JP7290338B2 - 単子葉植物において組み換えタンパク質の高発現を可能にする5’utrをコードするdna分子 - Google Patents
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Description
項1. 以下の(i)~(iii)のいずれかに示すポリヌクレオチドからなることを特徴とする、5'UTRをコードするDNA分子:
(i)配列番号1~4のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(ii)配列番号1~4のいずれかに示す塩基配列において、1又は数個の塩基が置換、欠失若しくは付加された塩基配列からなり、且つ配列番号1~4のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと同等の5'UTR活性を示すポリヌクレオチド、
(iii)配列番号1~4のいずれかに示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNA断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号1~4のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと同等の5'UTR活性を示すポリヌクレオチド。
項2. 項1に記載のDNA分子が、外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドの5'末端側に連結されている、核酸構築物。
項3. 項2の記載の核酸構築物を含む、ベクター。
項4. 項3に記載のベクターを単子葉植物又は単子葉植物細胞に導入する、形質転換体の製造方法。
項5. 項3に記載のベクターで、単子葉植物又は単子葉植物細胞が形質転換されてなる、形質転換体。
項6. 項5に記載の形質転換体を培養又は栽培する、組み換えタンパク質の製造方法。
本発明のDNA分子は、5'UTRをコードするDNA分子であって、以下の(i)~(iii)のいずれかに示すポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
(i)配列番号1~4のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(ii)配列番号1~4のいずれかに示す塩基配列において、1又は数個の塩基が置換、欠失若しくは付加された塩基配列からなり、且つ配列番号1~4のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと同等の5'UTR活性を示すポリヌクレオチド、
(iii)配列番号1~4のいずれかに示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNA断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号1~4のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと同等の5'UTR活性を示すポリヌクレオチド。
本発明の核酸構築物は、前記(i)~(iii)のポリヌクレオチドが、外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドに連結してなることを特徴とする。
本発明のベクター(発現ベクター)は、前記核酸構築物を、ベクター内で発現可能に連結することによって得ることができる。より具体的には、本発明のベクターは、プロモーター配列を備えたベクターに、前記核酸構築物をプロモーターの転写開始点直後に連結することにより得ることができる。
本発明の形質転換体は、本発明のベクターを単子葉植物又は単子葉植物細胞に導入することによって得ることができる。
以下の検討には、次の植物体及び培養細胞を用いた。
イネ培養細胞(Oryza sativa cv. Nipponbare)を以下のポリソーム/CAGE解析に用いた。培養は、30℃、暗期、攪拌速度90rpm(EYELA, MULTI SHAKER, Tokyo)の条件で行い、95mLのR2S培地を300mL容の三角フラスコに入れて使用した。一週間ごとに定常期に達した細胞8mLを新しい培地95mLに移植して継代培養を行った。
シロイヌナズナ培養細胞(Arabidopsis thaliana T87)は理化学研究所ジーンバンク室植物開発銀行より分与していただいたものを使用した。培養は22℃で、18時間明期/6時間暗期、攪拌速度120rpm(SLK-3-FS, NK system, Osaka)の条件で行い、95mLの改変LS培地(Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. (1992). Tobacco BY-2 cell line as the HeLa cell in the cell biology of higher plants. Int. Rev. Cytol. 132, 1-30.)を300mL容の三角フラスコに入れ使用した。一週間ごとに定常期に達した細胞4mLを新しい培地95mLに移植し継代培養を行った。また、一過性発現実験を行う際は、一週間ごとに定常期に達した細胞8mlを新しい培地95mlに移植し継代培養を行った。
ライムギ (Secale cereal)の種子を、キムワイプを敷き詰めた9cmシャーレに播種後、人工気象器LH-241/411RF(PID)T-Sで(25℃、明期11時間、暗期13時間)生育させた。
3-1.mRNAの翻訳状態の評価法としてのポリソーム/CAGE解析
一般的にmRNAの翻訳状態は、mRNAに多数のリボソームが結合していれば翻訳が活発に行われており(ポリソーム)、リボソームが結合していなければ翻訳が行われていない(ノンポリソーム)というように、mRNAに結合するリボソームの数を指標として判断されている(Bailey-Serres, J., Sorenson, R., Juntawong, O. (2009). Getting the message across: cytoplasmic ribonucleoprotein complex. Trends Plant Sci. 14:443-453)。このような手法はポリソーム解析と呼ばれており、DNAマイクロアレイ解析と組み合わせることでmRNAの翻訳状態をゲノムスケールで評価することができる。
本発明では、ポリソーム/CAGE解析を行うことにより、それぞれの遺伝子の各TSSから転写されたmRNAでのポリソームの形成度合(PR値)を評価した。その概念図を図2に示す。図2に示すように、まず、ポリソーム解析でPolysomal RNA画分(つまりリボソームが2個以上結合しているPolysomeのmRNA)とTotal RNA(つまりNonpolysome及びPolysomeを含む全てのmRNA)とについてCAGE解析した。CAGE解析で得られたTotal RNA画分及びPolysomal RNA画分のデータのTag数が両画分で等しくなるように、Polysomal RNA画分のTag数を補正した。転写開始点(TSS)ごとのTag数(mRNA量)を比較して、Total RNA画分中に占める、Polysomal RNA画分のTag数の割合であるPolysome Ratio値(PR値)を算出した。図2の例では、PR値が高い順から[1]、[2]となる。
培養3日目の細胞(通常条件、30℃、90rpm)とウォーターバスで熱処理した細胞(熱条件、41℃、15min、90rpm)とをそれぞれ回収し、液体窒素で急冷した。急冷したサンプルは乳鉢を用いて破砕し、2ml容チューブに300mgずつ分注した。ショ糖密度勾配遠心を利用したポリソーム分画は、若干の改変を加えた以外は基本的にDaviesらの方法に従って行った(Davies E, Abe S. Chapter 15 Methods for Isolation and Analysis of Polyribosomes. Methods in Cell Biology, Volume 50, 1995, Pages 209-222)。サンプル破砕粉末におおよそ4倍量(w/v)の Extraction Buffer(200 mM Tris-HCl, pH8.5, 50 mM KCl, 25 mM MgCl2, 2 mM EGTA, 100 μg/ml heparin, 100 μg/ml cycloheximide, 2% polyoxyethylene 10-tridecyl ether, 1% sodium deoxycholate)を加え、緩やかに懸濁させた。遠心(14,000×g, 15 min, 4℃)により細胞残さを除き、さらに遠心(14,000×g, 10 min, 4℃)し、その上清をRNA粗抽出液とした。この粗抽出液をExtraction Buffer によりRNA濃度333ng/μlに調整し、予め作製した26.25~71.25%ショ糖密度勾配液(ショ糖, 200 mM Tris-HCl, 200 mM KCl, 200 mM MgCl2)4.85mL上に300μL重層し、超遠心を行った(SW55Ti rotor, 55,000 rpm, 50 min, 4℃, brake-off)(Optima, Beckman Coulter, California, USA)。ピストン・グラジェント・フラクショネーター(BioComp, Churchill Row, Canada)によってショ糖密度勾配の上部より約1mL/minの速さで吸引すると同時に、BIO-MINI UV MONITOR AC-5200 (ATTO, Tokyo, Japan)を用いて254nmの吸光度を記録した。
超遠心後のショ糖密度勾配溶液からポリソームを形成したmRNAが存在する画分約2mLと全画分約4mLとを終濃度5.5Mになるように8Mグアニジン塩酸塩を予め加えておいた遠心管にそれぞれ回収した。各遠心管へ混合液と等量の100%エタノールを加え、-20℃にて一晩冷却した後、遠心操作(40,000× rpm, 45 min, 4℃)を行った。得られたペレットを85%エタノールにて一度洗浄し(40,000× rpm, 30 min, 4℃)た後、RNeasy kit(Qiagen, Hilden, Germany)に含まれるbuffer RLT 1mLにてペレットを溶解し、以降は付属のプロトコールに従いRNeasy kitを用いてRNA精製を行い、Polysomal RNA画分とTotal RNA画分とを得た。
抽出したRNAをCap Analysis of Gene Expression(CAGE)ライブラリーの作製に供した。CAGEライブラリーの作製手法は、MurataらのnAnT-iCAGEライブラリーの作製手法に従った(Murata, M., Nishiyori-Sueki, H., Kojima-Ishiyama, M., Carninci, P., Hayashizaki, Y., Itoh, M.(2014). Detecting expressed genes using CAGE. Methods Mol. Biol. 1164: 67-85.)。概要は次の通りである。N15ランダムプライマーを用いて相補鎖cDNAを合成し、キャップ・トラッピング法によりcDNAの5’末端を選別した。ついで、RNase Iを用いてRNA鎖を除去して得られた一本鎖cDNAの5’末端と3’末端側とにリンカーを結合させ、CAGEライブラリーとした。Illumina(R)HiSeq 2500を用い、5’末端に結合させたリンカー内に存在するシークエンスプライマー認識部位を用いたシングルリードにて、付属のプロトコールに従ってシーケンスを行った。また、解析は各RNA試料について細胞の回収時点から独立した2反復のサンプル(つまり、計8サンプル)を用いて行った。
シークエンスによって得られたrawデータのそれぞれのTagからCAGEリンカー配列を除去した。その後、正確に読み取れていないことを示すNが配列中に存在するTag、混入したrRNA由来のTag、及び5’末端にCap由来のGが存在していないTagを除去し、Capを有するmRNAの5’末端由来と考えられるTagを抽出した。その後、Os-Nipponbare-Reference-IRGSP-1.0(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)の情報を基にマッピングを行った。この際に、複数個所にマッピングされたマッピングクオリティが低いTag、及び5’末端にミスマッチが存在し末端位置がずれている可能性があるTagは除去した。Tagがマッピングされたゲノム上の位置を取得し、それぞれの位置におけるTag数をカウントした。なお、独立して行った2つのサンプル間で、共にTagが存在し、再現性が確認できているゲノム上の位置についてのみTag数をカウントし、Tag per million(TPM)値に変換した。その後、Os-Nipponbare-Reference-IRGSP-1.0に登録されているいずれかの遺伝子の5’末端の上流500ntからCDS(Coding DNA Sequence)のAUGまでの間に存在し、ストランド方向が一致しているTagを、その遺伝子の転写開始点(TSS: Transcription Start Site)を示すものとしてアノテーションした。遺伝子が存在しない領域またはCDS領域にマッピングされ、遺伝子のアノテーションができなかったTagは除去した。最終的に得られたTagの位置におけるTPM値をそのTSS由来のmRNA量を示すTPM_TSS値とした。続いて、Polysomal RNA画分のTPM_TSS値をTotal RNA画分の値で割ることによって、各TSSから転写されたmRNAがポリソームを形成している比率をPR_TSS値として算出した。
イネでのポリソーム/CAGE解析によって、非常に大規模な各TSSレベルの翻訳状態(PR_TSS値)とTSSから推測される5’UTRの配列情報を取得した。これらのデータセットを用いて、ランキングを作成し、翻訳状態の良いmRNAの5’UTRを候補として選抜した。ランキングには、様々な条件下でも活発な翻訳が行われている5’UTRの候補を取得するために通常条件と熱条件とでのPR_TSS値をZ-Score化してから平均した値(Mean of Normarized PR値)を使用した。Z-Score化は補正法の一つであり、今回のように分布が大きく異なるデータセット間での重要性の偏りを減らして平均する場合には有用な手法である。また、ランキングを作成する際には、uAUG及びイントロンを有する5’UTR配列は翻訳エンハンサーとして用いた場合に、対象となる遺伝子を正しく翻訳できない可能性があるために除外した。また、ポリソーム解析は手法上、CDS長が長いほど翻訳途中のリボソームが存在する確率が上がるため、PR値が高くなる傾向がある。そのため、長いCDSを有する場合は、高いPR_TSS値が5’UTRに起因するのかCDSの長さに起因するのかが区別できない。よってCDS長が中央値(864nt)以上の場合は除去した。
一過性発現実験に用いる基本ベクターとして、CaMV35Sプロモーター支配下にOryza sativa Indica Group(long-grained rice)のOsADH 5’UTR、Firefly luciferase遺伝子(F-luc)、ターミネーター(Heat Shock Protein18.2遺伝子由来)で構成される発現ベクター(pBluescript)を使用した。このベクター内に存在する制限酵素サイトAatII及びClaIを制限酵素処理し、ベクターDNAを線状化した。次に、候補5’UTRを遺伝子特異的に増幅させるために、Os-Nipponbare-Reference-IRGSP-1.0(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)の情報を基にプライマーを設計した。設計したプライマーには、基本ベクター内の制限酵素サイトであるAatII及びClaIを付加した。イネゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、目的断片を増幅した。候補5’UTRの15種類のDNA断片と線状化した基本ベクターをIn-Fusionクローニング(TaKaRa)のプロトコールに従って連結した(図3)。導入効率を補正するためのR-luc遺伝子については、35Sプロモーター、R-luc遺伝子、HSPターミネーターよりなる発現カセットを持つpBluescriptII KS+を用いた。
OsADH 5’UTRの翻訳能力を超える相対活性値を示したRank8、Rank12、Rank13及びRank14の5’UTRを組み込んだ発現ベクターを、双子葉植物であるシロイヌナズナのプロトプラストに導入し、一過的にレポーターであるF-lucを発現させることで相対活性値(F-luc活性値/R-luc活性値)を測定した。また、比較対象として、双子葉植物で翻訳能力の高いAtCOR47 5’UTR又はAtADH 5’UTRを連結させたベクターを使用し、同様にR-luc活性値及びF-luc活性値から相対活性値(F-luc活性値/R-luc活性値)を算出した。算出されたそれぞれの相対活性値(Relative F/R activity)を、OsADH 5’UTRの相対活性値を1とした場合の相対値(候補5’UTR相対活性値/OsADH 5’UTRの相対活性値)として算出した。
実際に導入遺伝子発現を行う際には、目的遺伝子が多様であることを考慮し、遺伝子領域の置換による5’UTRの高い翻訳能力への影響の有無を検証した。まず、レポーター遺伝子をF-lucからR-lucに置換したベクターを構築した。このベクターに、OsADH、Rank12、及びRank13の各5’UTRを連結した(図7)。OsADH 5’UTRは比較対象として用いた。これらのR-luc発現ベクターをイネ培養細胞(Oc細胞)のプロトプラストに導入し、一過的にレポーターであるR-lucを発現させた。また、プロトプラストへの導入効率の補正のため、OsADH 5’UTRを挿入したF-luc発現ベクターも共導入し、F-luc活性値に対するR-luc活性値(R-luc活性値/F-luc活性値)を算出した。算出されたそれぞれの相対活性値(Relative R/F activity)を、OsADH 5’UTRの相対活性値を1とした場合の相対値(候補5’UTR相対活性値/OsADH 5’UTRの相対活性値)として算出した。
実際の有用物質生産はイネ以外の宿主で行われることを考慮し、同じ単子葉植物イネ科のライムギ由来のプロトプラストを用いた一過性発現実験を行うことで、翻訳能力の高い5’UTRが植物種を超えて汎用できることの検証を行った。OsADHの5’UTRの翻訳能力を超える相対活性値を示すRank8、Rank12、Rank13、及びRank14をライムギプロトプラストに導入し、一過的にレポーター遺伝子であるF-lucを発現させた。また、プロトプラストへの導入効率の補正のため、OsADH 5’UTRを挿入したR-luc発現ベクターも共導入し、R-luc活性値に対するF-luc活性値(F-luc活性値/R-luc活性値)を算出した。算出されたそれぞれの相対活性値(Relative F/R activity)を、OsADH 5’UTRの相対活性値を1とした場合の相対値(候補5’UTR相対活性値/OsADH 5’UTRの相対活性値)として算出した。
Claims (6)
- 以下の(i)~(iii)のいずれかに示すポリヌクレオチドからなることを特徴とする、5'UTRをコードするDNA分子:
(i)配列番号1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(ii)配列番号1に示す塩基配列において、1又は数個の塩基が置換、欠失若しくは付加された塩基配列からなり、且つ配列番号1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと同等の5'UTR活性を示すポリヌクレオチド、
(iii)配列番号1に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNA断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと同等の5'UTR活性を示すポリヌクレオチド。 - 請求項1に記載のDNA分子が、外来タンパク質をコードするポリヌクレオチドの5'末端側に連結されている、核酸構築物。
- 請求項2の記載の核酸構築物を含む、ベクター。
- 請求項3に記載のベクターを単子葉植物又は単子葉植物細胞に導入する、形質転換体の製造方法。
- 請求項3に記載のベクターで、単子葉植物又は単子葉植物細胞が形質転換されてなる、形質転換体。
- 請求項5に記載の形質転換体を培養又は栽培する、組み換えタンパク質の製造方法。
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