CN1246463C - 低氧诱导微生物表达载体及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种低氧诱导微生物表达载体及其构建方法与应用。本发明所提供的低氧诱导原核生物表达载体，其特征在于它含有vgb启动子序列和par位点序列。一种构建上述低氧诱导原核生物表达载体的方法，是将vgb启动子序列和par位点序列连接入原核生物表达载体的多克隆位点，得到低氧诱导微生物表达载体。应用本发明低氧诱导原核生物表达载体发酵，可以达到不需加入抗生素仍旧保持质粒稳定遗传的效果；可以满足细胞生长对高溶氧的需求，降低了对搅拌和通气的要求；并且可以方便经济地诱导外源目的蛋白的表达，具有广阔的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域中一种低氧诱导微生物表达载体及其构建方法与应用。
背景技术
大肠杆菌外源基因表达系统广泛应用于真核与原核蛋白的表达，是动植物生长因子、基因工程药物、疫苗等生物转化技术产品研究开发的关键技术之一。
但这些微生物培养过程中，尤其是大规模生产和高密度发酵都遇到了不可避免的一些矛盾：生产菌株对氧的需求量和发酵设备的供养能力，连续发酵和质粒不稳定遗传，目的蛋白表达条件和发酵成本等。
含有天然质粒的细胞是长期自然选择的结果，这些包含在细菌体内的自然质粒一般都能稳定地传给子代，从而保持种群中质粒的稳定性，自然丢失率很低。其原因主要在于这些质粒带有很多控制因子。对低拷贝数质粒而言，有二个主要的控制因子，一个是par位点，具有控制质粒分离的功能，能协调细胞分裂与质粒复制，以保证每个细胞至少获得一个拷贝；二是“抑制细胞分裂系统”(Control of celldivision，简称ccd)，这个系统可以使没有获得质粒的子代细胞的分裂受到抑制，从而保证含有质粒的细胞在细胞群体中处于优势地位。对高拷贝数质粒而言，主要是通过多拷贝的随机分配，保证子细胞获得质粒，但高拷贝数质粒往往会聚合成多聚体，影响分配，因此许多高拷贝的自然质粒往往还有多聚体解离系统(multimerresolution system)，使质粒在分配之前分解成单体，以保证每个子细胞都能获得质粒，从而实现质粒的稳定遗传(毛牧灵，Lassana T B，沈萍，彭珍荣。含par位点的重组质粒pSJM3的构建及其稳定性研究。生物工程学报，1998，14(1)：64-69)。质粒pSC101的par位点是一个大小为300bp的顺式作用位点，能和细胞内的某些因子以特定方式结合并把质粒在细胞分裂时平均分配到子细胞中，起到稳定质粒的作用(Meacock P A，Cohen S N.Partitioning of bacteria plasmid during celldivision：a cis-acting locus that accomplishes stable plasmid inheritance.Cell，1980，20：529-542)。该位点在不同的质粒中，例如pACYC184，R1，oriC，miniF，p15A，RK2等，也有稳定质粒遗传的作用(Conley D L，Cohen S N.Isolationand characterization of plasmid mutations that enable partitioning of pSC101replicons lacking the partition(par)locus.J.Bacteriol，1995，177：1086-1089)。将par位点插入质粒pBR327(质粒pBR322的衍生物带有ColE1复制起始位点)，得到的质粒pBR327par的稳定性大为提高(Zurita M，Bolivar F，SoberonX.Construction of plasmid pBR327par，a completely sequenced，stablederivative of pBR327 containing the par locus of pSC101.Gene，1984，28：119-122)。然而par位点对于质粒的不相容性也有作用(Miller C A，Cohen S N.The partition(par)locus of pSC101 is an enhancer of plasmid incompatibility.Mol Microbiol，1993，9：695-702)。
细菌Vitreoscilla(透明颤菌)是严格好氧的，但多生长在贫氧环境中，这是因为它能合成一种可溶性的血红素蛋白(Vitreoscilla hemoglobin，VHb)(DikshitK L，Webster D A.Cloning，characterization and expression of the bacteriaglobin gene from Vitreoscilla in Escherichia coli.Gene，1988，70：377-386)以适应贫氧环境，编码该蛋白的基因即为透明颤菌血红蛋白基因(Vitreoscillahemoglobin gene，vgb)(Fish P A，Webster D A，Stark B C.Vitreoscillahemoglobin enhances the first step in 2，4-dinitroluene degradation in vitroand at low aerat ion in vivo，Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2000，9：75-82)。VHb以氧合态参与和氧有关的代谢，通过将氧传递给呼吸链，来调节末端氧化酶的活性，改变氧化磷酸化的效率，进而改变低氧条件下的代谢途径，以至影响到某些基因的表达。它能够从分子水平上提高重组菌对氧气的利用能力(Jacobsen J R，Khosla C.New directions in metabolic engineering.CurrentOpinion in如Chemical Biology 1998，2：133-137)。一些文献报导了vgb基因的应用实例，表明它具有促进细胞生长，提高细胞培养密度和外源基因表达的作用。如vgb基因在金色链霉菌中的表达可将产物合成提高40％-60％(孟春，叶勤，石贤爱，邱荔，宋思扬，郭养浩。透明颤菌血红蛋白基因在金色链霉菌中的克隆与表达。微生物学报，2002，42(3)：305-310)；vgb基因在链霉菌(Stretomyces lividans)中的表达可促进菌体生长(朱怡非，朱春宝，朱宝泉。透明颤菌血红蛋白基因在链霉菌中的克隆与表达。中国医药工业杂志，1998，29(6)：253-258)；vgb基因在生产聚羟基丁酸[poly(β-hydroxybutyrate)，PHB]的重组大肠杆菌E.coli中表达，有效的提高了细胞生长密度和PHB的产量(Yu H M，Shi Y，Zhang Y P，Yang S L，Shen Z Y.Effect of Vitreoscilla hemoglobin biosynthesis in Escherichia colion production of poly(β-hydroxybutyrate)and fermentative parameters.FEMSMicrobiology Letters，2002，214：223-227)等。
目前已有多种不同调控模式的大肠杆菌外源基因表达载体，包括：(1)基于来源于lac操纵子的启动子的表达系统，启动子tac、trc和lac受到乳糖及其类似物诱导调控；(2)受T7噬菌体RNA聚合酶调控的表达系统，例如在pET系列载体中，利用天然T7RNA聚合酶启动子或者所谓的T7lac动子的控制，lac阻抑物的结合能阻断转录起始；(3)带有λ噬菌体PL启动子的调控系统，由于该启动子受温度敏感性阻遏物cI ts857调控，所以在高温时可以起始转录，对于表达对大肠杆菌有毒的产物非常有用。在产业化生产中，对外源基因表达调控模式的选择是十分重要的。化学诱导模式由于诱导剂的加入将导致生产成本大大上升。温度调控模式在大体积发酵罐中使用时，会因为发酵罐升温缓慢，而导致调控不够灵敏。相比之下溶氧浓度调控模式更适合于生产过程。VHb及其启动子已经在大肠杆菌中成功表达(Dikshit K L，Webster D A.Cloning，characterization and expression of the bacteria globingene from Vitreoscilla in Escherichia coli.Gene，1988，70：377-386)。在大肠杆菌中，可以有效起始VHb蛋白以及其他外源基因的表达(Dikshit K L，DikshitR P，Webster D A.Study of Vitreoscilla globin(vgb)gene expression andpromoter activity in E.coli through transcriptional fusion.Nucleic AcidsRes，1990，18：4149-4155)。当环境溶氧降至5％-2％饱和氧浓度时，vgb启动子的起始转录能力可以被绝大部分激活(Khosla C，Bailey J E.Characterization ofthe oxygen dependent promoter of the Vitreoscilla hemoglobin gene inEscherichia.coli.J.Bacteriol，1989，171：5990-6004)。在大肠杆菌中vgb启动子的全力诱导下，β-半乳糖苷酶的表达可以达到整个细胞总量的10％(Khosla C，Curtis J E，Bydalek P，Swartz J R，Bailey J E.Expression of recombinantproteins in Escherichia.coli using an oxygen-responsive promoter.Bio/Technology，1990，8：554-558)。
发明创造内容
本发明的目的是提供一种低氧诱导微生物，特别是原核生物的表达载体。
本发明所提供的低氧诱导原核生物表达载体，其特征在于它含有vgb启动子序列和par位点序列。
为了增加低氧诱导效果，上述低氧诱导微生物表达载体还含有vgb操纵子序列或结核杆菌血红蛋白基因操纵子序列。
其中，上述par位点序列为来自质粒pSC101的par位点序列。
所述原核细胞表达载体为可在大肠杆菌或芽孢杆菌中表达的载体。
上述低氧诱导原核生物表达载体优选为低氧诱导大肠杆菌表达载体pKVpP，pKVpPV或pKVpPVII。
本发明的第二个目的是提供一种构建上述低氧诱导原核生物表达载体的方法。
本发明所提供的构建上述低氧诱导原核生物表达载体的方法，是将vgb启动子序列和par位点序列连接入原核生物表达载体的多克隆位点，得到低氧诱导微生物表达载体。
上述vgb启动子序列可由常规PCR扩增得到。
在本发明中，透明颤菌血红蛋白基因vgb操纵子表达的透明颤菌血红蛋白VHb可改善细胞生长情况，提高外源目的蛋白的表达量和活性；vgb启动子Pvgb可在低溶氧环境条件下，诱导下游基因转录表达；par位点可在有或没有抗生素加入的微生物培养基的中，保持表达载体的稳定遗传。
实验证明，用本发明的低氧诱导大肠杆菌质粒表达载体进行发酵时，在低溶氧条件下，外源目的蛋白的表达活力明显高于高溶氧条件；含有par位点的低氧诱导大肠杆菌质粒表达载体，在无抗生素加入的条件下，可以在大肠杆菌中稳定遗传至少100代；含有vgb操纵子的低氧诱导大肠杆菌质粒表达载体，菌浓度以及目的外源蛋白甲苯双加氧酶的活力有较大的提高。以包含tac启动子和同类复制子的载体作为对照，pKVpP载体所能达到的最大绿色荧光蛋白活力大约是对照的1.7倍，从而在启动子强度上要明显高于此类启动子。在绿色荧光蛋白及甲苯双加氧酶活力检测中可以发现，vgb启动子的启动明显受环境溶氧的调节：在高溶氧条件下，由其启动的目的蛋白表达大约在对数后期；在低溶氧条件下，由其启动的目的蛋白表达大约在对数前中期。由上可以得到在大肠杆菌中一种新的表达外源目的蛋白的调控方式：在摇瓶培养中，通过调节摇床转速及接种量，目的蛋白的表达可以在细胞生长对数期的任意阶段被起始，在对数生长期大肠杆菌对于外部环境及自身变化的应变能力是较强的；在大规模发酵生产中，通过调节转子的转速、通入空气或者氧气的速度、起始接种量以及采用二次接种的方式，目的蛋白的表达可以在细胞生长对数期的任意阶段被起始，如果通入一定量的纯氧，目的蛋白的表达还可以在大肠杆菌生长的稳定期，这对于生产对宿主菌有一定毒害作用的蛋白或其产物有非常重要的应用价值。
应用本发明低氧诱导微生物表达载体发酵，可以达到不需加入抗生素仍旧保持质粒稳定遗传的效果；可以满足细胞生长对高溶氧的需求，降低了对搅拌和通气的要求；并且可以方便经济地诱导外源目的蛋白的表达；具有广阔的工业应用前景。
附图说明
图1为质粒pKVp，pKVpP，pKVpV和pKVpPV构建过程示意图
图2为质粒pKVp，pKVpP，pKVpV和pKVpPV的稳定性分析曲线
图3为质粒pKVp-E，pKVpP-E，pKVpV-E和pKVpPV-E的绿色荧光蛋白活性检测柱状图
图4为质粒pKVp-E，pKVpP-E，pKVpV-E和pKVpPV-E的稳定性分析曲线
图5为质粒pKVp-T，pKVpP-T，pKVpV-T和pKVpPV-T甲苯双加氧酶活性曲线
图6为质粒pKVpPV-TII的甲苯双加氧酶活性曲线
具体实施方式
实施例1、低氧诱导大肠杆菌表达载体pKVp，pKVpP，pKVpV和pKVpPV的构建及其稳定性、透明颤菌血红蛋白VHb表达检测
菌种：大肠杆菌E.coli JM83
培养基1为(g/l)：蛋白胨10，酵母浸出物5，NaCl 10，氨卞青霉素60μg/l。
1、低氧诱导大肠杆菌表达载体pKVp，pKVpP，pKVpV和pKVpPV的构建低氧诱导大肠杆菌表达载体pKVp，pKVpP，pKVpV和pKVpPV的组成如表1所示，其构建过程如图1所示，具体步骤如下：
表1大肠杆菌表达载体pKVp，pKVpP，pKVpV和pKVpPV的组成
| 表达载体系统 | 重要组成部分 |
| pKVppKVpPpKVpVpKVpPV | vgb启动子vgb启动子，来自质粒pSC101的par位点vgb启动子，vgb操纵子vgb启动子，来自质粒pSC101的par位点，vgb操纵子 |
1)如图1所示，在标准的聚合酶链反应条件下，以vgb基因的启动子序列(KhoslaC，Bailey J E.Characterization of the oxygen dependent promoter of theVitreoscilla hemoglobin gene in Escherichia.coli.J.Bacteriol，1989，171：5990-6004)为模板，以Pvgb-uP：GCA
CATATG(NdeI)ACAGGACGCTGGGGTTAAAAG和Pvgb-do：GGC
GAATTC(EcoRI)GAGGGTCTTCCTTAAGTT为引物得到1436p的DNA扩增片断，该片断含有vgb基因的启动子，用限制性内切酶EcoRI，NdeI酶切处理后，插入到质粒pKK223-3的EcoRI，NdeI位点之间，得到质粒pKVp。
2)如图1所示，在标准的聚合酶链反应条件下，以质粒pSC101中的par位点为模板(Zurita M，Bolivar F，Soberon X.Construction of plasmid pBR327par，a completely sequenced，stable derivative of pBR327 containing the par locusof pSC101.Gene，1984，28：119-122)，以par-up：GTA
CATATG(NdeI)GACAGTAAGACGGGTAAGCC和par-do：GAC
CATATG(NdeI)CGGGCAAATCGCTGAATATT为引物得到367bp的DNA扩增片断，该片断含有质粒pSC101的par位点，用限制性内切酶NdeI酶切处理后，插入到经过去磷酸化处理的质粒pKVp的NdeI位点，得到质粒pKVpP。
3)如图1所示，在标准的聚合酶链反应条件下，以vgb操纵子为模板(Kosla C，Bailey J E.The Vitreoscilla hemoglobin gene：molecular cloning，nucleotidesequence and genetic expression in Escherichia coli.Mol.Gen.Genet，1988，214：158-161)，以Vgb-up：GCA
CATATG(NdeI)ACAGGACGCTGGGGTTAA和vgb-do：GCA
ATTAAT(AseI)GGTGAAGCGCAACGGGT为引物得到993bp的DNA扩增片断，该片断含有完整的vgb操纵子，用限制性内切酶Ase I和Nde I酶切处理后，插入到经过去磷酸化处理的质粒pKVp的NdeI位点，得到质粒pKVpV。
4)如图1所示，在标准的聚合酶链反应条件下，以质粒pSC101中的par位点为模板(Zurita M，Bolivar F，Soberon X.Construction of plasmid pBR327par，acompletely sequenced，stable derivative of pBR327 containing the par locusof pSC101.Gene，1984，28：119-122)，以par-up：GTA
CATATG(NdeI)GACAGTAAGACGGGTAAGCC和par-do：GAC
CATATG(NdeI)CGGGCAAATCGCTGAATATT为引物得到367bp的DNA扩增片断，该片断含质粒pSC101的par位点，用限制性内切酶NdeI酶切处理后，插入到经过去磷酸化处理的质粒pKVpV的NdeI位点，得到质粒pKVpPV。
2、质粒稳定性实验
1)参照文献(Easter C L，Sobecky P A，Helinski D R.Contribution ofdifferent segment of the par region to stable maintenance of thebroad-host-range plasmid RK2.J.Bacteriol，1997，179：6472-6479)进行质粒稳定性实验：
将步骤1中构建的4种表达载体按CaCl2处理法分别转化大肠杆菌E.coli JM83，得到含有上述四种质粒的重组大肠杆菌，将含有上述四种质粒的重组大肠杆菌接种于液体培养基1中37℃培养12小时。部分培养液在预热的培养基1中梯度稀释106倍，然后接种到无抗生素的培养基1中，培养至对数中期。这一个循环，定义为大肠杆菌对数生长20代。如此培养直至重组菌对数生长100代。部分培养液适当稀释后涂布LB平板。所得菌落利用影印平板到含有或者没有抗生素的LB平板上培养16-20小时，来检测保留质粒细胞在总细胞中所占的百分比。其中的培养条件设定为：在250ml无挡板三角瓶中，加入50ml液体培养基，200转每分钟作为氧气供应充分条件；在250ml无挡板三角瓶中，加入150ml液体培养基，100转每分钟作为氧气供应贫乏条件。质粒稳定性检测结果如图2所示，A代表氧气供应充分条件，B代表氧气供应贫乏条件。图2表明带有质粒pSC101par位点的质粒pKVpP、pKVpPV，无论氧气供应充分条件和氧气供应贫乏条件下，经过100代时仍然保持近100％细胞包含有外源质粒。
3、透明颤菌血红蛋白VHb表达检测
参照文献(Dikshit K L，Webster D A.Cloning，characterization andexpression of the bacteria globin gene from Vitreoscilla in Escherichia coli.Gene，1988，70：377-386)的方法检测透明颤菌血红蛋白VHb的表达：将离心后的过夜培养物重悬于磷酸盐缓冲液(100mmol/L，pH7.5)中，并分别加入过量的(0.1g/ml)Na2S2O3，进行还原处理。CO差光谱分析：CO差光谱是VHb的CO络合态与还原态光谱之差，在紫外分光光度计UV-8500的参比端和样品端分别加入1ml经还原处理的样品，在样品端通入5minCO气，再分光光度计下扫描400-460nm的差光谱。VHb浓度检测结果表明在含有质粒pKVpV和pKVpPV的重组大肠杆菌E.coli JM83中，透明颤菌血红蛋白浓度分别为：65.55±3.56nmol/g和66.53±3.81nmol/g。其中，VHb的摩尔消光系数为：ΔC(419，436)＝274cm-1·mM-1，定义c0为湿菌质量浓度(mg/ml)，cv为湿菌中所含VHb的量(nmol/g)，则有Cv＝c/c0＝ΔA*106/(Δ∈bc0)。
实施例2、利用低氧诱导大肠杆菌表达载体pKVp，pKVpP，pKVpV和pKVpPV表达绿色荧光蛋白
菌种：大肠杆菌E.coli JM83
外源基因：绿色荧光蛋白
培养基1为(g/l)：蛋白胨10，酵母浸出物5，NaCl 10。氨卞青霉素60μg/l。
1、以pKVp，pKVpP，pKVpV和pKVpPV为载体表达绿色荧光蛋白所需质粒的构建：
质粒pEGFP-N1含绿色荧光蛋白基因(egfp)。在标准的聚合酶链反应条件下，以质粒pEGFP-N1为模板(购自Clontech公司)，以eGFP-up：GTA
GAATTC(EcoR I)ATGGTGAGCAAGGGCGAGG和eGFP-do：GAC
AAGCTT(Hind III)TTACTTGTACAGCTCGTCC为引物扩增得到717bp的绿色荧光蛋白DNA片断，片断两端带有EcoR I和BamH I酶切位点。将其插入到载体pKVp，pKVpP，pKVpV和pKVpPV相应的酶切位点处，构建出质粒pKVp-E，pKVpP-E，pKVpV-E和pKVpPV-E。
2、绿色荧光蛋白活性检测
用Hitachi荧光分光光度计检测单位OD600的荧光强度。将质粒pKVp-E，pKVpP-E，pKVpV-E和pKVpPV-E按CaCl2处理法分别转化大肠杆菌E.coli JM83。包含有质粒pKVp-E，pKVpP-E，pKVpV-E和pKVpPV-E的E.coli JM83在氧气供应充分条件和氧气供应贫乏条件下培养，24小时时取样检测。以包含pKVp-E的大肠杆菌E.coli JM83在氧气供应充分条件下，单位菌浓度OD600激发荧光强度作为相对荧光强度1。结果如图3所示，表明在包含质粒pKVpP-E大肠杆菌E.coli JM83中，在氧气供应贫乏条件下的单位菌浓度的绿色荧光蛋白活性最高。其中，培养条件设定为：在250ml无挡板三角瓶中，加入50ml液体培养基，200转每分钟作为氧气供应充分条件；在250ml无挡板三角瓶中，加入150ml液体培养基，100转每分钟作为氧气供应贫乏条件。
3、质粒稳定性实验
方法同实施例1中的步骤2。质粒稳定性检测结果如图4所示，A代表氧气供应充分条件，B代表氧气供应贫乏条件。图4表明带有par位点的质粒pKVpP-E、pKVpPV-E，无论氧气供应充分条件和氧气供应贫乏条件下，经过100代时仍然保持近100％细胞包含有外源质粒。其中，培养条件设定为：在250ml无挡板三角瓶中，加入50ml液体培养基，200转每分钟作为氧气供应充分条件；在250ml无挡板三角瓶中，加入150ml液体培养基，100转每分钟作为氧气供应贫乏条件。
实施例3、利用低氧诱导大肠杆菌表达载体pKVp，pKVpP，pKVpV和pKVpPV表达甲苯双加氧酶所需质粒的构建及蛋白活性检测
菌种：大肠杆菌E.coli JM83
外源基因：甲苯双加氧酶
培养基1为(g/l)：蛋白胨10，酵母浸出物5，NaCl 10。氨卞青霉素60μg/l。
1、构建以pKVp，pKVpP，pKVpV和pKVpPV为载体表达甲苯双加氧酶的质粒
质粒pKST11含甲苯双加氧酶基因(tod)。在标准的聚合酶链反应条件下，以质粒pKST11为模板(Zylstra G J，Gibson D T.Toluene degradation by Pseudomonasputida F1：nucleotide sequence of the todClC2BADE genes and their expressionin Escherichia coli.J B C，1989.264：14940-14946.)，以TDO-up：GAC
GAATTC(EcoRI)CTAATGAATCAGACCGACACATC和TDO-do：GAC
GGATCC(BanHI)TCACGTTAGGTCTCCTTCAT为引物扩增得到3.6Kb的甲苯双加氧酶DNA片断，片断两端带有EcoR I和BamH I酶切位点。将其插入到载体pKVp，pKVpP，pKVpV和pKVpPV相应的酶切位点处，构建得到质粒pKVp-T，pKVpP-T，pKVpV-T和pKVpPV-T。
2、甲苯双加氧酶活性检测
参照文献(Woo H J，Sanseverino J，Cox C D，Robinson K G，Sayler G S.Themeasurement of toluene dioxygenase activity in biofilm culture of Psedomonasputida F1.Journal of Microbiological Methods，2000，40：181-191)的方法检测双加氧酶酶活：在检测过菌浓度后，1ml培养液立刻被转移到离心管中。离心(14,000rpm离心1分钟，在4℃)后，去上清，用pH值7.2的磷酸缓冲液重悬。加入25μ10.1M吲哚溶于二甲基甲酰胺的溶液。用分光光度计检测OD600，未加入吲哚的样品作为对照，确定靛蓝的生成量。在开始半小时内靛蓝的生成速度定义为重组菌的酶活力(靛蓝mg/min)。将质粒pKVp-T，pKVpP-T，pKVpV-T和pKVpPV-T按CaCl2处理法分别转化大肠杆菌E.coli JM83。包含有质粒pKVpP-T，和pKVpPV-T的大肠杆菌在氧气供应充分条件和氧气供应贫乏条件下培养，每隔2小时取样检测。结果如图5所示，可见在包含质粒pKVpPV-T大肠杆菌中，单位菌浓度的甲苯双加氧酶活性最高。图5中，A代表氧气供应充分条件，B代表氧气供应贫乏条件。其中，培养条件设定为：在250ml无挡板三角瓶中，加入50ml液体培养基，200转每分钟作为氧气供应充分条件；在250ml无挡板三角瓶中，加入150ml液体培养基，100转每分钟作为氧气供应贫乏条件。
实施例4、vgb启动子Pvgb与结核杆菌血红蛋白操纵子序列组成低氧诱导表达载体及其检测
1、稳定遗传的低氧诱导大肠杆菌表达载体pKVpPVII的构建
1)在标准的聚合酶链反应条件下，以glbO操纵子为模板(Couture M，Yeh S R，Wittenberg B A，Wittenberg J B，Ouellet Y，Rousseau D L，Guertin M.Acooperative oxygen-binding hemoglobin from Mycobacterium tuberculosis.ProcNatl Acad Sci U S A.1999，96：11223-8))，以g1bO-up：GCA
CATATG(NdeI)AGTAGGTTGAGGCCG和g1bO-do：GC
AATTAAT(AseI)TGGCGAGAAAGGAAG为引物得到956bp的DNA扩增片断，该片断含有完整的glbO操纵子，用限制性内切酶AseI和NdeI酶切处理后，插入到经过去磷酸化处理的质粒pKVp的NdeI位点，得到质粒pKVpVII。
2)在标准的聚合酶链反应条件下，以质粒pSC101中的par位点为模板(ZuritaM，Bolivar F，Soberon X.Construction of plasmid pBR327par，a completelysequenced，stable derivative of pBR327 containing the par locus of pSC101.Gene，1984，28：119-122)，以par-up：GTA
CATATG(NdeI)GACAGTAAGACGGGTAAGCC和par-do：GAC
CATATG(NdeI)CGGGCAAATCGCTGAATATT为引物得到367bp的DNA扩增片断，该片断含质粒pSC101的par位点，用限制性内切酶Nde I酶切处理后，插入到经过去磷酸化处理的质粒pKVpVII的Nde I位点，得到质粒pKVpPVII。
2、质粒稳定性实验
1)参照文献(Easter C L，Sobecky P A，Helinski D R.Contribution ofdifferent segment of the par region to stable maintenance of thebroad-host-range plasmid RK2.J.Bacteriol，1997，179：6472-6479)进行质粒稳定性实验：
将步骤1中构建的表达载体pKVpPVII按CaCl2处理法转化大肠杆菌E.coliJM83，得到含有目的质粒的重组大肠杆菌，将重组大肠杆菌接种于液体培养基1中37℃培养12小时。部分培养液在预热的培养基1中梯度稀释106倍，然后接种到无抗生素的培养基1中，培养至对数中期。这一个循环，定义为大肠杆菌对数生长20代。如此培养直至重组菌对数生长100代。部分培养液适当稀释后涂布LB平板。所得菌落利用影印平板到含有或者没有抗生素的LB平板上培养16-20小时，来检测保留质粒细胞在总细胞中所占的百分比。其中的培养条件设定为：在250ml无挡板三角瓶中，加入50ml液体培养基，200转每分钟作为氧气供应充分条件；在250ml无挡板三角瓶中，加入150ml液体培养基，100转每分钟作为氧气供应贫乏条件。质粒稳定性检测结果表明带有质粒pSC101 par位点的质粒pKVpPVII，无论氧气供应充分条件和氧气供应贫乏条件下，经过100代时仍然保持近100％细胞包含有该外源质粒。
3、利用低氧诱导大肠杆菌表达载体pKVpPVII表达甲苯双加氧酶所需质粒的构建及蛋白活性检测
1)构建以pKVpPVII为载体表达甲苯双加氧酶的质粒
质粒pKST11含甲苯双加氧酶基因(tod)。在标准的聚合酶链反应条件下，以质粒pKST11为模板(Zylstra G J，Gibson D T.Toluene degradation by Pseudomonasputida F1：nucleotide sequence of the todC1C2BADE genes andtheir expressionin Escherichia coli.J B C，1989.264：14940-14946)，以TDO-up：GACGAATTC(EcoRI)CTAATGAATCAGACCGACACATC和TDO-do：GACGGATCC(BamHI)TCACGTTAGGTCTCCTTCAT为引物扩增得到3.6Kb的甲苯双加氧酶DNA片断，片断两端带有EcoRI和BamHI酶切位点。将其插入到载体pKVpPVII相应的酶切位点处，构建得到质粒pKVpPV-TII。
2)甲苯双加氧酶活性检测
参照文献(Woo H J，Sanseverino J，Cox C D，Robinson K G，Sayler G S.Themeasurement of toluene dioxygenase activity in biofilm culture of Psedomonasputida F1.Journal of Microbiological Methods，2000，40：181-191)的方法检测双加氧酶酶活：在检测过菌浓度后，1ml培养液立刻被转移到离心管中。离心(14,000rpm离心1分钟，在4℃)后，去上清，用pH值7.2的磷酸缓冲液重悬。加入25μ10.1M吲哚溶于二甲基甲酰胺的溶液。用分光光度计检测OD600，未加入吲哚的样品作为对照，确定靛蓝的生成量。在开始半小时内靛蓝的生成速度定义为重组菌的酶活力(靛蓝mg/min)。将质粒pKVpPV-TII按CaCl2处理法分别转化大肠杆菌E.coli JM83。包含有质粒pKVpPV-TII的大肠杆菌在氧气供应充分条件和氧气供应贫乏条件下培养，每隔2小时取样检测。结果如图6所示，可见在包含质粒pKVpPV-TII大肠杆菌中，单位菌浓度的甲苯双加氧酶活性较高。图6中，A代表氧气供应充分条件，B代表氧气供应贫乏条件。其中，培养条件设定为：在250ml无挡板三角瓶中，加入50ml液体培养基，200转每分钟作为氧气供应充分条件；在250ml无挡板三角瓶中，加入150ml液体培养基，100转每分钟作为氧气供应贫乏条件。
实施例5、包含来自质粒R100的pemK和pemI基因、来自质粒F的ccdA和ccdB基因、来自质粒R1的hok和sok基因、来自IncPα质粒RK2的parDE对于表达载体稳定遗传的影响
1、稳定遗传的低氧诱导大肠杆菌表达载体pKVpPII，pKVpPIII，pKVpPIV和pKVpPVI的构建
1)在标准的聚合酶链反应条件下，以质粒R100的pemK/pemI基因序列(Tsuchimoto S，Ohtsubo H，Ohtsubo E.Two genes pemK and pemI，responsiblefor stable maintenance of resistance plasmid R100.J.Bacteriol，1988，170：1461-1466)为模板，pR100-up：GTA
CATATG(Nde I)GAAGCAACCACGCTGG和pR100-do：GTC
CATATG(Nde I)GCTGCGCTTGGAATT为引物得到847bp的DNA扩增片断，该片断含有pemK/pemI基因序列，用限制性内切酶NdeI酶切处理后，插入到经过去磷酸化处理的质粒pKVp的NdeI位点，得到质粒pKVpPII。
2)在标准的聚合酶链反应条件下，以质粒F的ccdA/ccdB基因序列(Ogura T，Hiraga S.Mini-F plasmid genes that couple host cell division to plasmidproliferation.Proc Natl Acad Sci USA，1983，80：4784-4788)为模板，pF-up：GTA
CATATG(NdeI)AATACATAAGGCTTAC和pF-do：ATC
CATATG(NdeI)AACGGAGCCTGACAT为引物得到651bp的DNA扩增片断，该片断含有ccdA/ccdB基因序列，用限制性内切酶Nde I酶切处理后，插入到经过去磷酸化处理的质粒pKVp的NdeI位点，得到质粒pKVpPIII。
3)在标准的聚合酶链反应条件下，以质粒R1的hok/sok基因序列(Gerdes K，Thisted T，Martinussen J.Mechanism of post-segregational killing by thehok/sok system of plasmid R1：sok antisense RNA regulates formation of a hokmRNA species correlated with killing of plasmid-free cells.Mol.Microbiol.1990，4：1807-1818)为模板，pR1-up：ATC
CATATG(NdeI)AACAAACTCCGGGAGG和pR1-do：GTC
CATATG(NdeI)ACAACATCAGCAAGG为引物得到596bp的DNA扩增片断，该片断含有hok/sok基因序列，用限制性内切酶Nde I酶切处理后，插入到经过去磷酸化处理的质粒pKVp的NdeI位点，得到质粒pKVpPIV。
4)在标准的聚合酶链反应条件下，以IncPα质粒RK2的parDE基因序列(EasterC L，Sobecky P A，Helinski D R.Contribution of different segments of thebroad-host-range plasmid RK2.J.Bacteriol，1997，179：6472-6479)为模板，pRK2-up：GTA
CATATG(Nde I)ACGCAATTTAAATGC和pRK2-do：GTC
CATATG(Nde I)AGTACGCCATCAGGAC为引物得到712bp的DNA扩增片断，该片断含有parDE基因序列，用限制性内切酶Nde I酶切处理后，插入到经过去磷酸化处理的质粒pKVp的Nde I位点，得到质粒pKVpPVI。
2、质粒稳定性实验
1)参照文献(Easter C L，Sobecky P A，Helinski D R.Contribution ofdifferent segment of the par region to stable maintenance of thebroad-host-range plasmid RK2.J.Bacteriol，1997，179：6472-6479)进行质粒稳定性实验：
将步骤1中构建的4种表达载体按CaCl2处理法分别转化大肠杆菌E.coli JM83，得到含有上述四种质粒的重组大肠杆菌，将含有上述四种质粒的重组大肠杆菌接种于液体培养基1中37℃培养12小时。部分培养液在预热的培养基1中梯度稀释106倍，然后接种到无抗生素的培养基1中，培养至对数中期。这一个循环，定义为大肠杆菌对数生长20代。如此培养直至重组菌对数生长100代。部分培养液适当稀释后涂布LB平板。所得菌落利用影印平板到含有或者没有抗生素的LB平板上培养16-20小时，来检测保留质粒细胞在总细胞中所占的百分比。其中的培养条件设定为：在250ml无挡板三角瓶中，加入50ml液体培养基，200转每分钟作为氧气供应充分条件；在250ml无挡板三角瓶中，加入150ml液体培养基，100转每分钟作为氧气供应贫乏条件。质粒稳定性检测结果表明新型大肠杆菌表达载体pKVpPII，pKVpPIII，pKVpPIV和pKVpPVI(前面的实施例1中已有名为pKVpPV的质粒，现将其改为pKVpPVI)，无论氧气供应充分条件和氧气供应贫乏条件下，经过100代时仍然保持近100％细胞包含有外源质粒。
上述实施例的实验结果表明以有par位点的质粒pKVpP，pKVpPV，pKVpPVII，pKVpPII，pKVpPIII，pKVpPIV和pKVpPVI为表达载体，在无抗生素加入的条件下，该质粒可以在大肠杆菌中稳定遗传至少100代而没有明显丢失(误差范围内小于4％)。在大规模工业发酵中应用带有par位点的质粒pKVpP，pKVpPV，pKVpPVII，pKVpPII，pKVpPIII，pKVpPIV和pKVpPVI，可以避免为保持质粒稳定遗传而加入抗生素所带来的投入。通过vgb启动子的作用满足了目的蛋白大量生产所需要的细胞内高溶氧条件，降低了对搅拌和通气的要求，为大规模工业化生产提供了可行性。实施例2表明低氧诱导大肠杆菌表达载体pKVp，pKVpP，pKVpV和pKVpPV在低溶氧条件下表达的外源目的蛋白活力明显高于高溶氧条件，利用pKVpP作为表达载体表达绿色荧光蛋白，在低溶氧条件下可以达到最高活力。质粒pKVpP中并不含有vgb基因，而表达效果却优于pKVpPV，原因可能是VHb蛋白对于绿色荧光蛋白活力的增强要小于两种蛋白对于低物和能量竞争的负影响。由实施例3可见，以有vgb操纵子的质粒pKVpV和pKVpPV为表达载体，菌浓度以及目的外源蛋白甲苯双加氧酶的活力有进一步提高，可能的原因是VHb蛋白对于甲苯双加氧酶酶活力的增强要大于两种蛋白对于底物和能量竞争的负影响。因为par位点对于质粒不相容性也有作用，所以在与包含pSC101复制起始位点的质粒进行共表达时，质粒pKVp，pKVpV将会有优势的作用。当用vgb启动子Pvgb与结核杆菌血红蛋白操纵子序列组成低氧诱导表达载体进行甲苯双加氧酶酶活力表达时，该酶活力也有一定的提高。利用包含来自质粒R100的pemK和pemI基因、来自质粒F的ccdA和ccdB基因、来自质粒R1的hok和sok基因、来自IncPα质粒RK2的parDE片段构建新表达载体pKVpPII，pKVpPIII，pKVpPIV和pKVpPVI，并进行稳定性检测。该系列质粒无论氧气供应充分条件和氧气供应贫乏条件下，在无抗生素加入的条件下，可以在大肠杆菌中稳定遗传至少100代而没有明显丢失(误差范围内小于4％)。
序列表
<110>清华大学
<120>低氧诱导微生物表达载体及其构建方法与应用
<130>CGGNA40356
<160>2
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
gcacatatga caggacgctg gggttaa 17
<210>2
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
gcaattaatg gtgaatcgca acgggt 16
Claims (8)
1、一种低氧诱导原核生物表达载体，其特征在于它含有vgb启动子序列和par位点序列。
2、根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体还含有vgb操纵子序列。
3、根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体还含有结核杆菌血红蛋白基因操纵子序列。
4、根据权利要求1、2或3所述的表达载体，其特征在于：所述par位点序列来自质粒pSC101。
5、根据权利要求1、2或3所述的表达载体，其特征在于：所述原核生物表达载体为可在大肠杆菌中表达的载体。
6、根据权利要求1、2或3所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体为pKVpP，pKVpPV或pKVpPVII。
7、一种构建权利要求1所述低氧诱导原核生物表达载体的方法，是将vgb启动子序列和par位点序列连接入原核生物表达载体的多克隆位点，得到低氧诱导微生物表达载体。
8、权利要求1所述低氧诱导原核生物表达载体在生产外源目的蛋白中的应用。
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