CN106577298A - 提高罗汉果苷ⅳ含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法，包括以下步骤：步骤一、制备含茉莉酸甲酯的固体培养基，所述固体培养基凝固前茉莉酸甲酯的浓度为50～400μmol/L；步骤二、将罗汉果组培苗接种在固体培养基中，培养28～35d后，移栽至田间。本发明能有效地提高罗汉果甜苷Ⅳ的产量，具有见效快、成本低、操作简单、方便实施、产品无毒无残留等特征，能满足罗汉果甜苷Ⅳ的大规模生产。

Description

提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法

技术领域

本发明涉及罗汉果栽培技术领域。更具体地说，本发明涉及一种提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法。

背景技术

罗汉果为中国特有的珍贵药用和甜料植物。其果实性凉、味甘，具有清热润肺，利咽开音，滑肠通便和抗癌等功效，活性成分甜苷V为世界上最强的非糖甜味物质之一，是蔗糖甜度的300～400倍，广泛应用于食品、保健品和药品中，是糖尿病人、肥胖者和高血压患者的理想糖替代品。研究发现，甜苷V是由苷Ⅳ等低苷转化而来，特别是在果实发育后期，苷Ⅳ等低苷被完全消耗殆尽转化成甜苷V，然而，苷Ⅳ只存在占果重不足15％的果肉内，且含量极低，严重制约了罗汉果产业的健康发展。

茉莉酸甲酯作为植物信号诱导子能够安全有效地激发植物次生代谢物的产生和积累。因此，优选合适的茉莉酸甲酯施用时间和浓度，可以最大限度地提高药用植物活性成分的含量。现有技术中未见有茉莉酸甲酯提高罗汉果苷Ⅳ含量的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法，其能有效地提高罗汉果甜苷Ⅳ的产量，具有见效快、成本低、操作简单、方便实施、产品无毒无残留等特征，能满足罗汉果甜苷Ⅳ的大规模生产。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法，包括以下步骤：

步骤一、制备含茉莉酸甲酯的固体培养基，所述固体培养基凝固前茉莉酸甲酯的浓度为50～400μmol/L；

步骤二、将罗汉果组培苗接种在固体培养基中，培养28～35d后，移栽至田间。

优选的是，所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法中，所述步骤二中将罗汉果组培苗接种在固体培养基中的培养条件为：相对湿度为60～66％、光照强度为1400lux、光照时间为8h/d和温度为23±2℃。

优选的是，所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法中，所述固体培养基的制备方法为：

步骤a、将茉莉酸甲酯溶于体积分数为2％的乙醇水溶液中，配制成浓度为50mmol/L的茉莉酸甲酯的乙醇母液，备用；

步骤b、将茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到凝固前的基础培养基中，至茉莉酸甲酯的最终浓度为50～400μmol/L后，将基础培养基灭菌，冷却至24～26℃。

优选的是，所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法中，所述基础培养基中包含：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖和1.0g/L活性炭。

优选的是，所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法中，所述步骤a中在制得茉莉酸甲酯的乙醇母液后，还包括用孔径为0.22μm的微孔滤膜对茉莉酸甲酯的乙醇母液进行灭菌的步骤。

优选的是，所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法中，所述步骤二之后还包括：

步骤三、将茉莉酸甲酯溶于乙醇中，配制成浓度为50～400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，在罗汉果授粉后50～60d，每天早、中、晚各喷洒一次茉莉酸甲酯溶液，至叶面滴水为止，连续喷洒10d。

优选的是，所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法中，所述步骤二中将罗汉果组培苗移栽至田间的具体步骤为：

在田间挖深度为8～14cm的种植坑，并在种植坑的底部铺设聚乙烯醇薄膜，之后在种植坑内插入育苗杯，再在育苗杯内倒入杀菌后的育苗基质至与种植坑外的土层高度相同，将罗汉果组培苗种植于育苗基质中，并使罗汉果组培苗的叶片位于育苗杯外后，在育苗基质上依次铺设1～2cm厚的保水剂层和1～3cm厚的填料层，再在填料层的表面铺设一层纱布，使罗汉果组培苗穿过纱布，之后在纱布上铺设粗石块，移栽后每天早、晚各喷洒一次所述茉莉酸甲酯溶液，至叶面滴水为止，连续喷洒10d，移栽10～20d后，取出粗石块和纱布，抽出育苗杯，将填料层填入抽出育苗杯后形成的环沟中，若填料层将环沟填满后还有多余，则将多余的填料层埋入育苗基质中或进行回收，若填料层未能将环沟填满，则用育苗基质填充环沟至与种植坑外的土层高度相同；其中，

所述填料层由细河沙、蛭石、珍珠岩和牡蛎壳粉按体积比为5～15：10～20：5～10：1混合后制得；

所述育苗杯包括：

杯体，其为圆筒体形，所述杯体的侧壁上沿其圆周方向间隔设置有多个出水孔，所述出水孔位于纱布的上方，粗石块与所述出水孔不接触；

积液板，其为直径上大下小的圆台形，所述积液板的内部中空，且顶部和底部均敞开，所述积液板的顶部的直径与所述杯体的内径相等，所述积液板的顶部与所述杯体的内侧壁固定连接，所述积液板与所述杯体一体成型，且位于所述出水孔的上方。

优选的是，所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法中，所述出水孔高于纱布0.1～1cm。

优选的是，所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法中，所述步骤二中组织培养之后，将罗汉果组培苗距离根部1cm以上部位划伤2～3个1mm深的伤口，并将含有0.04mg/L蜂毒、1～3mg/L木醋液，余量为水的诱导剂滴涂于伤口处，每株罗汉果组培苗滴涂0.05mL，然后将芦荟胶和纳米氧化锌按质量比为100:2～3混均后，涂覆于伤口处形成厚度为1～1.5mm厚度的膜，再将罗汉果组培苗置于波长为280～315nm的中波紫外线下辐射处理0.5h后用于移栽。

优选的是，所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法中，所述步骤三中每天早、中喷洒茉莉酸甲酯溶液后，对罗汉果植株进行全遮光30min。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明通过在罗汉果组培苗、移栽罗汉果后10d内、种植罗汉果时施加茉莉酸甲酯，以诱导罗汉果苷Ⅳ代谢关键酶(如葡萄糖基转移酶和细胞色素P450酶等)基因的高表达，从而在短期内快速提高罗汉果苷Ⅳ的含量。

本发明操作简便，成本低，对环境友好，适于规模化生产，具有较强的实用性和推广价值。

本发明在罗汉果组培苗移栽时采用了育苗杯，将幼苗种植于育苗杯的中部，并使叶片位于育苗杯外，能在移栽初期防止土传病害的发生，为幼苗提供丰富的营养和适宜的生长环境，能提高幼苗的成活率，进而能提高罗汉果的产量和罗汉果苷Ⅳ的提取量，也能对罗汉果幼苗的生长起导向作用，防止其长歪。在浇水过多或雨量较大时，育苗杯内过多的水经填料层和纱布过滤后从出水孔出来，能防止育苗杯内积水，这样也不会有杂质堵塞出水孔。当土壤干旱时，可以只往育苗杯内浇水，无需对育苗杯外的土壤施水，节约了水资源。因积液板为漏斗形，这样方便浇水，使浇的水都能流至位于中部的幼苗上。育苗杯可反复使用，节约了成本。

本发明在诱导处理培养之后移栽之前，将罗汉果组培苗根部划伤后滴涂含有蜂毒和木醋液的诱导剂，并用芦荟胶和纳米氧化锌涂覆后，置于中波紫外线下辐射处理，目的是划伤有助于加速蜂毒进入罗汉果组培苗，促使蜂毒进行化学刺激，诱导罗汉果苷Ⅳ的生物合成功能基因表达，打破罗汉果苷Ⅳ合成过程中的限速步骤，在短时间内加速罗汉果苷Ⅳ的合成与积累，纳米氧化锌具有高分散性，可以促进蜂毒快速分散于罗汉果内部，同时还起抑菌作用，芦荟胶起固封蜂毒促使其进入罗汉果组培苗根部，并起保湿抑菌促进罗汉果组织细胞再生，提高损伤处细胞活力，提高存活率的作用，木醋液也具有杀菌作用，能防止伤口感染，另中波紫外线穿透性强，能刺激划伤后的罗汉果组培苗为加强自身防御而加快该阶段的生物合成，从而进一步促进汉果苷Ⅳ的生物合成功能基因表达。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明所述的育苗杯的结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得；在本发明的描述中，术语“横向”、“纵向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，并不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

实施例1

一种提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法，包括以下步骤：

步骤一、制备含茉莉酸甲酯的固体培养基，所述固体培养基凝固前茉莉酸甲酯的浓度为220μmol/L；

步骤二、将罗汉果组培苗接种在固体培养基中，培养30d后，移栽至田间。

对罗汉果组培苗施加茉莉酸甲酯，诱导罗汉果苷Ⅳ代谢关键酶(如葡萄糖基转移酶和细胞色素P450酶等)基因的高表达，从而在短期内快速提高罗汉果苷Ⅳ的含量。

所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法中，所述步骤二中将罗汉果组培苗接种在固体培养基中的培养条件为：相对湿度为66％、光照强度为1400lux、光照时间为8h/d和温度为23℃。

所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法中，所述固体培养基的制备方法为：

步骤a、将茉莉酸甲酯溶于体积分数为2％的乙醇水溶液中，配制成浓度为50mmol/L的茉莉酸甲酯的乙醇母液，备用；

步骤b、将茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到凝固前的基础培养基中，至茉莉酸甲酯的最终浓度为220μmol/L后，将基础培养基灭菌，冷却至25℃。即在制作固体培养基时，在琼脂凝固前将茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到基础培养基中，混合均匀，琼脂凝固后茉莉酸甲酯能均匀地存在于固体培养基中。

所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法中，所述基础培养基中包含：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖和1.0g/L活性炭。

所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法中，所述步骤a中在制得茉莉酸甲酯的乙醇母液后，还包括用孔径为0.22μm的微孔滤膜对茉莉酸甲酯的乙醇母液进行灭菌的步骤。能防止茉莉酸甲酯的乙醇母液携带细菌，影响组培苗的生长。

实施例2

在实施例1的基础上，所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法中，所述步骤二之后还包括：

步骤三、将茉莉酸甲酯溶于乙醇中，配制成浓度为200μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，在罗汉果授粉后55d，每天早、中、晚各喷洒一次茉莉酸甲酯溶液，至叶面滴水为止，连续喷洒10d。次日，采样，采用HPLC法进行罗汉果苷Ⅳ含量检测。

种植罗汉果时施加茉莉酸甲酯，以诱导罗汉果苷Ⅳ代谢关键酶(如葡萄糖基转移酶和细胞色素P450酶等)基因的高表达，从而在短期内快速提高罗汉果苷Ⅳ的含量。

实施例3

在实施例2的基础上，如图1所示，所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法中，所述步骤二中将罗汉果组培苗移栽至田间的具体步骤为：

在田间挖深度为11cm的种植坑，并在种植坑的底部铺设聚乙烯醇薄膜，防止杀菌后的育苗基质与种植坑底部的土壤接触，防止土传病害的发生，聚乙烯醇薄膜可降解，不会污染环境，也不会阻碍幼苗的根部向下生长，之后在种植坑内插入育苗杯，再在育苗杯内倒入杀菌后的育苗基质150至与种植坑外的土层高度相同，为幼苗提供无菌的生长环境，育苗基质为栽培罗汉果时用到的任何一种基质，只是对其进行了杀菌，将罗汉果组培苗种植于育苗基质中，并使罗汉果组培苗的叶片位于育苗杯外后，在育苗基质上从下到上依次铺设2cm厚的保水剂层130和2cm厚的填料层140，再在填料层的表面铺设一层纱布，使罗汉果组培苗穿过纱布，之后在纱布上铺设粗石块，即用粗石块压住纱布，移栽后每天早、晚各喷洒一次所述茉莉酸甲酯溶液，至叶面滴水为止，连续喷洒10d，对罗汉果幼苗施加茉莉酸甲酯，诱导罗汉果苷Ⅳ代谢关键酶(如葡萄糖基转移酶和细胞色素P450酶等)基因的高表达，从而在短期内快速提高罗汉果苷Ⅳ的含量。移栽15d后，取出粗石块和纱布，抽出育苗杯，将填料层填入抽出育苗杯后形成的环沟中，将填料层填入抽出育苗杯后形成的环沟中，若填料层将环沟填满后还有多余，则将多余的填料层埋入育苗基质中或进行回收，若填料层未能将环沟填满，则用育苗基质填充环沟至与种植坑外的土层高度相同。即若环沟较浅，则用填料层即可填满，则无需再填充育苗基质，若填料层填满环沟后还有剩余，则将剩余部分埋入育苗基质中或回收后再利用，若环沟较深，则先将填料层填充至环沟中，再用育苗基质填充环沟至与种植坑外的土层高度相同；填料层粒度较大，能使土壤疏松，透气，透水，牡蛎壳粉具有多孔结构，能吸收育苗基质中的有效成分，如肥料，杀菌剂、杀虫剂和水等，再缓慢释放。其中，

所述填料层由细河沙、蛭石、珍珠岩和牡蛎壳粉按体积比为10：15：7：1混合后制得；

所述育苗杯100包括：

杯体101，其为圆筒体形，所述杯体的侧壁上沿其圆周方向间隔设置有多个出水孔102，所述出水孔位于纱布120的上方，粗石块与所述出水孔不接触；

积液板103，其为直径上大下小的圆台形，所述积液板的内部中空，且顶部和底部均敞开，所述积液板的顶部的直径与所述杯体的内径相等，所述积液板的顶部与所述杯体的内侧壁固定连接，所述积液板与所述杯体一体成型，且位于所述出水孔的上方。

本方案提供的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法中，在罗汉果组培苗移栽时采用了育苗杯，将幼苗种植于育苗杯的中部，并使叶片位于育苗杯外，能在移栽初期防止土传病害的发生，为幼苗提供丰富的营养和适宜的生长环境，能提高幼苗的成活率，进而能提高罗汉果的产量和罗汉果苷Ⅳ的提取量，也能对罗汉果幼苗的生长起导向作用，防止其长歪。在浇水过多或雨量较大时，育苗杯内过多的水经填料层和纱布过滤后从出水孔出来，能防止育苗杯内积水，这样也不会有杂质堵塞出水孔。当土壤干旱时，可以只往育苗杯内浇水，无需对育苗杯外的土壤施水，节约了水资源。因积液板为漏斗形，这样方便浇水，使浇的水都能流至位于中部的幼苗上。育苗杯可反复使用，节约了成本。

所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法中，所述出水孔高于纱布0.5cm。这样在浇水过多或雨量较大时，能使育苗杯内的积水都从出水孔出来。

实施例4

在实施例1的基础上，所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法中，所述步骤二中组织培养之后，将罗汉果组培苗距离根部1cm以上部位划伤2个1mm深的伤口，并将含有0.04mg/L蜂毒、2mg/L木醋液，余量为水的诱导剂滴涂于伤口处，每株罗汉果组培苗滴涂0.05mL，然后将芦荟胶和纳米氧化锌按质量比为100:3混均后，涂覆于伤口处形成厚度为1.2mm厚度的膜，再将罗汉果组培苗置于波长为300nm的中波紫外线下辐射处理0.5h后用于移栽。

在移栽之前，将罗汉果组培苗根部划伤后滴涂含有蜂毒和木醋液的诱导剂，并用芦荟胶和纳米氧化锌涂覆后，置于中波紫外线下辐射处理，目的是划伤有助于加速蜂毒进入罗汉果组培苗，促使蜂毒进行化学刺激，诱导罗汉果苷Ⅳ的生物合成功能基因表达，打破罗汉果苷Ⅳ合成过程中的限速步骤，在短时间内加速罗汉果苷Ⅳ的合成与积累，纳米氧化锌具有高分散性，可以促进蜂毒快速分散于罗汉果内部，同时还起抑菌作用，芦荟胶起固封蜂毒促使其进入罗汉果组培苗根部，并起保湿抑菌促进罗汉果组织细胞再生，提高损伤处细胞活力，提高存活率的作用，木醋液也具有杀菌作用，另中波紫外线穿透性强，能刺激划伤后的罗汉果组培苗为加强自身防御而加快该阶段的生物合成，从而进一步促进汉果苷Ⅳ的生物合成功能基因表达。

实施例5

在实施例2的基础上，所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法中，所述步骤三中每天早、中喷洒茉莉酸甲酯溶液后，对罗汉果植株进行全遮光30min，30min过后罗汉果植株按正常光照处理，不再进行全遮光。

实施例6

在实施例1的基础上，所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法中，所述步骤二之后还包括：

步骤三、将茉莉酸甲酯溶于乙醇中，配制成浓度为200μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，在罗汉果授粉后55d，每天早、中、晚各喷洒一次茉莉酸甲酯溶液，至叶面滴水为止，连续喷洒10d。次日(即在罗汉果授粉后66d)，采样，采用HPLC法进行罗汉果苷Ⅳ含量检测。

种植罗汉果时施加茉莉酸甲酯，以诱导罗汉果苷Ⅳ代谢关键酶(如葡萄糖基转移酶和细胞色素P450酶等)基因的高表达，从而在短期内快速提高罗汉果苷Ⅳ的含量。

如图1所示，所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法中，所述步骤二中将罗汉果组培苗移栽至田间的具体步骤为：

在田间挖深度为11cm的种植坑，并在种植坑的底部铺设聚乙烯醇薄膜，防止杀菌后的育苗基质与种植坑底部的土壤接触，防止土传病害的发生，聚乙烯醇薄膜可降解，不会污染环境，也不会阻碍幼苗的根部向下生长，之后在种植坑内插入育苗杯，再在育苗杯内倒入杀菌后的育苗基质150至与种植坑外的土层高度相同，为幼苗提供无菌的生长环境，育苗基质为栽培罗汉果时用到的任何一种基质，只是对其进行了杀菌，将罗汉果组培苗种植于育苗基质中，并使罗汉果组培苗的叶片位于育苗杯外后，在育苗基质上从下到上依次铺设2cm厚的保水剂层130和2cm厚的填料层140，再在填料层的表面铺设一层纱布，使罗汉果组培苗穿过纱布，之后在纱布上铺设粗石块，即用粗石块压住纱布，移栽后每天早、晚各喷洒一次所述茉莉酸甲酯溶液，至叶面滴水为止，连续喷洒10d，移栽15d后，取出粗石块和纱布，抽出育苗杯，将填料层填入抽出育苗杯后形成的环沟中，将填料层填入抽出育苗杯后形成的环沟中，若填料层将环沟填满后还有多余，则将多余的填料层埋入育苗基质中或进行回收，若填料层未能将环沟填满，则用育苗基质填充环沟至与种植坑外的土层高度相同。即若环沟较浅，则用填料层即可填满，则无需再填充育苗基质，若填料层填满环沟后还有剩余，则将剩余部分埋入育苗基质中或回收后再利用，若环沟较深，则先将填料层填充至环沟中，再用育苗基质填充环沟至与种植坑外的土层高度相同；填料层粒度较大，能使土壤疏松，透气，透水，牡蛎壳粉具有多孔结构，能吸收育苗基质中的有效成分，如肥料，杀菌剂、杀虫剂和水等，再缓慢释放。其中，

所述填料层由细河沙、蛭石、珍珠岩和牡蛎壳粉按体积比为10：15：7：1混合后制得；

所述育苗杯100包括：

杯体101，其为圆筒体形，所述杯体的侧壁上沿其圆周方向间隔设置有多个出水孔102，所述出水孔位于纱布120的上方，粗石块与所述出水孔不接触；

积液板103，其为直径上大下小的圆台形，所述积液板的内部中空，且顶部和底部均敞开，所述积液板的顶部的直径与所述杯体的内径相等，所述积液板的顶部与所述杯体的内侧壁固定连接，所述积液板与所述杯体一体成型，且位于所述出水孔的上方。

本方案提供的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法中，在罗汉果组培苗移栽时采用了育苗杯，将幼苗种植于育苗杯的中部，并使叶片位于育苗杯外，能在移栽初期防止土传病害的发生，为幼苗提供丰富的营养和适宜的生长环境，能提高幼苗的成活率，进而能提高罗汉果的产量和罗汉果苷Ⅳ的提取量，也能对罗汉果幼苗的生长起导向作用，防止其长歪。在浇水过多或雨量较大时，育苗杯内过多的水经填料层和纱布过滤后从出水孔出来，能防止育苗杯内积水，这样也不会有杂质堵塞出水孔。当土壤干旱时，可以只往育苗杯内浇水，无需对育苗杯外的土壤施水，节约了水资源。因积液板为漏斗形，这样方便浇水，使浇的水都能流至位于中部的幼苗上。育苗杯可反复使用，节约了成本。

所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法中，所述出水孔高于纱布0.5cm。这样在浇水过多或雨量较大时，能使育苗杯内的积水都从出水孔出来。

所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法中，所述步骤二中组织培养之后，将罗汉果组培苗距离根部1cm以上部位划伤2个1mm深的伤口，并将含有0.04mg/L蜂毒、2mg/L木醋液，余量为水的诱导剂滴涂于伤口处，每株罗汉果组培苗滴涂0.05mL，然后将芦荟胶和纳米氧化锌按质量比为100:3混均后，涂覆于伤口处形成厚度为1.2mm厚度的膜，再将罗汉果组培苗置于波长为300nm的中波紫外线下辐射处理0.5h后用于移栽。

在移栽之前，将罗汉果组培苗根部划伤后滴涂含有蜂毒和木醋液的诱导剂，并用芦荟胶和纳米氧化锌涂覆后，置于中波紫外线下辐射处理，目的是划伤有助于加速蜂毒进入罗汉果组培苗，促使蜂毒进行化学刺激，诱导罗汉果苷Ⅳ的生物合成功能基因表达，打破罗汉果苷Ⅳ合成过程中的限速步骤，在短时间内加速罗汉果苷Ⅳ的合成与积累，纳米氧化锌具有高分散性，可以促进蜂毒快速分散于罗汉果内部，同时还起抑菌作用，芦荟胶起固封蜂毒促使其进入罗汉果组培苗根部，并起保湿抑菌促进罗汉果组织细胞再生，提高损伤处细胞活力，提高存活率的作用，木醋液也具有杀菌作用，另中波紫外线穿透性强，能刺激划伤后的罗汉果组培苗为加强自身防御而加快该阶段的生物合成，从而进一步促进汉果苷Ⅳ的生物合成功能基因表达。

所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法中，所述步骤三中每天早、中喷洒茉莉酸甲酯溶液后，对罗汉果植株进行全遮光30min，30min过后罗汉果植株按正常光照处理，不再进行全遮光。

对比例1

一种罗汉果的种植方法，包括以下步骤：

步骤一、将罗汉果组培苗接种在固体培养基中，在相对湿度为66％、光照强度为1400lux、光照时间为8h/d、温度为23℃的条件下培养30d；固体培养基包含：MS、1.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖和1.0g/L活性炭，不含有茉莉酸甲酯；

步骤三、将步骤二中培养后的组培苗移栽至田间，移栽后按常规方法种植，即不喷施茉莉酸甲酯溶液、不采用育苗杯种植、移栽前不做划伤处理。

实施例1～6和对比例1中在罗汉果授粉后66d，采样，采用HPLC法进行罗汉果苷Ⅳ含量检测。结果见表1，表1中甜苷Ⅳ含量指每克果实中含有的甜苷Ⅳ的毫克数，单位为mg/g或‰。

表1实施例1～6和对比例1对应的罗汉果甜苷Ⅳ含量的检测结果

由表1可知，采用实施例1的方法与对比例1的方法相比，实施例1有效提高了罗汉果甜苷Ⅳ含量，说明在罗汉果组培苗时施加茉莉酸甲酯，能有效提高罗汉果甜苷Ⅳ含量。

采用实施例2的方法与实施例1的方法相比，实施例2进一步提高了罗汉果甜苷Ⅳ含量，说明在罗汉果组培苗和种植罗汉果时施加茉莉酸甲酯，能进一步提高罗汉果甜苷Ⅳ含量。

采用实施例3的方法与实施例2的方法相比，实施例3又进一步提高了罗汉果甜苷Ⅳ含量，说明在罗汉果组培苗、移栽罗汉果后10d内、种植罗汉果时施加茉莉酸甲酯，能更进一步提高罗汉果甜苷Ⅳ含量。

采用实施例4的方法与实施例1的方法相比，实施例4进一步提高了罗汉果甜苷Ⅳ含量，说明在罗汉果组培苗时施加茉莉酸甲酯和移栽前进行划伤处理，能有效地提高罗汉果甜苷Ⅳ含量。

采用实施例5的方法与实施例2的方法相比，实施例5又进一步提高了罗汉果甜苷Ⅳ含量，说明在罗汉果组培苗和种植罗汉果时施加茉莉酸甲酯，以及在种植时施加茉莉酸甲酯后进行遮光处理，能显著提高罗汉果甜苷Ⅳ含量。

采用实施例6的方法与实施例1～5的方法相比，实施例6提高罗汉果甜苷Ⅳ含量最明显，说明在罗汉果组培苗、移栽罗汉果后10d内、种植罗汉果时施加茉莉酸甲酯、移栽前进行划伤处理，以及在种植时施加茉莉酸甲酯后进行遮光处理，提高罗汉果甜苷Ⅳ含量最明显。该方法见效快、成本低、操作简单、方便实施，能为罗汉果的大规模种植和罗汉果甜苷Ⅳ的大规模生产提供新思路。

实验1采用实施例1～6和对比例1的方法分别培养50株罗汉果组培苗，实施例1、2、4、5、对比例1采用常规方法进行移栽，移栽一个月后检查存活率，结果见表2。

表2实施例1～6和对比例1对应的存活率

由表2可知，实施例3和实施例6移栽时采用育苗杯，能显著提高组培苗移栽后的成活率。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例和实施例。

Claims (10)

1.一种提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、制备含茉莉酸甲酯的固体培养基，所述固体培养基凝固前茉莉酸甲酯的浓度为50～400μmol/L；

步骤二、将罗汉果组培苗接种在固体培养基中，培养28～35d后，移栽至田间。

2.如权利要求1所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法，其特征在于，所述步骤二中将罗汉果组培苗接种在固体培养基中的培养条件为：相对湿度为60～66％、光照强度为1400lux、光照时间为8h/d和温度为23±2℃。

3.如权利要求1所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法，其特征在于，所述固体培养基的制备方法为：

步骤a、将茉莉酸甲酯溶于体积分数为2％的乙醇水溶液中，配制成浓度为50mmol/L的茉莉酸甲酯的乙醇母液，备用；

步骤b、将茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到凝固前的基础培养基中，至茉莉酸甲酯的最终浓度为50～400μmol/L后，将基础培养基灭菌，冷却至24～26℃。

4.如权利要求3所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法，其特征在于，所述基础培养基中包含：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖和1.0g/L活性炭。

5.如权利要求3所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法，其特征在于，所述步骤a中在制得茉莉酸甲酯的乙醇母液后，还包括用孔径为0.22μm的微孔滤膜对茉莉酸甲酯的乙醇母液进行灭菌的步骤。

6.如权利要求1所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法，其特征在于，所述步骤二之后还包括：

步骤三、将茉莉酸甲酯溶于乙醇中，配制成浓度为50～400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，在罗汉果授粉后50～60d，每天早、中、晚各喷洒一次茉莉酸甲酯溶液，至叶面滴水为止，连续喷洒10d。

7.如权利要求6所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法，其特征在于，所述步骤二中将罗汉果组培苗移栽至田间的具体步骤为：

在田间挖深度为8～14cm的种植坑，并在种植坑的底部铺设聚乙烯醇薄膜，之后在种植坑内插入育苗杯，再在育苗杯内倒入杀菌后的育苗基质至与种植坑外的土层高度相同，将罗汉果组培苗种植于育苗基质中，并使罗汉果组培苗的叶片位于育苗杯外后，在育苗基质上依次铺设1～2cm厚的保水剂层和1～3cm厚的填料层，再在填料层的表面铺设一层纱布，使罗汉果组培苗穿过纱布，之后在纱布上铺设粗石块，移栽后每天早、晚各喷洒一次所述茉莉酸甲酯溶液，至叶面滴水为止，连续喷洒10d，移栽10～20d后，取出粗石块和纱布，抽出育苗杯，将填料层填入抽出育苗杯后形成的环沟中，若填料层将环沟填满后还有多余，则将多余的填料层埋入育苗基质中或进行回收，若填料层未能将环沟填满，则用育苗基质填充环沟至与种植坑外的土层高度相同；其中，

所述填料层由细河沙、蛭石、珍珠岩和牡蛎壳粉按体积比为5～15：10～20：5～10：1混合后制得；

所述育苗杯包括：

杯体，其为圆筒体形，所述杯体的侧壁上沿其圆周方向间隔设置有多个出水孔，所述出水孔位于纱布的上方，粗石块与所述出水孔不接触；

积液板，其为直径上大下小的圆台形，所述积液板的内部中空，且顶部和底部均敞开，所述积液板的顶部的直径与所述杯体的内径相等，所述积液板的顶部与所述杯体的内侧壁固定连接，所述积液板与所述杯体一体成型，且位于所述出水孔的上方。

8.如权利要求7所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法，其特征在于，所述出水孔高于纱布0.1～1cm。

9.如权利要求1所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法，其特征在于，所述步骤二中组织培养之后，将罗汉果组培苗距离根部1cm以上部位划伤2～3个1mm深的伤口，并将含有0.04mg/L蜂毒、1～3mg/L木醋液，余量为水的诱导剂滴涂于伤口处，每株罗汉果组培苗滴涂0.05mL，然后将芦荟胶和纳米氧化锌按质量比为100:2～3混均后，涂覆于伤口处形成厚度为1～1.5mm厚度的膜，再将罗汉果组培苗置于波长为280～315nm的中波紫外线下辐射处理0.5h后用于移栽。

10.如权利要求6所述的提高罗汉果苷Ⅳ含量的方法，其特征在于，所述步骤三中每天早、中喷洒茉莉酸甲酯溶液后，对罗汉果植株进行全遮光30min。