CN107295971A - 促进罗汉果cyp4基因表达的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种促进罗汉果CYP4基因表达的方法，包括：在诱导培养基中对优质罗汉果的愈伤组织进行组织培养，获得罗汉果组培苗以及植株开花后对花粉进行特殊处理得到花粉液，其中过程中均添加2,4‑表油菜素内酯。本发明可以促进促进罗汉果CYP4基因表达，从而具有促进罗汉果甜苷V含量的积累的作用。

Description

促进罗汉果CYP4基因表达的方法
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种促进罗汉果CYP4基因表达的方法。
背景技术
罗汉果是我国特有珍贵药用和甜料植物，为葫芦科(Cucurbitaceae)罗汉果属(Siraitia)多年生藤本植物，具有止咳祛痰、凉血舒胃、润肠通便等作用。其主要成分甜苷V是世界上最强的非糖甜味物质之一，为蔗糖甜度的300-400倍，是一种低热量、纯天然的甜味剂及理想的保健品，此外还有抗氧化、免疫调节、抗癌、降血糖等作用。
甜苷V目前还不能化学合成，主要依靠提取获得。罗汉果对生境要求苛刻，只适宜在广西生长，且栽培中不能连作，果实中甜苷V含量低，无法满足市场需求，因此亟待探索提高甜苷V含量的新途径、新方法。
罗汉果甜苷V属于葫芦烷型四环三萜类物质，本课题组前期根据罗汉果转录组数据，已推导出甜苷V可能的生物合成途径。罗汉果甜苷V生物合成的前体物质是异戊烯二磷酸(IPP)和3,3-二甲基烯内基焦磷酸(DMAPP)，二者是通过甲羟戊酸(MVA)和甲基赤藓糖醇磷酸化(MEP)两条途径形成，MVA途径发生在胞质中，MEP途径发生在质体中。来源于上述两途径的IPP或DMAPP经牻牛儿基焦磷酸合酶(GPS)催化形成牻牛儿基焦磷酸(GPP)，IPP与GPP在法呢基焦磷酸合酶(FPS)的催化作用下进而形成法呢基焦磷酸(FPP)，然后经角鲨烯合酶(SS)、角鲨烯环氧化酶(SE)的催化形成2,3-氧化角鲨烯，葫芦二烯醇合酶(CS)进一步催化形成葫芦二烯醇，最后在CYP450酶和葡萄糖基转移酶的作用下，形成罗汉果甜苷V。
异戊二烯类物质的产生受到限速酶活性的严格调控，一直被认为在其生物合成途径中起着重要的调控作用。作为异戊二烯途径中的限速酶，CYP450酶基因的表达对罗汉果甜苷V的生物合成起着决定性作用。过表达CYP450酶基因，可以促进罗汉果甜苷V的积累；相反，如果抑制CYP450酶基因的表达，罗汉果甜苷V的产量将显著降低。然而，CYP450酶基因是个超基因家族，本课题组前期研究发现，CYP4与罗汉果甜苷V的合成途径有一定关联。现有技术中未见有促进罗汉果CYP4基因表达来提高罗汉果中甜苷V含量的报道。
发明内容
作为各种广泛且细致的研究和实验的结果，本发明的发明人已经发现，在罗汉果种植的育苗阶段和坐果阶段，喷洒含有2,4-表油菜素内酯的溶液可以刺激并诱导罗汉果中CYP4基因的表达，从而促进CYP450酶基因表达，促进罗汉果甜苷V的生物合成和累积。基于这种发现，完成了本发明。
本发明的一个目的是解决至少上述问题和缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种通过2,4-表油菜素内酯对罗汉果组培、育苗、果实发育进行干涉处理来促进CYP4基因表达基因表达的方法，可以有效促进罗汉果中甜苷V含量积累。
本发明还有一个目的是通过组织培养和人工授粉来促进优良植株的选育和规模化种植，进一步促进罗汉果甜苷V的产量。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种促进罗汉果CYP4基因表达的方法，包括：在诱导培养基中对罗汉果的愈伤组织进行组织培养，获得罗汉果组培苗，所述诱导培养基中2,4-表油菜素内酯浓度为50～400μmol/L；
雄株开花后对花粉进行特殊处理得到花粉液，用电动喷雾器将所述花粉液喷洒在开花的雌株进行人工授粉，其中花粉液中2,4-表油菜素内酯的浓度为50～100μmol/L。
优选的是，其中，所述诱导培养基中还包括基础培养基，其配方为MS+0.5mg/L BA+0.1mg/L IBA+3.5g/L琼脂+30g/l蔗糖+1.0g/L活性炭+10μmol/L铁盐。
优选的是，其中，所述诱导培养基制备方法如下：将2,4-表油菜素内酯用2％的乙醇水溶液(v/v)溶解，配制成10000μmol/L的母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的2,4-表油菜素内酯母液添加到配置好的仍是液态的基础培养基中使得2,4-表油菜素内酯达到所需的浓度，分装于100mL组培瓶中，每瓶30mL，待培养基冷却凝固后，盖上组培盖，或盖上封口膜并用棉线扎牢备用。
优选的是，其中，所述组织培养的条件为：25℃恒温，相对湿度70％～80％，采用人工光照，每天12小时光照，12小时黑暗培养，其中光照强度1000～1500lux。
优选的是，其中，所述愈伤组织是由优质罗汉果幼叶经过常规培育而来，其培育方法是将所述优质罗汉果幼叶切成直径约1cm的叶圆片，用蒸馏水冲洗干净，再用75％的酒精浸30秒取出，随后用HgCl2水溶液浸泡消毒3分钟，用无菌水冲洗3～5次后接种在培养基中，愈伤组织继代增殖数次后，取生长旺盛、生活力强的愈伤组织，切成直径lcm的小块；其中所述培养基的配方为MS+1mg/L玉米素+0.1mg/L IBA+3.5g/L琼脂+30g/l蔗糖+1.0g/L活性炭，所述培育方法的条件为：控制温度25～28℃，相对湿度80％～90％，黑暗培养。
优选的是，其中，所述花粉为当日刚开放的雄花的花粉，获得方法为：采摘所述雄花，将蕊柱连同花粉剪下收集后，倒入100目的细铁丝筛中，用手轻轻揉搓，将花粉从蕊柱上脱离。
优选的是，其中，所述特殊处理的具体包括：将收集的花粉进行干燥；采用吸湿干燥法，将硅胶置于花粉下方，封闭干燥机进行干燥24h；在花开的前一天晚上将干燥后，的花粉摊放在白纸的光面上，置于湿度为60～80％的加湿室内12-20个小时进行吸湿活化处理；吸湿活化处理后的花粉按照2重量份花粉和8重量份喷雾液的比例混合，并用频率为3KHz的超声波振荡器中10分钟确保混合均一稳定，得到花粉液；其中所述喷雾液的配方为0.1～0.3g/L硼酸、0.2％氨基酸水肥、0.15g/L葡甘露聚糖、0.02～0.06mg/L 2,4–D、50～100μmol/L的2,4-表油菜素内酯，以磁化水为溶剂。
优选的是，其中，还包括在进行人工授粉后20天，每天早、中、晚于罗汉果表面喷洒诱导液至表面滴水，连续喷洒7天，所述诱导液中含有浓度为50～400μmol/L的2,4-表油菜素内酯。
优选的是，其中，所述人工授粉具体包括：将所述花粉液倒入电动喷雾器中，调节为最小喷雾量，对准开放的雌花柱头进行喷洒，喷洒量根据每株雌花植株开花的情况进行调节，2～5L喷雾液/株。
优选的是，其中，所述诱导培养基中还包括有0.02mg/L独角金内酯。
本发明至少包括以下有益效果：
由于在组培苗培育过程中加入了2,4-表油菜素内酯的溶液，长期内以刺激并诱导罗汉果中CYP4基因的表达，从而促进CYP450酶基因表达，促进罗汉果甜苷V的生物合成，提高其产量；
由于用于授粉的花粉液采用特殊处理，其中磁化水结合超声波的空化作用将花粉浸泡液中的2,4-表油菜素内酯充分包裹花粉，强烈诱导并调控授粉后的果实中基因CYP4高表达，，从而促进CYP450酶基因高表达，提高罗汉果甜苷V含量；
由于组织培养开始刺激罗汉果CYP4基因表达的方法，因此植株对于该成分敏感，在授粉挂果后喷洒2,4-表油菜素内酯的溶液，对于促进基因表达的反馈更加敏感，可以增加罗汉果中甜苷V的累积；
由于培养基中增加独角金内酯，因此辅助2,4-表油菜素内酯对于CYP4基因表达的协同刺激，从而对罗汉果中甜苷V的累积有促进作用。
由于统一人工授粉，使得果实可以在后期诱导液喷洒时，同时接受刺激，有效的促进CYP4基因的集中表达，从而进一步提高罗汉果甜苷V的含量，并且有利于统一采摘管理等；
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
<实例1>
在诱导培养基中对优质罗汉果的愈伤组织进行组织培养，获得罗汉果组培苗，所述诱导培养基中2,4-表油菜素内酯浓度为50μmol/L；
其中，所述诱导培养基中还包括基础培养基，其配方为：MS+0.5mg/L BA+0.1mg/LIBA+3.5g/L琼脂+30g/l蔗糖+1.0g/L活性炭+10μmol/L铁盐。
其中，所述诱导培养的条件为：25℃恒温，相对湿度70％～80％，采用人工光照，每天12小时光照，12小时黑暗培养，其中光照强度1000～1500lux。
诱导培养基的配制方法如下：将2,4-表油菜素内酯用2％的乙醇水溶液(v/v)溶解，配制成10000μmol/L的母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的2,4-表油菜素内酯母液添加到配置好的仍是液态的基础培养基中使得2,4-表油菜素内酯达到所需的浓度，分装于100mL组培瓶中，每瓶30mL，待培养基冷却凝固后，盖上组培盖，或盖上封口膜并用棉线扎牢备用。
所述愈伤组织是由优质罗汉果幼叶经过常规培育而来，其培育方法是将所述优质罗汉果幼叶切成直径约1cm的叶圆片，用蒸馏水冲洗干净，再用75％的酒精浸30秒取出，随后用HgCl2水溶液消毒8分钟，用无菌水冲洗3～5次后接种在培养基中，愈伤组织继代增殖数次后，取生长旺盛、生活力强的愈伤组织，切成直径lcm的小块；所述培育方法的条件为：控制温度25～28℃，相对湿度80％～90％，黑暗培养。
<实例2>
在诱导培养基中对优质罗汉果的愈伤组织进行组织培养，获得罗汉果组培苗，所述诱导培养基中2,4-表油菜素内酯浓度为400μmol/L；
其中，所述诱导培养基中还包括基础培养基，其配方为：MS+0.5mg/L BA+0.1mg/LIBA+3.5g/L琼脂+30g/l蔗糖+1.0g/L活性炭+10μmol/L铁盐。
其中，所述诱导培养的条件为：25℃恒温，相对湿度70％～80％，采用人工光照，每天12小时光照，12小时黑暗培养，其中光照强度1000～1500lux。
诱导培养基的配制方法如下：将2,4-表油菜素内酯用2％的乙醇水溶液(v/v)溶解，配制成10000μmol/L的母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的2,4-表油菜素内酯母液添加到配置好的仍是液态的基础培养基中使得2,4-表油菜素内酯达到所需的浓度，分装于100mL组培瓶中，每瓶30mL，待培养基冷却凝固后，盖上组培盖，或盖上封口膜并用棉线扎牢备用。
所述愈伤组织是由优质罗汉果幼叶经过常规培育而来，其培育方法是将所述优质罗汉果幼叶切成直径约1cm的叶圆片，用蒸馏水冲洗干净，再用75％的酒精浸30秒取出，随后用HgCl2水溶液消毒8分钟，用无菌水冲洗3～5次后接种在培养基中，愈伤组织继代增殖数次后，取生长旺盛、生活力强的愈伤组织，切成直径lcm的小块；所述培育方法的条件为：控制温度25～28℃，相对湿度80％～90％，黑暗培养。
<实例3>
在诱导培养基中对优质罗汉果的愈伤组织进行组织培养，获得罗汉果组培苗，所述诱导培养基中2,4-表油菜素内酯浓度为200μmol/L；
其中，所述诱导培养基中还包括基础培养基，其配方为：MS+0.5mg/L BA+0.1mg/LIBA+3.5g/L琼脂+30g/l蔗糖+1.0g/L活性炭+10μmol/L铁盐。
其中，所述诱导培养的条件为：25℃恒温，相对湿度70％～80％，采用人工光照，每天12小时光照，12小时黑暗培养，光照强度1000～1500lux。
诱导培养基的配制方法如下：将2,4-表油菜素内酯用2％的乙醇水溶液(v/v)溶解，配制成10000μmol/L的母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的2,4-表油菜素内酯母液添加到配置好的仍是液态的基础培养基中使得2,4-表油菜素内酯达到所需的浓度，分装于100mL组培瓶中，每瓶30mL，待培养基冷却凝固后，盖上组培盖，或盖上封口膜并用棉线扎牢备用。
所述愈伤组织是由优质罗汉果幼叶经过常规培育而来，其培育方法是将所述优质罗汉果幼叶切成直径约1cm的叶圆片，用蒸馏水冲洗干净，再用75％的酒精浸30秒取出，随后用HgCl2水溶液消毒8分钟，用无菌水冲洗3～5次后接种在培养基中，愈伤组织继代增殖数次后，取生长旺盛、生活力强的愈伤组织，切成直径lcm的小块；所述培育方法的条件为：控制温度25～28℃，相对湿度80％～90％，黑暗培养。
<实例4>
在实施例3的基础上，待雄株开花后对花粉进行特殊处理得到花粉液，用电动喷雾器将所述花粉液喷洒在开花的雌花植株进行人工授粉，其中花粉液中2,4-表油菜素内酯的浓度为50μmol/L。
其中所述花粉为当日刚开放的雄花的花粉，获得方法为：采摘所述雄花，将蕊柱连同花粉剪下收集后，倒入100目的细铁丝筛中，用手轻轻揉搓，将花粉从蕊柱上脱离。
所述特殊处理的具体包括：将收集的花粉进行干燥；采用吸湿干燥法，将硅胶置于花粉下方，封闭干燥机进行干燥24h；在花开的前一天晚上将干燥后，的花粉摊放在白纸的光面上，置于湿度为60～80％的加湿室内12小时进行吸湿活化处理；吸湿活化处理后的花粉按照2重量份花粉和8重量份喷雾液的比例混合，并用频率为3KHz的超声波振荡器中10分钟确保混合均一稳定，得到花粉液；
其中所述喷雾液的配方为0.2g/L硼酸、0.2％氨基酸水肥、0.15g/L葡甘露聚糖、0.03mg/L 2,4–D、50μmol/L的2,4-表油菜素内酯，以磁化水为溶剂。
<实例5>
在实施例3的基础上，待雄株开花后对花粉进行特殊处理得到花粉液，用电动喷雾器将所述花粉液喷洒在开花的雌花植株进行人工授粉，其中花粉液中2,4-表油菜素内酯的浓度为100μmol/L。
其中所述花粉为当日刚开放的雄花的花粉，获得方法为：采摘所述雄花，将蕊柱连同花粉剪下收集后，倒入100目的细铁丝筛中，用手轻轻揉搓，将花粉从蕊柱上脱离。
所述特殊处理的具体包括：将收集的花粉进行干燥；采用吸湿干燥法，将硅胶置于花粉下方，封闭干燥机进行干燥24h；在花开的前一天晚上将干燥后，的花粉摊放在白纸的光面上，置于湿度为60～80％的加湿室内12小时进行吸湿活化处理；吸湿活化处理后的花粉按照2重量份花粉和8重量份喷雾液的比例混合，并用频率为3KHz的超声波振荡器中10分钟确保混合均一稳定，得到花粉液；
其中所述喷雾液的配方为0.2g/L硼酸、0.2％氨基酸水肥、0.15g/L葡甘露聚糖、0.03mg/L 2,4–D、100μmol/L的2,4-表油菜素内酯，以磁化水为溶剂。
<实例6>
在实施例4的基础上，将经诱导培养的罗汉果组培苗移栽后，待授粉后20天，每天早、中、晚于罗汉果表面喷洒诱导液至表面滴水，连续喷洒7天，所述诱导液中含有浓度为100μmol/L的2,4-表油菜素内酯。
<实例7>
在实施例4的基础上，将经诱导培养的罗汉果组培苗移栽后，待授粉后20天，每天早、中、晚于罗汉果表面喷洒诱导液至表面滴水，连续喷洒7天，所述诱导液中含有浓度为400μmol/L的2,4-表油菜素内酯。
<实例8>
在实施例3的基础上，所述诱导培养基中还包括有0.05mg/L独角金内酯。
测量方法：
1、CYP4基因表达量测定方法：利用ABI7500实时荧光定量PCR仪，采用qRT-PCR检测CYP4基因的表达。
步骤一：样品前处理：采集罗汉果果实，挑取果肉，切成2-4mm小块并分别用锡箔纸包好，立即置于液氮中速冻，保存于-80℃备用。
步骤二：先采用改良Trizol法提取罗汉果果实总RNA；
步骤三：将RNA反转录为cDNA的反应体系为RNA 10.0μL，PrimeScript RT EnzymeMix I 1.0μL，RT Primer Mix 1.0μL，5×PrimeScript Buffer 2 4.0μL，RNase Free dH2O4.0μL；反应条件为37℃(15min)→85℃(5s)→4℃；
步骤四：采用Primer Premier 5.0软件设计引物，其中，CYP4引物序列为：
FP：TTTGTACTGCTGTCTTTGCTTCA，
RP：GTTTGGAAGAGCATGGTTTTATT；
内参基因用UBQ5，
序列为FP：ATAAAAGACCCAGCACCACATTC，
RP：CCCTTGCCGACTACAACATCC；
步骤五：qRT-PCR反应体系(20μL)为SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×)10.0μL，PCR Forward Primer(10μM)0.8μL，PCR Reverse Primer(10μM)0.8μL，ROXReference Dye of Dye II(50×)0.4μL，Template 2.0μL，dH2O 6.0μL；反应条件为95℃(30s)，接着进行40个cycles[95℃(5s)，95℃(34s)]。
2、罗汉果甜苷V含量：采用高效液相色谱法，具体方法参考《广西中医学院学报》第2007年04期上发表的“HPLC测定罗汉果中罗汉果甜苷V的含量”一文。
采集罗汉果果实，烘干备用。将样品经70％甲醇溶液提取溶解，采用C18反相色谱柱分离，用乙腈-0.1％磷酸溶液(22∶78)为流动相进行洗脱，检测波长为203nm，流速为lmL/min，以色谱峰保留时间和紫外可见光谱进行定性，外标法进行定量。
为了说明本发明的效果，发明人提供比较实验如下：
<比较例1>
以实施例1-3的促进罗汉果CYP4基因表达的方法，将诱导培养基中2,4-表油菜素内酯的浓度依次设定为：0、50、100、150、200、250、300、400μmol/L，对比研究在获得组培苗时诱导培养基中2,4-表油菜素内酯的浓度对罗汉果CYP4基因表达量和甜苷V含量(质量百分数)的影响，结果见表1。
表1诱导培养基中2,4-表油菜素内酯浓度浓度对罗汉果CYP4基因表达量和甜苷V含量的影响
注：诱导培养基中不同2,4-表油菜素内酯浓度浓度处理的罗汉果果实CYP4基因表达量以未经2,4-表油菜素内酯浓度浓度处理方法得到的罗汉果果实CYP4基因表达量是1为参照；上述实验数据均为上述每一个实施方案得到的20棵罗汉果果树上任选其中5棵中得到的罗汉果果实进行平行试验得到的。
由表1可知，在诱导培养基中添加2,4-表油菜素内酯可以有效促进罗汉果果实CYP4基因的表达，且以150-200μmol/L时为最适宜浓度。
<比较例2>
以实施例4、5的促进罗汉果CYP4基因表达的方法，将喷雾液中2,4-表油菜素内酯的浓度依次设定为：0、20、50、70、90、100μmol/L，对比研究在获得组培苗时诱导培养基中2,4-表油菜素内酯的浓度对罗汉果CYP4基因表达量和甜苷V含量(质量百分数)的影响，结果见表1。
表2喷雾液中2,4-表油菜素内酯对罗汉果CYP4基因表达量和甜苷V含量的影响
2,4-表油菜素内酯浓度μmol/L 0 20 50 70 90 100
CYP4基因表达量 15.6 16.8 17.6 18.4 18.9 16.2
甜苷V含量/(w/w％) 1.74 1.84 1.92 2.05 2.13 1.81
注：诱导培养基中不同2,4-表油菜素内酯浓度浓度处理的罗汉果果实CYP4基因表达量以未经2,4-表油菜素内酯浓度浓度处理方法得到的罗汉果果实CYP4基因表达量是1为参照；上述实验数据均为上述每一个实施方案得到的20棵罗汉果果树上任选其中5棵中得到的罗汉果果实进行平行试验得到的。
由表2可知，在花粉喷雾液中添加2,4-表油菜素内酯可以有效促进罗汉果果实CYP4基因的表达，且以70～90μmol/L时为最适宜浓度。
实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8的促进罗汉果CYP4基因表达的方法，测定罗汉果CYP4基因表达量和甜苷V含量，结果见表3。空白组设定为：以未经2,4-表油菜素内酯浓度处理方法得到的罗汉果果实。
表3不同实施例对罗汉果CYP4基因表达量和甜苷V含量的影响
注：诱导培养基中不同2,4-表油菜素内酯浓度处理的罗汉果果实CYP4基因表达量以未经2,4-表油菜素内酯浓度处理方法得到的罗汉果果实CYP4基因表达量是1为参照；上述实验数据均为上述每一个实施方案得到的20棵罗汉果果树上任选其中5棵中得到的罗汉果果实进行平行试验得到的。
实施例4与实例3相比，诱导液1中甘草次酸，其CYP4基因表达量和甜苷V含量增加。
实施例5与实例3相比，诱导液2中芦丁素，其CYP4基因表达量和甜苷V含量增加，且增加的幅度略小于实施例4。
可见，在花粉液中增加2,4-表油菜素内酯促进CYP4基因表达量和甜苷V含量增加，且诱导液中含有2,4-表油菜素内酯的不宜过高；
实施例6与实例4相比，诱导液1中甘草次酸，其CYP4基因表达量和甜苷V含量增加。
实施例7与实例4相比，诱导液2中芦丁素，其CYP4基因表达量和甜苷V含量增加，且增加的幅度略小于实施例4。
可见，在授粉后在果实表面喷洒含有2,4-表油菜素内酯的诱导液可以促进CYP4基因表达量和甜苷V含量增加，且诱导液中含有2,4-表油菜素内酯的不宜过高；
实施例8与实例3相比，额外增加独角金内酯可以促进CYP4基因表达量和甜苷V含量增加。
可见，在组培阶段额外增加独角金内酯可以协同2,4-表油菜素内酯促进CYP4基因表达。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实例。

Claims (10)

1.一种促进罗汉果CYP4基因表达的方法，其特征在于包括：
在诱导培养基中对罗汉果的愈伤组织进行组织培养，获得罗汉果组培苗，所述诱导培养基中2,4-表油菜素内酯浓度为50～400μmol/L；
雄株开花后对花粉进行特殊处理得到花粉液，用电动喷雾器将所述花粉液喷洒在开花的雌株进行人工授粉，其中花粉液中2,4-表油菜素内酯的浓度为50～100μmol/L。
2.如权利要求1所述的促进罗汉果CYP4基因表达的方法，其特征在于，所述诱导培养基中还包括基础培养基，其配方为MS+0.5mg/L BA+0.1mg/LIBA+3.5g/L琼脂+30g/l蔗糖+1.0g/L活性炭+10μmol/L铁盐。
3.如权利要求1或2所述的促进罗汉果CYP4基因表达的方法，其特征在于，所述诱导培养基制备方法如下：将2,4-表油菜素内酯用2％的乙醇水溶液(v/v)溶解，配制成10000μmol/L的母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的2,4-表油菜素内酯母液添加到配置好的仍是液态的基础培养基中使得2,4-表油菜素内酯达到所需的浓度，分装于100mL组培瓶中，每瓶30mL，待培养基冷却凝固后，盖上组培盖，或盖上封口膜并用棉线扎牢备用。
4.如权利要求1所述的促进罗汉果CYP4基因表达的方法，其特征在于，所述组织培养的条件为：25℃恒温，相对湿度70％～80％，采用人工光照，每天12小时光照，12小时黑暗培养，其中光照强度1000～1500lux。
5.如权利要求1所述的促进罗汉果CYP4基因表达的方法，其特征在于，所述愈伤组织是由优质罗汉果幼叶经过常规培育而来，其培育方法是将所述优质罗汉果幼叶切成直径约1cm的叶圆片，用蒸馏水冲洗干净，再用75％的酒精浸30秒取出，随后用HgCl2水溶液浸泡消毒3分钟，用无菌水冲洗3～5次后接种在培养基中，愈伤组织继代增殖数次后，取生长旺盛、生活力强的愈伤组织，切成直径lcm的小块；
其中所述培养基的配方为MS+1mg/L玉米素+0.1mg/L IBA+3.5g/L琼脂+30g/l蔗糖+1.0g/L活性炭；
所述培育方法的条件为：控制温度25～28℃，相对湿度80％～90％，黑暗培养。
6.如权利要求1所述的促进罗汉果CYP4基因表达的方法，其特征在于，所述花粉为当日刚开放的雄花的花粉，获得方法为：采摘所述雄花，将蕊柱连同花粉剪下收集后，倒入100目的细铁丝筛中，用手轻轻揉搓，将花粉从蕊柱上脱离。
7.如权利要求1或6所述的促进罗汉果CYP4基因表达的方法，其特征在于，所述特殊处理的具体包括：
将收集的花粉进行干燥，采用吸湿干燥法，将硅胶置于花粉下方，封闭干燥机进行干燥24h；
在雌花开放的前一天晚上将干燥后的花粉摊放在白纸的光面上，置于湿度为60～80％的加湿室内12～20小时进行吸湿活化处理；
吸湿活化处理后的花粉按照2重量份花粉和8重量份喷雾液的比例混合，并用频率为3KHz的超声波振荡器中10分钟确保混合均一稳定，得到花粉液；
其中所述喷雾液的配方为0.1～0.3g/L硼酸、0.2％氨基酸水肥、0.15g/L葡甘露聚糖、0.02～0.06mg/L 2,4–D以及50～100μmol/L的2,4-表油菜素内酯，并且以磁化水为溶剂。
8.如权利要求1所述的促进罗汉果CYP4基因表达的方法，其特征在于，还包括在进行人工授粉后20天，每天早、中、晚于罗汉果表面喷洒诱导液至表面滴水，连续喷洒7天，所述诱导液中含有浓度为100～400μmol/L的2,4-表油菜素内酯。
9.如权利要求1所述的促进罗汉果CYP4基因表达的方法，其特征在于，所述人工授粉具体包括：将所述花粉液倒入电动喷雾器中，调节为最小喷雾量，对准开放的雌花柱头进行喷洒，喷洒量根据每株雌花植株开花的情况进行调节，2～5L喷雾液/株。
10.如权利要求1所述的促进罗汉果CYP4基因表达的方法，其特征在于，所述诱导培养基中还包括有0.05mg/L独角金内酯。
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