MX2014005298A - Modulacion de beta-damascenona en plantas. - Google Patents

Modulacion de beta-damascenona en plantas.

Info

Publication number
MX2014005298A
MX2014005298A MX2014005298A MX2014005298A MX2014005298A MX 2014005298 A MX2014005298 A MX 2014005298A MX 2014005298 A MX2014005298 A MX 2014005298A MX 2014005298 A MX2014005298 A MX 2014005298A MX 2014005298 A MX2014005298 A MX 2014005298A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
plant
polynucleotide
sequence
seq
beta
Prior art date
Application number
MX2014005298A
Other languages
English (en)
Other versions
MX356893B (es
Inventor
Lucien Bovet
Jeremy Catinot
Joanne Schwaar
Original Assignee
Philip Morris Products Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from EP11187332.9A external-priority patent/EP2586792A1/en
Application filed by Philip Morris Products Sa filed Critical Philip Morris Products Sa
Publication of MX2014005298A publication Critical patent/MX2014005298A/es
Publication of MX356893B publication Critical patent/MX356893B/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/825—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving pigment biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
    • C12Y503/99—Other intramolecular oxidoreductases (5.3.99)
    • C12Y503/99009—Neoxanthin synthase (5.3.99.9)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Manufacture Of Tobacco Products (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Una célula de planta que no ocurre de manera natural o transgénica, mutante, que comprende: (i) un polinucleótido que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia que codifica una neoxantina sintasa y que tiene al menos 60% de identidad de secuencia para SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:6; (ii) un polipéptido codificado por el polinucleátido expuesto en (i); (iii) un polipéptido teniendo al menos 66% de identidad de secuencia para SEQ ID NO:2 o al menos 60% de identidad de secuencia para SEQ ID NO: 7; o (iv) un constructo, vector o vector de expresión que comprende el polinucléotido aislado expuesto en (i), y en donde la expresión o actividad de la neoxantina sintasa es modulada como se compara con una planta de control o tipo silvestre.

Description

MODULACIÓN DE BETA-DAMASCENONA EN PLANTAS Campo de la Invención La presente invención describe una secuencia de polinucleótido de neoxantina sintasa, licopeno beta ciclasa y dioxigenasa 9-cis-epoxicarotenoide de Nicotiana tabacum y variantes, homólogos y fragmentos de las mismas. En particular se describe la modificación de la expresión de neoxantina sintasa o la actividad de una proteína codificada de esta forma para modular la cantidad de beta-damascenona que es detectable en el aerosol de tabaco calentado, que da como resultado nuevos perfiles de sabor en el tabaco.
Antecedentes de la Invención La beta-damascenona es un factor de aroma en el aerosol de destilación del tabaco curado. Tiene un sabor afrutado o de manzana cocinada típico, que también se puede encontrar naturalmente en Rosa damascena Mili (la rosa de Damasco), que indica de esta forma la existencia de una trayectoria enzimática que conduce a su síntesis en algunas plantas. Las flores de Rosa damascena son reconocidas por su fina fragancia, y se recolectan comercialmente para aceite de rosas utilizado en perfumería y para elaborar agua de rosas. Algunas veces los pétalos de la flor también se utilizan directamente para dar sabor a alimentos o bebidas, y se consideran seguros para el consumo humano.
Los carotenoides son precursores potenciales de la producción de beta-damascenona . La oxidación térmica de neoxantina conduce a la formación de beta-damascenona. La neoxantina es un derivado carotenoide oxigenado que pertenece a la clase de xanthophylls y consiste en ocho unidades isoprenoide. En hojas senescentes y curadas, no está presente la neoxantina libre o se detecta únicamente en niveles muy bajos. Dentro de la trayectoria carotenoide de la planta que ocurre en los cloroplastos - tal como cloroplastos - enzimas conocidas por formar neoxantina, pertenecen a la clase de neoxantina sintasas. La neoxantina sintasa cataliza la formación de neoxantina de la violaxantina es codificada por el polinucleótido ABA4. La licopeno beta ciclasa también cataliza la formación de neoxantina a partir de violaxantina, y es codificada por el polinucleótido NeSy. La dioxigenasa(s) 9-cis-epoxicarotenoide cataliza la disociación de c s-neoxantina en C25-alénico-apo-aldehído y xanotina y es codificada por el polinucleótido NCED2.
Existe una continua necesidad en la técnica de materiales de plantas - tal como tabaco - con perfiles de sabor modificados. Es un objeto de la presente invención satisfacer esta necesidad.
Breve Descripción de la Invención Los genes ABA4, NeSy y NCED2 correspondientes han sido clonados y secuenciados a partir de Nicotiana tabacum, y se ha investigado el efecto de la expresión modulada de estos genes. Las enzimas codificadas por los polinucleótidos NeSy y NCED2 se consideran los componentes de la trayectoria biosintética carotenoide y activan la expresión del polinucleótido NeSy y la desactivación de la expresión del polinucleótido NCED2 en la planta se encontró que incrementa el contenido carotenoide. Sin embargo, la producción alterada de beta-damascenona no fue detectada. Sorprendentemente, los inventores descubrieron que al incrementar la expresión de polinucleótido ABA4 no sólo se incrementó en contenido carotenoide si no también se incrementó significativamente el contenido de beta-damascenona en el aerosol formado después de calentar tabaco curado preparado a partir de una planta de tabaco. Este descubrimiento fue incluso más sorprendente ya que el polinucleótido NeSy codificó una enzima que actúa en el mismo punto en la trayectoria biosintética carotenoide como el polinucleótido ABA4, aunque el polinucleótido NeSy se descubrió que no tiene efecto significativo en los niveles de beta-damascenona. Sin pretender limitarse a teoría alguna en particular, este descubrimiento sugiere que una neoxantina sintasa codificada por el polinucleótido ABA4 desempeña un papel central en la síntesis de beta-damascenona en Nicotiana tabacum. Esto permite que las plantas sean producidas, en donde se modulan los niveles de beta-damascenona y por lo tanto tienen perfiles de sabor alterado. Las plantas pueden ser diseñadas de modo que se module el contenido carotenoide de las mismas. Dichas plantas pueden tener beneficios nutricionales para el consumidor. Además, la modulación del contenido carotenoide de una planta puede utilizarse para generar plantas que son resistentes a herbicidas que inhiben la biosíntesis carotenoide, lo cual puede extender el uso de inhibidores carotenoides como herbicidas para cosechas que son actualmente sensibles a estos compuestos. Convenientemente, estos cambios no alteran sustancialmente la apariencia visual de las plantas, lo cual es un criterio importante para la aceptación por parte de la industria, y para maximizar los rendimientos de la planta y similares.
ASPECTOS Y MODALIDADES DE LA INVENCIÓN Los aspectos y modalidades de la presente invención se establecen en las reivindicaciones adjuntas.
En un aspecto se proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia que codifica neoxantina sintasa y que tiene al menos el 60% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:1 o SEC ID No. 6.
En otro aspecto se proporciona un polipéptido aislado codificado mediante el polinucleótido.
En otro aspecto, se proporciona un polipéptido aislado que tiene al menos el 66% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:2 o al menos el 60% de identidad de secuencia con la SEC ID No. 7.
En otro aspecto, se proporciona una construcción, vector o vector de expresión que comprende el polinucleótido(s) aislado.
En otro aspecto, se proporciona una célula de planta mutante, de origen no natural o transgénica que comprende el polinucleótido(s) aislado, el polipéptido o la construcción, vector o vector de expresión aquí descrito, y en donde la expresión o actividad de la neoxantina sintasa se modula en comparación con la planta de control o tipo silvestre.
En una modalidad, la planta mutante, de origen no natural o transgénica comprende la célula de la planta.
En otro aspecto, se proporciona un método para modular el contenido carotenoide de una planta, en donde el método comprende los pasos de: (i) modular la expresión o actividad de neoxantina sintasa en la planta, preferentemente, en donde la neoxantina sintasa comprende la secuencia de polinucleótido o la secuencia de polinucleótido aquí establecida; (ii) medir el contenido carotenoide en al menos una parte de la planta mutante, de origen no natural o transgénica obtenida en el paso (i); y (iii) identificar una planta mutante, de origen no natural o transgénica en donde el contenido carotenoide en la misma ha cambiado en comparación con una planta de control en donde la expresión o actividad de neoxantina sintasa no ha sido modulada.
En una modalidad, la expresión o actividad de licopeno beta ciclasa o dioxigenasa 9-cis-epoxicarotenoide o una combinación de las mismas se modula en la planta.
En una modalidad, la licopeno beta ciclasa comprende la secuencia de polinucleótido establecida en la SEC ID NO:8 o tiene al menos el 60% de identidad de secuencia con la misma o la secuencia de polinucleótido comprende la establecida en la SEC ID NO:9 o tiene al menos el 60% de identidad de secuencia con la misma y en donde la dioxigenasa 9-cis-epoxicarotenoide comprende la secuencia de polinucleótido establecida en la SEC ID NO: 13 o tiene al menos el 60% de identidad de secuencia con la misma.
En otro aspecto, se proporciona un método para modular el contenido de beta-damascenona en una planta, en donde el método comprende los pasos de: (i) modular la expresión o actividad de neoxantina sintasa en la planta, preferentemente, en donde la neoxantina sintasa comprende la secuencia de polinucleótido o la secuencia de polinucleótido aquí descrita; (ii) medir el contenido de beta-damascenona en al menos una parte de la planta mutante, de origen no natural o transgénica obtenida en el paso (i); y (iii) identificar una planta mutante, de origen no natural o transgénica en donde el contenido de beta-damascenona en la misma ha cambiado en comparación con una planta de control en donde la expresión o actividad de neoxantina sintasa no ha sido modulada.
En otro aspecto, se proporciona una planta mutante, de origen no natural o transgénica o un material de planta derivado o que se puede derivar de la misma, que se obtiene o se puede obtener a través del método(s) aquí descrito.
En otro aspecto, se proporciona una planta mutante, de origen no natural o transgénica, en donde la expresión de una neoxantina sintasa o la actividad de la proteína codificada de esta forma ha sido incrementada; en donde el contenido de luteina de hoja verde o el contenido de beta-caroteno o el contenido combinado de luteína y beta-caroteno de la planta, es mayor a una planta de control, en donde la expresión o la actividad de neoxantina sintasa no ha sido incrementada; y en donde el contenido de beta-damascenona en aerosol del material de la planta curada es de al menos 10% más que el aerosol de la planta de control, preferentemente, en donde: (i) el contenido de luteína de hoja verde de la planta es al menos aproximadamente 18 mg/100 g; (ii) en donde el contenido de la beta-carotena de la planta es al menos aproximadamente 12 mg/100 g; y (iii) en donde el contenido de beta-damascenona en el aerosol al momento de calentar la biomasa de la hoja de la planta es de al menos aproximadamente 1 ng/mg.
En otro aspecto, se proporciona material de la planta que incluye biomasa, semilla u hojas de la planta aquí descrita.
En otro aspecto, se proporciona un producto de tabaco que comprende las células de la planta, al menos una parte de la planta o un material de la planta aquí descrito.
En otro aspecto, se proporciona un método para producir beta-damascenona, en donde el método comprende los pasos de: (a) proporcionar al menos una parte de una planta, material de la planta o producto de tabaco tal como aquí se describe; y (b) proporcionar calor a la misma para producir un aerosol que comprende beta-damascenona.
Los aspectos adicionales incluyen los siguientes: Un gen quimérico que comprende uno o más polinucleótidos aislados aquí descritos, enlazados en forma operable a una o más secuencias reguladoras.
Una construcción de polinucleótido que comprende uno o más de polinucleótidos aislados aquí descritos y que comprende, consiste o consiste esencialmente de al menos 15 a 30 nucleótidos, 30 a 50 nucleótidos, 50 a 100 nucleótidos, 100 a 150 nucleótidos, 150 a 200 nucleótidos, 200 a 300 nucleótidos, 300 a 400 nucleótidos, 400 a 500 nucleótidos, 500 a 600 nucleótidos o 600 a 700 nucleótidos.
Un producto consumible que incorpora o utiliza material de la planta, biomasa, semilla u hojas tal como aquí se describe.
Una línea celular que comprende el polinucleótido aislado, el gen quimérico, la construcción de polinucleótido, el ARN de hebra doble, el conjugado o el vector de expresión y similares tal como aquí se describe. Un método para modular la expresión de uno o más polinucleótidos aquí descritos o la actividad de uno o más polipéptidos codificados en una célula, en donde el método comprende administrar el gen quimérico, la construcción de polinucleótido, el ARN de hebra doble, el conjugado o el vector de expresión tal como aquí se describe.
Un método para detectar, aislar, amplificar o analizar uno o más de los polinucleotidos aquí descritos, en donde el método comprende el paso de proporcionar una muestra que comprende un polinucleótido e hibridar el polinucleótido para una molécula de polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótido de al menos 10 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótido aislada.
Un método para modular el contenido de carotenoide y el contenido de beta-damasceonona y el contenido carotenoide o el contenido de beta-damasceonona en al menos parte de una planta en comparación con una planta de control, en donde el método comprende el uso de un agente que modula la expresión de uno o más de los polinucleotidos aquí descritos o la actividad de la proteína codificada de esta forma.
El uso de un agente que modula la expresión de uno o más polinucleotidos aquí descritos o la actividad de la proteína codificada de esta forma para modular el contenido de carotenoide y el contenido de beta-damasceonona o el contenido carotenoide o el contenido de beta-damasceonona en al menos una parte de una planta en comparación con una planta de control.
En una modalidad, el agente es o se deriva de, un gen de polinucleótido quimérico, una construcción de polinucleótido que comprende uno o más de los polinucleótidos, un ARN antisentido, un ARN de hebra doble, un cADN, un conjugado que comprende uno o más de los polinucleótidos o al menos una porción sin nucleótido o sin polinucleótido enlazada en forma covalente al mismo, una ribosima, un mutageno, un dedo de zinc, una molécula pequeña o una meganucleasa.
En otra modalidad, el fragmento(s) de polinucleótido fragmento(s) codifica un ácido nucleico antisentido, una ribozima, un ARN que efectúa la transdivisión transmitida por espliceosoma, un ARN de interferencia, un ARN guía u otro ARN no traducido y similares. En otra modalidad, el fragmento(s) de polinucleótido codifica un ARN de interferencia.
Breve Descripción de las Figuras Figura 1. Versión simplificada de la trayectoria de carotenoide en plantas. Neoxantina y luteina son candidatos precursores que contribuyen a la formación de beta-damascenona en las hojas. Adicionalmente, hasta ahora los pasos no caracterizados incluyen la formulación de glucósido y la degradación bacteriana durante la curación, respectivamente.
Figura 2. (A) Secuencia de cADN NtABA4 amplificada a partir de K326 utilizada para diseñar plantas 35S::NtABA4; (B) secuencia traducida NtABA4; (C) Cebadores directos (F) inversos (R) utilizados para amplificar la secuencia NtABA4. Se requiere la secuencia 5' cace en el cebador F para clonación en los vectores pENTER Gateway.
Figura 3. Clonar y secuenciar una secuencia genómica de tabaco a partir de Hicks de Hoja Ancha que corresponden a una copia del gen NtABA4. (A) Esta secuencia genómica con cinco exones y cuatro intrones cubre un total de 1808 pb (bordes de intrón de 1792 + 16 pb). (B) El cADN NtABA4 (T) y la isoforma N1ABA4 genómica clonada (CQ) no son idénticas. (C) La copia NIABA4 larga 786 pb anticipada deducida de la secuencia genómica (Sbjct) difiere en 7 aminoácidos del cADN N1 ABA4 clonado (consulta) que incluye una serina en la posición 9 en el péptido de transito de cloroplasto que está ausente en la copia genómica .
Figura 4. (A) Secuencia de ADN NtNeSy amplificada a partir de K326 utilizada para diseñar platas 35S:: ?/eSy; (8) Secuencia traducida NtNeSy; (C) Cebadores directos (F) inversos (R) utilizados para amplificar la secuencia NtNeSy. Se guía la secuencia 5' cace de un cebador F para clonación en los vectores pENTER Gateway.
Figura 5. (A) Secuencia de cADN parcial NtNCED2 utilizada para diseñar plantas de ARN de interferencia NtNCED2. (B) Cebadores directos (F) inversos (R) utilizados para amplificar la secuencia parcial NtNCED2. La secuencia 5' cace en el cebador F se requiere para clonación en los vectores pENTER Gateway.
Figura 6. Concentraciones de luteina, beta-carotena y semi cuantificación de neoxantina en muestras "verdes" (conjuntos de hojas) de líneas seleccionadas de ARN-1_4 (CED2-1_4) de interferencia TN90-4, 35S::A/íA/eSy-1_2 (NeSyl -2), 35S::NIABA4-2_2 (ABA4-2_2) y NtNCED2.
Figura 7. Contenido de beta-damascenona en aerosol (Aerosol), tabaco curado (Tobacco) y tapones de tabaco después de la formación de aerosol (Tapón) de las líneas de ARN-1_4 (CED2-1_4) de interferencia TN90-4 (TN90 control), 35S::A/fA/eSy-1_2 (NeSy1-2), 35S:: NtABA4-2_2 (ABA4-2-2) y NtNCED2) . La cuantificación de beta-damascenona se lleva a cabo por triplicado, incluyendo simulador de humo, captación de aerosol y cuantificación de beta-damascenona. El análisis de prueba T muestra que el contenido de beta-damascenona en el aerosol de la línea NtABA4-2_2 es estadísticamente diferente a TN90-4 (P<0.01) y que el contenido de beta-damascenona en el tapón de la línea NtABA4-2_2 es estadísticamente diferente a TN90-4 (P<0.05).
DEFINICIONES Los términos técnicos y las expresiones utilizadas dentro del alcance de la presente solicitud serán el significado comúnmente aplicado a los mismos en la técnica pertinente de biología molecular y de plantas. Todas las definiciones de los términos que se encuentran a continuación aplican para el contenido total de la presente solicitud. La palabra "que comprende" no excluye otros elementos o pasos, y el artículo indefinido "un" o "una" no excluyen la pluralidad. Un solo paso puede cumplir con las funciones de diversas de las características mencionadas en las reivindicaciones. Los términos "alrededor de", "esencialmente" y "aproximadamente" dentro del contexto de un valor o rango numérico determinado se refiere a un valor o rango que está dentro del 20%, dentro del 10%, o dentro del 5%, 4%, 3%, 2% o 1% del valor o rango determinado.
El término "aislado" se refiere a cualquier entidad que se toma de su medio natural, aunque el término no indica algún grado de purificación.
Un "vector" se refiere a un vehículo de ácido nucleico que comprende la combinación de los componentes de ácido nucleico para permitir el transporte de ácido nucleico, construcción de ácido nucleico y los conjugados de ácido nucleico y similares. Los vectores adecuados incluyen episomas con la capacidad de réplica extra-cromosomal tal como plásmidos de ácido nucleico de hebra doble, circulares, plásmidos de ácido nucleico de hebra doble linealizados; y otros vectores de cualquier origen.
Un "vector de expresión" es un vehículo de ácido nucleico que comprende una combinación de componentes de ácido nucleico para permitir la expresión del mismo, tal como el polinucleótido ABA4, las construcciones de ácido nucleico y los conjugados de ácido nucleico y similares. Los vectores de expresión adecuados incluyen episomas con la capacidad de réplica extra-cromosomal tal como plásmidos de ácido nucleico de hebra doble, circular, plásmidos de ácido nucleico de hebra doble linealizados; y otros vectores de expresión funcionalmente equivalentes de cualquier origen. Un vector de expresión comprende al menos un promotor colocado en una corriente ascendente enlazado en forma operable a un ácido nucleico, construcciones de ácido nucleico o conjugado de ácido nucleico tal como se define más adelante.
El término "construcción" se refiere a un fragmento de ácido nucleico recombinante de hebra doble, que comprende uno o más polinucleótidos. La construcción comprende una "hebra de plantilla" con pares base con un "hebra de sentido o codificación" complementarias. Una construcción determinada puede ser insertada en un vector en dos orientaciones posibles, ya sea en la misma orientación o (o de sentido) o en la orientación inversa (o anti-sentido) con respecto a la orientación de un promotor colocado dentro de un vector - tal como un vector de expresión.
Un "promotor" se refiere a un elemento/secuencia de ácido nucleico, normalmente colocado en la corriente ascendente y enlazado en forma operable a un fragmento de ADN de hebra doble. Los promotores se pueden derivar completamente de las regiones próximas a un gen de interés nativo, o pueden estar compuestas de diferentes elementos derivados de diferentes promotores nativos o segmentos de ADN sintéticos.
El término "homología, identidad o similitud" se refiere al grado de similitud de secuencia entre dos polipéptidos o entre dos moléculas de ácido nucleico comparadas mediante alineación de secuencia. El grado de homología entre dos secuencias de ácido nucleico separadas que están siendo comparadas y son la función del número de nucleótidos idénticos, o correspondientes, en posiciones comparables. El porcentaje de identidad puede determinarse mediante inspección visual y el cálculo matemático. Alternativamente, el porcentaje de identidad de dos secuencias de ácido nucleico puede determinarse comparando la información de secuencia utilizando un programa de cómputo tal como - ClustalW, BLAST, FASTA o Smit-Waterman.
El término "planta" se refiere a cualquier planta en cualquier etapa de su ciclo de vida o desarrollo, y su progenie. En una modalidad, la planta es una "planta de tabaco", que se refiere a una planta que pertenece al género Nicotiana. Las especies de planta de tabaco preferidas se describen a continuación.
Una "célula de planta" se refiere a una unidad de una planta estructural y fisiológica. La célula de planta puede estar en la forma de un protoplasto sin una pared celular, o en una célula simple aislada o una célula de cultivo, o como parte de una unidad organizada superior, tal como pero sin limitarse a, tejido de planta, órgano de planta, o la planta completa.
El término "material de la planta" se refiere a cualquier composición sólida, líquida o gaseosa, o una combinación de las mismas, que se puede obtener de una planta, incluyendo biomasa, hojas, tallos, raíces, flores o partes de flores, frutos, polen, células de huevo, cigotos, semillas, esquejes, secreciones, extractos, cultivos celulares o de tejido, o cualquiera de otras partes o productos de una planta. En una modalidad, el material de la planta comprende o consiste en biomasa, semillas u hojas. En otra modalidad, el material de la planta comprende o consiste de hojas.
El término "variedad" se refiere a una población de plantas que comparten características constantes que las separan de otras plantas de la misma especie. Aunque posean uno o más rasgos distintivos, una variedad está caracterizada en forma adicional por una variación general muy pequeña entre individuos dentro de la variedad. Una variedad con frecuencia se vende comercialmente.
El término "línea" o "línea de cultivo" tal como se utiliza en la presente invención, indica un grupo de plantas que se utilizan durante el cultivo de plantas. Una línea se puede distinguir de una variedad ya que muestra una pequeña variación entre los individuos para uno o más rasgos de interés, aunque pueda haber cierta variación entre individuos para otros rasgos.
El término "modular" se puede referir a reducir, inhibir, incrementar o de otra manera afectar la expresión o actividad de un polipéptido. El término también se puede referir a reducir, inhibir, incrementar o de otra forma afectar la actividad de un gen que codifica un polipéptido que puede incluir, pero no se limita a, modular la actividad de transcripción.
El término "reducir" o "reducido" tal como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una reducción de aproximadamente el 10% hasta aproximadamente el 99%, o una reducción de al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98%, al menos el 99%, al menos el 100% o más de una cantidad o una actividad, tal como pero sin limitarse a, actividad de polipéptido, actividad de transcripción y expresión de proteína.
El término "inhibir" o "inhibido" tal como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una reducción de aproximadamente el 98% hasta aproximadamente 100%, o una reducción de al menos el 98%, al menos el 99%, aunque particularmente del 100%, de una cantidad o una actividad, tal como pero sin limitarse a, actividad de polipéptido, actividad de transcripción y expresión de proteína.
El término "incrementar" o "incrementado" tal como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un incremento de desde aproximadamente el 5% hasta aproximadamente el 99%, o un incremento de al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98%, al menos el 99%, o al menos el 100% o más de una cantidad o una actividad, tal como pero sin limitarse a una actividad de polipéptido, actividad de transcripción y una expresión de proteína.
El término "control" dentro del contexto de una planta de control significa una planta o célula de planta en donde la expresión o actividad de una enzima no se ha modificado (por ejemplo, incrementar o reducir) y, de esta forma puede proporcionar una comparación con una planta en cual la expresión o actividad de la enzima ha sido modificada. La planta de control puede comprender un vector vacío. La planta de control puede corresponder a una planta de tipo silvestre.
Descripción Detallada de la Invención En una modalidad, se proporciona un polinucleotido aislado que comprende, consiste, o consiste esencialmente de una secuencia de polinucleotido que tiene al menos el 60% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias aquí descritas, incluyendo cualquiera de los polinucleótidos mostrados en el listado de secuencia. En forma adecuada, el polinucleotido aislado comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia que tiene al menos el 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la misma.
En otra modalidad, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia de polinucleótido que codifica una neoxantina sintasa y que tiene al menos el 60% de identidad de secuencia con SEC ID No. 1. En forma adecuada, el polinucleótido aislado comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia que tiene al menos aproximadamente el 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con SEC ID No. 1.
En otra modalidad, se proporciona un polinucleótido aislado, que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia de polinucleótido que codifica una licopeno beta ciclasa que tiene al menos el 60% de identidad de secuencia con SEC ID No. 8. En forma adecuada, el polinucleótido aislado comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia que tiene al menos aproximadamente el 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de la identidad de secuencia con SEC ID No. 8.
En otra modalidad, se proporciona un polinucleótido aislado, que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia de polinucleótido que codifica una dioxigenasa 9-c/s-epoxicarotenoide y que tiene al menos el 60% de la identidad de secuencia con SEC ID No. 13. En forma adecuada el polinucleótido aislado, comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia que tiene al menos aproximadamente el 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%>, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de la identidad de secuencia con la SEC ID No. 13.
Tal como se utiliza en la presente descripción, el término "polinucleótido" se refiere a un polímero de nucleótidos, que puede ser ácido desoxirribonucleico (ADN) o un ácido ribonucleico (ARN) no modificado o modificado. Por consiguiente, un polinucleótido puede ser, sin limitación, un ADN genómico, ADN complementario (cADN), mARN o ARN antisentido o un fragmento(s) del mismos. Además, un polinucleótido puede ser un ADN de hebra simple o de hebra doble, el ADN que es una mezcla de regiones de hebra simple y hebra doble, una molécula híbrida que comprende ADN y ARN, o una molécula híbrida con una mezcla de regiones de hebra simple o hebra doble o un fragmento(s), del mismo. Además, el polinucleótido puede estar compuesto de regiones de hebra triple que comprende regiones ADN, ARN, o ambos, o un fragmento(s) del mismo. Un polinucleótido puede contener una o más bases modificadas, tal como fosfotioatos, y puede ser un ácido nucleico de péptido. Generalmente, los polinucleótidos puede ensamblarse de fragmentos aislados o clonados de cADN, ADN genómico, oligonucleótidos, o nucleótidos individuales, o una combinación de los anteriores. Aunque las secuencias de polinucleótido aquí descritas se muestran como secuencias de ADN, las secuencias incluyen sus secuencias de ARN correspondientes, y sus secuencias de ADN o ARN complementarias (por ejemplo, totalmente complementarias), incluyendo los complementos inversos del mismo.
El término "polinucleótido NtABA4", se refiere a polinucleótidos que codifican sintasa de neoxantina de Nicotiana tabacum e incluyen otros polinucleótidos que comprenden, consisten o consisten esencialmente de polinucleótidos con homología substancial (esto es similitud de secuencia) o identidad sustancial con SEC ID NO:1 o SEC ID NO:6; variantes de polinucleótido que tienen al menos aproximadamente el 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de la identidad con la secuencia de SEC ID NO:1 o SEC ID NO: 6; fragmentos de polinucleótido NtABA4 incluyendo fragmentos de SEC ID NO:1 o SEC ID NO:6; fragmentos de SEC ID NO:1 o SEC ID NO:6 con homología substancial (esto es, similitud de secuencia) o identidad sustancial con la misma que tiene al menos aproximadamente el 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los fragmentos correspondientes de SEC ID NO:1 o SEC ID NO:6. El polinucleótido NtABA4 también incluye secuencias que comprenden un grado de identidad o similitud suficiente o substancial con la SEC ID NO:1 o SEC ID NO: 6 para codificar un polipéptido que funciona como una sintasa de neoxantina. En una modalidad, el término "polinucleótido NtABA4" se refiere a un polímero de nucleótidos que comprende, consiste o consiste esencialmente de un polinucleótido designado en la presente invención tal como SEC ID NO:1 o SEC ID NO: 6.
El término "polinucleótido NtNeSY", se refiere a polinucleótidos que codifican licopeno beta ciclasa de Nicotiana tabacum e incluye otros polinucleótidos que comprende, consiste o consiste esencialmente de polinucleótidos con homología substancial (esto es, similitud de secuencia) o identidad sustancial con SEC ID NO:8; fragmentos del polinucleótido NtNeSy incluyen fragmentos de SEC ID NO:8; variantes de polinucleótido que tienen al menos aproximadamente el 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de la identidad de secuencia con la secuencia de SEC ID NO:8; fragmentos de SEC ID NO:8 con homología substancial (esto es, similitud de secuencia) o identidad sustancial con la misma que tienen al menos aproximadamente el 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los fragmentos correspondientes de la SEC ID NO:8; y fragmentos de la SEC ID NO:8 con homología sustancial (esto es, similitud de secuencia), o identidad sustancial con la misma que tiene al menos aproximadamente el 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, de identidad de secuencia con los fragmentos correspondientes de la SEC ID NO:8. El polinucleótido NtNeSy también incluye secuencias que comprenden un grado de identidad o similitud suficiente o sustancial con la SEC ID NO:8 para codificar un polipéptido que funciona como un licopeno beta ciclasa. En una modalidad, el término "polinucleótido NtNeSy" se refiere a un polímero de nucleótidos que comprende, consiste o consiste esencialmente de un polinucleótido designado en la presente invención como SEC ID NO:8 que tiene el 100% de identidad de secuencia con el mismo.
El término "polinucleótido NtNCED2", se refiere a polinucleótidos que codifican dioxigenasa de 9-c/s-epoxicarotenoide de Nicotiana tabacum e incluye otros polinucleótidos, que comprenden, consisten o consisten esencialmente de polinucleótidos con homología sustancial (esto es, similitud de secuencia) o identidad sustancial con la SEC ID NO:13; variantes polinucleótidos que tienen al menos aproximadamente el 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%», 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con SEC ID NO:13; fragmentos del polinucleótido NtNeSy que incluyen fragmentos de SEC ID NO:13; fragmentos de SEC ID NO:13 con homología sustancial (esto es, similitud de secuencia) o identidad sustancial, con la misma, que tienen al menos aproximadamente el 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los fragmentos correspondientes de SEC ID NO:13. El polinucleótido NtNC ED2 también incluye secuencias que comprende un grado de identidad o similitud suficiente o sustancial con la SEC ID NO:13 para codificar un polipéptido que funciona como una dioxigenasa 9-c/s-epoxicarotenoide. En una modalidad, el término "polinucleótido NtNCED2" se refiere a un polímero de nucleótidos que comprende, consiste o consiste esencialmente de un polinucleótido designado en la presente invención como SEC ID NO:13 con el 100% de identidad de secuencia en la misma.
Un polinucleótido tal como se describe en la presente descripción, generalmente contendrá enlaces de fosfodiésteres, aunque en algunos casos, los análogos de polinucleótido están incluidos de modo que tengan esqueletos alternativos que comprenden, por ejemplo, ligaduras de fosforamidato, fosforotioato, fosforoditioato, u O-metilfosforoamidita; esqueletos y ligaduras de polinucleótido de péptido. Otros polinucleótidos análogos incluyen los que tienen esqueletos positivos; esqueletos no iónicos; y esqueletos sin ribosa. Las modificaciones del esqueleto de ribosa-fosfato se pueden llevar a cabo por una variedad de razones, por ejemplo, para incrementar la estabilidad y vida media de dichas moléculas en ambientes fisiológicos o como sondas en un biochip. Se pueden elaborar mezclas de polinucleótidos y análogos de origen natural; alternativamente, mezclas de diferentes polinucleótidos análogos, y se pueden elaborar mezclas de polinucleótidos y análogos de origen natural.
Se conoce una variedad de análogos de polinucleótido, incluyendo por ejemplo, ligaduras de fosforamidato, fosforotioato, fosforoditioato, O-metilfosforoamidita y esqueletos y ligaduras de polinucleótido de péptido. Otros polinucleótidos análogos incluyen aquellos con esqueletos positivos, esqueletos no iónicos y esqueletos sin ribosa.
También se pueden incluir polinucleotidos que contienen uno o más azucares carbocíclicos.
Otros análogos incluyen polinucleotidos de péptido que son análogos de polinucleótido de péptido. Estos esqueletos son sustancialmente no-iónicos bajo condiciones neutrales, en contraste con el esqueleto de fosfodiéster altamente cargado de polinucleótidos de origen natural. Esto puede dar como resultado ventajas. Primero, el esqueleto del polinucleótido de péptido puede exhibir cinéticas de hibridación mejoradas. Los polinucleótidos de péptido pueden tener mayores cambios en la temperatura de fusión para pares base desacoplados versus perfectamente acoplados. El ADN y ARN normalmente exhibe una gota con temperatura de 2-4°C en la temperatura de fusión para un desacoplamiento interno. Con el esqueleto de polinucleótido de péptido no iónico, la gota tiene una temperatura más cercana de 7-9°C. Similarmente, debido a su naturaleza no-iónica, la hibridación de las bases adheridas a estos esqueletos es relativamente insensible a la concentración de sal. Además, los polinucleótidos de péptidos pueden no degradarse o degradarse a un menor grado mediante enzimas celulares, y por lo tanto, ser más estables.
Entre los usos de los polinucleótidos descritos, y las combinaciones de fragmentos de los mismos, se encuentra el uso de fragmentos como sondas en ensayos de hibridación de ácido nucleico o cebadores para utilizarse en los ensayos de amplificación de ácido nucleico. Dichos fragmentos generalmente comprenden al menos aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN. En otras modalidades, un fragmento de ADN comprende al menos aproximadamente 10, 15, 20, 30, 40, 50 o 60 o más nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN. Por lo tanto, en un aspecto, también se puede proporcionar un método para detectar un polinucleótido ABA4 que comprende el uso de sondas o cebadores, o ambos. Los cebadores de ejemplo se establecen en las SEC ID NOs: 3 a 5. En otro aspecto, también se proporciona un método para detectar un polinucleótido NeSy que comprende el uso de sondas o cebadores o ambos. Los cebadores de ejemplo se establecen en las SEC ID NOs: 10 a 12. En otro aspecto, también se proporciona un método para detectar un polinucleótido NCED2 que comprende el uso de sondas o cebadores o ambos. Los cebadores de ejemplo se establecen en la SEC ID NOs: 14 a 16.
Los parámetros básicos afectan la elección de las condiciones de hibridación y la guía para considerar condiciones adecuadas se describe en las publicaciones de Sambrook, J., E. F. Fritsch, y T. Maniatis (1989, Molecular: Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.). Utilizando el conocimiento del código genético en combinación con las secuencias de aminoácidos aquí descritas, se pueden preparar conjuntos de oligonucleótidos de degeneración. Dichos oligonucleótidos son útiles como cebadores, por ejemplo, en reacciones de cadena de polimerasa (PCR), mediante lo cual se aislan y amplifican fragmentos de ADN. En ciertas modalidades, se pueden utilizar cebadores de degeneración como sondas para bibliotecas genéticas. Dichas bibliotecas pueden incluir pero no se limitan a bibliotecas de cADN, bibliotecas genómicas, e incluso una etiqueta de secuencia expresa electrónica o bibliotecas de ADN. Las secuencias homólogas identificadas a través de este método posteriormente se pueden utilizar como sondas para identificar homólogos de las secuencias aquí identificadas. También como uso potencial se encuentran polinucleótidos y oligonucleótidos (por ejemplo, cebadores o sondas) que hibridan bajo condiciones de rigurosidad reducida, normalmente condiciones de rigurosidad moderada, y comúnmente condiciones de alta rigurosidad para el polinucleótido(s) tal como se describe en la misma. Los parámetros básicos que afectan la elección de las condiciones de hibridación y guía para considerar condiciones adecuadas se establecen en las publicaciones de Sambrook, J., E. F. Fritsch, y T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. y pueden ser determinados fácilmente por los expertos en la técnica con base, por ejemplo, en la longitud o composición base del polinucleótido.
Una forma de lograr condiciones moderadamente estrictas implica el uso de una solución de prelavado que contiene Citrato de Sodio Estándar 5x, 0,5 % Sulfato Dodecilo de Sodio, 1.0 mm ácido etilendiaminotetraacético (pH 8,0), amortiguador de hibridación de aproximadamente 50% de formamida, Citrato de Sodio Estándar 6x, y una temperatura de hibridación de aproximadamente 55°C (u otras soluciones de hibridación similares, tal como una que contiene aproximadamente 50% de formamida, con una temperatura de hibridación de aproximadamente 42°C), y condiciones de lavado de aproximadamente de 60°C, en un Citrato de Sodio Estándar 0.5x, Sulfato Dodecilo de Sodio 0.1%. Generalmente, las condiciones altamente rigurosas se definen como condiciones de hibridación tal como se describen anteriormente, pero con un lavado a una temperatura de aproximadamente 68°C, Citrato de Sodio Estándar 0.2x, Sulfato Dodecilo de Sodio 0.1%. Se puede sustituir SSPE (1x SSPE es cloruro de sodio 0.15M, fosfato de sodio 10 mM, y ácido etilendiaminotetraacético 1.25 mM, pH 7.4) por Citrato de Sodio Estándar (Citrato de Sodio Estándar 1x es cloruro de sodio 0.15M y citrato de sodio 15 mM) en la hibridación y amortiguadores de lavado; los lavados se llevan a cabo durante 15 minutos después de que se completa la hibridación. Debe quedar entendido que la temperatura de lavado y la concentración de sal de lavado se puede ajustar según sea necesario para lograr un grado de rigurosidad deseado aplicando los principios básicos que gobiernan las reacciones de hibridación y la estabilidad dúplex, tal como lo conocen los expertos en la técnica y se describe en forma adicional más adelante (ver, por ejemplo, la publicación de Sambrook, J., E. F. Fritsch, y T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y). Cuando se híbrida un polinucleótido para un polinucleótido objetivo de secuencia desconocida, la longitud de híbrido se asume para ser la de un polinucleótido hibridante. Cuando los polinucleótidos de secuencia conocida son hibridados, la longitud del híbrido se puede determinar mediante alineación de secuencias de los polinucleótidos e identificando la región o regiones de complementariedad de secuencia óptima. La temperatura de hibridación para híbridos anticipados que será menor a 50 pares base de longitud debe ser de 5°C a 10°C o menos que la temperatura de fusión del híbrido, en donde la temperatura de fusión se determina de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para híbridos con menos de 18 pares de bases de longitud, la temperatura de fusión (°C) = 2 (número de bases A + T)+4(número de bases G + C). Para los híbridos con arriba de 18 pares de bases de longitud, la temperatura de fusión (°C) = 81.5 +16.6 (Iog10 [Na + ]) + 0.41 (% G + C)-(600/N), donde N es el número de bases en el híbrido, y [Na + ] es la concentración de iones de sodio en el amortiguador de hibridación ([Na+] para Citrato de Sodio Estándar 1x =0,165 M). Normalmente, cada uno de dichos polinucleótidos de hibridación tiene una longitud que es al menos de 25% (comúnmente al menos un 50%, 60%, o 70%, y más comúnmente al menos 80%) de la longitud de un polinucleótido para el cual híbrida, y tiene al menos 60% de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%.) con un polinucleótido para el cual híbrida.
( Tal como lo comprenderán los expertos en la técnica, un ADN lineal tiene dos posibles orientaciones: la dirección 5'-a-3' y la dirección 3'-a-5', Por ejemplo, si se coloca una secuencia de referencia en la dirección 5'-a-3', y si se coloca una segunda secuencia en la dirección 5'-a-3' dentro de la misma molécula/hebra de polinucleótido, entonces la secuencia de referencia y la segunda secuencia son orientadas en la misma dirección, o tienen la misma orientación. Normalmente, una secuencia promotora y un gen de interés bajo la regulación del promotor determinado se colocan en la misma orientación. Sin embargo, con respecto a la secuencia de referencia colocada, en la dirección 5'-a-3', si se coloca una segunda secuencia en la dirección 3'-a-5', dentro de la misma molécula/hebra de polinucleótido, entonces la secuencia de referencia y la segunda secuencia se orienta en una dirección anti-sentido, o tienen una dirección anti-sentido. Se pueden describir alternativamente dos secuencias que tienen orientación antisentido con respecto una de la otra, como teniendo la misma orientación, si la secuencia de referencia (5'-a-3' dirección) y la secuencia complementaria inversa de la secuencia de referencia (secuencia de referencia colocada en la 5'-a-3') se colocan dentro de la misma molécula/hebra de polinucleótido. Las secuencias que se establecen en la presente invención se muestran en la dirección 5'-a-3'. Las construcciones recombinantes aquí proporcionadas se pueden utilizar para transformar plantas o células de plantas con el objeto de modular los niveles de expresión o actividad de proteína. Una construcción de polinucleótido recombinante puede comprender un polinucleótido que codifica uno o más polinucleótidos tal como se describe en la presente invención, enlazados en forma operable a una región reguladora adecuada para expresar el polipéptido en la planta o célula de planta. Por lo tanto, un polinucleótido puede comprender una secuencia de codificación que codifica el polipéptido tal como aquí se describen. Las plantas en donde se modula los niveles de expresión o actividad de la proteína pueden incluir plantas mutantes, plantas de origen no natural, plantas transgénicas, plantas elaboradas por el hombre o plantas diseñadas genéticamente. En forma adecuada, la planta transgénica, comprende un genoma que ha sido alterado mediante la hibridación estable del ADN recombinante. El ADN recombinante incluye ADN recombinante que ha sido genéticamente diseñado y construido fuera de una célula e incluye ADN que contiene ADN de origen natural, o cADN o ADN sintético. Una planta transgénica puede incluir una planta regenerada de una célula de planta transformada de origen y plantas transgénicas de progenie de las últimas generaciones o cruces de una planta transformada.
El polipéptido codificado por un polinucleótido recombinante puede ser un polinucleótido nativo, o puede ser heterólogo para la célula. En algunos casos, la construcción recombinante contiene un polinucleótido que modula la expresión, está enlazado en forma operable a una región reguladora. Los ejemplos de las regiones reguladoras adecuadas se describen en la presente invención.
También se proporcionan vectores que contienen construcciones de polinucleótido recombinante tal como las aquí descritas. Los esqueletos de vector adecuado incluyen, por ejemplo, los utilizados rutinariamente en la técnica, tal como plásmidos, virus, cromosomas artificiales, cromosomas artificiales bacterianos, cromosomas artificiales de levaduras o cromosomas artificiales de bacteriófagos. Los vectores de expresión adecuados incluyen, sin limitación, los plásmidos y vectores virales derivados de, por ejemplo, bacteriófago, baculovirus, y retrovirus. Están comercialmente disponibles numerosos vectores y sistemas de expresión.
Los vectores también pueden incluir, por ejemplo, orígenes de réplica, regiones o marcadores de adhesión de andamio. Un gen marcador puede conferir un fenotipo seleccionable en una célula de planta. Por ejemplo, un marcador puede conferir resistencia a biocida, tal como resistencia a un antibiótico (por ejemplo, canamicina, G418, bleomicina, o higromicina), o un herbicida (por ejemplo, glifosato, clorsulfuron o fosfinotricina). Además, un vector de expresión puede incluir una secuencia de etiqueta diseñada para facilitar la manipulación o detección (por ejemplo, purificación o localización) del polipéptido expresado. Las secuencias de etiqueta, tal como secuencias de luciferasa, beta-glucuronidasa, proteína fluorescente verde, S-transferasa de glutationa, polihistidina, c-myc o hemaglutinina normalmente se expresan como una fusión con el polipéptido codificado. Dichas etiquetas pueden insertarse en cualquier lugar dentro del polipéptido, incluyendo cualquiera de los términos carboxilo o amino.
Una planta o célula de planta se puede transformar teniendo el polinucleótido recombinante integrado en su genoma para volverse establemente transformado. La planta o célula de planta aquí descrita por consiguiente puede ser establemente transformada. Las células transformadas de forma estable normalmente retienen el polinucleótido introducido con cada división celular. Una planta o célula de planta también puede ser temporalmente transformada de modo que el polinucleótido recombinante no esté integrado en su genoma. Las células transformadas temporalmente, normalmente pierden todo o parte del polinucleótido recombinante introducido, con cada división celular de modo que el polinucleótido recombinante introducido no pueda ser detectado en células hija después de un número suficiente de divisiones celulares.
Está disponible un número de métodos en la técnica para transformar una célula de planta, los cuales todos están aquí comprendidos, incluyendo biolísticas, técnicas de pistola génetica, transformación transmitida por Agrobacteria, transformación transmitida por vector viral y electroporación. El sistema Agrobacterium para integración de ADN extraño en cromosomas de plantas ha sido extensamente estudiado, modificado, y explotado para diseño genético de plantas. Las moléculas de ADN recombinante descubiertas que comprenden secuencias de ADN que corresponden a la proteína de tabaco purificada en cuestión enlazada en forma operable, en la orientación sentido o antisentido, a secuencias reguladoras que están unidas a las secuencias de T-ADN adecuadas mediante métodos convencionales. Éstas se introducen en protoplastos de tabaco mediante técnicas de polietilénglicol o mediante técnicas de electroporación, ambas de las cuales son estándar. Alternativamente, dichos vectores comprenden moléculas de ADN recombinante que codifican la proteína de tabaco purificada en cuestión, se introducen en las células Agrobacterium vivas, las cuales posteriormente transfieren el ADN en las células de la planta del tabaco. La transformación mediante ADN descubierto sin secuencias de vector de T-ADN acompañantes puede lograrse mediante fusión de protoplastos de tabaco con liposomas que contienen ADN o mediante electroporación. El ADN descubierto no acompañado por las secuencias de vector de T-ADN también se puede utilizar para transformar células de tabaco mediante microproyectiles de alta velocidad .
Si se utiliza un tejido de célula o cultivado como el tejido receptor para transformación, las plantas pueden ser regeneradas de cultivos transformados si se desea, mediante técnicas conocidas para los expertos en el arte. La elección de las regiones reguladoras serán incluidas en una construcción recombinante depende de diversos factores, incluyendo, pero sin limitarse a, eficiencia, selectividad, inducibilidad, nivel de expresión deseado, y expresión preferencial de células o tejidos. Es una cuestión de rutina para un experto en la técnica modular la expresión de una secuencia de codificación seleccionando y colocando en forma adecuada regiones reguladoras relativas a la secuencia de codificación. La transcripción de un polinucleótido se puede modular en una forma similar. Algunas regiones reguladoras adecuadas inician únicamente la transcripción, o predominantemente en ciertos tipos celulares. Los métodos para identificar y caracterizar las regiones reguladoras en ADN genómico de plantas, son conocidos en la técnica.
Los promotores adecuados incluyen promotores específicos de tejido reconocidos por factores específicos de tejido presentes en diferentes tejidos o tipos celulares (por ejemplo, promotores específicos de raíz, promotores específicos del brote, promotores específicos de la xilema), o presentes durante diferentes etapas del desarrollo, o presentes en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Dichos promotores incluyen promotores constitutivos que pueden activarse en la mayor parte de los tipos celulares sin requerir inductores específicos. Los ejemplos de promotores adecuados para controlar la producción de polipéptido de ARNi incluyen el virus de mosaico de coliflor 35S (CaMV/35S), SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, o los promotores de ubiquitina o faseolina. Un experto en la técnica tiene la capacidad de generar múltiples variaciones de promotores recombinantes.
Los promotores específicos de tejidos son elementos de control de transcripción que únicamente son activos en células o tejidos particulares en momentos específicos durante el desarrollo de la planta, tal como en tejidos vegetativos o tejidos reproductores. La expresión específica del tejido puede ser conveniente, por ejemplo, cuando se prefiere la expresión de polinucleótidos en ciertos tejidos. Los ejemplos de promotores específicos de tejidos bajo control de desarrollo, incluyen promotores que pueden iniciar la transcripción únicamente (o principalmente en forma única) en ciertos tejidos, tales como tejidos vegetativos, por ejemplo, raíces u hojas, o los tejidos reproductivos, tales como frutos, óvulos, semillas, polen, pistilos, flores, o cualquier tejido embriónico. Los promotores específicos de tejido reproductores pueden ser, por ejemplo, específicos de antera, específicos de óvulo, específicos de embrión, específicos de endosperma, específicos de integumento, específicos de semilla y recubrimiento de semilla, específicos de polen, específicos de pétalo, específicos de sépalo, o combinaciones de los mismos.
Los promotores específicos de hoja adecuados incluyen piruvato, promotor de diquinasa de ortofosfato (PPDK), promotor de plantas C4 (maíz), promotor de Cab-m1Ca + 2 de maíz, el promotor de gen relacionado con myb Arabidopsis taliana (Atmyb5), los promotores de carboxilasa de bifosfato de ribulosa (RBCS) (por ejemplo, los genes RBCS 1, RBCS2 y RBCS3A de tomate expresados en hojas y sembradíos que crecen en la luz, RBCS1 y RBCS2 expresados en frutos de tomate en desarrollo o un promotor de carboxilasa de bisfosfato de ribulosa, expresado casi exclusivamente en las células de mesófilo en cuchillas de hojas y forros de hojas en altos niveles).
Los promotores específicos de senectud adecuados incluyen un promotor de tomate activo durante la maduración de la fruta, senectud y abscisión de hojas, un promotor de maíz de un gen que codifica una proteasa de cisteína. Se pueden utilizar promotores específicos de antera adecuados. Se pueden seleccionar promotores preferidos de raíz adecuados conocidos para los expertos en la técnica. Los promotores preferidos para las semillas adecuados incluyen tanto promotores específicos de semilla (los promotores activos durante el desarrollo de la semilla, tal como promotores de proteínas de almacenamiento de semillas) como promotores de germinación de semilla (los promotores activos durante la germinación de la semilla). Dichos promotores preferidos para la semilla incluyen, pero no se limitan a, Cim1 (mensaje inducido por citoquinina); cZ19B1 (zeína de maíz 19 kDa); milpas (myo-inositol-1 -fosfato sintasa); MZE40-2, también conocido como Zm-40; nuclc; y celA (celulosa sintasa). La Gama de zeína es un promotor específico de endoesperma. Glob-1 es un promotor específico de embrión. Para dicotiledóneas, los promotores específicos de semillas incluyen, pero no se limitan a, beta-faseolina de frijol, napina, ß-conglicinina, lectina de frijol de soya, cruciferin, y similares. Para monocotiledóneas, los promotores específicos de semillas, incluyen pero no se limitan a promotor de zeína de maíz 15 kDa, un promotor de zeína 22 kDa, un promotor de zeína 27 kDa, un promotor de g-zeína, un promotor de gama-zeína de 27 kDa (tal como promotor gzw64A, ver el número de Acceso Genbank S78780), un promotor ceroso, un promotor reducido 1, un promotor reducido 2, un promotor de globulina 1 (ver número de Acceso Genbank L22344), un promotor Itp2, un promotor cim1, promotores de extremo 1 y extremo 2 de maíz, un promotor nucí, un promotor Zm40, eepl y eep2; led, un promotor de tioredoxina H; promotor de mlip15, promotor de PCNA2; y el promotor reducido-2.
Los ejemplos de promotores inducibles incluyen promotores que responden a ataque de patógenos, condiciones anaeróbicas, temperatura elevada, luz, sequía, temperaturas frías, o alta concentración de sal. Los promotores inducibles por patógeno incluyen los de las proteínas relacionados con patogénesis (proteínas PR) las cuales son inducidas después de la inducción por un patógeno (por ejemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1 ,3-glucanasa, quitinasa).
Además de los promotores de plantas, se pueden derivar otros promotores adecuados de origen bacteriano, por ejemplo, el promotor de octopina sintasa, el promotor de nopalina sintasa y otros promotores derivados de plásmidos Ti), o se pueden derivar de promotores virales (por ejemplo, promotores 35S y 19S ARN de virus de mosaico de coliflor (CaMV), promotores constitutivos de virus de mosaico de tabaco, promotores de virus de mosaico de coliflor (CaMV) 19S y 35S, o promotor de virus de mosaico de escrofuralia 35S). El término "polipéptido NtABA4" se refiere a un polipéptido que codifica la llamada "neoxantina sintasa" de Nicotiana tabacum e incluye otras variantes de polipéptidos que comprenden, consisten o consisten esencialmente de una secuencia de aminoácido codificada por una variante de polinucleótido con al menos aproximadamente 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 1 o una variante de polinucleótido con al menos aproximadamente 60%, el 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:6; una variante de polipéptido que tiene al menos aproximadamente 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:2 o una variante de polipéptido que tiene al menos aproximadamente 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEC ID No. 7; fragmentos del polipéptido de NtABA4 con la SEC ID NO:2 o SEC ID NO:7; y fragmentos de SEC ID NO:2 o SEC ID NO: 7 que tienen al menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los fragmentos correspondientes de la SEC ID NO:2 o SEC ID NO: 7, respectivamente. El polipéptido(s) NtABA4 también incluye secuencias que comprenden un grado de identidad o similitud suficiente o substancial con SEC ID NO:2 o SEC ID NO:7 para funcionar como una neoxantina sintasa. Los fragmentos del polipéptido NtABA4 normalmente retienen actividad de neoxantina sintasa. Los polipéptidos NtABA4 también incluyen mutantes producidos introduciendo cualquier por tipo de alteraciones (por ejemplo, inserciones, eliminaciones, o sustituciones de aminoácidos; cambios en los estados de glucosilación, cambios que afectan el redoblez o isomerizaciones, estructuras tridimensionales, o estados de auto-asociación), que pueden ser diseñados en forma deliberada o aislados naturalmente siempre que aún funcionen como una neoxantina sintasa. Los polipéptidos NtABA4 pueden estar en forma lineal o ciclarse utilizando métodos conocidos. El término "polipéptido NtABA4" también se puede referir a un polipéptido codificado por la SEC ID NO:1 o SEC ID NO:6 que tiene el 100% de identidad de secuencia con la misma o un polipéptido que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia establecida con la SEC ID NO:2 o SEC ID NO:7 que tiene el 100% de identidad de secuencia.
El término "polipéptido NtNeSy" se refiere a un polipéptido que codifica licopeno beta ciclasa de Nicotiana tabacum e incluye otras variantes de polipéptido, que comprenden, consisten o consisten esencialmente de una secuencia de aminoácido codificada por un polinucleótido con al menos aproximadamente 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:9; una variante de polipéptido que tiene al menos 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:9; fragmentos del polipéptido NtNeSy de la SEC ID NO:9; y fragmentos de la SEC ID NO:9 que tiene al menos aproximadamente 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los fragmentos correspondientes de la SEC ID NO:9. Los polipéptidos NtNeSy también incluyen secuencias que comprenden un grado de identidad o similitud suficientes o sustancial con la SEC ID NO:9 para funcionar como una licopeno beta ciclasa. Los fragmentos del polipéptido NtNeSy normalmente retienen actividad licopeno beta ciclasa. Los polipéptidos NtNeSy también incluyen variantes y mutantes producidas introduciendo cualquier tipo de alteraciones (por ejemplo, inserciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos; los cambios en los estados de glucosilación; cambios que afectan el redoblez o isomerizaciones, estructuras tridimensionales, o estados de auto-asociación), que pueden ser diseñados deliberadamente o aislados naturalmente siempre que aún funcionen como una licopeno beta ciclasa. Los polipéptidos NtNeSy pueden estar en una forma lineal o ciclarse utilizando métodos conocidos. El término "polipéptido NtNeSy" también se puede referir a un polipéptido que comprende, consiste o consiste esencialmente de la secuencia establecida en la SEC ID NO:9 con el 100% de identidad de secuencia con la misma.
El término "polipéptido NtNCED2" se refiere a un polipéptido que codifica dioxigenasa 9-c/s-epoxicarotenoide de Nicotiana tabacum e incluye un polipéptido que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia de aminoácido codificada por un polinucleótido con 100 % de identidad de secuencia con la SEC ID NO:13; o una variante de polipéptido que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia de aminoácido codificada por un polinucleótido con al menos aproximadamente 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 13. Los fragmentos del polipéptido NtNCED2 también están comprendidos de modo que normalmente retienen la actividad de dioxigenasa 9-c/s-epoxicarotenoide. Los polipéptidos NtNCED2 también incluyen variantes y mutantes producidas mediante la introducción de cualquier tipo de alteraciones (por ejemplo, inserciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos; cambios en los estados de glucosilación; cambios que afectan el redoblez o isomerizaciones, estructuras tridimensionales, o estados de auto-asociación), que pueden ser diseñados deliberadamente o aislados naturalmente siempre que aún funcionen como una dioxigenasa 9-c/s-epoxicarotenoide. Los polipéptidos NtNCED2 pueden estar en forma lineal o ciclada utilizando métodos conocidos.
En otro aspecto, se proporciona un polipéptido aislado que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia de polipéptido que tiene al menos el 60% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias aquí descritas, incluyendo cualquiera de los polipéptidos mostrados en el listado de secuencia. En forma adecuado el polipéptido aislado comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia que tiene al menos el 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de la identidad de secuencia con la misma.
Los polipéptidos incluyen variantes producidas introduciendo cualquier tipo de alteraciones (por ejemplo, inserciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos; cambios en los estados de glucosilación; los cambios que afectan el redoblez o isomerizaciones, estructuras tridimensionales, o estados de auto-asociación), que pueden ser diseñados deliberadamente o aislados naturalmente. La variante puede tener alteraciones que producen un cambio silente y dan como resultado una proteína funcionalmente equivalente. Se pueden llevar acabo sustituciones de aminoácido deliberadas sobre las bases de similitud, polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y naturaleza antipática de los residuos, siempre que se retenga la actividad de enlace secundaria de la sustancia. Por ejemplo, los aminoácidos cargados en forma negativa incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados en forma positiva incluyen Usina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polar no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Se pueden llevar a cabo sustituciones conservadoras, De acuerdo con la Tabla que se encuentra a continuación. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferentemente en la misma línea en la tercera columna, pueden sustituirse entre si: El polipéptido puede ser una proteína madura o una proteína inmadura o una proteína derivada de una proteína inmadura. Los polipéptidos pueden estar en forma lineal o ciclarse utilizando métodos conocidos. Los polipéptidos comprenden al menos 10, al menos 20, al menos 30, o al menos 40 aminoácidos contiguos.
En una modalidad, se proporciona un polipéptido NtABA4 aislado, que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia que codifica una neoxantina sintasa y que tiene al menos aproximadamente 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:2 o aproximadamente el 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:7.
En otra modalidad, se proporciona un polipéptido NtNeSy aislado que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia que codifica un licopeno beta ciclasa y que tiene al menos aproximadamente el 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:9.
En otra modalidad, se proporciona un polipéptido NtNCED2 aislado codificado por el polinucleotido NtNCED2 que se describe en la presente invención.
Los fragmentos de las secuencias de polipéptidos también se incluyen en la presente invención, en forma adecuada, estos fragmentos retienen la actividad de la secuencia de longitud total.
Las variantes de polipéptido mutantes se pueden utilizar para crear plantas mutantes, de origen no natural, o transgénicas (por ejemplo, plantas mutantes, de origen no natural, transgénicas, elaboradas por el hombre o genéticamente diseñadas) que comprenden una o más variantes de polipéptido mutante. En forma adecuada, las variantes de polipéptido mutante retienen la actividad del polipéptido no mutado. La actividad de la variante del polipéptido mutante, puede ser mayo, menor o aproximadamente igual que el polipéptido no mutado.
Las mutaciones en las secuencias de nucleótido y polipéptidos aquí descritos pueden incluir mutaciones elaboradas por el hombre o mutaciones sintéticas o mutaciones genéticamente diseñadas. Las mutaciones en las secuencias de nucleótido y los polipéptidos aquí descritos pueden ser mutaciones que se obtienen o que se pueden obtener a través de un proceso el cual incluye un paso de manipulación in vitro o in vivo. Las mutaciones en las secuencias de nucleótido y polipéptidos aquí descritos pueden ser mutaciones que se pueden obtener a través de un proceso el cual incluye la intervención del hombre. A manera de ejemplo el proceso puede incluir mutagénesis utilizando químicos agregados en forma exógena - tal como compuestos orgánicos mutagénicos, teratogénicos, o carcinogénicos, por ejemplo metanosulfonato de etilo (EMS), que producen mutaciones aleatorias en el material genético. A manera de ejemplo adicional, el proceso puede incluir uno o más pasos de diseño genético - tal como uno o más pasos de diseño genético que se describen en la presente invención, o combinaciones de los mismos. A manera de ejemplo adicional, el proceso puede incluir uno o más pasos de cruce de planta.
Tal como aquí se describe, el término de origen no natural' significa que la entidad - tal como el polipéptido, el polinucleótido o la planta y similares, no se encuentra en la naturaleza y por consiguiente excluye expresamente las entidades que existen en la naturaleza. Dichas entidades de origen no natural pueden ser estructuralmente no modificadas, sintetizadas y manipuladas por el hombre. En ciertas modalidades, una mutación no es una mutación de origen no natural que exista naturalmente en una secuencia de nucleótido o un polipéptido - tal como un gen o proteína.
Se pueden preparar un polipéptido cultivando células huésped transformadas o recombinantes bajo condiciones de cultivo adecuadas para expresar un polipéptido. El polipéptido expresado resultante posteriormente puede purificarse a partir de dicho cultivo utilizando procesos de purificación conocidos. La purificación del polipéptido puede incluir una columna de afinidad que contiene agentes que enlazarán al polipéptido; uno o más pasos de columna en dichas resinas de afinidad; uno o más pasos que implican cromatografía de interacción hidrofóbica; o cromatografía por inmunoafínidad. Alternativamente, el polipéptido también puede expresarse en una forma que facilitará la purificación. Por ejemplo, se puede expresar como un polipéptido de fusión, tal como los de maltosa que enlazan polipéptido, glutationa-5-transferasa o tioredoxina. Los equipos para expresión y purificación de polipéptidos de fusión están comercialmente disponibles. El polipéptido puede etiquetarse con un epítopo y subsecuentemente purificado utilizando un anticuerpo específico dirigido a dicho epítopo. Se pueden emplear uno o más paso de cromatografía líquida - tal como cromatografía líquida de alto desempeño de fase inversa, para purificar en forma adicional el polipéptido. Algunos o todos los pasos de purificación anteriores, en diversas combinaciones pueden emplearse proporcionar un polipéptido recombinante substancialmente homogéneo. El polipéptido purificado de esta forma puede estar substancialmente libre de otros polipéptidos y se define en la presente invención como un "polipéptido sustancialmente purificado". Dichos polipéptidos purificados incluyen polipéptidos, fragmentos, variantes, y similares. La expresión, aislamiento, y purificación de los polipéptidos y fragmentos se pueden lograr a través de cualquier técnica adecuada, incluyendo pero sin limitarse a los métodos aquí descritos.
También es posible utilizar una columna de afinidad tal como un anticuerpo monoclonal generado contra polipéptidos, para generar afinidad y purificar los polipéptidos expresados. Estos polipéptidos se pueden eliminar de una columna de afinidad utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, en un amortiguador de elusión de sal de alto nivel y posteriormente dializarse en un amortiguador de sal de menor nivel para utilizarse o cambiando el pH u otros componentes dependiendo de la matriz de afinidad utilizada, o eliminarse en forma competitiva utilizando el substrato de origen natural de la porción de afinidad.
Un polipéptido también puede ser producido a través de síntesis química convencional conocida. Los métodos para construir los polipéptidos o fragmentos de los mismos mediante medios sintéticos son conocidos por expertos en la técnica. Las secuencias de polipéptido construidas en forma sintética, en virtud de que comparten características de conformación o estructurales primarias, secundarias o terciarias con polipéptidos nativos pueden poseer propiedades biológicas en común entre ellas, incluyendo actividad biológica.
El término "de origen no natural" tal como se describe en la presente invención, describe una entidad (por ejemplo, un polinucleótido, una mutación genética, un polipéptido, una planta, una célula de planta y material de planta) que no se forma en la naturaleza o que no se forma en la naturaleza. Dichas entidades de origen no natural o entidades artificiales pueden elaborarse, sintetizarse, iniciarse, modificarse, intervenirse o manipularse a través de los métodos aquí descritos o los métodos que son conocidos para los expertos en la técnica. Por lo tanto a manera de ejemplo, una planta de origen no natural, una célula de planta de origen no natural o material de planta de origen no natural puede elaborarse utilizando técnicas de cultivos de plantas tradicional - tal como retrocruce - o mediante tecnologías de manipulación genética -tal como ARN antisentido, ARN de interferencia, meganucleasa y similares. A manera de ejemplo adicional, una planta de origen no natural, una célula de planta de origen no natural, o un material de planta de origen no natural puede elaborarse mediante introgresión de o transfiriendo una o más mutaciones genéticas (por ejemplo, uno o más polimorfismos) de una primera planta o célula de planta en una segunda planta o célula de planta (la cual por si misma puede ser de origen natural), de modo que la planta o célula de planta o material de la planta resultante o la progenie de la misma comprenda una constitución genética (por ejemplo, un genoma, un cromosoma o un segmento del mismo) que no se forma por naturaleza o que no existe en la naturaleza. La planta, célula de planta o material de planta resultante es por lo tanto artificial o de origen no natural. Por consiguiente, una planta o célula de planta artificial o de origen no natural puede elaborarse modificando una secuencia genética en una primera planta o célula de planta de origen natural, incluso si surge la secuencia genética resultante en forma natural en una segunda planta o célula de planta que comprende un diferente fondo genético de la primera planta o célula de planta. Las diferencias en el fondo genético se pueden detectar mediante diferencias fenotípicas o mediante técnicas de biología molecular conocidas en el arte -tal como secuenciación de ácido nucleico presencia o ausencia de marcadores genéticos (por ejemplo, marcadores de ARN de microsatélite) .
También se proporcionan anticuerpos que son inmunoreactivos con los polipéptidos NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 aquí descritos. Los polipéptidos, fragmentos, variantes, polipéptidos de fusión, y similares, tal como aquí se establece, se puede emplear "inmunogenes" para producir anticuerpos inmunoreactivos con los mismos. Dichos anticuerpos pueden enlazar específicamente al polipéptido a través de los sitios de enlace de antígeno del anticuerpo. Los anticuerpos de enlace específicos son los que reconocerán específicamente y enlazaran con un polipéptido, homólogos, y variantes, pero no con otras moléculas. En una modalidad, los anticuerpos son específicos para los polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la presente invención, y no reaccionan en forma cruzada con otros polipéptidos.
Más específicamente, los polipéptidos, fragmentos, variantes, y polipéptidos de fusión, y similares contienen determinantes antigénicas o epítopes que provocan la formación de anticuerpos. Estas determinantes antigénicas o epítopes pueden ser ya sea lineales o de conformación (discontinuos). Los epítopes lineales están compuestos de una sola sección de aminoácidos del polipéptido, mientras que los epítopes conformacionales o discontinuos están compuestos de secciones de aminoácidos de diferentes regiones de la cadena de polipéptido que se llevan en proximidad cercana al momento del doblez del polipéptido. Los epítopes pueden identificarse a través de cualquiera de los métodos conocidos en el arte. Además, los epítopes de los polipéptidos pueden utilizarse como reactivos de investigación, en ensayos, y para purificar, anticuerpos de enlace específicos de substancias tales como suero policlonal o sobrenadantes de hibridomas cultivados. Dichos epítopes o variantes de los mismos se pueden producir utilizando técnicas conocidas en el arte tal como síntesis de fase sólida, descomposición química o enzimática de un polipéptido, o utilizando tecnología de ADN recombinante.
Los anticuerpos tanto policlonales y monoclonales para los polipéptidos se pueden preparar a través de técnicas convencionales. Las líneas de célula de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales específicos para los polipéptidos también se contemplan en la presente invención. Dichos hibridomas pueden producirse e identificarse a través de técnicas convencionales. Para la producción de anticuerpos, se pueden inmunizar diversos animales huésped mediante inyección con un polipéptido, fragmento, variante, o mutantes del mismo. Dichos animales huésped pueden incluir, pero no se limitan a, conejos, ratones y ratas, por nombrar solo algunos. Se pueden utilizar diversos adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica. Dependiendo de la especie de huésped, estos adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, medio de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias de superficie activa tales como lisolecitina , polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de penetración magnética, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles, tales como BCG (bacille Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Los anticuerpos monoclonales se pueden recuperar a través de técnicas convencionales. Dichos anticuerpos monoclonales pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, y cualquier subclase de las mismas.
Los anticuerpos se pueden utilizar en ensayos para detectar la presencia de los polipéptidos o fragmentos, ya sea in vitro o in vivo. Los anticuerpos también se pueden emplear en polipéptidos o fragmentos de purificación mediante cromatografía de inmunoafinidad.
Las composiciones que pueden modular (por ejemplo, incrementar) la expresión o la actividad de NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 (o una combinación de dos o más o tres o más de los mismos), incluyen pero no se limitan a, polinucleóticos específicos de secuencia que pueden interferir con la transcripción de uno o más gene(s) endógenos; polinucleótidos específicos que pueden intervenir con la traducción de las transcripciones de ARN (por ejemplo, ARN, siARN de hebra doble, ribocimas); polipéptidos específicos de la secuencia que pueden interferir con la estabilidad de una o más proteínas; polinucleótidos específicos de la secuencia que pueden interferir con la actividad enzimática de una o más proteínas o la actividad de enlace de una o más proteínas con respecto a los substratos o proteínas reguladoras; anticuerpos que exhiben especificad para una o más proteínas; compuestos de molécula pequeña que pueden interferir con la estabilidad de una o más proteínas o la actividad enzimática de una o más de una o más proteínas o la actividad de enlace de una o más proteínas; proteínas de dedo de zinc que enlazan a uno o más polinucleótidos; y meganucleasas que tienen actividad de uno o más polinucleótidos. Las tecnologías de edición de gen, tecnologías de edición de genética; y tecnologías de edición de genoma son bien conocidas en la técnica.
La tecnología antisentido es un método bien conocido que se puede utilizar para modular la expresión de un polipéptido. Un polinucleótido del gen que será reprimido se clona y se enlaza en forma operable a una región reguladora y a una secuencia de terminación de transcripción, de modo que la hebra antisentido del ARN sea transcrita. La construcción recombinante posteriormente se transforma en plantas y se produce la hebra antisentido del ARN. El polín ucleótido no necesita ser toda la secuencia del gen que será reprimido, aunque normalmente será substancialmente complementaria al menos a una parte de la hebra de sentido que será reprimido.
Se puede transcribir un polinucleótido en una ribozima, o ARN catalítico, que afecta la expresión de un mARN. Las ribozimas se pueden diseñar para emparejarse específicamente con virtualmente cualquiera ARN objetivo y descomponer el esqueleto de fosfodiéster en una ubicación específica, desactivando de esta forma el ARN objetivo. Los polinucleótidos heterólogos pueden codificar ribozimas diseñadas para descomponer transcripciones de mARN particulares, evitando de esta forma la expresión de un polipéptido. Las ribozimas cabeza de martillo son útiles para destruir los mARNs particulares, aunque se pueden utilizar varios ribozimas que disocian el mARN en secuencias de reconocimiento específicas del sitio. Las ribozimas cabeza de martillo disocian los mARNs en los lugares dictados por las regiones de flanqueo que forman pares base complementarios con el mARN objetivo. El requerimiento es que el ARN objetivo contenga una secuencia de nucleótido 5'-UG-3'. La construcción y producción de las ribozimas cabeza de martillo son conocidas en la técnica. Las secuencias de ribozima cabeza de martillo pueden incrustarse en un ARN estable tal como un ARN de transferencia (tARN) para incrementar la eficiencia de descomposición in vivo.
En una modalidad, el polinucleótido específico de la secuencia que puede interferir con la traducción de la transcripción de ARN es el ARN de interferencia. La interferencia de ARN o silenciación de ARN es un proceso evolutivamente conservado a través del cual los mARNs específicos pueden dirigirse para degradación enzimática. Se introduce un ARN de hebra doble (ARN de hebra doble) o se produce a través de una célula (por ejemplo, virus de ARN de hebra doble, o polinucleótidos de ARN de interferencia) para iniciar la trayectoria de ARN. El ARN de hebra doble puede convertirse en múltiples dúplex de ARN de interferencia pequeños de 21 a 23 pares base de longitud mediante Rnasas III, las cuales son endonucleasas específicas de ARN de hebra doble. Los ARNs de interferencia pequeños pueden ser reconocidos en forma subsecuente mediante complejos de silenciación inducidos por ARN que promueven el desenrollado de ARN de interferencia pequeño a través de un proceso que dependen de ATP. La hebra antisentido desenrollada del ARN de interferencia pequeño guía los complejos de silenciación inducidos por ARN activados para el mARN dirigido que comprende una secuencia complementaria para la hebra anti- sentido del ARN de interferencia pequeño. El mARN dirigido y la hebra anti-sentido pueden formar una hélice con forma de A, y la ranura mayor de la hélice con forma de A puede ser reconocida por los complejos de silenciación inducido por ARN activado. El mARN objetivo puede descomponerse mediante complejos de silenciación inducidos por ARN activado en un sitio definido por un sitio de enlace del extremo 5', de la hebra de ARN de interferencia pequeña. Los complejos de silenciación inducidos por ARN activados pueden reciclarse para catalizar otro evento de descomposición.
Los vectores de expresión de ARN de interferencia pueden comprender construcciones de ARN de interferencia que codifican polinucleótidos de ARN de interferencia que exhiben actividad de interferencia de ARN reduciendo el nivel de expresión de las variantes de mARNs, pre-mARNs, o ARN relacionados. Los vectores de expresión pueden comprender un promotor colocado en una corriente ascendente y enlazado en forma operable a una construcción de ARN de interferencia, tal como se describirá con mayor detalle en la presente invención. Los vectores de expresión de ARN de interferencia pueden comprender un promotor de centro mínimo adecuado, una construcción de ARN de interferencia de interés, una región reguladora de corriente ascendente (5'), una región reguladora de corriente descendente (3'), incluyendo señales de poliadenilación y terminación de transcripción, y otras secuencias conocidas para los expertos en la técnica, tal como diversos marcadores de selección.
Los polinucleótidos pueden producirse en en diversas formas, incluyendo como estructuras de hebra doble (esto es, una molécula de ARN de hebra doble que comprende una hebra antisentido y una hebra de sentido complementaria), estructuras tipo horquilla con hebra doble, o estructuras de hebra simple (esto es una molécula de ssARN que comprende solo una hebra antisentido). Las estructuras pueden comprender un dúplex, dúplex asimétrico, horquilla o estructura secundaria de horquilla asimétrica, que tiene hebras de sentido y antisentido auto-complementarias. El ARN de interferencia de hebra doble puede ser convertido en forma enzimática a los ARNs de interferencia pequeños de hebra doble. Una de las hebras del dúplex de ARN de interferencia pequeña puede endurecerse hasta obtener una secuencia complementaria dentro del mARN objetivo y variantes de ARN relacionadas. Los dúplex de ARN/mARN de interferencia pequeños son reconocidos por los complejos de silenciación inducidos por ARN que se pueden descomponer ARNs en múltiples sitios en una forma dependiente de la secuencia, dando como resultado la degradación del mARN objetivo y las variantes de ARN relacionadas.
Las moléculas de ARN de hebra doble pueden incluir moléculas de ARN de interferencia pequeñas ensambladas desde un oligonucleótido simple en una estructura de tallo-lazo, en donde las regiones de sentido y antisentido auto-complementarias de la molécula de ARN de interferencia pequeña, se enlazan por medio de un enlazador(es) con base en polinucleótido o sin base de polinucleótido, asi como un ARN de hebra simple circular que tiene dos o más estructuras de lazo y tallo que comprende hebras de sentido y antisentido auto-complementarias, en donde el ARN circular puede ser procesado ya sea in vivo o in vitro para generar una molécula de ARN de interferencia pequeña activa con la capacidad de transmitir el ARN de interferencia.
Pero también está contemplado el uso de moléculas de ARN de horquilla pequeña. Comprenden una secuencia antisentido específica además de la secuencia de complemento inversa (sentido), normalmente separada por una secuencia espaciadora o de lazo. La descomposición del espaciador o lazo proporciona una molécula de ARN de hebra simple y su complemento inverso, de modo que puedan endurecerse para formar una molécula de ARN de hebra doble (opcionalmente con pasos de procesamiento adicionales que pueden dar como resultado la adición o eliminación de uno, dos, tres o más nucleótidos del extremo 3' o el extremo 5' de cualquiera o ambas hebras). El espaciador puede tener una longitud suficiente para permitir que las secuencias antisentido y sentido se endurezcan y formen una estructura de hebra doble (o tallo) antes de la descomposición del espaciador (y, opcionalmente, los pasos del procesamiento subsecuente que pueden dar como resultado la adición o eliminación de uno, dos, tres, cuatro o más nucleótidos del extremo 3', o el extremo 5' de cualquiera o ambas de las hebras). La secuencia del espaciador normalmente es una secuencia de nucleótido no relacionada que está situada entre dos regiones de secuencia de nucleótido complementarias las cuales, cuando se endurecen en un polinucleótido de hebra doble, comprenden un ARN de horquilla pequeño. La secuencia espaciadora generalmente comprende entre aproximadamente 3 y aproximadamente 100 nucleótidos.
Cualquier polinucleótido de ARN puede ser producido seleccionando una composición de secuencia, tamaño de lazo, y longitud de tallo adecuadas para producir el dúplex de horquilla. Un rango adecuado para diseñar las longitudes de tallo de un dúplex de horquilla, incluye longitudes de tallo de al menos aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20 nucleótidos - tal como aproximadamente 14 a 30 nucleótidos, aproximadamente 30 a 50 nucleótidos, aproximadamente 50 a 100 nucleótidos, aproximadamente 100 a 150 nucleótidos, aproximadamente 150 a 200 nucleótidos, aproximadamente 200 a 300 nucleótidos, aproximadamente 300 a 400 nucleótidos, aproximadamente 400 a 500 nucleótidos, aproximadamente 500 a 600 nucleótidos, y aproximadamente 600 a 700 nucleótidos. Un rango adecuado para diseñar longitudes de lazo de un dúplex de horquilla incluye longitudes de lazo de aproximadamente 4 a 25 nucleótidos, aproximadamente 25 a 50 nucleótidos, o mayor si es substancial la longitud del tallo del dúplex de horquilla. En ciertas modalidades, una molécula de ARN o ssARN de hebra doble tiene entre aproximadamente 15 y aproximadamente 40 nucleótidos en longitud. En otra modalidad, la molécula de ARN de interferencia pequeña es una molécula de ARN o ssARN de hebra doble de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 35 nucleótidos de longitud. En otra modalidad, la molécula de ARN de interferencia pequeña es una molécula de ARN o ssARN de hebra doble de entre aproximadamente 17 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En otra modalidad, la molécula de ARN de interferencia pequeña es una molécula de ARN o ssARN de hebra doble de entre aproximadamente 19 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. En otra modalidad, la molécula de ARN de interferencia pequeña es una molécula de ARN o ssARN de hebra doble de entre aproximadamente 21 hasta aproximadamente 23 nucleótidos de longitud. En ciertas modalidades, las estructuras de horquilla con regiones dúplex mayores a 21 nucleótidos pueden promover la silenciación dirigida por ARN, de interferencia pequeña efectiva, sin importar la secuencia y longitud del lazo.
La secuencia de ARN objetivo normalmente es de entre aproximadamente 14 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. El mARN objetivo, por consiguiente, puede ser escaneado para regiones de entre aproximadamente 14 y aproximadamente 50 nucleótidos de longitud que cumplen preferentemente con uno o más de los siguientes criterios para una secuencia objetivo: una proporción A + T/G + C de aproximadamente 2:1 y aproximadamente 1:2; un dinucleótido AA o un dinucleótido CA en el extremo 5' de la secuencia objetivo; una secuencia de al menos 10 nucleótidos consecutivos única para el mARN objetivo (esto es, la secuencia no está presente en otras secuencias mARN de la misma planta); y sin "corridas" de más de tres nucleótidos de guanina (G) consecutivos o más de tres nucleótidos de citosina (C) consecutivos. Estos criterios pueden evaluarse utilizando varias técnicas conocidas en el arte, por ejemplo programas de cómputo tales como BLAST que se pueden utilizar para buscar en bases de datos públicamente disponibles para determinar si la secuencia objetivo seleccionada es única para el mARN objetivo. Alternativamente, se puede seleccionar una secuencia objetivo (y una secuencia de ARN de interferencia pequeña diseñada) utilizando un software de computadora comercialmente disponible (por ejemplo, OligoEngine, Target finder y la small interfering RNA Design Tool las cuales están comercialmente disponibles.
En una modalidad, las secuencias de mARN objetivo se seleccionan de modo que tengan entre aproximadamente 14 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, y que cumplan con más de uno de los criterios anteriores. En otra modalidad, las secuencias objetivo se seleccionan para que tengan entre aproximadamente 16 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud para que cumplan con uno o más de los criterios anteriores. En una modalidad adicional, las secuencias objetivo se seleccionan para que tengan entre aproximadamente 19 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud para que cumplan con uno o más de los criterios anteriores. En otra modalidad, las secuencias objetivo se seleccionan para que tengan entre aproximadamente 19 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud para que cumplan con uno o más de los criterios anteriores. En una modalidad de ejemplo, las moléculas de ARN de interferencia pequeñas comprenden una secuencia antisentido específica que es complementaria con al menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, o más nucleótidos contiguos de cualquiera de las secuencias de polinucleótido aquí descritas.
La secuencia antisentido específica comprendida por la molécula de ARN de interferencia pequeña puede ser idéntica o sustancialmente idéntica al complemento de la secuencia objetivo. En una modalidad, la secuencia antisentido específica comprendida por la molécula de ARN de interferencia pequeña es al menos aproximadamente el 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica al complemento de la secuencia mARN objetivo. Los métodos para determinar la identidad de secuencia son conocidos en la técnica y se pueden determinar, por ejemplo, utilizando el programa BLASTN del University of Wisconsin Computer Group (Grupo de Cómputo de la Universidad de Wisconsin) (GCG) o proporcionados en el sitio web de NCBI.
La secuencia antisentido específica de las moléculas de ARN de interferencia pequeñas pueden exhibir variabilidad mediante diferencias (por ejemplo por sustitución de nucleótido, incluyendo transición o transversión) en uno, dos, tres, cuatro o más nucleótidos de la secuencia del mARN objetivo. Cuando dichas sustituciones de nucleótido están presentes en la hebra antisentido de una molécula de ARN de hebra doble, el nucleótido complementario en la hebra de sentido con la cual el nucleótido sustituto normalmente podría formar emparejamiento base de enlace de hidrógeno, pueden o no ser sustituidas en forma correspondiente. Las moléculas de ARN de hebra doble en donde ocurren una o más sustituciones de nucleótido en la secuencia de sentido, pero no en la hebra antisentido, también están contempladas. Cuando la secuencia antisentido de una molécula de ARN de interferencia pequeña comprende uno o más desacoplamientos entre la secuencia de nucleótido del ARN de interferencia pequeña y la secuencia de nucleótido objetivo, tal como se describe anteriormente, los desacoplamientos pueden encontrarse en el término 3', el término 5' o en la parte central de la secuencia antisentido. En otra modalidad, las moléculas de ARN de interferencia pequeñas comprenden una secuencia antisentido específica que tiene la capacidad de hibridar selectivamente bajo condiciones rigurosas con una parte del gen objetivo de origen natural o mARN objetivo. Tal como lo saben los expertos en la técnica, las variaciones en rigurosidad de las condiciones de hibridación pueden lograrse alterando el tiempo, temperatura o concentración de las soluciones utilizadas para la hibridación y pasos de lavado. Las condiciones adecuadas también pueden depender en parte de las secuencias de nucleótido particulares utilizadas, por ejemplo, la secuencia del mARN o gen objetivo.
Un método para inducir silenciación de ARN de hebra doble en plantas, es transformación con una construcción de gen que produce ARN de horquilla (ver Publicación Smith et al. (2000) Nature, 407, 319-320). Dichas construcciones comprenden regiones invertidas de la secuencia de gen objetivo, separadas por un espaciador adecuado. La inserción de una región de intrón de planta funcional como un fragmento espaciador, incrementa adicionalmente la eficiencia de la inducción de silenciación de gen, debido a la generación de un ARN de horquilla dividido por intrón (Wesley et al. (2001) Plant J., 27, 581-590). En forma adecuada, la longitud de tallo es de aproximadamente 50 nucleótidos hasta aproximadamente 1 kilobases. Los métodos para producir ARN de horquilla dividido por intrón están bien descritos en la técnica (ver por ejemplo la Publicación de Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry (2008) 72, 2, 615-617). Las moléculas de ARN de interferencia que tienen una estructura dúplex o de hebra doble, por ejemplo, ARN de hebra doble o ARN de horquilla pequeña, pueden tener extremos romos o pueden tener proyecciones 3' o 5'. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "proyección" se refiere al nucleótido sin par o nucleotidos que sobresalen de una estructura dúplex con un término 3' de una hebra de ARN que se extiende más allá del término 5' de la otra hebra (proyección 3') o viceversa (proyección 5'). Los nucleótidos que comprenden la proyección pueden ser ribonucleótidos, desoxirribon ucleótidos o versiones modificadas de los mismos. En una modalidad, al menos una hebra de la molécula de ARN de interferencia tiene una proyección 3' de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 6 nucleótidos de longitud. En otras modalidades, la proyección 3' tiene de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 5 nucleótidos, de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 nucleótidos y de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 4 nucleótidos de longitud.
Cuando la molécula de ARN de interferencia comprende una proyección 3' en un extremo de la molécula, el otro extremo puede ser de extremo romo o tener también una proyección (5' o 3'). Cuando la molécula de ARN de interferencia comprende una proyección en ambos extremos de la molécula, la longitud de las proyecciones puede ser igual o diferente. En una modalidad, la molécula de ARN de interferencia comprende proyecciones 3' de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 nucleótidos en ambos extremos de la molécula. En una modalidad adicional, la molécula de ARN de interferencia es un ARN de hebra doble que tiene una proyección 3' de 2 nucleótidos en ambos extremos de la molécula. Aún en otra modalidad, los nucleótidos que comprenden la proyección del ARN de interferencia son dinucleótidos TT o dinucleótidos UU.
Cuando se determina el porcentaje de identidad de la molécula de ARN de interferencia que comprende una o más proyecciones con la secuencia de mARN objetivo, la proyección(s) puede o no tomarse en cuenta. Por ejemplo, los nucleótidos de una proyección 3' de hasta 2 nucleótidos del término 5'- o 3'- de la hebra doble, se pueden modificar sin una pérdida significativa de actividad de la molécula de ARN de interferencia pequeña.
Las moléculas de ARN de interferencia pueden comprender una o más estructuras de tapa 5' o 3'. La molécula de ARN de interferencia puede comprender una estructura de tapa en el extremo 3' de la hebra de sentido, la hebra antisentido o tanto de las hebras de sentido como antisentido; o en el extremo 5'-de la hebra de sentido, la hebra antisentido o las hebras tanto de sentido como de antisentido de la molécula de ARN de interferencia. Alternativamente, la molécula de ARN de interferencia puede comprender una estructura de tapa tanto en el extremo 3' como 5' de la molécula de ARN de interferencia. El término "estructura de tapa" se refiere a una modificación química incorporada en cualquier término de un oligonucleótido, que protege la molécula contra degradación de exonucleasa, y también puede facilitar el suministro o localización dentro de una célula.
Otra modificación aplicable a las moléculas de ARN de interferencia en el enlace químico a la molécula de ARN de interferencia de una o más porciones o conjugados lo cual incrementa la actividad, distribución celular, captación celular, biodisponibilidad o estabilidad de la molécula de ARN de interferencia. Los polinucleótidos pueden ser sintetizados o modificados a través de métodos bien establecidos en la técnica. Las modificaciones químicas pueden incluir, pero no se limitan a modificaciones 2', introducción de bases no naturales, adhesión covalente a un ligando y reemplazo de enlaces de fosfato con enlaces de tiofosfato. En esta modalidad, la integridad de la estructura dúplex se refuerza mediante al menos uno, y normalmente dos enlaces químicos. El enlace químico puede lograrse a través de cualquier variedad de técnicas bien conocidas, por ejemplo introduciendo enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno; interacciones hidrofóbicas, interacciones de van der Waals o de apilamiento; por medio de coordinación de metal-ión o a través del uso de análogos de purina.
Los nucleótidos en una o ambas de dos hebras simples puede modificarse para modular la activación de enzimas celulares, tal como, por ejemplo, sin limitación, ciertas nucleasas. Las técnicas para reducir o inhibir la activación de enzimas celulares son conocidas en la técnica, e incluyen pero no se limitan a modificaciones 2'-amino, modificaciones 2'-fluoro, modificaciones 2'-alquilo, modificaciones de esqueleto no cargadas, modificaciones de morfolino, modificaciones de 2'-O-metilo y fosforamidato. Por lo tanto, al menos un grupo 2'-hidroxilo de los nucleótidos en un ARN de hebra doble se reemplaza a través de un grupo químico. Asimismo, al menos un nucleótido puede ser modificado para formar un nucleótido bloqueado. Dicho nucleótido bloqueado contiene un puente de metileno o etileno que conecta el 2'-oxígeno de ribosa con 4'-carbono de ribosa. La introducción de un nucleótido bloqueado en un oligonucleótido mejora la afinidad de la secuencia complementaria e incrementa la temperatura de fusión en varios grados.
Los ligandos pueden conjugarse a una molécula de ARN de interferencia, por ejemplo, para incrementar su absorción celular. En ciertas modalidades, se conjuga un ligando hidrofóbico a la molécula para facilitar la permeación directa de la membrana celular. Estos métodos han sido utilizados para facilitar la permeación celular de los oligonucleótidos antisentido. En ciertos casos, la conjugación de un ligando catiónico a oligonucleótidos con frecuencia da como resultado una resistencia incrementada a las nucleasas. Los ejemplos representativos de ligandos catiónicos incluyen propilamonio y dimetilpropilamonio. Los oligonucleótidos antisentido pueden retener su alta afinidad de enlace al mARN cuando el ligando catiónico se dispersa a través del oligonucleótido.
Las moléculas y polinucleótidos aquí descritas pueden prepararse utilizando técnicas bien conocidas de síntesis de fase sólida. Se puede emplear en forma adicional o alternativa cualquier otro medio para dichas síntesis conocidas en la técnica.
Varias modalidades se dirigen a vectores de expresión que comprenden uno o más polinucleótidos NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 o construcciones ARN de interferencia que comprenden uno o más polinucleótidos.
Varias modalidades se dirigen a vectores de expresión que comprenden uno o más de los polinucleótidos NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 o una o más construcciones de ARN de interferencia .
Varias modalidades se dirigen a vectores de expresión que comprenden uno o más polinucleótidos NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 o una o más construcciones de ARN de interferencia que codifican uno o más polinucleótidos de ARN de interferencia con la capacidad de autoendurecerse para formar una estructura de horquilla, en donde la construcción comprende (a) uno o más polinucleótidos aquí descritos; (b) una segunda secuencia que codifica un elemento espaciador que forma un lazo de la estructura de horquilla; y (c) una tercera secuencia que comprende una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, colocada en la misma orientación que la primera secuencia, en donde la segunda secuencia se coloca entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda secuencia se enlaza en forma operable a la primera secuencia y a la tercera secuencia.
Las secuencias descritas pueden utilizarse para construir diversos polinucleótidos NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 que no forman estructuras de horquilla. Por ejemplo, un ARN de hebra doble puede formarse mediante (1) transcripción de una primera hebra del ADN mediante enlace en forma operable a un primer promotor, y (2) transcribir la secuencia complementaria inversa de la primera hebra del fragmento de ADN mediante enlace en forma operable a un segundo promotor. Cada hebra de polinucleótido puede transcribirse del mismo vector de expresión, o de diferentes vectores de expresión. El dúplex de ARN que tiene actividad de interferencia de ARN puede ser convertido en forma enzimática a ARNs de interferencia pequeña que modulan los niveles de ARN.
Por lo tanto diversas modalidades se dirigen a vectores de expresión que comprenden uno o más polinucleótidos NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 o construcciones de ARN de interferencia que codifican los polinucleótidos de ARN de interferencia con la capacidad de autoendurecimiento, en donde la construcción comprende (a) uno o más de los polinucleótidos aquí descritos; y (b) una segunda secuencia que comprende una secuencia complementaria (por ejemplo, complementaria inversa) de la primera secuencia, colocada en la misma orientación que la primera secuencia.
Se proporcionan diversas composiciones y métodos para modular los niveles de expresión endógena de uno o más de los polipéptidos NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 (o una combinación de dos o más o tres o más de los mismos) promoviendo la cosupresión de la expresión de gen. El fenómeno de la cosupresión surge como un resultado de introducir múltiples copias de un transgen en un huésped de célula de planta. La integración de múltiples copias de un transgen puede dar como resultado la expresión modulada del transgen y el gen endógeno dirigido. El grado de cosupresión depende del grado de identidad de secuencia entre el transgen y el gen endógeno dirigido. La silenciación tanto del gen endógeno como del transgen puede ocurrir mediante metilación extensa del lugar silenciado (esto es, el promotor endógeno y el gen endógeno de interés) que pueden excluir la transcripción. Alternativamente en algunos casos, la cosupresión del gen endógeno y el transgen puede surgir mediante silenciación de gen post-transcripción, en donde las transcripciones se pueden producir, aunque los rangos incrementados de degradación excluyan la acumulación de las transcripciones. El mecanismo para cosupresión mediante silenciación de gen post-transcripción se considera que se asemeja a la interferencia de ARN, ya que ARN parece ser tanto un iniciador como un objetivo importante en estos procesos, y puede ser transmitido al menos en parte por la misma maquinaria molecular, posiblemente a través de degradación guiada por ARN de los mARNs.
La cosupresión de ácidos nucleicos se puede lograr integrando múltiples copias del ácido nucleico o fragmentos de los mismos, como transgenes, en el genoma de una planta de interés. La planta huésped puede ser transformada con un vector de expresión que comprende un promotor enlazado en forma operable al ácido nucleico o fragmentos del mismo. Se dirigen varias modalidades a vectores de expresión para promover la cosupresión de genes endógenos que comprenden un promotor enlazado en forma operable a un polinucleótido.
Se dirigen varias modalidades a métodos para modular el nivel de expresión de los polinucleótidos NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 (o una combinación de dos o más o tres o más de los mismos) mediante integración de múltiples copias del polinucleótido(s) en un genoma de planta (tabaco), en donde los métodos comprenden: transformar un huésped de célula de planta con un vector de expresión que comprende un promotor enlazado en forma operable a un polinucleótido.
Se proporcionan varias composiciones y métodos para modular el nivel de expresión de gen endógeno modulando la traducción de mARN. Una célula de planta huésped (tabaco) puede ser transformada con un vector de expresión que comprende: un promotor enlazado en forma operable a un polinucleótido, colocado en una orientación antisentido con respecto al promotor para permitir la expresión de polinucleótidos de ARN que tienen una secuencia complementaria a una parte del mARN.
Diversos vectores de expresión para modular la traducción de mARN pueden comprender: un promotor enlazado en forma operable a un polinucleótido en donde la secuencia se coloca en una orientación antisentido con respecto al promotor. Las longitudes de los polinucleótidos de ARN antisentido pueden variar, y pueden tener de aproximadamente 15 a 20 nucleótidos, aproximadamente 20 a 30 nucleótidos, aproximadamente 30 a 50 nucleótidos, aproximadamente 50 a 75 nucleótidos, aproximadamente 75 a 100 nucleótidos, aproximadamente 100 a 150 nucleótidos, aproximadamente 150 a 200 nucleótidos, y aproximadamente 200 a 300 nucleótidos.
También se proporcionan métodos para obtener polinucleótidos y polipéptidos mutantes. Cualquier planta de interés, incluyendo una célula de planta o material de planta puede ser genéticamente modificada a través de diversos métodos conocidos por inducir mutagénesis, incluyendo mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis dirigida por oligonucleótido, mutagénesis inducida químicamente, mutagénesis inducida por irradiación, mutagénesis que utiliza bases modificadas, mutagénesis que utiliza ADN dúplex con espacios en blanco, mutagénesis de rompimiento de hebra doble, mutagénesis que utiliza cepas huésped con deficiencia de reparación, mutagénesis mediante síntesis de gen total, revoltura de ADN y otros métodos equivalentes.
Alternativamente, los genes pueden ser dirigidos para inactivación introduciendo transposones (por ejemplo, elementos IS) en los genomas de las plantas de interés. Estos elementos genéticos móviles pueden ser introducidos mediante cruce sexual-fertilización y los mutantes de inserción pueden ser clasificados para pérdida en actividad de proteína. El gen interrumpido en una planta progenitora puede introducirse en otras plantas cruzando la planta progenitora con una planta no sometida a mutagénesis inducida por transposón, por ejemplo, mediante cruce sexual-fertilización. Se puede utilizar cualquiera técnicas de cultivo estándar conocidas para los expertos en la técnica. En una modalidad, se pueden desactivar uno o más genes mediante la inserción de uno o más transposones. Las mutaciones pueden dar como resultado interrupción homocigosa de uno o más genes, interrupción heterocigosa de uno o más genes o una combinación de interrupciones tanto homocigosas como heterocigosas, si se interrumpe más de un gen. Los elementos transposables adecuados incluyen retrotransposones, retroposones y elementos tipo SINE. Dichos métodos son conocidos para los expertos en la técnica.
Alternativamente, los genes se pueden dirigir para activación introduciendo ribozimas derivadas de un número de ARNs circulares pequeños que tienen la capacidad de autodescomposición y réplica en plantas. Estos ARNs pueden replicarse ya sea solos (ARNs viroides) o con un virus auxiliar (ARNs de satélite). Los ejemplos de ARNs adecuados incluyen los derivados del viroide del veteado marrón rojizo de aguacate y ARNs satelitales derivados de virus de las manchas anulares del tabaco, virus del veteado transitorio de la alfalfa, virus del moteado de tabaco suave, virus del moteado nodoso de flor del género Solanum, y virus del moteado de trébol subterráneo. Varias ribozimas específicas de ARN objetivo son conocidas para los expertos en la técnica.
En algunas modalidades, la expresión de un polipéptido se modula mediante medios no transgénicos, tal como la creación de una mutación en un gen. Los métodos que introducen una mutación en forma aleatoria en una secuencia de gen, pueden incluir mutagénesis química, mutagénesis EMS y mutagénesis de radiación. Los métodos que introducen una o más mutaciones objetivo en una célula incluyen pero no se limitan a tecnología de edición de genoma, particularmente mutagénesis transmitida por nucleasa de dedo de zinc, cultivo (dirigiendo lesiones locales inducidas en genoma), recombinación homóloga, mutagénesis dirigida por oligon ucleótido y mutagénesis transmitida por meganucleasa.
Algunos ejemplos no limitantes de mutaciones son eliminaciones, inserciones y mutaciones missense de al menos un nucleótido, polimorfismos de nucleótido simple y una repetición de secuencia simple. Después de la mutación, se puede llevar a cabo clasificación para identificar mutaciones que crean codones de detención prematuros o genes de otra manera no funcionales. Después de la mutación, la clasificación se puede llevar a cabo para identificar mutaciones que crean genes funcionales que tienen la capacidad de expresarse en niveles elevados. La clasificación de los mutantes se puede llevar a cabo mediante secuenciación, o mediante el uso de una o más sondas o cebadores específicos para el gen o proteína. Las mutaciones específicas en polinucleótidos también se pueden crear de modo que den como resultado expresión de gen modulada, estabilidad modulada de mARN, o estabilidad modulada de proteína. Dichas plantas son referidas en la presente invención como plantas "de origen no natural" o "mutantes". Normalmente las plantas mutantes o de origen no natural incluirán al menos una parte del ácido nucleico extraño o sintético elaborado por el hombre (por ejemplo ADN o ARN) que no estaba presente en la planta antes de que fuera manipulada. El ácido nucleico extraño puede ser un solo nucleótido, dos o más nucleótidos, dos o más nucleótidos contiguos o dos o más nucleótidos no contiguos - tal como al menos 10, 20, 30, 40, 50,100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 o 1500 o más nucleótidos contiguos o no contiguos.
Las plantas mutantes o de origen no natural pueden tener cualquier combinación de una o más mutaciones que da como resultado niveles de proteína modulados. Por ejemplo, las plantas mutantes o de origen no natural pueden tener una sola mutación en un solo gen; múltiples mutaciones en un solo gen; una mutación en dos o más o tres o más genes; o mutaciones múltiples en dos o más o tres o más genes. A manera de ejemplo adicional, las plantas mutantes o de origen no natural pueden tener una o más mutaciones en una parte específica del gene(s) - tal como en la región del gen que codifica un sitio activo de la proteína o parte de la misma. A manera de ejemplo adicional, las plantas mutantes o de origen no natural pueden tener una o más mutaciones en una región fuera de uno o más gene(s) - tal como en una región de corriente ascendente o corriente descendente del gen que lo regula, siempre que modulen la actividad o expresión del gene(s). Los elementos de corriente ascendente pueden incluir promotores, aumentadores o factores de transcripción. Algunos elementos - tal como aumentadores - pueden colocarse en la corriente ascendente o corriente descendente del gen que regulan. El elemento(s) no necesita estar localizado cerca del gen que regula, ya que se han encontrado algunos elementos localizados en varios cientos de miles de pares base de la corriente ascendente o corriente descendente del gen que regulan. Las plantas mutantes o de origen no natural pueden tener una o más mutaciones localizadas dentro de los primeros 100 nucleótidos del gen(s), dentro de los primeros 200 nucleótidos del gen(s), dentro de los primeros 300 nucleótidos del gen(s), dentro de los primeros 400 nucleótidos del gen(s), dentro de los primeros 500 nucleótidos del gen(s), dentro de los primeros 600 nucleótidos del gen(s), dentro de los primeros 700 nucleótidos del gen(s), dentro de los primeros 800 nucleótidos del gen(s), dentro de los primeros 900 nucleótidos del gen(s), dentro de los primeros 1000 nucleótidos del gen(s), dentro de los primeros 1100 nucleótidos del gen(s), dentro de los primeros 1200 nucleótidos del gen(s), dentro de los primeros 1300 nucleótidos del gen(s), dentro de los primeros 1400 nucleótidos del gen(s) o dentro de los primeros 1500 nucleótidos del gen(s). Las plantas mutantes o de origen no natural pueden tener una o más mutaciones localizadas dentro del primero, segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto, séptimo, octavo, noveno, décimo, decimoprimero, decimosegundo, decimotercero, decimocuarto o decimoquinto conjunto de 100 nucleótidos del gen(s) o combinaciones de los mismos. Se describen plantas mutantes o de origen no natural (por ejemplo, plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas y similares tal como aquí se describe) que comprenden las variantes de polipéptido mutante.
En una modalidad, las semillas de las plantas son mutagenizadas y posteriormente se crecen en las plantas mutantes de primera generación. Las plantas de primera generación posteriormente se dejan autopolinizar y las semillas de la planta de la primera generación se crecen en plantas de segunda generación, las cuales posteriormente se clasifican para mutaciones en sus lugares. Aunque el material de planta mutagenizada puede ser clasificado para mutaciones, una ventaja de clasificar las plantas de segunda generación es que todas las mutaciones somáticas corresponden a las mutaciones de línea germinal. Un experto en la técnica puede comprender que se pueden mutagenizar una variedad de materiales de planta, incluyendo pero sin limitarse a semillas, polen, tejido de planta o células de planta, con el objeto de crear las plantas mutantes. Sin embargo, el tipo de material de planta mutagenizado puede afectarse cuando el ácido nucleico de la planta es clasificado para mutaciones. Por ejemplo, cuando el polen se somete a mutagénesis antes de la polinización de una planta no mutgenizada, estas semillas que resultan de dicha polinización, se crecen en plantas de primera generación. Cada célula de las plantas de primera generación contendrán mutaciones claras en el polen; por lo tanto estas plantas de primera generación posteriormente pueden ser clasificadas para mutaciones en lugar de esperar hasta la segunda generación.
Los mutagenes que crean principalmente mutaciones de punta y eliminaciones, inserciones, transversiones, o transiciones cortas, incluyendo mutagenes o radiación química, se pueden utilizar para crear las mutaciones. Los mutagenes incluyen, pero no se limitan a metanosulfonato de etilo, sulfonato de metilmetano, N-etil-N-nitrosurea, trietilmelamina, N-metil-N-nitrosourea, procarbazina, clorambucilo, ciclofosfamida, sulfato de dietilo, monómero de acrilamida, melfalan, mostaza de nitrógeno, vincristina, dimetilnitrosamina, N-metil-N'-nitro-Nitrosoguanidina, nitrosoguanidina, 2-aminopurina, 7,12 dimetil-benz(a)antraceno, óxido de etileno, hexametilfosforamida, bisulfan, diepoxialcanos (diepoxioctano, diepoxibutano, y similares), diclorhidrato de 2-metoxi-6-cloro-9[3-(etil-2-cloro-etil)aminopropilamino]acridina y formaldehído.
Las mutaciones espontáneas en el lugar que pueden no haber sido originadas directamente por el mutageno, también están contempladas siempre que den como resultado el fenotipo deseado. Los agentes mutagénicos adecuados también pueden incluir, por ejemplo, radiación por ionización - tal como rayos X, rayos gamma, irradiación de neutrones rápida y radiación UV. Se puede utilizar cualquier método de preparación de ácido nucleico de planta conocido por los expertos en la técnica, para preparar el ácido nucleico de plantas para clasificación por mutación.
El ácido nucleico preparado de plantas individuales, células de plantas o material de planta puede ser recolectado opcionalmente con el objeto de agilizar la clasificación para las mutaciones en la población de plantas que se originan del tejido, células o material de la planta mutagenizada. Se pueden clasificar una o más generaciones de plantas, células de plantas o material de plantas subsecuentes. El tamaño del grupo recolectado opcionalmente depende de la sensibilidad del método de clasificación utilizado.
Después de que se recolectan opcionalmente las muestras de ácido nucleico, pueden someterse a técnicas de amplificación específica de polinucleótido, tal como Reacción de Cadena de Polimerasa. Cualquiera de uno o más cebadores o sondas específicas para el gen o las secuencias inmediatamente adyacentes al gen para amplificar la secuencia dentro de la muestra de ácido nucleico recolectada en forma opcional. Los cebadores de ejemplo se establecen en las SEC ID Nos: 3 a 5, 10 a 12 y 14 a 16. Preferentemente, el uno o más cebadores o sondas se diseñan para amplificar las regiones del lugar en donde es más probable que surjan las mutaciones útiles. Más preferentemente, el cebador se diseña para detectar mutaciones dentro de regiones del polinucleótido. Además, es preferible que el cebador(s) y la sonda(s) eviten sitios polimórficos conocidos con el objeto de facilitar la clasificación de mutaciones de punta. Para facilitar la detección de los productos de amplificación, el uno o más cebadores o sondas pueden ser etiquetados utilizando cualquier método de etiquetado convencional. El cebador(s) o sonda(s) puede diseñarse con base en las secuencias aquí descritas utilizando métodos que son bien comprendidos en la técnica.
Para facilitar la detección de los productos de amplificación, el cebador(s) o sonda(s) pueden etiquetarse utilizando cualquier método de etiquetado convencional. Estos pueden ser diseñados con base en las secuencias aquí descritas utilizando métodos que son bien comprendidos en la técnica .
Los polimorfismos se pueden identificar a través de medios conocidos en la técnica y algunos han sido descritos en la literatura.
En un aspecto adicional se proporciona un método para preparar una planta muíante. El método implica proporcionar al menos una célula de una planta que comprende un gen que codifica un polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNC ED2 funcional (o una combinación de dos o más o tres o más del mismo). Posteriormente la al menos una célula de la planta se trata bajo condiciones efectivas para modular la actividad del polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2. La al menos una célula de planta mutante posteriormente se propaga en una planta mutante, en donde la planta mutante tiene un nivel modulado de polipéptidos NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 (o una combinación de dos o más o tres o más de los mismos) comparado con el de una planta de control. En una modalidad de este método para elaborar una planta mutante, el paso de tratamiento implica someter la al menos una célula a un agente de mutagenización química tal como se describió anteriormente, y bajo condiciones efectivas para producir al menos una célula de planta mutante. En otra modalidad de este método, el paso de tratamiento implica someter la al menos una célula a una fuente de radiación bajo condiciones efectivas para producir al menos una célula de planta mutante. El término "planta mutante" incluye plantas mutantes en donde el gen o tipo se modifica en comparación con una planta de control, en forma adecuada por medios diferentes a ingeniería genética o modificación genética.
En ciertas modalidades, la planta mutante, la célula de planta mutante o el material de planta mutante puede comprender una o más mutaciones que han surgido en forma natural en otra planta, célula de planta o material de planta, y confieren un rasgo deseado. Esta mutación puede incorporarse (por ejemplo, introgresarse) en otra planta, célula de planta o material de planta (por ejemplo, una planta, célula de planta o material de planta con un diferente fondo genético al de la planta de la cual se derivó la mutación) para conferir el rasgo en la misma. Por lo tanto a manera de ejemplo, puede introducirse en una segunda planta una mutación que surgió naturalmente en una primera planta- tal como una segunda planta con un diferente fondo genético al de la primera planta. El experto por consiguiente tendrá la capacidad de buscar e identificar una planta que lleva naturalmente en su genoma, uno o más alelos mutantes de los genes aquí descritos que confieren un rasgo deseado. El alelo(s) mutante que surge naturalmente puede ser transferido a la segunda planta mediante diversos métodos incluyendo cultivo, retrocruce e introgresión para producir una línea, variedades o híbridos que tengan una o más mutaciones en los genes aquí descritos. Las plantas que muestran un rasgo deseado pueden ser clasificadas de un conjunto de plantas mutantes. En forma adecuada, la selección se lleva a cabo utilizando el conocimiento de las secuencias de nucleótido tal como aquí se describe. En consecuencia, es posible clasificar un rasgo genético en comparación con un control. Dicho método de clasificación puede implicar la aplicación de amplificación de ácido nucleico y/o técnicas de hibridación convencionales, tal como aquí se describen. Por lo tanto, un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un método para identificar una planta mutante, en donde el método comprende los pasos de: (a) proporcionar una muestra que comprende un polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 de una planta; y (b) determinar la secuencia de nucleótido del polinucleótido, en donde una diferencia en la secuencia del polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 en comparación con la secuencia de polinucleótido. de una planta de control, indica que la planta es una planta mutante NtABA4 o NtNeSy o NtNC ED2. En otro aspecto se proporciona un método para identificar una planta mutante que acumula niveles incrementados de ya sea (i) carotenoide o beta-damascenona ; o (ii) carotenoide y beta-damascenona, en comparación con una planta de control, en donde el método comprende los pasos de: (a) proporcionar una muestra de una planta que será clasificada; (b) determinar si la muestra comprende una o más mutaciones en el polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2; y (c) determinar el contenido de (i) carotenoide o beta-damascenona; o (ii) carotenoide y beta-damascenona de la planta; en donde si la muestra comprende una o más mutaciones en el polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 que modulan la expresión o la actividad de la proteína codificada en comparación con una planta de control y una parte de la planta de tabaco tiene un incremento ya sea en el contenido de (i) carotenoide o beta-damascenona; o (ii) carotenoide y beta-damascenona de al menos 5% en comparación con una planta de tabaco de control en donde la expresión de la actividad de NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 no ha sido modulada, indica una planta mutante que acumula niveles incrementados ya sea de (i) carotenoide o beta-damascenona; o (ii) carotenoide y beta-damascenona. En otro aspecto se proporciona un método para preparar una planta mutante que acumula niveles incrementados ya sea de (i) carotenoide o beta-damascenona; o (ii) carotenoide y beta-damascenona, en comparación con una planta de control, en donde el método comprende los pasos de: (a) proporcionar una muestra de la primera planta; (b) determinar si la muestra comprende una o más mutaciones en el polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 que da como resultado la acumulación de niveles incrementados ya sea de (i) carotenoide o beta-damascenona; o (ii) carotenoide y beta-damascenona; y (c) transferir la una o más mutaciones en una segunda planta. La mutación(s) puede transferirse en la segunda planta utilizando varios métodos que son conocidos en la técnica - tal como mediante ingeniería genética, manipulación genética, introgresión, cultivo de plantas, retrocruce y similares. En una modalidad, la primera planta es una planta de origen natural. En una modalidad, la segunda planta tiene un diferente fondo genético al de la primera planta. En otro aspecto se proporciona un método para preparar una planta mutante que acumula niveles incrementados ya sea de (i) carotenoide o beta-damascenona; o (ii) carotenoide y beta-damascenona, en comparación con una planta de control, en donde el método comprende los pasos de: (a) proporcionar una muestra de una primera planta; (b) determinar si la muestra comprende una o más mutaciones en el polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 que dan como resultado la acumulación de niveles incrementados ya sea de (i) carotenoide o beta-damascenona; o (ii) carotenoide y beta-damascenona; y (c) introgresar la una o más mutaciones de la primera planta en una segunda planta. En una modalidad, el paso de introgresión comprende cultivo de plantas, incluyendo opcionalmente retrocruce, y similares. En una modalidad, la primera planta es una planta de origen natural. En una modalidad, la segunda planta tiene un diferente fondo genético de la primera planta. En una modalidad, la primera planta no es un cultivo o un cultivo élite. En una modalidad, la segunda planta es un cultivo o es un cultivo élite. Un aspecto adicional se refiere a una planta muíante (incluyendo planta mutante de cultivo o cultivo élite) obtenida o que se puede obtener a través de los métodos aquí descritos. En ciertas modalidades, las "plantas mutantes" pueden tener una o más mutaciones localizadas únicamente en una región específica de la planta - tal como dentro de la secuencia del polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2(s). De acuerdo con esta modalidad, la secuencia genómica restante de la planta mutante será la misma o sustancialmente la misma que la planta antes de la mutagénesis.
En ciertas modalidades, las plantas mutantes pueden tener una o más mutaciones localizadas en más de una región de la planta - tal como dentro de la secuencia del polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 y en una o más regiones adicionales del genoma. De acuerdo con esta modalidad, la secuencia genómica restante de la planta mutante no será la misma o no será sustancialmente la misma a la de la planta antes de la mutagénesis. En ciertas modalidades, las plantas mutantes pueden tener una o más mutaciones en uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más o cinco o más exones del polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2; o pueden no tener una o más mutaciones en uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más o cinco o más intrones del polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2; o pueden no tener una o más mutaciones en un promotor del polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2; o pueden no tener una o más mutaciones en la región traducida 3* del polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2; o pueden no tener una o más mutaciones en la región no traducida 5' del polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2; o pueden no tener una o más mutaciones en la región de codificación del polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2; o pueden no tener una o más mutaciones en la región de codificación del polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2; o cualquier combinación de dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más; o seis o más partes de las mismas.
En un aspecto adicional se proporciona un método para identificar una planta, una célula de planta o material de planta que comprende una mutación en un gen que codifica NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 en donde el método comprende: (a) someter una planta, célula de planta o material de planta a mutagénesis; (b) obtener una muestra de ácido nucleico de la planta, célula de planta o material de planta o descendientes de la misma; y (c) determinar la secuencia de ácido nucleico del gen que codifica NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 o una variante o fragmento del mismo, en donde la diferencia en la secuencia indica una o más mutaciones en la misma.
Las proteínas de dedo de Zinc se pueden utilizar para modular la expresión o la actividad de uno o más polinucleótidos NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2s aquí descritos. En varias modalidades, se modifica una secuencia de ADN genómica que comprende una parte o toda la secuencia de codificación del polinucleótido, mediante mutagénesis transmitida por nucleasa de dedo de zinc. La secuencia de ADN genómica se busca en un sitio único para el enlace de proteína de dedo de zinc. Alternativamente, la secuencia de ADN genómica se busca para dos sitios de zinc para el enlace de proteína de dedo de zinc, en donde ambos sitios están en hebras opuestas y cercanas, por ejemplo con 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más pares base de separación. Por lo tanto, se proporcionan proteínas de dedo de zinc que enlazan a polinucleótidos.
Una proteína de dedo de zinc puede diseñarse para reconocer un sitio objetivo seleccionado en un gen. Una proteína de dedo de zinc puede comprender cualquier combinación de motivos derivados de dominios de enlace de ADN de dedo de zinc naturales y dominios de enlace de ADN de dedo de zinc no naturales mediante truncado o expansión o un proceso de mutagénesis dirigido al sitio acoplado a un método de selección tal como, pero sin limitarse a, selección de despliegue de fago, selección de dos híbridos bacterianos o selección de un híbrido bacteriano. El término "dominio de enlace de ADN de dedo de zinc no natural" se refiere a un dominio de enlace de ADN de dedo de zinc que enlaza a una secuencia de tres pares base dentro de un ácido nucleico objetivo y que no surge en la célula u organismo que comprende el ácido nucleico el cual será modificado. Los métodos para diseñar la proteína de dedo de zinc que enlazan a secuencias de nucleótido específicas que son únicas para un gen objetivo, son conocidos en la técnica.
Una nucleasa de dedo de zinc puede ser construida elaborando una fusión de un primer polín ucleótido que codifica para una proteína de dedo de zinc que enlaza a un polinucleótido, y un segundo polinucleótido que codifica para una endonucleasa no específica tal como, pero sin limitarse a las de una endonucleasa Tipo US. Una proteína de fusión entre una proteína de dedo de zinc y la nucleasa puede comprender un espaciador que consiste de dos pares base o alternativamente, el espaciador puede consistir de tres, cuatro, cinco, seis, siete o más pares base. En varias modalidades, una nucleasa de dedo de zinc que introduce un rompimiento de hebra doble en una región reguladora, una región de codificación o una región de no codificación de una secuencia de ADN genómica de un polinucleótido y conduce a una reducción del nivel de expresión de un polinucleótido, o una reducción en la actividad de la proteína codificada de esta forma. La descomposición mediante nucleasas de dedo de zinc frecuentemente da como resultado la eliminación de ADN en el sitio de descomposición después de la reparación de ADN mediante unión de extremo no homologa.
En otras modalidades, se puede seleccionar una proteína de dedo de zinc para enlazar a una secuencia reguladora de un polinucleótido. Más específicamente, la secuencia reguladora puede comprender un sitio de inicio de transcripción, un codón de inicio, una región de un exón, un enlace de un exón-intrón, un terminador o un codón de detención. Por consiguiente, la presente invención proporciona una planta o células de planta mutante, de origen no natural o transgénica, producidas mediante mutagénesis transmitida por nucleasa de dedo de zinc en los alrededores o dentro de uno o más polinucleótidos aquí descritos, y métodos para elaborar dicha planta o célula de planta mediante mutagénesis transmitida por nucleasa de dedo de zinc. Los métodos para suministrar una proteína de dedo de zinc y nucleasa de dedo de zinc a una planta de tabaco, son similares a los descritos para el suministro de meganucleasa.
En otro aspecto, se describen métodos para producir plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas o de otra forma modificadas genéticamente utilizando meganucleasas, tal como l-Crel. Las meganucleasas de origen natural así como las meganucleasas recombinantes se pueden utilizar para originar específicamente un rompimiento de hebra doble en un solo sitio o en relativamente pocos sitios en el ADN genómico de una planta para permitir la interrupción de uno o más polinucleótidos aquí descritos. La meganucleasa puede ser una meganucleasa diseñada con propiedades de reconocimiento de ADN alterada. Las proteínas de meganucleasa pueden suministrarse en células de plantas a través de una variedad de diferentes mecanismos conocidos en la técnica.
La presente invención comprende el uso de meganucleasas para desactivar el polinucleótido(s) NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 (o una combinación de dos o más o tres o más del mismo) en una célula de planta o planta. Particularmente, la presente invención proporciona un método para desactivar un polinucleótido en una planta utilizando meganucleasa, en donde el método comprende: a) proporcionar una célula de planta que comprende un polinucleótido tal como aquí se describe; (b) introducir una meganucleasa o una construcción que codifica una meganucleasa en la célula de planta; y (c) permitir que la meganucleasa desactive sustancialmente el polinucleótido(s). Las meganucleasas se pueden utilizar para descomponer los sitios de reconocimiento de meganucleasa dentro de las regiones de codificación de un polinucleótido. Dicha descomposición frecuentemente da como resultado la eliminación de ADN en el sitio de reconocimiento de meganucleasa después de la reparación de ADN mutagénica mediante unión de enlace no homologa. Dichas mutaciones en la secuencia que codifica el gen normalmente son suficientes para desactivar el gen. Este método para modificar una célula de planta implica, primero, el suministro de un cartucho de expresión de meganucleasa a una célula de planta utilizando un método de transformación adecuado. Para la más alta eficiencia, es deseable enlazar el cartucho de expresión de meganucleasa o un marcador seleccionable y seleccionar las células transformadas con éxito en la presencia de un agente de selección. Este método dará como resultado la integración del cartucho de expresión de meganucleasa en el genoma, sin embargo, lo cual puede no ser deseable si la planta es probable que requiera aprobación reguladora. En dichos casos, el cartucho de expresión de meganucleasa (y el gen marcador seleccionable enlazado) puede ser segregado en las generaciones de plantas subsecuentes utilizando técnicas de cultivo convencionales. Alternativamente, las células de planta pueden ser transformadas inicialmente con un cartucho de expresión de meganucleasa que carece de un marcador seleccionable y pueden crecerse en un medio que carece de un agente de selección. Bajo dichas condiciones, una fracción de las células tratadas adquirirá el cartucho de expresión de meganucleasa y expresará temporalmente la meganucleasa diseñada sin integrar el cartucho de expresión de meganucleasa en el genoma. Bebido a que no abarca la eficiencia de transformación, este último procedimiento de transformación requiere que se clasifique un mayor número de células tratadas para obtener la modificación de genoma deseada. El método anterior también puede aplicarse para modificar una célula de planta cuando se utiliza una proteína de dedo de zinc o nucleasa de dedo de zinc.
Después del suministro del cartucho de expresión de meganucleasa, se crecen las células de plantas, inicialmente, bajo condiciones que son típicas para el procedimiento de transformación particular que fue utilizado. Esto puede significar crecer las células transformadas en un medio a temperaturas debajo de 26°C, frecuentemente en la oscuridad. Dichas condiciones estándar se pueden utilizar durante un período de tiempo, preferentemente 1 a 4 días, para permitir que la célula de planta se recupere del proceso de transformación. En cualquier punto después del período de recuperación inicial, se puede elevar la temperatura de crecimiento para estimular la actividad de la meganucleasa diseñada para descomponer y mutar el sitio de reconocimiento de meganucleasa.
Para ciertas aplicaciones, puede ser deseable eliminar precisamente el polinucleótido del genoma de la planta. Dichas aplicaciones son posibles utilizando un par de meganucleasas diseñadas, cada una de las cuales descompone un sitio de reconocimiento de meganucleasa en cualquier lado de la eliminación proyectada. También se pueden utilizar Nucleasas Efectoras TAL (TALENs) tienen la capacidad de reconocer y enlazar a un gen e introducir un rompimiento de hebra doble en el genoma. Por lo tanto en otro aspecto están contemplados los métodos para producir plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas o de otra forma modificadas genéticamente tal como aquí se describe utilizando Nucleasas Efectoras TAL.
Las plantas adecuadas para utilizarse en modificación genética incluyen plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas y sistemas de células de planta, incluyendo especies de una de las siguientes familias: Acantaceae, Alliaceae, Alstroemeriaceae, Amarillidaceae, Apocynaceae, Arecaceae, Asteraceae, Berberidaceae, Bixaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Caryofillaceae, Cefalotaxaceae, Chenopodiaceae, Colchicaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Efedraceae, Erytroxilaceae, Euforbiaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Linaceae, Lycopodiaceae, Malvaceae, Melantiaceae, Musaceae, Myrtaceae, Nyssaceae, Papaveraceae, Pinaceae, Plantaginaceae, Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Sapindaceae, Solanaceae, Taxaceae, Theaceae, o Vitaceae.
Las especies adecuadas pueden incluir miembros del género Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria , Ananas, Andrografis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberís, Beta, Bixa, Brassica, Caléndula, Camellia, Camptoteca, Cannabis, Capsicum, Cartamus, Catarantus, Cefalotaxus, Chrysantemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucúrbita, Cynodon, Datura, Diantus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Efedra, Eriantus, Erytroxilum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galantus, Glycine, Gossypium, Heliantus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatrofa, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Menta, Miscantus, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Partenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopolia, Sécale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Triticum, Unióla, Veratrum, Vinca, Vitis, y Zea.
Las especies adecuadas pueden incluir Panicum spp., Sorghum spp., Miscantus spp., Saccharum spp., Eriantus spp., Populus spp., Andropogon gerardii (Big Bluestem), Pennisetum purpureum (pasto elefante), Phalaris arundinacea (hierba cinta), Cynodon dactilon (Pastizal de Bermuda), Festuca arundinacea (festuca alta), Spartina pectinata (pasto de pradera), Medicago sativa (alfalfa), Arundo donax (Carrizo gigante), Sécale cereale (centeno), Salix spp. (sauce), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale (centeno de trigo Triticum), bamboo, Heliantus annuus (girasol), Cartamus tinctorius (cártamo), Jatrofa curcas (jatrofa), Ricinus communis (castor), Elaeis guineensis (palma), Linum usitatissimum (lino), Brassica júncea, Beta vulgaris (remolacha), anihot esculenta (cassaya), Lycopersicon esculentum (tomate), Lactuca sativa (lechuga), Musa paradisiaca (plátano), Solanum tuberosum (papa), Brassica olerácea (brócoli, coliflor, col de Brusselas), Camellia sinensis (té), Fragaria ananassa (fresa), Theobroma cacao (cocoa), Coffea arábica (café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (piña), Capsicum annum (chile picoso y dulce), Allium cepa (cebolla), Cucumis meló (melón), Cucumis sativus (pepino), Cucúrbita máxima (calabaza), Cucúrbita moschata (calabaza), Spinacea olerácea (espinaca), Citrullus lanatus (sandía), Abelmoschus esculentus (okra), Solanum melongena (berengena), Rosa spp. (rosa), Diantus caryofillus (clavel), Petunia spp. (petunia), Poinsettia pulcherrima (flor de pascua), Lupinus albus (altramuz), Unióla paniculata (avenas), bentgrass (Agrostis spp.), Populus tremuloides (avenas), Pinus spp. (pino), Abies spp. (abeto), Acer spp. (maple), Hordeum vulgare (cebada), Poa pratensis (hierba azul para forraje), Lolium spp. (césped ingles) y Phleum pratense (fleo), Panicum virgatum (hierba demijo), Sorghum bicolor (sorgo, césped de sudán), Miscantus giganteus (miscantus), Saccharum sp. (caña), Populus balsamifera (álamo), Zea mays (maíz), Glycine max (frijol de soya), Brassica napus (cañóla), Triticum aestivum (trigo), Gossypium hirsutum (algodón), Oryza sativa (arroz), Heliantus annuus (girasol), Medicago sativa (alfalfa), Beta vulgaris (remolacha), o Pennisetum glaucum (mijo perla).
Se dirigen varias modalidades a plantas mutantes, plantas que no tienen origen natural o plantas transgénicas modificadas para modular (por ejemplo, reducir o inhibir) niveles de expresión de gen NtMRP de esta forma, para producir plantas -tal como plantas de tabaco - en las cuales el nivel de expresión de NtMRP se reduce dentro de los tejidos de planta de interés en comparación con una planta de control. Las composiciones y métodos descritos se pueden aplicar a cualquier especie del género Nicotians, incluyendo N. rustica y N. tabacum (por ejemplo, LA B21, LN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1, y Petico). Otras especies incluyen N. acaulis, N. acuminata, N. acuminata var. multiflora, N. africana, N. alata, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuata, N. benavidesii, N. bentamiana, N. bigelovii, N. bonariensis, N. cavicola, N. clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forgetiana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N. gossei, N. hybrid, N. ingulba, N. kawakamü , N. knightiana, N. langsdorffii , N. linearis, N. longiflora , N. marítima, N. megalosifon, N. miersii, N. noctíflora, N. nudicaulis, N. obtusifolia, N. occidentalis, N. occidentalis subsp. hesperis, N. otofora, N. paniculata, N. pauciflora, N. petunioides, N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis, N. raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundifolia, N. setchellii, N. simulans, N. solanifolia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveolens, N. silvestris, N. tyrsi flora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trigonofilla, N. umbrática, N. undulata, N. velutina, N. wigandioides, y N. x sanderae.
El uso de cultivos de tabaco y cultivos de tabaco élite también está contemplado en la presente invención. La planta transgénica, que no tiene origen natural o muíante por consiguiente puede ser una variedad de tabaco o cultivo de tabaco élite que comprende uno o más transgenes, o una más mutaciones genéticas o una combinación de las mismas. La mutación(s) genética (por ejemplo, uno o más polimorfismos) pueden ser mutaciones que no existen naturalmente en la variedad de tabaco o cultivo de tabaco individual (por ejemplo, cultivo de tabaco élite) o pueden ser una mutación(s) genética que ocurre naturalmente, siempre que la mutación no ocurra naturalmente en la variedad de tabaco o cultivo de tabaco individual (por ejemplo, cultivo de tabaco élite).
Las variedades de Nicotiana tabacum particularmente útiles, incluyen tabacos tipo Burley, tipo oscuridad, tipo curado con humo y tipo Oriental. Los ejemplos sin limitación de variedades o cultivos son: BD 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301 , CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CD 263, DF911, DT538 LC tabaco Galpao, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, HB 04P LC, HB3307PLC, Híbrido 403LC, Híbrido 404LC, Híbrido 501 LC, K 149, K 326, ? 346, ? 358, ?394, ? 399, ? 730, KDH 959, ?? 200, KT204LC, ??10, ??14, ?? 160, ?? 17, ?? 171, ?? 907, KY907LC, KTY14xL8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, Narrow Leaf Madole LC, NBH 98, N-126, N-777LC, N-7371 LC, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smit Madole, OXFORD 207, PD 7302 LC, PD 7309 LC, PD 7312 LC, tabaco de 'Perique', PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA359, AA 37-1, B 13P, Xanti (Mitchell-Mor), Bel-W3, 79-615, Samsun Holmes NN, KTRDC número 2 Híbrido 49, Burley 21, KY 8959, KY 9, MD 609, PG 01, PG 04, P0 1, P02, P0 3, RG 11, RG 8, VA 509, AS44, Banket A1, Basma Drama B84/31, Basma I Zichna ZP4/B, Basma Xanti BX 2A, Batek, Besuki Jember, C104, Coker 347, Criollo Misionero, Delcrest, Djebel 81, DVH 405, Galpao Comum, HB04P, Hicks Broadleaf, Kabakulak Elassona, Kutsage E1, LA BU 21, NC 2326, NC 297, PVH 2110, Red Russian, Samsun, Saplak, Simmaba, Talgar 28, Wislica, Yayaldag, Prilep HC-72, Prilep P23, Prilep PB 156/1 , Prilep P12-2/1, Yaka JK-48, Yaka JB 125/3, TI-1068, KDH-960, TI-1070, TW136, Basma, TKF 4028, L8, TKF 2002, GR141, Basma xanti, GR149, GR153, Petit Havana. También están contempladas subvariedades de convertidor inferior de las anteriores, incluso si no se identifican en forma específica en la presente descripción.
También se dirigen modalidades a composiciones y métodos para producir plantas mutantes, plantas de origen no natural, plantas híbridas o plantas transgénicas que han sido modificadas para modular la expresión o actividad del polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 (o una combinación de dos o más o tres o más del mismo) o un polipéptido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 (o una combinación de dos o más o tres o más del mismo). En forma conveniente, las plantas mutantes, las plantas de origen no natural, las plantas híbridas o las plantas transgénicas que se obtienen pueden ser similares o sustancialmente iguales en apariencia general a las plantas de control. Se puede evaluar mediante observaciones en el campo varias características fenotípicas tales como grado de madurez, número de hojas por planta, altura del tallo, ángulo de inserción de la hoja, tamaño de la hoja (ancho y largo), distancia de internodo, proporción de lámina-nervadura central.
Un aspecto se relaciona con una semilla de una planta mutante, una planta de origen no natural, una planta híbrida o una planta transgénica aquí descrita. Preferentemente la semilla es una semilla de tabaco. Un aspecto adicional se refiere a polen o un óvulo de una planta mutante, una planta de origen no natural, una planta híbrida o una planta transgénica que aquí se describe. Además, se proporciona una planta mutante, una planta de origen no natural, una planta híbrida o una planta transgénica tal como aquí se describe, que además comprende un ácido nucleico que confiere esterilidad masculina.
También se proporciona un cultivo de tejido de células regenerables de la planta mutante, planta de origen no natural, planta híbrida o planta transgénica o una parte de la misma tal como aquí se describe, en donde el cultivo regenera plantas con la capacidad de expresar todas las características morfológicas y fisiológicas del progenitor. Las células regenerables incluyen pero no se limitan a células de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotiledones, raíces, puntas de raíces, anteras, flores y partes de las mismas, óvulos, brotes, tallos, varas, médula y cápsulas o callos o protoplastos derivados de las mismas.
Un objeto es proporcionar plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas que exhiben niveles modulados carotenoides o de beta-damascenona o niveles modulados de carotenoide y beta-damascenona que mantienen al mismo tiempo sustancialmente la misma apariencia visual en comparación con una planta de control. Por consiguiente, se describe en la presente invención plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas o células de plantas que tienen niveles modulados de carotenoide o beta-damascenona o niveles modulados de carotenoide y beta-damascenona en comparación con células de control o plantas de control. Las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas o células de planta han sido modificadas para modular la síntesis o actividad de una o más de las enzimas aquí descritas, modulando la expresión de uno o más polipéptidos que codifican las secuencias de polinucleótido aquí descrito. Un aspecto adicional se relaciona con una planta o célula mutante, de origen no natural o transgénica, en donde la expresión o la actividad de una o más de las enzimas aquí descritas, se modula y una parte de la planta (por ejemplo, las hojas) tiene un incremento o disminución en los niveles carotenoides de al menos 5% en comparación con una planta de control en donde la expresión de la actividad de dichas enzima(s) no ha sido modulada. Un aspecto aún adicional se refiere a una planta o célula mutante, de origen no natural o transgénica, en donde la expresión de neoxantina sintasa o la actividad de la proteína codificada de esta forma se modula y en donde los niveles de beta-damascenona en aerosol se incrementan o disminuyen en al menos el 5% en comparación con el aerosol de la planta de control .
El cambio en el contenido de carotenoide en comparación con la planta de control puede ser un cambio de al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, o aproximadamente 100% o más - tal como 200% o 300% o más.
El cambio en el contenido de beta-damascenona en comparación con la planta de control puede ser un cambio de al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, o aproximadamente 100% o más - tal como 200% o 300% o más.
En forma adecuada, el contenido de luteína en parte de la planta (por ejemplo, las hojas) es de al menos aproximadamente 18mg/100g, en forma adecuada, al menos aproximadamente 18.5mg/100g, en forma adecuada, al menos aproximadamente 19mg/100g, en forma adecuada, al menos aproximadamente 19.5mg/100g, en forma adecuada, al menos aproximadamente 20mg/100g, en forma adecuada, al menos aproximadamente 25mg/100g o más.
En forma adecuada, el contenido de beta-caroteno en parte de la planta (por ejemplo, las hojas) es de al menos aproximadamente 11.5mg/100g del material de la planta recolectada (por ejemplo, hoja), en forma adecuada al menos aproximadamente 12mg/100g, en forma adecuada, al menos aproximadamente 12.5mg/100g, en forma adecuada, al menos aproximadamente 13mg/100g, en forma adecuada, al menos aproximadamente 13.5 mg/100g, en forma adecuada, al menos 14mg/100g, en forma adecuada, al menos aproximadamente 14.5mg/100g, o en forma adecuada, al menos aproximadamente 15mg/1 OOg, o más.
En forma adecuada, el contenido de luteína en parte de la planta (por ejemplo las hojas) es de al menos aproximadamente 18mg/100g del material de la planta recolectada (por ejemplo, hoja), en forma adecuada, al menos aproximadamente 18.5mg/100g, en forma adecuada, al menos aproximadamente 19mg/100g, en forma adecuada, al menos aproximadamente 19.5mg/100g, en forma adecuada, al menos aproximadamente 20mg/100g, en forma adecuada, al menos aproximadamente 25mg/100g o más y el contenido de beta-caroteno en parte de la planta (por ejemplo, las hojas) es al menos aproximadamente 11.5mg/100g, en forma adecuada, al menos aproximadamente 12mg/100g, en forma adecuada, al menos aproximadamente 12.5mg/100g, en forma adecuada, al menos aproximadamente 13mg/100g, en forma adecuada, al menos aproximadamente 13.5 mg/100g, en forma adecuada, al menos 14mg/100g, en forma adecuada, al menos aproximadamente 14.5mg/100g, o en forma adecuada, al menos aproximadamente 15mg/100g, o más.
En forma adecuada, los niveles de beta-damascenona en aerosol de hojas quemadas o calentadas es de al menos aproximadamente 1 ng/mg del material de la planta quemado o calentado (por ejemplo, la hoja), en forma adecuada, al menos aproximadamente 1.05 ng/mg, en forma adecuada, al menos aproximadamente 1.1 ng/mg, en forma adecuada, al menos aproximadamente 1.15 ng/mg, o en forma adecuada, al menos aproximadamente 2 ng/mg o más.
En forma adecuada, (i) el contenido de luteína en parte de la planta (por ejemplo, las hojas) es de al menos aproximadamente 18mg/100g del material de la planta recolectado (por ejemplo, la hoja), en forma adecuada, al menos aproximadamente 18.5mg/100g, en forma adecuada, al menos aproximadamente 19mg/100g, en forma adecuada, al menos aproximadamente 19.5mg/100g, en forma adecuada, al menos aproximadamente 20mg/100g; en forma adecuada, al menos aproximadamente 25mg/100g o más; en forma adecuada, (ii) el contenido de beta-caroteno en parte de la planta (por ejemplo, las hojas) es al de menos aproximadamente 11.5mg/100g del material de la planta recolectado (por ejemplo, la hoja), en forma adecuada, al menos aproximadamente 12mg/100g, en forma adecuada, al menos aproximadamente 12.5mg/100g, en forma adecuada, al menos aproximadamente 13mg/100g, en forma adecuada, al menos aproximadamente 13.5mg/100g, en forma adecuada, al menos 14mg/100g, en forma adecuada, al menos aproximadamente 14.5mg/100g, o en forma adecuada, al menos aproximadamente 15mg/100g, o más; y (iii) en forma adecuada, los niveles de beta-damascenona en aerosol de las hojas quemadas o calentadas es de al menos aproximadamente 1 ng/mg del material de la planta quemado o recolectado (por ejemplo, la hoja), en forma adecuada, al menos aproximadamente 1.05 ng/mg, en forma adecuada, al menos aproximadamente 1.1 ng/mg, en forma adecuada, al menos aproximadamente 1.15 ng/mg, o en forma adecuada, al menos aproximadamente 2 ng/mg o más.
La planta puede ser calentada a una temperatura de 100°C o superior - tal como al menos 125°C, al menos 150°C, al menos 175°C o al menos 200° - para liberar el aerosol.
En un aspecto aún adicional, se proporciona una planta muíante, de origen no natural o transgénica, en donde la expresión de una enzima se selecciona del grupo que consiste en neoxantina sintasa, licopeno beta ciclasa y dioxigenasa 9-cis-epoxicarotenoide o una combinación de dos o más o tres o más de los mismos (y las combinaciones se describen en la presente invención) o la actividad de la proteína codificada de esta forma se incrementa, y (i) el contenido de luteína en parte de la planta (por ejemplo, las hojas) es de al menos aproximadamente 18mg/100g del material de la planta recolectado (por ejemplo, la hoja); (ii) el contenido de beta-caroteno en parte de la planta (por ejemplo, las hojas) es de al menos aproximadamente 11.5mg/100g del material de la planta recolectado (por ejemplo, la hoja); y (iii) los niveles de beta-damascenona en aerosol de hojas quemadas o calentadas es de al menos aproximadamente 1 ng/mg del material de la planta quemado o recolectado (por ejemplo, la hoja). En forma adecuada la apariencia visual de la planta es sustancialmente igual a la de la planta de control. En forma adecuada, la planta es una planta de tabaco.
También se dirigen las modalidades a composiciones y métodos para producir plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas que han sido modificadas para modular la expresión o actividad de neoxantina sintasa; la expresión o actividad de licopeno beta ciclasa; o la expresión o actividad de dioxigenasa 9-cis-epoxicarotenoide que puede dar como resultado plantas o componentes de planta (por ejemplo, hojas -tal como hojas verdes u hojas curadas) con niveles modulados de carotenoides (por ejemplo, pero sin limitarse a, luteína o beta-caroteno o ambos) en comparación con un control. Las modalidades también se dirigen a composiciones y métodos para producir plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas que han sido modificadas para modular la expresión o actividad de una combinación de dos o más o tres o más de neoxantina sintasa, licopeno beta ciclasa y dioxigenasa 9-cis-epoxicarotenoide. Por lo tanto una modalidad se refiere a modular la expresión o actividad de neoxantina sintasa, licopeno beta ciclasa y dioxigenasa 9-cis-epoxicarotenoide; otra modalidad se refiere a modular la expresión o actividad de neoxantina sintasa y dioxigenasa 9-cis-epoxicarotenoide; y otra modalidad se refiere a modular la expresión o actividad de licopeno beta ciclasa y dioxigenasa 9-cis-epoxicarotenoide o cualquier otra combinación de dos o más secuencias. Modular los niveles de carotenoides en las plantas puede tener beneficios nutricionales para el consumidor, especialmente cuando los niveles carotenoides en la planta se incrementan. Modular los niveles de carotenoides en plantas se puede utilizar para generar plantas que son resistentes a herbicidas que inhiben la biosíntesis carotenoide, especialmente cuando los niveles de carotenoide en la planta se incrementan. Por lo tanto en una modalidad específica, las composiciones y métodos para producir plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas que han sido modificadas para incrementar la expresión o actividad de los polinucleótidos antes mencionados y combinaciones de los mismos, se proporcionan de modo que puedan dar como resultado plantas o componentes de planta (por ejemplo, hojas - tal como hojas verdes u hojas curadas) con beneficios nutricionales mejorados o resistencia incrementada a herbicidas.
Las modalidades también se dirigen a composiciones y métodos para producir plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas que han sido modificadas para modular la expresión o actividad de neoxantina sintasa que pueden dar como resultado plantas o componentes de plantas (por ejemplo, hojas curadas, calentadas) con niveles modulados de beta-damascenona en comparación con un control. Por lo tanto, en una modalidad adicional, se proporcionan composiciones y métodos para producir plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas han sido modificadas para modular la expresión o actividad de neoxantina sintasa, de modo que dan como resultado plantas o material de plantas - tal como hojas de tabaco curadas calentadas o quemadas - en donde se modulan los niveles de beta-damascenona. Por lo tanto, el incrementar o reducir el contenido de beta-damascenona puede dar como resultado un material de la planta con perfiles de sabor alterado. En una modalidad específica, se proporcionan las composiciones y métodos para producir plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas que han sido modificadas para incrementar la expresión o actividad de neoxantina sintasa, lo cual puede dar como resultado plantas o material de plantas -tal como hojas de tabaco curadas calentadas o quemadas - en donde se incrementan los niveles de beta-damascenona. El incremento del contenido de beta-damascenona puede dar como resultado un material de la planta que tiene un perfil de sabor con un sabor de manzana cocinada. El disminuir el contenido de beta-damascenona puede dar como resultado un material de la planta que tiene un perfil de sabor modificado. De acuerdo con ciertas modalidades, la referencia en la presente invención a beta-damascenona también puede incluir precursores de la misma. Dicha modificación también puede modular el contenido carotenoide de las plantas.
En forma conveniente, las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas que se obtienen de acuerdo con los métodos aquí descritos son similares o sustancialmente iguales en apariencia visual a las plantas de control. En una modalidad, la altura del tallo de las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas es sustancialmente la misma que la de las plantas de control, por ejemplo, al uno, dos o tres o más meses después del trasplante en campo o a los 10, 20, 30 o 36 o más días después del recorte. Por ejemplo, la altura del tallo de las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas no es menor a la altura del tallo de las plantas de control. En otra modalidad, el contenido de clorofila de las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas es sustancialmente igual a las plantas de control. En otra modalidad, la altura del tallo de las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas es sustancialmente igual a las plantas de control, y el contenido de clorofila de las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas es sustancialmente igual a las plantas de control. En otras modalidades, el tamaño o forma o número o coloración de las hojas de las plantas mutantes, de origen no natural o transgénicas, es sustancialmente el mismo al de las plantas de control. En forma adecuada, la planta es una planta de tabaco.
En otro aspecto, se proporciona un método para modular el contenido carotenoide en al menos una parte de una planta (por ejemplo, las hojas), en donde el método comprende los pasos de: (i) modular la expresión o actividad de una enzima seleccionada del grupo que consiste en neoxantina sintasa, licopeno beta ciclasa y dioxigenasa 9-cis-epoxicarotenoide, una combinación de dos o más o tres o más de los mismos (las combinaciones se describen anteriormente) en la planta, preferentemente en donde la neoxantina sintasa, licopeno beta ciclasa y dioxigenasa 9-cis-epoxicarotenoide comprenden la secuencia de polinucleótido aquí descrita o la secuencia de polipéptido aquí descrita; (ii) medir el contenido carotenoide en al menos una parte (por ejemplo, las hojas) de la planta mutante, de origen no natural o transgénica obtenida en el paso (i); y (iii) identificar una planta mutante, de origen no natural o transgénica en donde el contenido de carotenoide en la misma ha sido modulado en comparación con una planta de control. En forma adecuada, la apariencia visual de la planta mutante, de origen no natural o transgénica es sustancialmente igual a la planta de control. En forma adecuada, la planta es una planta de tabaco.
En otro aspecto, se proporciona un método para incrementar el contenido carotenoide en al menos una parte de una planta (por ejemplo, las hojas) en donde el método comprende los pasos de: (i) incrementar la expresión o actividad de una enzima seleccionada del grupo que consiste en neoxantina sintasa, licopeno beta ciclasa y dioxigenasa 9-cis-epoxicarotenoide o una combinación de dos o más o tres o más de las mismas (las combinaciones tal como se describen anteriormente) en la planta, preferentemente, en donde la neoxantina sintasa, licopeno beta ciclasa y dioxigenasa 9-cis-epoxicarotenoide comprenden la secuencia de polinucleótido aquí descrita o la secuencia de polipéptido aquí descrita; (ii) medir el contenido carotenoide en al menos una parte (por ejemplo, las hojas) de la planta mutante, de origen no natural o transgénica obtenida en el paso (i); y (iii) identificar una planta muíante, de origen no natural o transgénica en la cual se ha incrementado el contenido carotenoide en la misma en comparación con una planta de control. En forma adecuada, la apariencia visual de la planta mutaníe, de origen no natural o transgénica es sustancialmente igual a la de la planta de control. En forma adecuada, la planta es una planta de tabaco.
En otro aspecto, se proporciona un método para disminuir el contenido carotenoide en al menos una paríe de una plañía (por ejemplo, las hojas), en donde el méfodo comprende los pasos de: (i) reducir la expresión o aclividad de una enzima seleccionada del grupo que consisle en neoxanlina sinlasa, licopeno beía ciclasa y dioxigenasa 9-cis-epoxicarotenoide o una combinación de dos o más o tres o más de la misma (las combinaciones íal como aquí se describen) en la planta, preferentemenfe en donde la neoxanlina sinlasa, licopeno beta ciclasa y dioxigenasa 9-cis-epoxicarotenoide comprenden la secuencia de polinucleótido aquí descrita o la secuencia de polipéptido aquí descrita; (ii) medir el contenido carotenoide en al menos una parte (por ejemplo, las hojas) de la planta mutante, de origen no natural o transgénica obtenido en el paso (i); y (iii) identificar una planta mutante, de origen no natural o transgénica en donde el contenido carotenoide en la misma ha sido disminuido en comparación con una planta de control. En forma adecuada, la apariencia visual de la planta mutante, de origen no natural o transgénica es sustancialmente igual a la planta de control. En forma adecuada, la planta es una planta de tabaco.
El incremento en la expresión en comparación con la planta de control puede ser de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 100%, o un incremento de al menos 10%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o 100% o más - tal como 200% o 300% o más, que incluye un incremento en la actividad de transcripción o expresión de proteína, o ambas.
El incremento en la actividad en comparación con la planta de control puede ser de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 100%, o un incremento de al menos 10%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o 100% o más - tal como 200% o 300% o más.
La reducción en comparación con la planta de control puede ser de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 100%, o una reducción de al menos 10%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o 100%, que incluye una reducción en la actividad transcripcional o expresión de proteína, o ambas.
La reducción en la actividad en comparación con una planta de control puede ser de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 100%, o una reducción de al menos 10%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o 00%.
El incremento en el contenido carotenoide en comparación con una planta de control puede ser de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 100%, o un incremento de al menos 10%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o hasta el 100% o más - tal como 200% o 300% o más.
La disminución en contenido carotenoide en comparación con una planta de control puede ser de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 100%, o una disminución de al menos 10%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o hasta el 100%.
En otro aspecto, se proporciona un método para modular el contenido de beta-damascenona de una planta, en donde el método comprende los pasos de: (i) modular la expresión o actividad de neoxantina sintasa en la planta, preferentemente, en donde la neoxantina sintasa comprende la secuencia de polinucleótido o la secuencia de polipéptido aquí descrita; (ii) medir el contenido de beta-damascenona en al menos una parte de la planta mutante, de origen no natural o transgénica obtenida en el paso (i) o un aerosol de la misma; y (iii) identificar una planta mutante, de origen no natural o transgénica en donde el contenido de beta-damascenona en la misma ha cambiado en comparación con una planta de control en donde la expresión o actividad de neoxantina sintasa ha sido modulada. En forma adecuada, la apariencia visual de la planta mutante, de origen no natural o transgénica es sustancialmente igual a la de la planta de control. En forma adecuada, la planta es una planta de tabaco. En forma adecuada, el contenido de beta-damascenona se mide en el aerosol formado después de calentar las hojas de tabaco curadas.
En otro aspecto, se proporciona un método para incrementar el contenido de beta-damascenona de una planta, en donde el método comprende el paso de: (i) incrementar la expresión o actividad de neoxantina sintasa en la planta, preferentemente, en donde la neoxantina sintasa comprende la secuencia de polinucleótido o la secuencia de polipéptido aquí descrita; (ii) medir el contenido de beta-damascenona en al menos una parte de la planta mutante, de origen no natural o transgénica obtenida en el (i); y (iii) identificar una planta mutante, de origen no natural o transgénica en donde el contenido de beta-damascenona en la misma se ha incrementado en comparación con una planta de control en donde no se ha incrementado la expresión o actividad de la neoxantina sintasa. En forma adecuada, la apariencia visual de la planta mutante, de origen no natural o transgénica es sustancialmente igual a la planta de control. En forma adecuada, la planta es una planta de tabaco. En forma adecuada, el contenido de beta-damascenona se mide en el aerosol formado después de calentar las hojas de tabaco curadas.
En otro aspecto, se proporciona un método para reducir o inhibir (por ejemplo inhibir sustancialmente) el contenido de beta-damascenona de una planta, en donde el método comprende los pasos de: (i) reducir o inhibir la expresión o actividad de neoxantina sintasa en la planta, preferentemente, en donde la neoxantina sintasa comprende la secuencia de polinucleótido o la secuencia de polipéptido aquí descrita; (ii) medir el contenido de beta-damascenona en al menos una parte de la planta mutante, de origen no natural o transgénica obtenida en el paso (i); y (iii) identificar una planta mutante, de origen no natural o transgénica en donde el contenido de beta-damascenona en la misma ha sido reducido o inhibido en comparación con una planta de control en donde la expresión o actividad de neoxantina sintasa no ha sido reducida o inhibida.
En forma adecuada, la apariencia visual de la planta muíante, de origen no natural o transgénica es sustancialmente igual a la planta de control. En forma adecuada, la planta es una planta de tabaco. En forma adecuada, el contenido de beta-damascenona se mide en el aerosol formado después de calentar las hojas de tabaco curadas.
El incremento en expresión de neoxantina sintasa en comparación con la planta de control puede ser de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 100%, o un incremento de al menos 10%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o 100% o más - tal como 200% o 300% o más - lo cual incluye un incremento en la actividad de transcripción o expresión de proteína, o ambas.
El incremento en la actividad de neoxantina sintasa en comparación con una planta de control puede ser de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 100%, o un incremento de al menos 10%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o 100% o más - tal como 200% o 300% o más.
La reducción en expresión de la neoxantina sintasa en comparación con la planta de control puede ser de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 100%, o una reducción de al menos 10%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o 100%, lo cual incluye una reducción en la actividad de transcripción o expresión de proteína, o ambas.
La reducción en la actividad de neoxantina sintasa en comparación con una planta de control puede ser de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 100%, o una reducción de al menos 10%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o 100% o más.
El incremento en el contenido de beta-damascenona en comparación con una planta de control, puede ser aproximadamente 5% hasta aproximadamente 100%, o un incremento de al menos 10%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o hasta el 100% o más - tal como 200% o 300% o más.
La disminución en el contenido de beta-damascenona en comparación con una planta de control puede ser de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 100%, o una disminución de al menos 10%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o hasta el 100%.
Los polinucleótidos y construcciones recombinantes aquí descritas se pueden utilizar para modular la expresión de las enzimas aquí descritas en una especie de planta de interés, en forma adecuada, tabaco.
Se puede utilizar una cantidad de métodos a base de polinucleótido para incrementar la expresión genética en plantas. A manera de ejemplo, se puede preparar un vector o vector de expresión que sea compatible con la planta que será transformada, de modo que comprenda el gen de interés junto con un promotor de corriente ascendente que tiene la capacidad de sobreexpresar el gen en la planta. Los promotores de ejemplo se describen en la presente invención. Después de la transformación y cuando se crece bajo condiciones adecuadas, el promotor puede conducir la expresión con el objeto de modular (por ejemplo, incrementar) los niveles de esta enzima en la planta, o en un tejido específico de la misma. En una modalidad de ejemplo, se genera un vector que lleva un polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNC ED2 (o cualquiera de las combinaciones del mismo, tal como aquí se describe) para sobreexpresar el gen en una planta. El vector lleva un promotor adecuado - tal como el promotor de virus de mosaico de coliflor CaMV 35S - en la corriente ascendente del transgen que conduce su expresión constitutiva en todos los tejidos de la planta. El vector también lleva un gen de resistencia a antibióticos con el objeto de conferir la selección de los callos y líneas de células transformadas.
Por consiguiente varias de las modalidades se dirigen a métodos para modular (por ejemplo, incrementar) el nivel de expresión del polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNC ED2 (o cualquiera de las combinaciones del mismo, tal como aquí se describe) integrando múltiples copias del polinucleótido en un genoma de planta, en donde los métodos comprenden: transformar un huésped de célula de la planta con un vector de expresión que comprende un promotor enlazado en forma operable a un polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2. El polipéptido NtABA4 o NtNeSy o NtNC ED2 codificado por un polinucleótido recombinante, puede ser un polipéptido nativo o puede ser heterólogo para la célula.
De acuerdo con la presente invención, se puede utilizar una planta de tabaco que lleva un alelo mutante de NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 (o cualquiera de las combinaciones del mismo, tal como aquí se describe) en un programa de cultivo de plantas para crear líneas, variedades e híbridos. En particular el alelo mutante se introgresa en las variedades comercialmente importantes descritas anteriormente. Por lo tanto, se proporcionan métodos para cultivar plantas, en donde los métodos comprenden cruzar una planta muíante, una planta de origen no natural o una planta transgénica tal como aquí se describe, con una planta que comprende una identidad genética diferente. El método puede comprender además cruzar la planta de la progenie con otra planta, y repetir opcionalmente el cruce hasta que se obtiene una progenie con los rasgos genéticos o fondo genético deseable. Un propósito que se cumple a través de dichos métodos de cultivo, es introducir un rasgo genético deseado en otras variedades, líneas de cultivo, híbridos o cultivos, particularmente los que son de interés comercial. Otro propósito es facilitar el apilamiento de las modificaciones genéticas de diferentes genes en una sola variedad de planta, líneas, híbridos o cultivos. Los cruces intraespecíficos, así como interespecíficos están contemplados. Las plantas de la progenie que surgen de dichos cruces, también referidas como líneas de cultivo, son ejemplos de plantas de origen no natural de la presente invención.
En una modalidad, se proporciona un método para producir una planta de tabaco de origen no natural, en donde el método comprende: (a) cruzar una planta de tabaco mutante o transgénica con una segunda planta de tabaco para producir una semilla de tabaco de progenie; (b) crecer la semilla de tabaco de la progenie, bajo condiciones de crecimiento de la planta, para producir una planta de tabaco de origen no natural. El método puede comprender además: (c) cruzar la generación previa de la planta de tabaco de origen no natural consigo misma o con otra planta de tabaco para producir una semilla de tabaco de progenie; (d) crecer la semilla de tabaco de progenie del paso (c) bajo condiciones de crecimiento de la planta, para producir plantas de tabaco de origen no natural adicionales, y (c) repetir múltiples veces los pasos de cruce y crecimiento de (c) y (d) para generar generaciones adicionales de plantas de tabaco de origen no natural. El método puede comprender opcionalmente antes del paso (a), un paso para proporcionar una planta progenitora que comprende una identidad genética que está caracterizada y que no es idéntica a la planta mutante o transgénica. En algunas modalidades, dependiendo del programa de cultivo, se repiten los pasos de cruce y crecimiento de 0 a 2 veces, de 0 a 3 veces, de 0 a 4 veces, de 0 a 5 veces, de 0 a 6 veces, de 0 a 7 veces, de 0 a 8 veces, de 0 a 9 veces y de 0 a 10 veces, con el objeto de generar generaciones de plantas de tabaco de origen no natural. El retrocruce es un ejemplo de dicho método en donde la progenie se cruza con uno de sus progenitores u otra planta genéticamente similar a su progenitor, con el objeto de obtener una planta de progenie en la siguiente generación que tiene una identidad genética que es más cercana a la de uno de los progenitores. Las técnicas para cultivar plantas, particularmente cultivar plantas de tabaco, son bien conocidas y se pueden utilizar en los métodos de la presente invención. La presente invención proporciona además plantas de tabaco de origen no natural producidas a través de estos métodos.
En algunas modalidades de los métodos aquí descritos, las líneas que resultan de cultivar y clasificar genes variantes se evalúan en el campo utilizando procedimientos de campo estándar. Se incluyen genotipos de control que incluyen el progenitor no mutagenizado original, y se distribuyen las entradas en el campo en un diseño de bloque completo aleatorizado u otro diseño de campo adecuado. Para el tabaco, se utilizan prácticas agrónomas estándar, por ejemplo, el tabaco se recolecta, pesa y muestrea para pruebas químicas y otras pruebas comunes antes y durante la curación. Los análisis estadísticos de los datos se llevan a cabo para confirmar la similitud de las líneas seleccionadas con la línea progenitora. Se llevan a cabo opcionalmente análisis citogenéticos de las plantas seleccionadas para confirmar el complemento de cromosoma y las relaciones de emparejamiento de cromosoma.
Se puede utilizar huella de ADN, polimorfismo de nucleótido simple, marcadores de microsatélite o tecnologías similares en un programa de cultivo de selección asistida por marcador (MAS) para transferir o cultivar alelos mutantes de un gen en otros tabacos, tal como aquí se describe.
Por ejemplo, un cultivador puede crear poblaciones de segregación de hibridaciones de un genotipo que contiene un alelo muíante con un genotipo agrónomamente deseable. Las plantas en F2 son las generaciones de retrocruce pueden clasificarse utilizando un marcador desarrollado de una secuencia genómica o un fragmento de la misma, utilizando una de las técnicas aquí descritas. Las plantas identificadas como que poseen el alelo muíante pueden ser retrocruzadas o autopolinizadas para crear una segunda población que será clasificada. Dependiendo del patrón de herencia esperado o la tecnología MAS utilizada, puede ser necesario autopolinizar las plantas seleccionadas antes de cada ciclo de retrocruce para ayudar a la identificación de las plantas individuales deseadas. El retrocruce u otro procedimiento de cultivo pueden repetirse hasta que se recupera el fenotipo deseado del progenitor recurrente.
De acuerdo con la descripción, en un programa de cultivo, los cruces exitosos producen plantas F1 que son fértiles. Las plantas F1 seleccionadas pueden cruzarse con uno de los progenitores, y las plantas de primera generación de retrocruce son autopolinizadas para la producción de una población que nuevamente se clasifica para la expresión de variable (por ejemplo, la versión nula del gen). El proceso de retrocruce, autopolinización y clasificación se repite, por ejemplo, al menos 4 veces hasta que la clasificación final produce una planta que es fértil y razonablemente similar al progenitor recurrente. Esta planta, si se desea, se autopoliniza y la progenie se clasifica subsecuentemente nuevamente para confirmar que la planta presenta una expresión de gen variante. En algunas modalidades, una población de plantas en la generación F2 se amplifica para expresión de gen variante, por ejemplo, se identifica una planta que falla en expresar un F2 debido la ausencia del gen de acuerdo con métodos estándar, por ejemplo, utilizando un método PCR con cebadores con base en la información de la secuencia de nucleótido para los polinucleótidos incluyendo polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 (o cualquiera de las combinaciones anteriores) tal como se describió anteriormente.
Las variedades de tabaco híbrido pueden ser producidas evitando la autopolinización de las plantas progenitoras femeninas (esto es, progenitores de semilla) de una primera variedad, permitiendo que el polen de las plantas progenitoras masculinas de una segunda variedad fertilicen las plantas progenitoras femeninas, y permitiendo que las semillas híbridas F1 se formen en las plantas femeninas. La autopolinización de las plantas femeninas puede prevenirse, mutilando las flores en una etapa temprana del desarrollo de la flor. Alternativamente, se puede evitar la formación de polen en las plantas progenitoras femeninas utilizando una forma de esterilidad masculina. Por ejemplo, la esterilidad masculina puede producirse mediante esterilidad masculina citoplásmica (CMS), o esterilidad masculina transgénica en donde un transgen inhibe la microesporogénesis y/o la formación de polen, o auto- incompatibilidad. Las plantas progenitoras femeninas que contienen CMS son particularmente útiles. En modalidades en las cuales las plantas progenitoras femeninas son CMS, se recolecta el polen de plantas fértiles masculinas y se aplica manualmente a los estigmas de las plantas progenitoras femeninas CMS, y se recolecta la semilla F1 resultante.
Las variedades y líneas aquí descritas se pueden utilizar para formar híbridos F1 de tabaco de un solo cruce. En dichas modalidades, las plantas de las variedades progenitoras pueden crecerse como poblaciones de unión sustancialmente homogéneas para facilitar el cruce-polinización natural de las plantas progenitoras masculinas a las plantas progenitoras femeninas. La semilla F1 formada en las plantas progenitoras femeninas se recolecta selectivamente a través de medios convencionales. También se puede crecer las dos variedades de plantas progenitores por volumen y recolectar una combinación de semilla híbrida F1 formada en el progenitor femenino, y la semilla formada en el progenitor masculino, como el resultado de la autopolinización. Alternativamente, se pueden llevar a cabo cruces de tres vías en donde se utiliza un híbrido F1 de un solo cruce como un progenitor femenino, y se cruza con un diferente progenitor masculino. Como otra alternativa, se pueden crear híbridos de doble cruce en donde la progenie F1 de dos diferentes cruces simples se cruzan consigo mismas.
Se puede clasificar o seleccionar una población de plantas muíante, de origen no natural o transgénico para los miembros de la población que tienen un rasgo o fenotipo deseado. Por ejemplo, una población de progenie de un solo evento de transformación puede clasificarse para las plantas que tienen un nivel deseado de expresión o actividad de NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 o el polipéptido codificado de esta forma. Los métodos físicos y bioquímicos se pueden utilizar para identificar los niveles de expresión o actividad. Estos incluyen análisis Southern o amplificación PCR para detección de un polinucleótido; manchados Northern, proíección de S1 RNasa, cebador-extensión o amplificación RT-PCR para detectar las transcripciones de ARN; ensayos enzimáticos para detectar la actividad de enzimas o ribosima de los polipéptidos y polinucleótidos; y electroforesis de gel de proteína, manchados Western, inmunoprecipitación e inmunoensayos enlazados por enzimas para detectar polipéptidos. Oirás técnicas tal como hibridación in situ, manchado de enzimas e inmunomanchado y ensayos de enzima también se puede utilizar para detectar la presencia o expresión o actividad de polipéptidos o polinucleótidos.
Las células de plantas y las plantas mutante, de origen no natural o transgénico se describen en la presente invención comprendiendo uno o más polinucleótidos recombinantes - tal como uno o más polinucleótidos NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 aislados (o una combinación de dos o más o tres o más de los mismos), una o más construcciones de polinucleótido, uno o más ARNs de hebra doble, uno o más conjugados o uno o más vectores/vectores de expresión.
Sin limitación, las plantas aquí descritas pueden modificarse para otros propósitos ya sea antes o después de que se ha modulado la expresión o actividad de acuerdo con la presente invención. Una o más de las siguientes modificaciones genéticas pueden estar presentes en las plantas mulantes de origen no natural o transgénicas. En una modalidad, uno o más genes que están implicados en la captación de metal pesado o en el transporte de metal pesado se modifican dando como resultado plantas o partes de la planta (tal como hojas) que tienen un contenido de metal pesado inferior que las plantas de control o partes de las mismas, sin la modificación(s). Los ejemplos no limitantes incluyen genes en la familia de proteínas asociadas con resistencia a fármacos múltiples, la familia de facilitadores de difusión de catión (CDF), la familia de Zrt-, proteínas tipo Irt (ZIP), la familia de intercambiadores de cationes (CAX), la familia de transportadores de cobre (COPT), la familia de ATPasas tipo P de metal pesado (HMAs, tal como se describe en la Publicación de Patente WO2009074325), la familia de homólogos de proteínas de macrófago asociados con resistencia natural (NRAMP), y la familia de transportadores del cartucho de enlace ATP (ABC), que participan en el transporte de metales pesados, tal como cadmio. El término metal pesado tal como se utiliza en la presente invención, incluye metales de transición. En otra modalidad, se modifican uno o más genes que están implicados en la conversión de los intermediarios metabólicos de nitrógeno, dando como resultado plantas o partes de la planta (tal como hojas) que cuando se calienten, producen menores niveles al menos una nitrosamina específica de tabaco (por ejemplo, 4-(metilnitrosamino)-1-(3-pir¡dil)-1-butanona, N-nitrosonornicotina, N-nitrosoanatabina , y N-nitrosoanabasina) que las plantas de control o partes de las mismas. Los ejemplos no limitantes de genes que se pueden modificar incluyen genes que codifican una desmetilasa de nicotina, tal como CYP82E4, CYP82E5 y CYP82E10 que participan en la conversión de nicotina a nornicotina y se describe en las Publicaciones de patente WO2006091194, WO2008070274, WO2009064771 y en la PCT/US201 1/021088.
Los ejemplos de otras modificaciones incluyen tolerancia a herbicida, herbicidas por ejemplo, glifosato es un ingrediente activo de muchos herbicidas de amplio espectro.
Se han desarrollado plantas transgénicas resistentes a glifosato, transfiriendo el gen aroA (una sintetasa de glifosato EPSP de Salmonella typhimurium y E. coli). Las plantas resistentes a sulfonilurea han sido producidas transformando el gen ALS mutante (sintetasa de acetolactato) de Arabidopsis. La proteína OB del fotosistema II de Amaranthus hybridus mutante, ha sido transferida en plantas para producir plantas transgénicas resistentes a atrazina; y se han producido plantas transgénicas resistentes a bromoxinil incorporando el gen bkn de la bacteria Klebsiella pneumoniae. Otra modificación de ejemplo da como resultado plantas que son resistentes a insectos. Las toxinas Bacillus thuringiensis (Bt) pueden proporcionar una forma efectiva de retardar el surgimiento de pestes resistentes a Bt, tal como se ilustra recientemente en brócoli, en donde los genes Bt en pirámide cryIAc y cryIC controlaron las polillas con marcas de diamante (Plutella xylostella) resistentes a cualquier proteína simple, y retardaron en forma significativa la evolución de insectos resistentes. Otra modificación de ejemplo se obtiene como resultado en plantas que son resistentes a enfermedades originadas por patógenos (por ejemplo, virus, bacterias, hongos). Las plantas que expresan el gen Xa21 (resistente a plaga bacteriana) con plantas que expresan tanto un gen de fusión Bt como un gen de quitinasa (resistente al gusano de tallo amarillo y tolerante al forro) han sido diseñadas. Otra modificación de ejemplo da como resultado una capacidad reproductiva alterada, tal como esterilidad masculina. Otra modificación de ejemplo da como resultado plantas que son tolerantes a tensión abiótica (por ejemplo, sequía, temperatura, salinidad) y se han producido plantas transgénicas tolerantes transfiriendo la enzima de fosfato de glicerol de acilo de Arabidopsis; los genes que codifican la deshidrogenasa de manitol y la deshidrogenasa de sorbitol que están implicados en síntesis de manitol y sorbitol, mejoran la resistencia a sequía. Otra modificación de ejemplo da como resultado plantas que producen proteínas que tienen propiedades inmunogénicas favorables para utilizarse en humanos. Por ejemplo, las plantas con la capacidad de proteínas que carecen sustancialmente de residuos de fucosa enlazados por alfa-1,3, residuos de xilosa enlazados por beta-1,2, o ambos, en su N-glicano pueden ser utilizadas. Otras modificaciones de ejemplo pueden dar como resultado plantas con proteínas y aceites de almacenamiento mejorados, plantas con eficiencia fotosintética mejorada, plantas con vida en anaquel prolongada, plantas con contenido de carbohidratos mejorado y plantas resistentes a hongos; las plantas que codifican una enzima están implicadas en la biosíntesis de alcaloides. También están contempladas plantas transgénicas en las cuales se ha modulado la expresión de S-adenosil-L-metionina (SAM) y/o gamma-sintasa de cistationina (CGS).
Uno o más de dichos rasgos pueden ser introgresados en las plantas de tabaco muíante, de origen no natural o transgénico de otros cultivos de tabaco o pueden ser transformadas directamente en las mismas. La introgresión del rasgo(s) en las plantas de tabaco muíante, de origen no natural o íransgénico de la présenle invención puede lograrse a íravés de cualquier méíodo de culfivo de plañías conocido en la lécnica, por ejemplo, culfivo de linaje, retrocruce, cullivo de haploide duplicado y similares (ver la Publicación de Wernsman, E. A, y Rufty, R. C. 1987. Capítulo Diecisiete. Tobacco. Pages 669-698 En: Cultivar Development. Crop Species (Desarrollo de Cultivo. Especie de cosecha) . W. H. Fe r (ed.), MacMillan Publishing Co, Inc., Nueva York, N.Y, páginas 761). Las técnicas con base en biología molecular descritas anteriormente, en particular RFLP y marcadores de microsatélite, se pueden utilizar en dichos retrocruces para identificar las progenies que tienen el más alto grado de identidad genética con el progenitor recurrente. Esto permite acelerar la producción de las variedades de tabaco que tienen al menos el 90%, más preferentemente al menos el 95%, más preferentemente al menos el 99% de identidad genética con el progenitor recurrente, aún más preferentemente, genéticamente idénticos al progenitor recurrente, y que comprende además el rasgo(s) introgresado del progenitor donador. Dicha determinación de identidad genética puede estar basado en los marcadores moleculares conocidos en la técnica.
La última generación de retrocruce puede ser autosembrada para proporcionar una progenie de cultivo pura para el ácido(s) nucleico que será transferido. Las plantas resultantes generalmente tienen esencialmente todas las características morfológicas y fisiológicas de las plantas de tabaco muíante, de origen no natural o transgénico de la invención, además del rasgo(s) transferido (por ejemplo, uno o más rasgos de gen simple). El protocolo de retrocruce exacto dependerá del rasgo que esté siendo alterado para determinar un protocolo de pruebas adecuados. Aunque los métodos de retrocruce se simplifican cuando el rasgo que esté siendo transferido es un alelo dominante, también se puede transferir un alelo recesivo. En este caso, puede ser necesario introducir una prueba de la progenie para determinar si el rasgo deseado ha sido transferido con éxito.
Varias modalidades proporcionan plantas mutantes, de origen no natural o plantas transgénicas, así como biomasa en donde el nivel de expresión del polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 (o cualquier combinación de los mismos) se modula para modular el contenido carotenoide o el contenido de beta-damascenona en el aerosol formado después de calentar el tabaco curado preparado a partir de las plantas.
Las partes de dichas plantas, particularmente plantas de tabaco, y más particularmente la lámina y nervadura central de la hoja de las plantas de tabaco, se pueden incorporar en o utilizarse para elaborar varios productos consumibles, incluyendo pero sin limitarse a materiales que forman aerosol, dispositivos que forman aerosol, artículos para fumar, artículos que se pueden fumar, productos sin humo y productos de tabaco. Los ejemplos de materiales que forman aerosol incluyen pero no se limitan a composiciones de tabaco, tabaco, extracto de tabaco, tabaco de corte, rellenador de corte, tabaco curado, tabaco expandido, tabaco homogenizado, tabaco reconstituido y tabaco para pipa. Los artículos para fumar y artículos que se pueden fumar son tipos de dispositivos que forman aerosol. Los ejemplos de artículos para fumar o artículos que se pueden fumar incluyen pero no se limitan a cigarros, cigarrillos y puros. Los ejemplos de productos sin humo comprenden tabacos para masticar y en polvo. En ciertos dispositivos que forman aerosol, en lugar de combustión, se calienta una composición de tabaco u otro material que forma un aerosol a través de uno o más elementos de calentamiento eléctrico para producir un aerosol. En otro tipo de dispositivo que forma aerosol calentado, se produce un aerosol mediante la transferencia de calor desde un elemento de combustible o fuente de calor hasta un material que forma aerosol físicamente separado, el cual se puede localizar dentro, alrededor o en la corriente descendente de la fuente de calor. Los productos de tabaco sin humo y los diversos materiales que forman aerosol que contienen tabaco pueden contener tabaco en cualquier forma, incluyendo partículas secas, tiras, gránulos, polvos o una pasta, depositados en, mezclados en, rodeados por o de otra forma combinados por otros ingredientes en cualquier formato, tal como hojuelas, películas, gránulos, espumas o pedazos. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "fumar" se utiliza para describir un tipo de aerosol que se produce a través de artículos para fumar, tal como cigarros, o mediante combustión de un material que forma aerosol.
En una modalidad, también se proporciona material curado de las plantas de tabaco mutantes, que no tienen origen natural o transgénicas aquí descritas. Los procesos para curar hojas de tabaco verde son conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen sin limitación curación con aire, curación con fuego, curación con humo y curación con sol. Los procesos de curación de hojas de tabaco verde dependen del tipo de tabaco recolectado. Por ejemplo, el tabaco de humo de Virginia (brillante) normalmente se cura con humo, Burley y algunas cepas oscuras normalmente se curan con aire, y el tabaco de pipa, tabaco para masticar y de inhalación normalmente se curan con fuego.
En otra modalidad, se describen productos de tabaco que incluyen materiales que forman aerosol que contienen tabaco que comprenden hojas, preferentemente hojas curadas, de las plantas de tabaco mutantes, plantas de tabaco transgénicas o plantas de tabaco que no tienen origen natural aquí descritas. Los productos de tabaco aquí descritos pueden ser un producto de tabaco combinado que puede comprender adicionalmente tabaco no modificado.
El % carotenoide o de beta-damascenona o el % carotenoide y beta-damascenona en estos artículos que se pueden fumar y productos sin humo y aerosoles de los mismos, puede ser de al menos aproximadamente el 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, y 100% o más - tal como 200% o 300% - o más, cuando se compara con productos consumibles derivados de contrapartes no mutantes, de origen no natural o no transgénicas.
El % carotenoide o el % beta-damascenona o el % carotenoide y beta-damascenona en estos artículos para fumar y productos sin humo y aerosoles de los mismos, pueden ser de al menos aproximadamente el 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, y 100% menos, cuando se comparan con productos consumibles derivados de contrapartes no mutantes, de origen no natural o no transgénicas.
Las plantas mutantes, de origen no natural o transgénico pueden tener otros usos, por ejemplo, agricultura. Por ejemplo, las plantas mutantes, de origen no natural o transgénica aquí descritas pueden utilizarse para elaborar alimento para animales y productos alimenticios para humanos.
La presente invención también proporciona métodos para producir semillas que comprende cultivar la planta muíante, la planta de origen no natural, o la planta transgénica aquí descrita, y recolectar semillas de la plantas cultivadas. Las semillas de las plantas aquí descritas pueden acondicionarse y embolsarse en un material para empaque por medios conocidos en la técnica para formar un artículo de fabricación. El material para empaque, tal como papel y tela son bien conocidos en la técnica. Un paquete de semillas puede tener una etiqueta, por ejemplo, una marca o etiqueta asegurada al material de empaque, y una etiqueta impresa en el paquete que describe la naturaleza de las semillas ahí contenidas.
Un aspecto adicional se refiere a un método para producir beta-damascenona, en donde el método comprende los pasos de: (a) proporcionar una parte de una planta mutante, de origen no natural o transgénico; biomasa, semilla u hojas; o un producto de tabaco tal como aquí se describe; y (b) proporcionar calor a las mismas.
Las composiciones, métodos y equipos para genotipificar plantas para identificación, selección y cultivo puede comprender un medio para detectar la presencia de un polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2 (o una combinación de dos o más o tres o más de los mismos) en una muestra de polinucleótido. Por consiguiente, se describe una composición que comprende uno o más cebadores (por ejemplo, uno o más cebadores o sondas que comprenden, consisten o consisten esencialmente de una secuencia establecida en las SEC ID NOs: 3 a 5, 10 a 12 o 14 a 16) para amplificar específicamente al menos una parte de uno o más de los polinucleótidos y opcionalmente una o más sondas y opcionalmente uno o más reactivos para llevar a cabo la amplificación o detección.
Por consiguiente, se describen cebadores o sondas de oligonucleótido específicos de gen que comprenden aproximadamente 10 o más polinucleótidos contiguos que corresponden al polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2. Los cebadores o sondas pueden comprender o consistir en aproximadamente 15, 20, 25, 30, 40, 45 o 50 más polinucleótidos contiguos que hibridan (por ejemplo, hibridan específicamente) al polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2. En algunas modalidades, las sondas o cebadores pueden comprender o consistir en aproximadamente 10 a 50 nucleótidos contiguos, aproximadamente 10 a 40 nucleótidos contiguos, aproximadamente 10 a 30 nucleótidos contiguos o aproximadamente 15 a 30 nucleótidos contiguos que pueden ser utilizados en métodos de identificación de gen dependientes de secuencia (por ejemplo, hibridación Southern) o aislamiento (por ejemplo, hibridación in situ de colonias bacterianas o placas de bacteriófago) o detección genética (por ejemplo, como uno o más cebadores de amplificación en amplificación o detección de polinucleótido). El uno o más cebadores o sondas específicos pueden ser diseñados y utilizados para amplificar o detectar una parte, o todo el polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2. A manera de ejemplo específico, se pueden utilizar dos cebadores en un protocolo de reacción de cadena de polimerasa para amplificar un fragmento de polinucleótido que codifica el polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2- tal como ADN o ARN. La reacción de cadena de polimerasa también se puede llevar a cabo utilizando un cebador que se deriva de la secuencia de polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2, y un segundo cebador que híbrida para una secuencia en la corriente ascendente o corriente descendente de la secuencia de polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2- tal como una secuencia promotora NtABA4 o NtNeSy o NtNCED2, el extremo 3' del precursor mARN o la secuencia derivada de un vector. Los ejemplos de técnicas térmicas o isotérmicas útiles para amplificación in vitro de polinucleótidos, son bien conocidos en la técnica. La muestra puede ser o puede derivarse de una planta, célula de planta o material de planta, o un producto elaborado o derivado de la planta, la célula de la planta o el material de la planta tal como aquí se describe En un aspecto adicional, también se proporciona un método para detectar un polinucleótido NtABA4 o NtNeSy o NÍNCED2 (o una combinación de dos o más o tres o más de los mismos) en una muestra, en donde el método comprende los pasos de proporcionar de: (a) proporcionar una muestra que comprende, o se sospecha que comprende, un polinucleótido; (b) contactar la muestra con uno o más cebadores o una o más sondas para detectar específicamente al menos una parte del polinucleótido(s); y (c) detectar de presencia de un producto de amplificación, en donde la presencia de un producto de amplificación indica la presencia del polinucleótido(s) en la muestra. En un aspecto adicional, también se proporciona el uso de uno o más cebadores o sondas para detectar específicamente al menos una parte del polinucleótido(s). Los equipos para detectar al menos parte del polinucleótido(s) también se proporcionan de modo que comprendan uno o más cebadores o sondas para detectar específicamente al menos una parte del polinucleótido(s). El equipo puede comprender reactivos para amplificar reactivos con amplificación de polinucleótido - tal como PCR - o reactivos para tecnología de detección de hibridación de sonda - tal como Manchados Southern, Manchados Northern, hibridación in-situ, o microformación. El equipo también puede comprender reactivos para tecnología de detección de enlace de anticuerpos tal como manchados Western, ELISAs, espectrometría de masa SELDI o tiras de prueba. El equipo puede comprender reactivos para secuenciación de ADN. El equipo puede comprender reactivos o instrucciones para determinar el contenido carotenoide (por ejemplo, luteína o beta-caroteno; o luteína y beta-caroteno) y de beta-damascenona o el contenido de beta-damascenona. El equipo puede comprender reactivos e instrucciones para determinar el contenido de carotenoide (por ejemplo, luteína o beta-caroteno; o luteína y beta-caroteno) y de beta-damascenona o el contenido de beta-damascenona.
En algunas modalidades, un equipo puede comprender instrucciones para uno o más de los métodos aquí descritos. Los equipos aquí descritos pueden ser útiles para determinación de identidad genética, estudios filogenéticos, genotipificación , haplotipif icación , análisis de linaje, o cultivo de plantas particularmente con una calificación codominante. La presente invención también proporciona un método para genotipificar una planta, una célula de planta o un material de planta que comprende un polinucleótido tal como aquí se describe. La genotipificación proporciona un medio para distinguir homólogos de un par de cromosomas y se puede utilizar para diferenciar segregadores en una población de plantas. Se pueden utilizar métodos de marcador molecular para estudios filogenéticos, caracterizar relaciones genéticas entre variedades de cosechas, identificar cruces o híbridos somáticos, localizar segmentos cromosomales que afectan los rasgos monogénicos, clonación a base de mapas, y el estudio de herencia cuantitativa. El método específico de genotipificación puede emplear cualquier número de técnicas analíticas de marcador molecular que incluyen amplificación de polimorfismos de longitud de fragmento (AFLPs). Los AFLPs son el producto de diferencias alélicas entre fragmentos de amplificación originados por variabilidad en la secuencia de nucleótido. Por lo tanto, la presente invención proporciona además un medio para seguir la segregación de uno o más genes o ácidos nucleicos, así como secuencias cromosomales genéticamente enlazadas a estos genes o ácidos nucleicos utilizando técnicas tales como análisis AFLP.
En una modalidad, también se proporciona material curado de las plantas mutantes, transgénicas y de origen no natural aquí descritas. Por ejemplo, los procesos de curación de hojas de tabaco verde son conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen sin limitación, curación con aire, curación con fuego, curado al aire caliente y curación con sol. El proceso de curación de hojas de tabaco verde depende del tipo de tabaco recolectado. Por ejemplo, el tabaco de humo de Virginia (brillante) normalmente se cura al aire caliente, Burley y ciertas cepas oscuras normalmente se curan con aire, el tabaco para pipa, tabaco para masticar y en polvo, normalmente se curan con fuego.
En otra modalidad, se describen productos de tabaco que incluyen productos de tabaco que comprenden hojas, preferentemente hojas curadas, de plantas mutantes, transgénicas y de origen no natural aquí descritas o que se producen a través de los métodos aquí descritos. Los productos de tabaco aquí descritos pueden comprender además tabaco no modificado.
En otra modalidad, se describen productos de tabaco que comprenden material para la planta, preferentemente hojas - tal como hojas curadas, de las plantas mutantes, transgénicas y de origen no natural aquí descritas. Por ejemplo, el material de la planta puede agregarse al interior o al exterior del producto del tabaco y al momento de quemarse se libera un aroma deseable.
El producto de tabaco de acuerdo con esta modalidad puede incluso ser un tabaco no modificado o un tabaco modificado. El producto de tabaco de acuerdo con esta modalidad incluso puede derivarse de una planta mutante, transgénica o de origen no natural que tiene modificaciones en uno o más genes además de los genes aquí descritos.
Un aspecto adicional se refiere a un polinucleótido aislado que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia que codifica una licopeno beta ciclasa y que tiene al menos el 60% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:8. Un aspecto adicional se refiere a un polipéptido aislado codificado por este polinucleótido. Un aspecto adicional se refiere a un polipéptido aislado que tiene al menos el 87% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 9. Un aspecto adicional se refiere a una construcción, vector o vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado. Un aspecto adicional se refiere a una célula de planta mutante, de origen no natural o transgénica que comprende el polinucleótido aislado, el polipéptido o la construcción, vector o vector de expresión y en donde la expresión o actividad de la licopeno beta ciclasa se modula en comparación con una planta de control o tipo natural, preferentemente, en donde la expresión o actividad de neoxantina sintasa o dioxigenasa 9-c/s-epoxicarotenoide; o neoxantina sintasa y dioxigenasa 9-c/s-epoxicarotenoide también se modula. Un aspecto adicional se refiere a una planta mutante, de origen no natural o transgénica que comprende una célula de planta. Un aspecto adicional se refiere a un método para modular el contenido carotenoide de una planta, en donde el método comprende los pasos de: (i) modular la expresión o actividad de una licopeno beta ciclasa en la planta, preferentemente, en donde la licopeno beta ciclasa comprende la secuencia de polinucleótido o la secuencia de polinucleótido aquí descrita; (ii) medir el contenido carotenoide en al menos una parte de la planta mutante, de origen no natural o transgénico obtenida en el paso (i); y (iii) identificar una planta mutante, de origen no natural o transgénico en donde el contenido carotenoide en la misma ha cambiado en comparación con una planta de control en la cual la expresión o actividad de licopeno beta ciclasa no ha sido modulada. En una modalidad, la expresión o actividad de licopeno beta ciclasa o dioxigenasa 9-c/s-epoxicarotenoide; y licopeno beta ciclasa y dioxigenasa 9-c/s-epoxicarotenoide también se modula. Un aspecto adicional se refiere a una planta mutante, de origen no natural o transgénico o material de planta derivado o que se puede derivar de la misma, que se obtiene o se puede obtener a través de este método. Un aspecto adicional se refiere a una planta mutante, de origen no natural o transgénica, o la actividad de la proteína codificada en donde la expresión de licopeno beta ciclasa o la actividad de la proteína codificada de esta forma ha sido incrementada; en donde el contenido de luteína de hoja verde o el contenido de beta-caroteno o el contenido combinado de la planta es mayor a una planta de control en donde la expresión o la actividad de la licopeno beta ciclasa no ha sido incrementada, preferentemente, en donde: (i) el contenido de luteína de hoja verde de la planta es de al menos aproximadamente 17 mg/100 g (por ejemplo, al menos aproximadamente 17.5 mg/100 g; al menos aproximadamente 18 mg/100 g, al menos aproximadamente 18.5 mg/100 g o al menos aproximadamente 19 mg/100 g) y (ii) el contenido de la beta-caroteno de la planta es al menos aproximadamente 10 mg/100 g (por ejemplo, al menos aproximadamente 10.5 mg/100 g; al menos aproximadamente 11 mg/100 g, al menos aproximadamente 11.5 mg/100 g o al menos aproximadamente 12 mg/100 g). Un aspecto adicional se refiere a un material de la planta que incluye biomasa, semilla u hojas que comprenden células o tejido de la planta. Un aspecto adicional se refiere a un producto de tabaco que comprende células de plantas, al menos una parte de la planta o material de la planta. Un aspecto adicional se refiere a un polinucleótido aislado que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia que codifica dioxigenasa 9-cis-epoxicarotenoide y que tiene al menos el 60% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 13. Un aspecto adicional se refiere a un polipéptido aislado codificado a través de este polinucleótido. Un aspecto adicional se refiere a una construcción, vector o vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado. Un aspecto adicional se refiere a una célula de planta mutante, de origen no natural o transgénica que comprende el polinucleótido aislado, el polipéptido o la construcción, vector o vector de expresión y en donde la expresión o actividad de dioxigenasa 9-cis-epoxicarotenoide se modula en comparación con una planta de control o tipo silvestre, preferentemente, en donde la expresión o actividad de expresión o actividad de neoxantina sintasa o licopeno beta ciclasa; o neoxantina sintasa y licopeno beta ciclasa también se modula. Un aspecto adicional se refiere a una planta mutante, de origen no natural o transgénica que comprende una célula de planta. Un aspecto adicional se refiere a un método para modular el contenido carotenoide de una planta, en donde el método comprende los pasos de: (i) modular la expresión o actividad de dioxigenasa 9-cis-epoxicarotenoide en la planta, y preferentemente, en donde la dioxigenasa 9-cis-epoxicarotenoide comprende la secuencia de polinucleótido o la secuencia de polinucleótido aquí descrita; (ii) medir el contenido carotenoide en al menos una parte de la planta mutante, de origen no natural o transgénica obtenida en el paso (i); y (iii) identificar una planta mutante, de origen no natural o transgénica en donde el contenido carotenoide en la misma ha cambiado en comparación con una planta de control en donde la expresión o actividad de la dioxigenasa 9-cis-epoxicarotenoide no ha sido modulada. En una modalidad, la expresión o actividad de neoxantina sintasa o licopeno beta ciclasa; y la neoxantina sintasa y licopeno beta ciclasa también se modula. Un aspecto adicional se refiere a una planta mutante, de origen no natural o transgénica o un material de planta derivado o que se puede derivar de la misma que se obtiene o se puede obtener a través de este método. Un aspecto adicional se refiere a una planta mutante, de origen no natural o transgénica, en donde la expresión de dioxigenasa 9-cis-epoxicarotenoideo la actividad de la proteína codificada de esta forma ha sido incrementada; en donde el contenido de luteína de hoja verde o el contenido de beta-caroteno o el contenido combinado de la planta es mayor a la planta de control en donde la expresión en la actividad de dioxigenasa 9-cis-epoxicarotenoide no ha sido incrementada, preferentemente, en donde: (i) el contenido de luteína de hoja verde de la planta es de menos aproximadamente 15 mg/100g (por ejemplo, al menos aproximadamente 15.5 mg/100 g; al menos aproximadamente 16 mg/100 g, al menos aproximadamente 16.5 mg/100 g o al menos aproximadamente 17 mg/100 g); y (ii) el contenido de beta-caroteno de la planta es al menos aproximadamente 11 mg/100 g (por ejemplo, al menos aproximadamente 11.5 mg/100 g; al menos aproximadamente 12 mg/100 g, al menos aproximadamente 12.5 mg/100 g o al menos aproximadamente 13 mg/100 g). Un aspecto adicional se refiere al material de la planta que incluye biomasa, semilla u hojas que comprenden células o tejido de la planta. Un aspecto adicional se refiere a un producto de tabaco que comprende células de planta, al menos una parte de la planta o material de la planta.
La presente invención se describe en forma adicional en los ejemplos que se encuentran a continuación, los cuales se proporcionan para describir con mayor detalle la presente invención. Estos ejemplos, los cuales establecen un modo preferido actualmente contemplado para llevar a cabo la presente invención, están proyectados para ilustrar y no para limitar la presente invención.
EJEMPLOS Ejemplo 1: Clonación de ABA4 a partir de Nicotinia tabacum Se expresó en forma ectópica una secuencia de codificación Nicotinia tabacum homologa a ABA4. El gen se llamó Nicotinia tabacum ABA4 (NtABA4) con base en las homologías con A. thaliana ABA4. NtABA4 es un gen que pertenece a la "familia" extendida de enzimas de neoxantina que catalizan la formación de trans-neoxantina a partir de violaxantina . El producto de gen es más probable que se localice en los plástidos mediante analogía con AtABA4 y de acuerdo con un análisis WoLFPSORT. Se identificó una secuencia de codificación de longitud total de 663 kb y se amplificó utilizando cADN de hoja K326 como plantilla PCR, se clonó en un vector pENTR Gateway ( I nvitrogen) , se secuenció y transfirió en pK2WG7 (vector Gateway obtenido de Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology (Instituto de Biotecnología de la Interuniversidad de Flanders), Gent, Bélgica) para expresión constitutiva en Nicotinia tabacum. Las secuencias de nucleótido y aminoácidos de NtABA4 se establecieron en SEC I D No. 1 y SEC ID No. 2, respectivamente y en la figura 2. NtABA4 despliega el 65% de identidad en el nivel de aminoácido con la proteína Arabidopsis AtABA4, Atlg67080. La amplificación PCR comenzando a partir de gADN de Hicks de Hoja Ancha como plantilla, nos permitió identificar un homólogo NtABA4 de 1808 pb. Al comparar el cADN y las secuencias de gADN, la estructura de gen se dedujo para demostrar que NtABA4 posee 4 intrones y 5 exones (figura 3A). Existen diferencias entre las isoformas NtABA4 K326 y Hicks BL (figura 3B). La secuencia de aminoácido NtABA4 de Hicks de Hoja Ancha tiene el 97% de identidad con secuencia K326 lo cual se debe a una diferencia de aminoácido y a una serina faltante en la posición 9 (figura 3C). Tal como se indica mediante las comparaciones de etiqueta de secuencia expresadas, la secuencia genómica NtABA4 no es un pseudogen ya que se ha identificado una marca de secuencia expresada (AM824569) que tiene características idénticas en el extremo N-terminal y una biblioteca de secuencia de tensión fría NCBI a partir de tabaco SNN. Para el diseño de tabaco, se utilizó la secuencia de cADN de NtABA4 K326 y se expresó en forma constitutiva TN90 bajo control del promotor CaMV35S viral fuerte.
Ejemplo 2: Clonación de Neoxantina sintasa (NeSy) a partir de Nicotinia tabacum NeSy (licopeno beta ciclasa), igual que ABA4, cataliza la formación de neoxantina (cis-neoxantina) a partir de violaxantina (ver figura 1). Esta enzima se localiza probablemente en los plástidos (con base en la homología con Arabadopsis thaliana NeSy). Comenzando con una secuencia disponible en la base de datos TGI, se amplificó una secuencia de codificación de longitud total de 1482 kb (ver figura 4) a partir de ARN K326, se clonó en un vector pENTR Gateway (Invitrogen), se secuenció y subclonó en el vector Gateway pK2WG7 (obtenido de Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology , (Instituto de Biotecnología de la Interuniversidad de Flanders), Gent, Bélgica) para sobreexpresión . Se identificó un clon BAC. La secuencia genómica presente en este clon BAC, mostró que NtNeSy no tiene intrón en la estructura genómica y muy probablemente un gen de copia simple en tabaco. El cADN NtNeSy K326 se expresa en forma constitutiva en TN90 bajo el control del promotor CaMV35S para comparación con plantas 35S: :NtABA4.
Ejemplo 3: Clonación de dioxigenasa 9-cis-epoxicarotenoide (CED2) a partir de Nicotinia tabacum CED2 (dioxigenasa 9-cis-epoxicarotenoide) cataliza la descomposición de c/s-neoxantina en C25-alénico-apo-aldehído y xantoxina (ver figura 1). NtCED2 comparte una fuerte homología con Arabidopsis AtNCED4, la cual está presente en plastoglóbulos y probablemente descompone neoxantina en el cloroplasto de la hoja. Se identifica un fragmento de cADN de tabaco en la base de datos TGI. A partir de esto, se clonó una secuencia parcial de (407 pb) en un vector pENTR Gateway (Invitrogen), se secuenció y subclonó en el vector Gateway pK7GWIWG2(ll), obtenido de la Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology , (Instituto de Biotecnología de la Interuniversidad de Flanders), Gent, Bélgica. En este caso, se expresó el fragmento NtCED2 como una horquilla de ARN en plantas de tabaco induciendo la silenciación de gen de la transcripción NtCED2 correspondiente (figura 5).
Ejemplo 4: Diseño de tabaco Burley TN90 con cADN NtABA4 Se generó un plásmido binario pK2WG7 que lleva la secuencia de codificación NtABA4 (figura 2) para sobreexpresar este gen en Nicotinia tabacum. Este vector incluye el promotor de virus de mosaico de coliflor CaMV 35S en la corriente ascendente del frangen que conduce su expresión constitutiva en todos los tejidos de la planta, y el gen kan/nptll para la selección de canamicina (antibiótico) de las líneas Nicotinia tabacum transgénicas sobre placas de agar (100 mg/ml). Se transformó un tabaco Burley TN90 con esta construcción a través de Agrobacteri um tumefaciens utilizando un procedimiento de disco de hoja clásico. A partir de los callos, se regeneraron las líneas individuales y se seleccionaron en canamicina. Las líneas de sobreexpresión TO son monitoreadas posteriormente mediante PCR en ADN genómico utilizando un cebador en el promotor 35S (5 - GAG CATC GTG G AAAAAG AAG AC) y un cebador dentro de la secuencia de codificación NtABA4 para detectar específicamente la copia transgénica de NtABA4 mediante RT-PCR utilizando cebadores NtABA4 específicos. Se recolectaron semillas T1, se volvieron a crecer en placas de agar que contienen canamicina y se monitorearon exactamente como para plántulas TO. La PCR en gADN muestra que el T-ADN que alberga el cADN NtABA4 se insertó en el genoma en líneas seleccionadas y el análisis RT-PCR permitió identificar tres líneas en donde el gen se sobreexpresó. Las plantas resistentes a canamicina son crecidos subsecuentemente en charolas flotantes antes de cultivarse en el campo. Veinte plantas de tres líneas NtABA4 (NtABA4-\, NtABA-2 y NtABA-3), control de vector (VC, pK7GWIWG2(ll) vacío) y tabaco de antecedente TN90 US se cultivaron en cuatro réplicas de 20 plantas. Tres meses después del trasplante en el campo (36 días después de la poda, se muestreó una hoja en la posición de la nervadura central en 10 plantas idénticas fuera de las 20 plantas en el subtrazo que representa una réplica experimental. Estas hojas ("hojas verdes") son almacenadas inmediatamente en hielo seco y liofilizadas. Las plantas 35S: :NtABA4 no exhibieron fenotipos visuales diferentes a las plantas TN90 y VC después de dos meses en el campo. A lo largo de las mismas líneas, el análisis de la altura de la planta y contenido de clorofila documentó que las líneas 35S:: NtABA4 transgénicas fueron similares a los controles TN90 y VC lo que sugiere que la sobreexpresión NtABA4 no tiene un impacto visible en las propiedades fenotípicas. El material de la hoja restante de las 10 plantas seleccionadas por subtrazo, y la línea se muestreó y curó de acuerdo con las prácticas agrícolas de las Burley. Después de curarse, se muestrearon tres hojas en la posición de la nervadura central. Para monitorear el efecto de la expresión NtABA4 incrementada en tres líneas transgénicas {?????4-?, NtABA4-2 y NtABA4-Z), se molieron "hojas verdes" y "hojas curadas" y se sometieron a análisis carotenoide.
Ejemplo 5: Análisis carotenoide en hojas verdes curadas de líneas transgénicas 35S: :NtABA4 En "hojas verdes" no son posibles análisis cuantitativos de carotenoides para todos los antofilos debido a las limitaciones técnicas, particularmente para la cuantificación de neoxantina (baja concentración en Nicotinia tabacum y deficiente separación analítica). Se asume que el conjunto de neoxantina (con base en los análisis semicuantitativos, datos no mostrados) tiene una tendencia similar al contenido de luteína (y también beta-caroteno en un menor grado) en TN90, VC, ?/ ??4-1, NtABA4-2 y Nt-AB A4-3. Se utilizaron ambos pigmentos posteriores como medidas representativas de las concentraciones de otros carotenoides (xantofilos) en hojas verdes. En contraste, en hojas senescentes y curadas, dichas suposiciones no se consideraron debido a que se sabe que el conjunto de neoxantina se degrada rápida y totalmente. El análisis carotenoide se lleva a cabo utilizando el método HPLC clásico y detección visible. Las líneas de sobreexpresión NtABA4 muestran que la luteína se eleva significativamente en las líneas NtABA4-2 y NtABA4-3 cuando se compara con el control de vector y tipo silvestre. La sobreexpresión de NtABA4 da como resultado un incremento de luteína en la hoja del 30% y 26% en las líneas NtABA4-2 y NtABA4-3 , respectivamente, cuando se comparan las líneas TN90 y las líneas de fondo del control de vector. Además, el beta-caroteno también fue significativamente superior en líneas NtABA4 (aproximadamente el 15% superior) en comparación con TN90 tipo silvestre. Estos datos indican que la sobreexpresión de NtABA4 tiene un efecto de incremento general en el contenido carotenoide. El incremento en carotenoides dentro de las líneas de plantas transgénicas es significativo (P<0.05; prueba T).
El análisis de carotenoides en hojas curadas muestra globalmente una disminución en los conjuntos de luteína y beta-caroteno en comparación con hojas verdes. Del 87 al 95% de la luteína y beta-caroteno presentes en muestras verdes, se degrada durante la curación en todas las líneas tipo silvestre de control de vector y transgénicas 35S::NtABA4. Esto sugiere que estos carotenoides se someten a modificaciones químicas o enzimáticas activas durante la curación. La presencia de grandes variaciones dentro de cada conjunto de muestras curadas indican que el catabolismo carotenoide durante la curación es menos "controlado" y es un proceso menos controlado y "homogéneo" que la síntesis carotenoide en hojas verdes de los análisis de prueba T que muestran que el contenido de luteína es significativamente diferente cuando se compara con las siguientes líneas: NtABA4-2 es mayor a TN90 (PO.001I) y al control de vector (PO.05); el control de vector es mayor a TN90 (PO.05) y ?????4- es mayor a TN90 (P<0.05). el contenido de beta-caroteno es mayor en el control de vector (P<0.05) y NtABA4-1 (PO.01 I) cuando se compara con TN90. Ejemplo 6: Análisis carotenoides en líneas de ARN de interferencia 35S::NeSy y NtCED2 seleccionados Tal como se describe para 35S : : NtABA4, las líneas transformadas de ARN de interferencia 35S : : NtNeSy y NtNCED2 se seleccionan con base en la genotipificación y RT-PCR. Como resultado, se identificaron dos líneas Z5S::NtNeSy y tres líneas de ARN de interferencia de NtNCED2 y se plantaron en cuatro réplicas al mismo tiempo y en el mismo campo. El contenido de los carotenoides mayores (luteína y beta-caroteno) se determina en líneas de ARN de interferencia NCED2 y 35S::NtNeSy. Tanto las líneas de ARN de interferencia NCED2 como de 35S::NtNeSy presentan un incremento en los carotenoides principales en hojas verdes, lo confirma que estos dos candidatos de gen para la transformación de plantas afectan el metabolismo carotenoide en hoja de tabaco. Sin embargo, cuando se comparan todas las líneas transgénicas seleccionadas, la sobreexpresión de NtABA4 parece ser la más eficiente para lograr un incremento carotenoide general en hojas verdes. El material de hoja recolectado se expone a curación con aire con el objeto de confirmar que los cambios carotenoides observados dan como resultado cantidades alteradas de beta-damascenona producidos en el aerosol respectivo. Con el objeto de seleccionar las muestras curadas más prometedoras, las muestras/líneas con los cambios más drásticos se eligieron las muestras/líneas con los cambios más drásticos en luteína, beta-caroteno y neoxantina (datos semicuantitativos). Estas muestras/líneas fueron NtNeSy-1 _2, NtABA4-2_2 y ARN-1_4 de interferencia NtNCE D2, respectivamente (figura 6). Aquí una suposición es que la neoxantina o posiblemente otros carotenoides que se acumulan en hojas verdes se convierten en hojas curadas para precursores beta-damascenona-glucósido u otros precursores beta-damascenona, los cuales posteriormente se liberan mediante calentamiento.
Ejemplo 7: Análisis de beta-damascenona en líneas transgénicas seleccionadas Para analizar el contenido de beta-damascenona en el aerosol formado después de calentar el tabaco curado de TN90-4 (control), de líneas de muestra NtNeSy-1 _2, NtABA4-2_2 y de ARN-1_4 de interferencia NtN CE D2 , se generaron aerosoles del rellenador de corte de tabaco impregnado. La plataforma de humo utilizada es un simulador de humo con una fuente de calor NHS (54W) que incluye un régimen de 12 Bocanadas de 2 segundos cada una. Antes de fumarse, las láminas curadas de tabaco se cortaron e impregnaron con 20% de glicerina. Los aerosoles producidos calentando tabaco curado impregnado (100 mg, 3 réplicas completas) quedaron atrapados en el filtro Cambridge PAD. Los PADs se introdujeron en un frasco que contiene 10 mL de agua/EtOH (9/1, v/v). La beta-damascenona se extrajo mediante el método de Extracción Stir Bar Sorbtive (tal como se describe en Lancas et al. (2009) J. Sep. Sci. 32, 813-824). Este método permitió la extracción de compuestos químicos que exhiben afinidad para la fase de absorción. La barra de agitación se desabsorbió térmicamente en un inyector de GC-MS y se analizó para beta-damascenona. En comparación con TN90 (control), la muestra NtABA4-2_2 mostró un 68% de incremento de beta-damascenona en el aerosol (figura 7). Esta diferencia es estadísticamente relevante (P<0.01, prueba T). Estos resultados sugieren que el conjunto de precursores para beta-damascenona en hojas curadas se incrementa mediante la expresión ectópica de NtABA4, mientras que el efecto de los otros dos genes objetivo NtNeSy (sobre-expresión) y NtNCED2 (silenciación de ARN de interferencia), es parecido al control TN90. Por lo tanto, la sobreexpresión de NtABA4, pero no el diseño de NtNeSy o NtNCED en hojas de tabaco, probablemente conduce a la producción elevada de precursores de beta-damascenona.
Cualquier publicación mencionada o descrita en el presente documento, proporciona información relevante descrita antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Las manifestaciones en el presente documento serán construidas como una admisión de que los inventores no están titulados para anteceder dichas descripciones. Todas las Publicaciones mencionadas en la especificación anterior, están incorporadas a la presente invención, como referencia. Los expertos en la técnica podrán apreciar diversas modificaciones y variaciones de la invención, sin apartarse del alcance y esencia de la misma. Aunque la presente invención ha sido descrita en relación con modalidades preferidas específicas, deberá quedar entendido que la presente invención, tal como se reivindica, no deberá limitarse indebidamente a dichas modalidades específicas. De hecho, las diversas modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención, los cuales son obvios para los expertos en biología celular, molecular y de plantas o campos relacionados, están proyectadas para estar dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
SECUENCIAS SEQ ID NO: 1 (Secuencia de nucleótido de ABA4 a partir de Nicotiana tabacum k326) atgtcactttcttttaattcttcttgtttttgttcccctcttaataagtcaagtatggacttctcttcttcttgctt ctgctactctcacatctcactcaagatgaactgcagggcacctgccttgatgtccaggagaaaccagcctacctctt atacttttctagaaaagaattctgacattgtaaatcaacaagtagtggaattcggaaccaagtttagaagtggagcg aatttcctgggaggatcaagagtcattattcaacttaatcttcaaacaactcttgctcaaagaaaaagctccagggt gactgcttgtttgccaagttctgaaattgcttctactgttttcacactgggaacagcagcagttcttccgttttata ctctcatggttgtggctcctaaaactgaacttaccagaaaagtgatgaaaagcagcatacccaatattggctttgga cttctgtacacatatctagtatácetetettggacaccagatacagt tcggctgatgtttgctagtaa tactggct tccggagctgcccggcataactaagatg tctccaacgagatgacattagcttctgcatggattcacttgttggctg tagatett tttgctgcaaggcaggtttatcatgatggattgcaaaatgatattgaaacccgccattctgtgtctctg tgcttgctgttttgccccgtcggaattgttactcacttcatcaccaaagctctagccagtagcccagaaaagagaca gcataggactcattaa SEQ ID NO: 2 (Secuencia de aminoácido de ABA4 a partir de Nicotiana tabacum k326) MSLSFNSSCFCSPLNKSSMDFSSSCFCYSHISLKMMCRAPALMSRRNQPTSYTFLEKNSDIVNQQWEFGTKFR SGANFLGGSRVI IQLNLQTTLAQR SSRVTACLPSSEIASTVFTLGTAAVLPFYTLMWAP TELTRKVMKSSI PNIGFGLLYTYLVYLS TPDTVRLMFASKYWLPELPGITKMFSNEMTLASAWIHLLAVDLFAARQVYHDGLQMD IETRHSVSLCLLFCPVGIVTHFITKALASSPEKRQHRTH SEQ ID NO: 3 (Secuencia de nucleótido de cebador directo utilizado para amplificar NtABA4 a partir de Nicotiana tabacum k326 con la secuencia cace en el cebador para clonación) caccatgtcactttcttttaattcttcttgt SEQ ID NO: 4 (Secuencia de nucleótido de cebador directo utilizado para amplificar NtABA4 a partir de Nicotiana tabacum k326 sin la secuencia cace en el cebador para clonación) atgtcactttcttttaattcttcttgt SEQ ID NO: 5 (Secuencia de nucleótido de cebador inverso utilizado para amplificar NtABA4 a partir de Nicotiana tabacum k326) ttaatgagtcctatgctgtctcttttc SEQ ID NO: 6 (Secuencia de nucleótido de ABA4 a partir de Nicotiana tabacum de Hoja Ancha de Hicks) atgtcactttcttttaattcttcttcttgtttttgttcccctcttaataagtcaagtatggacttctcttcttcttg cttctgctactctcacatctcactcaagatgaactgcagggcacctgccttgatgtccaggagaaaccagcctacct cttatacttttctagaaaagaattctgacattgtaaatcaacgagtagtggaattcagaaccaagtttagaagtgga gcgaatttcctgggaggatcaagagtcattattcaacttaatcttcaaacaactcttgctcaaagaaaaagctccag ggtgactgcttgtttgccaagttctgaaattgcttctactgttttcacactgggaacagcagcggttcttccgtttt atacactcatggtagtggctcctaaagctgaacttaccagaaaagtgatgaaaagcagcataccctatattggcttt ggacttctgtacacatatctagtatacctctcttggacaccagatacagttcggctgatgtttgctagtaaatactg gcttccggagc gcccggcataactaagatgt tct ccaacgaga gacat tagcttctgcatggattcacttgttgg ccgtagatctt t ttgctgcaaggcaggtttatcatgatggattgcaaaatgatattgaaacccgccattctgtgtct ctgtgcttgctgttttgccccttcggaattgttactcacttcatcaccaaagctctaaccagtagcccagaaaagag acagcataggactcat aa SEQ ID NO: 7 (Secuencia de aminoácido de ABA4 a partir de Nicotiana tabacum de Hoja Ancha de Hicks) MSLSFNS3SCFCSPLNKSSMDFSSSCFCYSHISLKMNCRAPALMSRRNQPTSYTFLEKNSDIVNQR EFRTKFRSG ANFLGGSRVIIQLNLQTTLAQRKSSRVTACLPSSEIASTVFTLGTAA.VLPFYTLMWAPKAELTR VM SSIPYIGF GLLYTYLVYLSWTPDTVRLMFASKYWLPELPGITKMFSNEMTLASAWIHLLAVDLFAARQVYHDGLQMDIETRHSVS LCLLFCPFGIVTHFITKALTSSPEKRQHRTH SEQ ID NO: 8 (Secuencia de nucleótido de NeSy a partir de Nicotiana tabacum k326) atggaaactcttctcaaaccttttccatctccttt c tttcactcctacacctcacaggtctatttttcaactgaa ttctacttttctgaatccaaccacccagaacttttcaagaaaagttcatcgcagaaacaaaagtagtagtaacaaat tttgtagctttcttgacttagcacccacatcaaaaccagagtctttagatgttgacatctcatgggttgatcctaat tcgggccgggctctattcgacgtgatcatcatcggagctggtcctgcgggcctccggctagctgagcaagtatcaag atatggtattaaggtatgttgtgttgaccc tcaccact tccatgtggccaaataa tatggtgt tgggttgatg agtttgagaagttaggattggaagattgtttagatcataagtggcctatgacttgtgttcatataaatgataacaag actaagtatttgggaagaccatatggtagagtcagtagaaaaaagttgaagttgaaattgttgaatagttgtgttga taatggagggaagttttataaagccaaggtttggaaagtggagcatgaagaatt gagtcttcagttgtttgtgatg atggtaggaagataaggggtagtttgattgtagatgcaagtggttttgctagtccttttatagaatatgacaagcca agaaaccatggttatcaaatagctcatgggattttagcacaagtggataatcatccatttgatttggataaaatggt gc t tggattggagggattctcatctgggaaatgagccatatttgagggtgaacaatactaaagaaccaacattct tgtatgtgatgccatttgataggaatttggtattcttggaagagacttctttggtgagtcggcctgtgctatcgtat agggaagtgaaaaataggatggtggcaaggttaaggcatttggggatcaaagtgacaagtgttattgaggatgagaa atgtgtgat ceceatgggaggaccacttccgcggatccctcaaaatgttatggcaattggtggaaattcagggatag ttcatccatcgacagggtacatggtggctcggagcatggcattggcaccagttttggctgaggccattgctgagagc ctcggcacaaccagaatgataagaggatctccactttaccataaagtttggaatggtttgtggcctctagagagaag aagtgtgagagaatgt actcttttgggatggagact t tgt tgaaget tgatttgaaagggactaggagattgtttg atgctttctttgatcttgatcccaaatactggcaagggttcctttcctcaaggttgtctgtcaaagaacttgctatg cttagcttgtaccttt tgggcatgcctcaaatt ggctaggttggatattgttacaaaatgcccggtgcccttggt taaaatgatggaaatctag SEQ ID NO: 9 (Secuencia de aminoácido de NeSy a partir de Nicotiana tabacum k326) METLLKPFPSPLLFTPTPHRSIFQLMSTFLNPTTQNFSR VHRRNFCSSSNKFCSFLDLAPTSKPESLDVDISWVDPN SGRALFDVI I IGAGPAGLRLAEQVSRYGIKVCCVDPSPLSMWPNNYGV VDEFEKLGLEDCLDHKWPMTCVHINDNK TKYLGRPYGRVSRKKLKLKLLNSCVDNGG FYKAKVWKVEHEEFESSWCDDGRKIRGSLIVDASGFASPFIEYDKP RNHGYQIAHGILAQVD HPFDLDKMVLMDWRDSHLGMEPYLRVNNTKEPTFLY'/MPFDRNLVFLEETSLVSRPVLSY REV NRMVARLRHLGIKVTSVIEDEKCVIPMGGPLPRIPQNV^IGGNSGIVHPSTGY^¾RS^¾LAPVLAEAIAES LGTTRMIRGSPLYH V GLWPLERRSVRECYSFGMETLLKLDL GTRRLFDAFFDLDP YWQGFLSSRLSVKELAM LSLYLFGHASMLARLDIVTKCPVPLV MMEI SEQ ID NO: 10 (Secuencia de nucleótido de cebador directo utilizado para amplificar NeSy a partir de Nicotiana tabacum k326 con la secuencia cace en el cebador para clonación) caccatggaaactcttctcaaaccttttc SEQ ID NO: 11 (Secuencia de nucleótido de cebador directo utilizado para amplificar NeSy a partir de Nicotiana tabacum k326 sin la secuencia cace en el cebador para clonación) atggaaactcttctcaaaccttttc SEQ ID NO: 12 (Secuencia de nucleótido de cebador inverso utilizado para amplificar NeSy a partir de Nicotiana tabacum k326) ctagatttccatcattttaaccaag SEQ ID NO: 13 (Secuencia de nucleótido de NCED2 a partir de Nicotiana tabacum) acacaagcttggctttattcggaggcaaactattcgctcttggtgaatctgatttaccgtatgcagtaaaattagcc ccagatggtgatattattaccctcggccgttacgatttcgacggaaaacttttcatgagcatgacggcacatcccaa aattgacccagatactaacgaggcttttgctttccgttacggtccaatgcctccttttttaacttactttagaatcg aaccaaatgqtacaaaaacaccaqacqtgccaatattttctatgacacqtccgtcatttcttcatqactttqcaatt acaaataaatttgcgatattctcggacatacaaataggaatgaacccacttgagttcatcaccggtggttcaccggt gagttcagactcggggaaaatc SEQ ID NO: 14 (Secuencia de nucleótido de cebador directo utilizado para amplificar NCED2 a partir de Nicotiana tabacum con la secuencia cace en el cebador para clonación) caccacacaagcttggctttattcg SEQ ID NO: 15 (Secuencia de nucleótido de cebador directo utilizado para amplificar NCED2 a partir de Nicotiana tabacum sin la secuencia cace en el cebador para clonación) acacaagcttggctttattcg SEQ ID NO: 16 (Secuencia de nucleótido de cebador inverso utilizado para amplificar NCED2 a partir de Nicotiana tabacum) gattttccccgagtctgaact

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una célula de planta muíante, de origen no natural o transgénica que comprende: (i) un polinucleótido que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia que codifica neoxantina sintasa y que tiene al menos el 60% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:1 o SEC ID No. 6; (ii) un polipéptido codificado por el polinucleótido establecido en (i); (iii) un polipéptido que tiene al menos el 66% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 2 o al menos el 60% de identidad de secuencia con la SEC ID No. 7; o (iv) una construcción, vector o vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado establecido en (i), y en donde la expresión o actividad de la neoxantina sintasa se modula en comparación con una planta de control o tipo silvestre.
2. Una planta muíante, de origen no natural o transgénica que comprende la célula de plañía de acuerdo con la reivindicación 1.
3. Un méíodo para modular el confenido carofenoide de una planta, en donde el método comprende los pasos de: (a) modular la expresión o actividad de neoxantina sintasa en la planta, preferenlemeníe, en donde la neoxaníina sinfasa comprende: (i) un polinucleótido que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia que codifica una neoxantina sintasa y que tiene al menos el 60% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:1 o SEC ID No. 6; (ii) un polipéptido codificado por el polinucleótido establecido en (i); o (iii) un polipéptido que tiene al menos el 66% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 2 o al menos el 60% de identidad de secuencia con la SEC ID No. 7; (b) medir el contenido carotenoide en al menos parte de la planta muíante, de origen no natural o transgénica obtenida en el paso (a); y (c) identificar una planta muíante, de origen no natural o transgénica en donde el contenido carotenoide en el mismo ha cambiado en comparación con una planta de control en donde la expresión o actividad de la neoxantina sintasa no ha sido modulada.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la expresión o actividad de licopeno beta ciclasa o dioxigenasa 9-cis-epoxicarotenoide o una combinación de las mismas, también se modula en la planta.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la licopeno beta ciclasa comprende la secuencia de polinucleótido establecida en SEC ID NO:8 o tiene al menos el 60% de identidad de secuencia con la misma o la secuencia de polinucleótido establecida en la SEC ID NO:9 o que tiene al menos el 60% de identidad de secuencia con la misma y en donde la dioxigenasa 9-cis-epoxicarotenoide comprende la secuencia de polinucleótido establecida en SEC ID NO:13 o tiene al menos el 60% de identidad de secuencia de la misma.
6. Un método para modular el contenido de beta-damascenona en una planta, en donde el método comprende los pasos de: (a) modular la expresión o actividad de neoxantina sintasa en la planta, preferentemente, en donde la neoxantina sintasa comprende: (i) un polinucleótido que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia que codifica una neoxantina sintasa y que tiene al menos el 60% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:1 o SEC ID No. 6; (ii) un polipéptido codificado por el polinucleótido establecido en (i); o (iii) un polipéptido que tiene al menos el 66% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 2 o al menos el 60% de identidad de secuencia con la SEC ID No. 7; (b) medir el contenido de beta-damascenona en al menos una parte de la planta muíante, de origen no natural o transgénica obtenida en el paso (a) o un aerosol del mismo; y (c) identificar una planta mutante, de origen no natural o transgénica en donde el contenido de beta-damascenona ha cambiado en comparación con una planta de control en donde la expresión o actividad de la neoxantina sintasa no ha sido modulada.
7. Una planta o material de la planta muíante, de origen no natural o transgénica o derivado que se puede derivar de la misma, que se obtiene o se puede obtener a través del método de acuerdo con la reivindicación 6.
8. Una planta muíante, de origen no natural o transgénica en donde la expresión de neoxaníina siníasa o la actividad de la proteína codificada de esta forma ha sido incrementada; en donde el contenido de luteína de hoja verde o el contenido de beta-caroíeno o el coníenido combinado de lufeína o beta-caroteno de la planta, es mayor a una planta de control en donde la expresión o la actividad de neoxantina sintasa no han sido incrementados; y en donde el contenido de beta-damascenona en el aerosol del material de la planta curada es al menos el 10% mayor que el aerosol de la planta de control, preferentemente en donde: (i) el contenido de luteína de hoja verde de la planta es al menos aproximadamente 18 mg/100 g; (ii) en donde el contenido de beta-caroteno de la planta es de al menos aproximadamente 12 mg/100 g; y (iii) en donde el contenido de beta-damascenona en el aerosol al momento del calentamiento es de al menos aproximadamente 1 ng/mg.
9. El material de la planta que incluye biomasa, semilla u hojas de la planta de acuerdo con las reivindicaciones 2, 7 u 8.
10. Un producto de tabaco que comprende la célula de planta de acuerdo con la reivindicación 1, al menos una parte de la planta de acuerdo con las reivindicaciones 2, 7 o 8 o un material de la planta de acuerdo con la reivindicación 9.
11. Un método para producir beta-damascenona, en donde el método comprende los pasos de: (a) proporcionar al menos una planta de acuerdo con las reivindicaciones 2, 7 o 8, un material de la planta de acuerdo con la reivindicación 9, o el producto del tabaco de acuerdo con la reivindicación 10; y (b) proporcionar calor a la misma para producir un aerosol que comprende beta-damascenona.
12. Un polinucleótido aislado que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia que codifica una neoxantina sintasa y que tiene al menos el 60% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:1 o SEC ID No. 6.
13. Un polipéptido aislado codificado por el polinucleótido establecido en la reivindicación 12.
14. Un polipéptido aislado que tiene al menos el 66% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 2 o al menos el 60% de identidad de secuencia con la SEC ID No. 7.
15. Una construcción, vector o vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 12.
MX2014005298A 2011-10-31 2012-10-30 Modulacion de beta-damascenona en plantas. MX356893B (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11187332.9A EP2586792A1 (en) 2011-10-31 2011-10-31 Modulating beta-damascenone in plants
EP12152508 2012-01-25
PCT/EP2012/071488 WO2013064499A1 (en) 2011-10-31 2012-10-30 Modulating beta-damascenone in plants

Publications (2)

Publication Number Publication Date
MX2014005298A true MX2014005298A (es) 2014-10-24
MX356893B MX356893B (es) 2018-06-19

Family

ID=47351568

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2014005298A MX356893B (es) 2011-10-31 2012-10-30 Modulacion de beta-damascenona en plantas.

Country Status (16)

Country Link
US (1) US9683240B2 (es)
EP (1) EP2773658B1 (es)
JP (1) JP6302407B2 (es)
KR (1) KR101965019B1 (es)
CN (1) CN104080802B (es)
AU (1) AU2012331235B2 (es)
BR (1) BR112014010259B1 (es)
CA (1) CA2853320A1 (es)
IL (1) IL232220A0 (es)
MX (1) MX356893B (es)
MY (1) MY167122A (es)
RU (1) RU2681497C2 (es)
SG (1) SG11201401858YA (es)
UA (1) UA116530C2 (es)
WO (1) WO2013064499A1 (es)
ZA (1) ZA201403109B (es)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015169925A1 (en) * 2014-05-08 2015-11-12 Philip Morris Products S.A. Plant promoter
CN107404857B (zh) 2014-09-15 2023-06-06 瑞克斯旺种苗集团公司 高温种子萌发
WO2018067985A1 (en) * 2016-10-07 2018-04-12 Altria Client Services Llc Composition and methods for producing tobacco plants and products having reduced tobacco-specific nitrosamines (tsnas)
EP3772911A1 (en) 2018-03-28 2021-02-17 Philip Morris Products S.a.s. Modulating reducing sugar content in a plant
JP7463284B2 (ja) 2018-03-28 2024-04-08 フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム 植物におけるアミノ酸含有量の調節
US11976286B2 (en) 2018-12-30 2024-05-07 Philip Morris Products S.A. Modulation of nitrate levels in plants via mutation of nitrate reductase
CN112390856A (zh) * 2019-08-19 2021-02-23 辽宁医学诊疗科技研发中心有限公司 一种具有生物活性的多肽eep2和二倍体的固相合成方法
CN114514321A (zh) 2019-10-01 2022-05-17 菲利普莫里斯生产公司 调节植物中的糖和氨基酸含量（sultr3）
KR20220070305A (ko) 2019-10-01 2022-05-30 필립모리스 프로덕츠 에스.에이. 식물 내 환원당 (inv) 함량 조절
CN110656114B (zh) * 2019-10-18 2022-07-01 云南中烟工业有限责任公司 一种烟草色素合成相关的基因及其应用
CN115426874A (zh) * 2020-04-21 2022-12-02 日本烟草产业株式会社 烟草植物体及其制备方法
WO2023036691A1 (en) 2021-09-10 2023-03-16 Philip Morris Products S.A. Modulating alkaloid profiles in nicotiana tabacum
WO2023117661A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Philip Morris Products S.A. Increasing anatabine in tobacco leaf by regulating methyl putrescine oxidase
WO2023117701A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 Philip Morris Products S.A. Modulation of nicotine production by alteration of nicotinamidase expression or function in plants
WO2024079137A1 (en) 2022-10-13 2024-04-18 Philip Morris Products S.A. Increasing leaf biomass and nitrogen use efficiency by regulating ntp2

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3940499A (en) 1974-09-19 1976-02-24 International Flavors & Fragrances Inc. Food or flavor containing 2,6,6-trimethyl-1-cyclohexen-1-ylacetaldehyde
US6252141B1 (en) * 1998-08-14 2001-06-26 Yissum Research And Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Tomato gene B polynucleotides coding for lycopene cyclase
AR021056A1 (es) 1998-11-03 2002-06-12 Syngenta Participations Ag Adn que comprende un gen especifico de antera de arroz y planta transgenica transformada con el mismo
US7575766B2 (en) * 2001-06-29 2009-08-18 Ball Horticultural Company Tagetes erecta with altered carotenoid compositions and ratios
US7081478B2 (en) * 2001-06-29 2006-07-25 Chrysantis, Inc. Mixed zeaxanthin ester concentrate and uses thereof
WO2006091194A1 (en) 2005-02-23 2006-08-31 North Carolina State University Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome p450 genes
DE102006005711A1 (de) 2006-02-08 2007-08-23 Robert Bosch Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur Überwachung wenigstens einer Glühkerze eines Kraftfahrzeugs
EP1867723A1 (en) * 2006-06-16 2007-12-19 Genoplante-Valor Plants with increased tolerance to water deficit
BRPI0717355B1 (pt) 2006-10-13 2018-01-16 North Carolina State University Método para obtenção de uma planta transgênica de nicotina, método para obtenção de uma semente; construto de ácido nucléico recombinante; método de redução da conversão de nicotina em nornicotina em uma planta de nicotina
RU2324737C1 (ru) * 2006-10-18 2008-05-20 Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (СО РАН) Способ получения трансгенных растений табака с повышенным содержанием пролина
BRPI0820042B1 (pt) 2007-11-12 2020-05-19 North Carolina State University método de obtenção de uma planta de tabaco, ou célula ou parte desta, tendo níveis reduzidos de nornicotina, produto de tabaco, método para fabricar um produto de tabaco, polinucleotídeo isolado, cassete de expressão, polipetpídeo isolado e método de obtenção de uma planta, ou parte de planta desta, do gênero nicotiana
DK2231861T3 (en) 2007-12-13 2015-01-19 Philip Morris Products Sa Transgenic plants modified to produce less cadmium transport, derivative products and related methods.
CN101624556A (zh) * 2009-07-30 2010-01-13 无锡嘉华香精香料有限公司 一种具有红花大金元烟叶风格特征的烟用香精
JP5393341B2 (ja) 2009-08-20 2014-01-22 株式会社デンソー グロープラグ劣化判定装置

Also Published As

Publication number Publication date
EP2773658A1 (en) 2014-09-10
CN104080802B (zh) 2017-09-01
IL232220A0 (en) 2014-06-30
JP6302407B2 (ja) 2018-03-28
KR20140087025A (ko) 2014-07-08
WO2013064499A1 (en) 2013-05-10
AU2012331235A1 (en) 2014-05-22
CN104080802A (zh) 2014-10-01
RU2014121656A (ru) 2015-12-10
BR112014010259A2 (pt) 2017-04-18
UA116530C2 (uk) 2018-04-10
JP2015505666A (ja) 2015-02-26
SG11201401858YA (en) 2014-05-29
MX356893B (es) 2018-06-19
RU2681497C2 (ru) 2019-03-06
BR112014010259B1 (pt) 2021-07-06
KR101965019B1 (ko) 2019-04-02
ZA201403109B (en) 2015-07-29
CA2853320A1 (en) 2013-05-10
MY167122A (en) 2018-08-13
NZ624229A (en) 2016-04-29
EP2773658B1 (en) 2018-05-16
US9683240B2 (en) 2017-06-20
US20140289901A1 (en) 2014-09-25
AU2012331235B2 (en) 2017-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2733837C2 (ru) Снижение превращения никотина в норникотин в растениях
EP2773658B1 (en) Modulating beta-damascenone in plants
US10563215B2 (en) Tobacco specific nitrosamine reduction in plants
AU2016318423B2 (en) Plants with reduced asparagine content
AU2012301350B2 (en) Threonine synthase from nicotiana tabacum and methods and uses thereof
EP3169149B1 (en) Tobacco protease genes
US20170145431A1 (en) Modulation of nitrate content in plants
RU2792235C2 (ru) Растения с сокращенным периодом времени до наступления цветения
EP2586792A1 (en) Modulating beta-damascenone in plants
NZ624229B2 (en) Modulating beta-damascenone in plants

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration