CN106688889A - 提高罗汉果中葫芦二烯醇含量的方法 - Google Patents

提高罗汉果中葫芦二烯醇含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高罗汉果中葫芦二烯醇含量的方法，罗汉果组培过程和/或栽培过程中施加茉莉酸甲酯。本发明能够有效提高罗汉果葫芦二烯醇的产量，具有见效快、成本低、操作简单、方便实施、产品无毒无残留等优点，以满足罗汉果葫芦二烯醇的大规模生产，具有较强的实用性和推广价值。

Description

提高罗汉果中葫芦二烯醇含量的方法
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种提高罗汉果中葫芦二烯醇含量的方法。
背景技术
罗汉果(Siraitia grosvenorii)为中国特有的珍贵药用和甜料植物。其果实性凉、味甘，具有清热润肺，利咽开音，滑肠通便和抗癌等功效，活性成分甜苷V为世界上最强的非糖甜味物质之一，是蔗糖甜度的300～400倍，广泛应用于食品、保健品和药品中，是糖尿病人、肥胖者和高血压患者的理想糖替代品。研究发现，葫芦二烯醇是甜苷V生物合成的中间产物，在罗汉果果实发育后期，葫芦二烯醇被完全消耗殆尽转化成甜苷V，然而，葫芦二烯醇只存在占果重不足15％的果肉内，且含量极低，严重制约了罗汉果产业的健康发展。
茉莉酸甲酯广泛地存在于植物体中，外源应用能够激发防御植物基因的表达，诱导植物的化学防御，产生与机械损伤和昆虫取食相似的效果。现有技术中未见有茉莉酸甲酯提高罗汉果葫芦二烯醇含量的报道。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种提高罗汉果中葫芦二烯醇含量的方法，其能够有效提高罗汉果葫芦二烯醇的产量，具有见效快、成本低、操作简单、方便实施、产品无毒无残留等优点，以满足罗汉果葫芦二烯醇的大规模生产，具有较强的实用性和推广价值。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种提高罗汉果中葫芦二烯醇含量的方法，在罗汉果组培过程和/或栽培过程中施加茉莉酸甲酯。
优选的是，所述的提高罗汉果中葫芦二烯醇含量的方法，组培过程中，将罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的MS固体培养基中，置于相对湿度60～66％、光照强度1300～1500Lux、光照时间8h/d、温度21～25℃条件下培养28～31d，其中，茉莉酸甲酯的添加量为50～400μmol/L。
优选的是，所述的提高罗汉果中葫芦二烯醇含量的方法，栽培过程中，将茉莉酸甲酯配成浓度为50～400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，罗汉果授粉20～30d后，每天喷洒茉莉酸甲酯溶液于罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施8～12d。
优选的是，所述的提高罗汉果中葫芦二烯醇含量的方法，包括：
步骤一、将罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的MS固体培养基中，置于相对湿度60～66％、光照强度1300～1500Lux、光照时间8h/d、温度21～25℃条件下培养28～31d，其中，茉莉酸甲酯的添加量为50～400μmol/L；
步骤二、将步骤一培养后的组培苗移栽至田间，罗汉果授粉20～30d后，每天喷洒浓度为50～400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液于罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施8～12d。
优选的是，所述的提高罗汉果中葫芦二烯醇含量的方法，用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为50mmol/L茉莉酸甲酯的乙醇母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到MS固体培养基中，至茉莉酸甲酯浓度为50～400μmol/L，灭菌并冷却至24～26℃，其中，MS固体培养基包括：MS、1.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、以及1.0g/L活性炭。
优选的是，所述的提高罗汉果中葫芦二烯醇含量的方法，用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为50～400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液。
优选的是，所述的提高罗汉果中葫芦二烯醇含量的方法，MS固体培养基还包括调节剂，调节剂的添加量为5μmol/L，调节剂包括质量比为2:1:0.1的竹醋液、石菖蒲水提物、茶皂素。
优选的是，所述的提高罗汉果中葫芦二烯醇含量的方法，组培过程包括两阶段，第一阶段培养15d，每隔3～5d更换一次MS固体培养基，被更换的MS固体培养基加热至熔化为液态混合物，将海绵浸泡在液态混合物中充分吸收，然后覆盖在更换的MS固体培养基上方，直至下次更换培养基时移除并更换；第二阶段培养15d，每隔5～7d更换一次MS固体培养基，每次更换后的第2d对接种有组培苗的MS固体培养基进行雾化处理，雾化剂为质量分数为1％的酪蛋白溶液。
优选的是，所述的提高罗汉果中葫芦二烯醇含量的方法，茉莉酸甲酯溶液中添加有促进剂，促进剂的添加量为5μmol/L，促进剂包括质量比为1:1:5的芹菜素、复合维生素B以及皂角米蛋白，皂角米蛋白的制备方法为：将皂角米溶解于碱液中，震荡、离心、分离，上清液即得皂角米蛋白。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、本发明通过在组培和/或栽培过程施加茉莉酸甲酯，能够诱导罗汉果葫芦二烯醇代谢关键酶(如葫芦二烯醇合酶等)基因的高表达，从而在短期内快速提高罗汉果葫芦二烯醇的含量；组培过程或栽培过程优选茉莉酸甲酯的施加浓度和施用时间，将组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的MS固体培养基中，或将茉莉酸甲酯溶液喷洒于授粉20～30d后的罗汉果表面，促进苗木中葫芦二烯醇的积累，可以最大限度地提高药用植物活性成分的含量；
第二、本发明通过在MS固体培养基中加入由竹醋液、石菖蒲水提物、茶皂素复配的调节剂，辅助促进对葫芦二烯醇合酶防御蛋白的活性水平，实现次生物质的积累，石菖蒲水提物还具有抗真菌作用，茶皂素提高调节剂在罗汉果组培苗的附着力，竹醋液促进罗汉果组培苗生长，浓度配比避免茶皂素沉淀；
第三、两阶段分别不同时间间隔更换培养基，补充罗汉果生长不同阶段因消耗而所需的营养物质，第一阶段浸泡海绵避免使用过的培养基营养物质浪费，同时覆盖在上方具有保水作用、营养物质下沉吸收，第二阶段利用酪蛋白溶液雾化处理，避免组培苗叶片表面营养物质的流失，促进根部对培养基中茉莉酸甲酯的吸收；
第四、栽培阶段喷洒由芹菜素、复合维生素B以及皂角米蛋白复配的促进剂，促进对茉莉酸甲酯的吸收，芹菜素抑制生物酶的渗出，复合维生素B促进氨基酸的代谢，皂角米蛋白含有丰富必需氨基酸优于小麦、玉米蛋白，还具有一定驱虫作用。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
<实施例1>
步骤一、用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为200mmol/L茉莉酸甲酯的乙醇母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到MS固体培养基中，至茉莉酸甲酯的添加量为200μmol/L，灭菌并冷却至24～26℃，其中，MS固体培养基包括：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、以及1.0g/L活性炭；
步骤二、将罗汉果组培苗接种在步骤一得到的含有茉莉酸甲酯的MS固体培养基中，置于相对湿度60～66％、光照强度1300～1500Lux、光照时间8h/d、温度21～25℃条件下培养30d，然后将组培苗移栽至田间进行常规田间培养。
<实施例2>
用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为200μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，罗汉果授粉25d后，每天喷洒茉莉酸甲酯溶液于罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施10d。
<实施例3>
步骤一、用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为50mmol/L茉莉酸甲酯的乙醇母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到MS固体培养基中，至茉莉酸甲酯的添加量为50μmol/L，灭菌并冷却至24～26℃，其中，MS固体培养基包括：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、以及1.0g/L活性炭；
步骤二、将罗汉果组培苗接种在步骤一得到的含有茉莉酸甲酯的MS固体培养基中，置于相对湿度60～66％、光照强度1300～1500Lux、光照时间8h/d、温度21～25℃条件下培养28d；
步骤三、用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为50μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，将步骤一培养后的组培苗移栽至田间，罗汉果授粉20d后，每天喷洒浓度为50μmol/L的茉莉酸甲酯溶液于罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施8d。
<实施例4>
步骤一、用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为400mmol/L茉莉酸甲酯的乙醇母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到MS固体培养基中，至茉莉酸甲酯的添加量为400μmol/L，灭菌并冷却至24～26℃，其中，MS固体培养基包括：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、以及1.0g/L活性炭；
步骤二、将罗汉果组培苗接种在步骤一得到的含有茉莉酸甲酯的MS固体培养基中，置于相对湿度60～66％、光照强度1300～1500Lux、光照时间8h/d、温度21～25℃条件下培养31d；
步骤三、用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，将步骤一培养后的组培苗移栽至田间，罗汉果授粉30d后，每天喷洒浓度为400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液于罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施12d。
<实施例5>
步骤一、用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为200mmol/L茉莉酸甲酯的乙醇母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到MS固体培养基中，至茉莉酸甲酯的添加量为200μmol/L，灭菌并冷却至24～26℃，其中，MS固体培养基包括：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、以及1.0g/L活性炭；
步骤二、将罗汉果组培苗接种在步骤一得到的含有茉莉酸甲酯的MS固体培养基中，置于相对湿度60～66％、光照强度1300～1500Lux、光照时间8h/d、温度21～25℃条件下培养30d；
步骤三、用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为200μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，将步骤一培养后的组培苗移栽至田间，罗汉果授粉25d后，每天喷洒浓度为200μmol/L的茉莉酸甲酯溶液于罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施10d。
<实施例6>
步骤一、用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为200mmol/L茉莉酸甲酯的乙醇母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到MS固体培养基中，将调节剂加入MS固体培养基，调节剂的添加量为5μmol/L，茉莉酸甲酯的添加量为200μmol/L，灭菌并冷却至24～26℃，调节剂包括质量比为2:1:0.1的竹醋液、石菖蒲水提物、茶皂素，MS固体培养基包括：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、以及1.0g/L活性炭；
步骤二、将罗汉果组培苗接种在步骤一得到的含有茉莉酸甲酯的MS固体培养基中，置于相对湿度60～66％、光照强度1300～1500Lux、光照时间8h/d、温度21～25℃条件下培养30d；组培过程包括两阶段，第一阶段培养15d，每隔3d更换一次MS固体培养基，被更换的MS固体培养基加热至熔化为液态混合物，将海绵浸泡在液态混合物中充分吸收，然后覆盖在更换的MS固体培养基上方，直至下次更换培养基时移除并更换；第二阶段培养15d，每隔5d更换一次MS固体培养基，每次更换后的第2d对接种有组培苗的MS固体培养基进行雾化处理，雾化剂为质量分数为1％的酪蛋白溶液；
步骤三、用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为200μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，将步骤一培养后的组培苗移栽至田间，罗汉果授粉25d后，每天喷洒浓度为200μmol/L的茉莉酸甲酯溶液于罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施10d；其中，茉莉酸甲酯溶液中添加有促进剂，促进剂的添加量为5μmol/L，促进剂包括质量比为1:1:5的芹菜素、复合维生素B以及皂角米蛋白，皂角米蛋白的制备方法为：将皂角米溶解于碱液中，震荡、离心、分离，上清液即得皂角米蛋白。
<对比例1>
将罗汉果种子浸泡在浓度为200μmol/L的茉莉酸甲酯溶液中进行浸种处理，然后进行常规组织培养得到组培苗，最后将组培苗移栽至田间进行常规田间培养。
<对比例2>
将罗汉果外植体浸泡在浓度为200μmol/L的茉莉酸甲酯溶液中进行预处理，然后进行常规组织培养得到组培苗，最后将组培苗移栽至田间进行常规田间培养。
<对比例3>
将罗汉果组培苗接种在MS固体培养基中，置于相对湿度60～66％、光照强度1300～1500Lux、光照时间8h/d、温度21～25℃条件下培养30d；其中，MS固体培养基包括：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、以及1.0g/L活性炭；然后将组培苗移栽至田间进行常规田间培养。
<罗汉果品质试验>
对实施例2、5、6连续喷施茉莉酸甲酯溶液后的次日采样，对实施例1、对比例1～3果实发育中期授粉30d后采样，统计立枯病发病率以及罗汉果苗成活率，同时采用GC-MS法进行罗汉果葫芦二烯醇含量检测。
供试品溶液的制备：取0.5g罗汉果果肉粉末，置于50mL磨口锥形瓶中，精密加入20mL甲醇(6％氢氧化钾w/v)溶液，在室温下放置10min,超声提取1h后过滤，向溶液中加入20mL去离子水,将混合物倒入分液漏斗中，加入等体积的正己烷萃取3次，合并正己烷层,加入适量无水Na2SO4脱水，过滤，40℃减压回收正己烷，残留物溶解在1mL甲醇中，用容量瓶定容，过0.45μm滤膜。
对照品的配置：精密称取40mg葫芦二烯醇标准品于100mL棕色容量瓶中，用正己烷定容至刻度，摇匀，得到400μg/mL葫芦二烯醇母液。再从上述溶液中取2mL至10mL棕色容量瓶中，同时加入5mL葫芦二烯醇母液，加入正己烷定容至刻度，摇匀，制成1mL混标溶液中葫芦二烯醇200μg的对照品溶液。
气相色谱条件：TR-5MS柱(30m×0.32mm×0.25μm)；程序升温：初温160℃，保持1min后，以20℃/min升温至300℃，保持10min；载气为氦气，流速为0.7mL/min，分流比为50:1；进样口温度为250℃。
质谱条件：离子化模式为EI，传输线温度为250℃，离子源温度为250℃，电离电压为70eV，选用选择离子扫描(SIM)：426、410、408、393、341、367、274、95、69；溶剂延迟时间为7min。
各色谱峰对应的质谱图通过与标准谱图对照进行定性，用外标一点法进行定量计算，数据如下表所示。
由上表可知，对比例1～2相较于对比例3，葫芦二烯醇的含量没有明显升高，说明浸种、外植体浸泡在茉莉酸甲酯溶液没有明显提升罗汉果葫芦二烯醇的含量，实施例1、2的含量相较于对比例3，葫芦二烯醇的含量有明显升高，说明组培或栽培期间通过茉莉酸甲酯诱导植株生长，能够明显提升葫芦二烯醇的含量，实施例5、6的含量相较于对比例3，葫芦二烯醇的含量有显著升高，说明在组培、栽培期间均通过茉莉酸甲酯诱导植株生长，能够显著提升葫芦二烯醇的含量。此外，实施例1、2、5、6、对比例1、2的立枯病发病率均显著低于对比例3，茉莉酸甲酯还可以显著降低罗汉果的立枯病患病率，实施例1、2、5、6的罗汉果苗成活率均高于对比例1～3，说明组培和/或栽培期间通过茉莉酸甲酯诱导植株生长能提高罗汉果苗成活率。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

Claims (9)

1.一种提高罗汉果中葫芦二烯醇含量的方法，其特征在于，在罗汉果组培过程和/或栽培过程中施加茉莉酸甲酯。
2.如权利要求1所述的提高罗汉果中葫芦二烯醇含量的方法，其特征在于，组培过程中，将罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的MS固体培养基中，置于相对湿度60～66％、光照强度1300～1500Lux、光照时间8h/d、温度21～25℃条件下培养28～31d，其中，茉莉酸甲酯的添加量为50～400μmol/L。
3.如权利要求1所述的提高罗汉果中葫芦二烯醇含量的方法，其特征在于，栽培过程中，将茉莉酸甲酯配成浓度为50～400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，罗汉果授粉20～30d后，每天喷洒茉莉酸甲酯溶液于罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施8～12d。
4.如权利要求1所述的提高罗汉果中葫芦二烯醇含量的方法，其特征在于，包括：
步骤一、将罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的MS固体培养基中，置于相对湿度60～66％、光照强度1300～1500Lux、光照时间8h/d、温度21～25℃条件下培养28～31d，其中，茉莉酸甲酯的添加量为50～400μmol/L；
步骤二、将步骤一培养后的组培苗移栽至田间，罗汉果授粉20～30d后，每天喷洒浓度为50～400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液于罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施8～12d。
5.如权利要求2或4所述的提高罗汉果中葫芦二烯醇含量的方法，其特征在于，用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为50mmol/L茉莉酸甲酯的乙醇母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到MS固体培养基中，至茉莉酸甲酯浓度为50～400μmol/L，灭菌并冷却至24～26℃，其中，MS固体培养基包括：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、以及1.0g/L活性炭。
6.如权利要求3或4所述的提高罗汉果中葫芦二烯醇含量的方法，其特征在于，用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为50～400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液。
7.如权利要求5所述的提高罗汉果中葫芦二烯醇含量的方法，其特征在于，MS固体培养基还包括调节剂，调节剂的添加量为5μmol/L，调节剂包括质量比为2:1:0.1的竹醋液、石菖蒲水提物、茶皂素。
8.如权利要求7所述的提高罗汉果中葫芦二烯醇含量的方法，其特征在于，组培过程包括两阶段，第一阶段培养15d，每隔3～5d更换一次MS固体培养基，被更换的MS固体培养基加热至熔化为液态混合物，将海绵浸泡在液态混合物中充分吸收，然后覆盖在更换的MS固体培养基上方，直至下次更换培养基时移除并更换；第二阶段培养15d，每隔5～7d更换一次MS固体培养基，每次更换后的第2d对接种有组培苗的MS固体培养基进行雾化处理，雾化剂为质量分数为1％的酪蛋白溶液。
9.如权利要求6所述的提高罗汉果中葫芦二烯醇含量的方法，其特征在于，茉莉酸甲酯溶液中添加有促进剂，促进剂的添加量为5μmol/L，促进剂包括质量比为1:1:5的芹菜素、复合维生素B以及皂角米蛋白，皂角米蛋白的制备方法为：将皂角米溶解于碱液中，震荡、离心、分离，上清液即得皂角米蛋白。
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