das sequências expressas, a sequência genômica de NtABA4 não é um pseudogene visto que um rótulo de de sequência expressa (AM824569) tendo aspectos idênticos na extremidade N terminal foi identificado em uma biblioteca de sequência de estresse pelo frio NCBI de tabaco SNN. Para a engenharia de tabaco, a sequência de NtABA4 K326 cDNA é usada e constitutivamente expressa em TN90 sob o controle do promotor viral CaMV35S forte.

Exemplo 2: Clonagem de neoxantina sintase (NeSy) de Nicotinia tabacum

[00254] NeSy (licopeno beta ciclase), como ABA4, catalisa a formação da neoxantina (cis-neoxantina) a partir da violaxantina (ver a Figura 1). Esta enzima é provavelmente localizada em plastídios (com base na homologia à Arabadopsis thaliana NeSy). Começando com uma sequência disponível na base de dados do TGI, uma sequência de codificação de comprimento completo de 1482 kb (ver a Figura 4) é amplificada a partir do RNA K326, clonado em um vetor pENTR Gateway (Invitrogen), sequenciado e subclonado no vetor Gateway pK2WG7 (obtido da Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology, Gent, Belgium) para a super-expressão. Um clone BAC é identificado. A sequência genômica presente neste clone BAC mostra que o NtNeSy não possui nenhum intron na estrutura genômica e é muito provavelmente um gene de cópia única no tabaco. O cDNA de NtNeSy K326 é constitutivamente expresso em TN90 sob o controle do promotor CaMV35S para comparação com as plantas 35S::NtABA4.

Exemplo 3: Clonagem de 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase (CED2) de Nicotinia tabacum

[00255] CED2 (9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase) catalisa a clivagem de cis-neoxantina em C25-alênico-apo-aldeído e xantoxina (ver a Figura 1). A NtCED2 compartilha forte homologia com Arabidopsis AtNCED4, que está presente em plastoglóbulos e provavelmente cliva a neoxantina no cloroplasto da folha. Um fragmento de cDNA de tabaco é identificado no banco de dados TGI. A partir disso, uma sequência parcial (407 bp) é clonada em um vetor pENTR Gateway (Invitrogen), sequenciada e subclonada no vetor Gateway pK7GWIWG2(II), obtidos da Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology, Gent, Belgium. Neste caso, o fragmento de NtCED2 é expresso como um RNA grampo de cabelo nas plantas de tabaco que induzem o silenciamento do gene da transcrição de NtCED2 endógena correspondente (Figura 5).

Exemplo 4: Engenharia do tabaco TN90 Burley com cDNA de NtABA4

[00256] Um plasmídeo binário pK2WG7 que carrega a sequência de codificação de NtABA4 (Figura 2) é gerado para super-expressar este gene em Nicotinia tabacum. Este vetor inclui o promotor CaMV 35S do vírus do mosáico da couve-flor a montante do transgene que aciona a sua expressão constitutiva em todos os tecidos da planta e o gene kan/nptII para a seleção de canamicina (antibiótico) das linhagens transgênicas de Nicotinia tabacum em placas de ágar (100 mg/ml). O tabaco Burley TN90 é transformado com este constructo através de Agrobacterium tumefaciens utilizando um procedimento de disco de folha clássico. A partir dos calos, as linhagens individuais são regeneradas e selecionadas em canamicina. As linhagens de super- expressão T0 são então monitoradas pela PCR no DNA genômico utilizando um iniciador no promotor 35S (5’- GAGCATCGTGGAAAAAGAAGAC) e um iniciador dentro da sequência de codificação de NtABA4 que especificamente detecta a cópia transgênica de NtABA4através da RT-PCR utilizando iniciadores específicos de NtABA4. Sementes T1 foram coletadas, cultivadas novamente em placas de ágar contendo canamicina e monitoradas exatamente como para plântulas T0. A PCR em gDNA mostra que o T- DNA que abriga o cDNA de NtABA4 foi inserido no genoma nas linhagens selecionadas e a análise de RT-PCR permitiu a identificação de três linhagens em que o gene foi super-expressado. As plantas resistentes a canamicina são subsequentemente cultivadas em bandejas flutuante antes do cultivo no campo. Vinte plantas das três linhagens de NtABA4 (NtABA4 -I, NtABA-2 e NtABA-3), o controle de vetor (VC, pK7GWIWG2(II) vazio) e o tabaco de formação de TN90 US são cultivadas em quatro repetições de 20 plantas. Três meses após o transplante para o campo (36 dias após a cobertura), uma folha na posição de meia haste é experimentada em 10 plantas idênticas fora as 20 plantas na subparcela que representa uma réplica experimental. Estas folhas ("folhas verdes") são imediatamente armazenadas em gelo seco e liofilizadas. As plantas 35S::NtABA4 não apresentaram qualquer fenótipo visual diferente das plantas TN90 e VC após dois meses no campo. Junto das mesmas linhagens, os documentos de análise da altura da planta e teor de clorofila em que as linhagens transgênicas 35S::NtABA4 foram semelhantes aos controles TN90 e VC sugerem que a superexpressão de NtABA4 não teve impacto visível sobre as propriedades fenotípicas. O material foliar remanescente das 10 plantas selecionadas por subparcela e a linhagem é experimentada e curada de acordo com as práticas agrícolas Burley. Após a cura, três folhas na posição da meia haste são experimentadas. Para monitorar o efeito do aumento da expressão de NtABA4 nas três linhagens transgênicas (NtABA4-1, NtABA4-2 e NtABA4-3), "folhas verdes" e "folhas curadas"são trituradas e submetidas às análises de carotenoide.

Exemplo 5: Análises de carotenoide nas folhas verdes e curados das linhagens transgênicas 35S::NtABA4

[00257] Nas "folhas verdes" as análises quantitativas de carotenoides não são possíveis para todas as xantofilas devido às limitações técnicas, especialmente para a quantificação de neoxantina (baixas concentrações em Nicotinia tabacum e fraca separação analítica). Supõe-se que o conjunto de neoxantina (com base nas análises semi-quantitativas, dados não mostrados) possui uma tendência similar ao teor de luteina (e também o beta-caroteno em uma menor extensão) em TN90, VC, NtABA4-1, NtABA4-2 e NtABA4-3. Ambos os últimos pigmentos são utilizados como medidas representativas das concentrações de outros carotenoides (xantofilas) nas folhas verdes. Ao contrárioe, nas folhas senescentes e curadas tais suposições não são consideradas por causa do conjunto de neoxantina que é conhecido por ser rápida e completamente degradada. A análise de carotenoide é executada utilizando o método de HPLC clássico e detecção visível. Nas linhagens de super-expressão de NtABA4 mostra que a luteína é significativamente elevada nas linhagens de NtABA4-2 e NtABA4-3, quando comparadas com o tipo selvagem e controle de vetor. A superexpressão dos resultados de NtABA4 em uma luteína da folha aumenta de 30 % e 26 % nas linhagens de NtABA4-2 e NtABA4- 3, respectivamente, quando comparadas com as linhagens de formação de TN90 e controle de vetor. Além disso, o beta-caroteno também é significativamente mais elevado nas linhagens de NtABA4 (cerca de 15 % mais elevado) em comparação com o TN90 tipo selvagem. Estes dados indicam que a superexpressão de NtABA4 possui um efeito de aumento global dos carotenoides. O aumento nos carotenoides dentro das linhagens de plantas transgênicas é significativa (P < 0,05, teste T).

[00258] A análise de carotenoides nas folhas curadas mostra globalmente uma diminuição nos conjuntos de luteína e beta-caroteno em comparação com as folhas verdes. De 87 a 95 % da luteína e beta- caroteno presentes nas amostras verdes é degradado durante a cura em todas as linhagens transgênicas do tipo selvagem, de controle de vetor e 35S::NtABA4. Isso sugere que estes carotenoides são submetidos às modificações ativas enzimáticas ou químicas durante a cura. A presença de grandes variações dentro de cada conjunto de amostras curadas indica que o catabolismo de carotenoide durante a cura é um processo menos "controlado" e homogêneo do que a síntese de carotenoide nas folhas verdes. A análise de teste T mostra que o teor de luteína é significativamente diferente quando se compara com as seguintes linhagens: NtABA4-2 é maior do que TN90 (P < 0,001I) e o controle de vetores (P < 0,05); o controle do vetor é superior TN90 (P < 0,05) e NtABA4 - 1 é maior do que TN90 (P < 0,05). O teor de beta- caroteno é maior no controle do vetor (P < 0,05) e NtABA4-1 (P < 0,01 I) quando comparada com TN90.

Exemplo 6: Análise de carotenoide das linhagens de RNA interferente 35S::NeSy e NtCED2 selecionadas

[00259] Como descrito para o 35S::NtABA4, as linhagens transformadas por RNA interferente de 35S::NtNeSy e NtNCED2 são selecionadas com base na genotipagem e RT-PCR. Como um resultado, duas linhagens de RNA interferente de 35S::NtNeSy e NtNCED2 são identificadas e plantadas em quatro repetições ao mesmo tempo e no mesmo campo. O teor dos principais carotenoides (luteína e de beta-caroteno) é determinado nas linhagens de RNA interferente de NCED2 e 35S::NtNeSy. As linhagens tanto de RNA interferente NCED2 quanto 35S::NtNeSy apresentam um aumento nos principais carotenoides nas folhas verdes, confirmando que estes dois genes candidatos para a transformação da planta afetam o metabolismo de carotenoide na folha de tabaco. No entanto, quando se compara todas as linhagens de transgênicas selecionadas, a superexpressão de NtABA4 parece ser mais eficiente para alcançar um aumento geral de carotenoides nas folhas verdes.

[00260] O material folhoso colhido é submetido à cura ao ar a fim de confirmar que as alterações observadas de carotenoide resultam em quantidades alteradas de beta-damascenona produzidas no respectivo aerossol. A fim de selecionar as amostras curadas mais promissores, a amostra/linhagens com as mudanças mais drásticas em luteína, beta- caroteno e neoxantina (dados semi-quantitativos) nas folhas verdes são selecionadas. Estas amostras/linhagens foram RNA-1_4 interferente de NtNeSy-1_2, NtABA4-2_2 e NtNCED2, respectivamente (Figura 6). Uma suposição aqui é que a neoxantina ou possivelmente outros carotenoides que se acumulam nas folhas verdes são convertidos em folhas curadas em beta-damascenona-glucosídeo ou outros precursores de beta-damascenona, que são então liberados por aquecimento.

Exemplo 7: Análise de beta-damascenona nas linhagens transgênicas selecionadas

[00261] Para analisar o teor de beta-damascenona no aerossol formado após o aquecimento do tabaco curado de TN90-4 (controle), as linhagens de amostra de RNA-1_4 interferente de NtNeSy-1_2, NtABA4-2_2 e NtNCED2, os aerossóis de carga cortada de tabaco impregnado são gerados. A plataforma de fumegação utilizada é simuador de fumar com fonte de calor NHS (54W), incluindo um regime de 12 baforadas de 2 segundos cada. Antes da fumegação, a lâmina curada de tabaco é cortada e impregnada com 20 % de glicerina. Os aerossóis produzidos pelo aquecimento de tabacos curados impregnado (100 mg, 3 repetições completas) são capturados no filtro Cambridge PAD. Os PADs foram introduzidos em um frasco contendo 10 ml de água/EtOH (9/1, v/v). O beta-damascenona foi extraída pelo método Stir Bar Sorbtive Extraction (conforme descrito em Lancas et aI. (2009) J. Sep. Sci. 32, 813-824). Este método permite a extracção de compostos químicos que apresentam afinidade para a fase de adsorção. A barra de agitação é dessorvida termicamente em um injetor GC-MS e analisada com relação à beta-damascenona. Comparado com TN90 (controle), a amostra de NtABA4-2_2 apresentou um aumento de 68 % de beta-damascenona no aerossol (Figura 7). Esta diferença é estatisticamente significativa (P < 0,01, teste T). Estes resultados sugerem que a associação de precursores de beta-damascenona nas folhas curadas seja reforçada pela expressão ectópica de NtABA4 enquanto que o efeito dos dois outros genes alvo, NtNeSy (superexpressão) e NtNCED2 (silenciamento do RNA interferente), é o que se parece com o controle TN90. Assim, a superexpressão de NtABA4, mas não a engenharia de NtNeSy ou NtNCED nas folhas de tabaco, leva provavelmente à produção elevada de precursores de beta- damascenona.

[00262] Qualquer publicação aqui citada ou descrita fornece informações relevantes divulgadas antes da data de depósito do presente pedido. As declarações aqui não devem ser interpretadas como uma admissão de que os inventores não são habilitados de antecipar tais divulgações. Todas as publicações mencionadas no relatório descritivo acima são aqui incorporadas por referência. Várias modificações e variações da invenção serão evidentes para aqueles versados na técnica sem divergir do escopo e espírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com as modalidades preferidas específicas, deve ficar entendido que a invenção como reivindicada não será indevidamente limitada a tais modalidades específicas. De fato, várias modificações dos modos descritos para realizar a invenção que são óbvias para aqueles versados em biologia celular, molecular e vegetal campos relacionados se destinam a estar dentro do escopo das seguintes reivindicações.

Claims (8)

1. Processo para produzir uma célula de planta de tabaco transgênico tendo um perfil de sabor alterado, caracterizado pelo fato de compreender a introdução na célula de planta de tabaco: (i) um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência que codifica uma neoxantina sintase e tendo a sequência da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID No. 6; ou (ii) um constructo, vetor ou vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo isolado apresentado em (i), e em que a expressão ou a atividade da neoxantina sintase na célula de planta de tabaco transgênica é aumentada em comparação com um controle ou célula de planta de tabaco tipo selvagem.

2. Processo para produzir uma planta de tabaco transgênica tendo o perfil de sabor alterado, caracterizado por compreender a introdução na planta de tabaco de: (i) um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência que codifica uma neoxantina sintase e tendo a sequência da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID No. 6; ou (ii) um constructo, vetor ou vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo isolado apresentado em (i), e em que a expressão ou a atividade da neoxantina sintase na planta de tabaco transgênica é aumentada em comparação com um controle ou planta de tabaco tipo selvagem.

3. Método para aumentar o teor de carotenoide de uma planta de tabaco de modo a alterar o perfil de sabor de uma planta de tabaco, caracterizado por compreender as etapas de: (a) aumentar a expressão ou atividade de neoxantina sintase na planta de tabaco transformando a planta do tabaco com uma neoxantina sintase, em que a neoxantina sintase compreende um polinucleotídeo compreendendo, consistindo em uma sequência que codifica uma neoxantina sintase e tendo a sequência da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID No. 6; (b) medir o teor de carotenoide em pelo menos uma parte da planta de tabaco transgênica obtida na etapa (a); e (c) identificar uma planta de tabaco transgênica, em que o teor de carotenoide nela aumentou em comparação com uma planta de controle de tabaco, em que a expressão ou atividade de neoxantina sintase não foi aumentada.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a expressão ou atividade de licopeno beta ciclase é aumentada ou a expressão ou atividade do 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase é diminuída ou uma combinação destas na planta de tabaco; em que o aumento da expressão ou atividade do licopeno beta ciclase e a diminuição da expressão ou atividade do 9-cis- epoxicarotenoide dioxigenase aumentam o teor de carotenoides na planta de tabaco, em que a licopeno beta ciclase compreende a sequência de polinucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 8, e em que a 9-cis- epoxicarotenoide dioxigenase compreende a sequência de polinucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 13.

5. Método para aumentar o teor de beta-damascenona em uma planta de tabaco de modo a alterar o perfil de sabor do tabaco em uma planta, caracterizado por compreender as etapas de: (a) aumentar a expressão ou atividade de neoxantina sintase na planta de tabaco transformando a planta do tabaco com uma neoxantina sintase, em que a neoxantina sintase compreende um polinucleotídeo compreendendo, consistindo em uma sequência que codifica uma neoxantina sintase e tendo a sequência da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID No. 6; (b) medir o teor de beta-damascenona em pelo menos uma parte da planta de tabaco transgênica obtida na etapa (a) ou um aerossol do mesmo; e (c) identificar uma planta de tabaco transgênica em que o teor de beta-damascenona aumentou em comparação com uma planta de controle de tabaco, em que a expressão ou a atividade de neoxantina sintase não foi aumentada.

6. Artigo fumável caracterizado pelo fato de que compreende tabaco curado obtenível de uma célula de planta tabaco transgênica produzida pelo processo como definido na reivindicação 1, ou pelo menos uma parte da planta de tabaco produzida pelo processo como definido na reivindicação 2.

7. Método para a produção de beta-damascenona caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) fornecer pelo menos parte de uma planta de tabaco produzida pelo processo como definido na reivindicação 2 ou o produto de tabaco como definido na reivindicação 6; e (b) fornecer também calor para produzir um aerossol compreendendo beta-damascenona.

8. Constructo, vetor ou vetor de expressão caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência que codifica uma neoxantina sintase e tendo a sequência da SEQ ID No. 6 e um promotor heterólogo recombinante.

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