CN107258546A - 定心藤的组织培养繁殖方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种定心藤的组织培养繁殖方法，取定心藤的2‑3cm带芽茎段作为外植体组培得到无根植株，将无根植株置于生根培养基中培养得生根苗，所述生根培养基为1/2MS、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、0.1mg/LN‑甲基牛磺酸和0.1‑0.3mg/L的中药提取物，其中所述中药提取液由生南星提取物和旱莲草提取物分按质量比1:2混合而成。本发明具有抑制定心藤在组织培养过程中发生褐化的概率，提高定心藤的生根率和存活率。

Description

定心藤的组织培养繁殖方法
技术领域
本发明涉及组织培养领域。更具体地说，本发明涉及一种定心藤的组织培养繁殖方法。
背景技术
定心藤为茶茱萸科定心藤属植物，又名甜果藤、铜钻。定心藤以根或藤茎入药，为瑶族常用药材“十八钻”之一，性平，味微苦、涩，具有传经走脉、祛风除湿、调经活血、清热解毒和消肿止痛的功效，用于黄疸型肝炎、风湿痹痛、月经不调、痛经、闭经、产后风痛、心慌心跳、尿频尿急、风湿关节炎、类风湿性关节炎；外用治跌打损伤、毒蛇咬伤。定心藤分布在我国广西、广东、云南、贵州、福建、湖南等省区，主要产于广西的武鸣、上林、融水、桂林、临桂、兴安、龙胜、藤县、蒙山、上思、东兴、平南、容县、那坡、凌云、贺州、钟山、罗城、金秀等地。
定心藤地域分布零散且蕴藏量稀少。随着人们生活水平的提高和健康意识的增强，定心藤的市场需求量逐年攀升，野生资源遭到过度采挖，濒临枯竭。自然条件下，定心藤主要依靠种子进行繁殖，但是定心藤的种子数量极为稀少，且存在明显的休眠特性，即在自然状态下萌发时间长、发芽率低，生产上难以实现大面积栽培。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种生根培养基，提高定心藤的生根率。
本发明还有一个目的是提供通过Omega-3脂肪酸溶液处理定心藤外植体，抑制其褐化，减少后期组培过程中的褐化率。
本发明还有一个目的是提供一种适合定心藤移栽的基质，提高定心藤炼苗的存活率。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种定心藤的组织培养繁殖方法，取定心藤的2-3cm带芽茎段作为外植体组培得到无根植株，将无根植株置于生根培养基中培养得生根苗，所述生根培养基为1/2MS、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、0.1mg/LN-甲基牛磺酸和0.1-0.3mg/L的中药提取物，其中所述中药提取液由生南星提取物和旱莲草提取物分按质量比1:2混合而成。
优选的是，所述外植体培育得到无根植株，具体为：
将外植体置于诱导培养基中进行培养18～22天，得到无菌试管苗，其中，所述诱导培养基包括：MS、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、1mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.1mg/L的萘乙酸，调节诱导培养基pH值为5.8；
将无菌试管苗置于增殖培养基中进行增殖培养28～32天，得到丛生芽，其中，所述增殖培养基包括：MS、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、1g/L活性炭、1～2mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.1～1mg/L的灵发素、0.3-0.5mg/L的吲哚乙酸，调节增殖培养基pH值为5.8；
将丛生芽置于壮苗培养基中进行壮苗培养28～32天，得到无根植株，其中，所述壮苗培养基包括：MS、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、1g/L活性炭、0.5～1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.2～0.6mg/L的灵发素，调节壮苗培养基pH值为5.8。
优选的是，所述外植体在进行组培前，进行了消毒处理。
优选的是，将所述生根苗进行炼苗后移栽至基质，所述基质由姜黄素、珍珠岩、松鳞、秸秆发酵产物按质量比3:20:2:10混合而成；所述秸秆发酵产物由棉花秸秆和油菜秸秆按质量比3:2混合发酵制成。
优选的是，所述外植体在进行组织培养前进行了防褐化预处理，具体为：将外植体置于浓度为0.8-1.2mg/L的Omega-3脂肪酸溶液中超声震荡2-3min，频率为20千赫兹。
本发明至少包括以下有益效果：在定心藤的组培过程中抑制其褐化，提高定心藤的生根率和存活率。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
步骤一、定心藤的组织培养繁殖方法，取定心藤的3cm带芽茎段作为外植体，经消毒组培得到无根植株，在此过程中采用常规的组培方法即可，优选的为将外植体置于诱导培养基中进行培养18天，得到无菌试管苗，其中，所述诱导培养基包括：MS、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、1mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.1mg/L的萘乙酸，调节诱导培养基pH值为5.8。
步骤二、将无菌试管苗置于增殖培养基中进行增殖培养28天，得到丛生芽，其中，所述增殖培养基包括：MS、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、1g/L活性炭、1mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.3mg/L的灵发素、0.3mg/L的吲哚乙酸，调节增殖培养基pH值为5.8。
步骤三、将丛生芽置于壮苗培养基中进行壮苗培养28天，得到无根植株，其中，所述壮苗培养基包括：MS、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、1g/L活性炭、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.3mg/L的灵发素，调节壮苗培养基pH值为5.8。在实施例1中采用优选的方案培育外植体至无根植株。
步骤四、将无根植株置于生根培养基中培养得生根苗，所述生根培养基为1/2MS、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、0.1mg/LN-甲基牛磺酸和0.3mg/L的中药提取物，其中所述中药提取液由生南星提取物和旱莲草提取物分按质量比1:2混合而成。
对比例1
定心藤外植体组培得到无根植株的方法与实施例相同，在步骤四种采用的生根培养基为1/2MS、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖和0.1-0.3mg/L的吲哚丁酸。其他步骤均与实施例相同。
选取100株定心藤无根植株平均分为两组，分别通过实施例1和对比例1进行生根培养，结果见表1.
表1 不同生根培养基对定心藤生根的影响
培养基 平均生根数/条 生根率/％ 生根最短时间/天
实施例1 3.2 82.8 10.81
对比例1 1.8 38.6 20.44
从表1可以看出，添加有N-甲基牛磺酸和中药提取物的培养基，其生根数、生根率都显著高于添加常规生根剂吲哚丁酸的培养基，由此可知采用本申请的生根培养基能显著提高定心藤的生根效果，缩短生根时间。
实施例2
定心藤的外植体组织培养得到生根苗的培育方法与实施例1相同，将生根苗进行炼苗后移栽至基质，所述基质由姜黄素、珍珠岩、松鳞、秸秆发酵产物按质量比3:20:2:10混合而成；所述秸秆发酵产物由棉花秸秆和油菜秸秆按质量比3:2混合发酵制成。利用实施例2的基质培育50株炼苗，并记录50个炼苗在基质中不同栽培时间的平均存活率。
对比例2
定心藤的外植体组织培养得到生根苗的培育方法与实施例1相同，将生根苗进行炼苗后移栽至基质，所述基质由泥炭土、蛭石及细河砂按质量比1:2:1混合而成。利用对比例2的基质培育50株炼苗，并记录50个炼苗在基质中不同栽培时间的平均存活率。
表2 不同基质对炼苗平均成活率的影响/％
基质 5天 10天 15天 20天 30天
实施例2 100 100 98 96 96
对比例2 100 50 41 32 28
从表2可以看出，炼苗移植于添加有姜黄素、松鳞和秸秆发酵产物的基质中一个月后，其存活率为96％，而采用常规的基质，炼苗的存活率只能达到28％，由此可知，本申请中的栽培基质能显著提高炼苗的存活率。
实施例3
定心藤的组织培养方法与实施例1相同，唯一的区别在于，外植体在进行组培前进行了防褐化预处理，具体为：将外植体置于消毒后的浓度为1mg/L的Omega-3脂肪酸溶液中超声震荡3min，频率为20千赫兹。选取100个定心藤外植体采用实施例3的方法进行组织培养。
对比例3
取定心藤的2-3cm带芽茎段作为外植体，经过常规消毒后直接接种于MS培养基中，调节培养基的pH为5.8。选取100个定心藤外植体采用对比例3的方法进行组织培养。
另外采用实施例1的方法组织培养100个定心藤外植体，并记录其褐化率。
表3 不同环境下定心藤组织培养的褐化率％
实施例1 实施例3 对比例3
褐化率/％ 29.3 12.5 45.4
从表3可知，通过Omega-3脂肪酸溶液的浸泡，可有效降低定心藤组织培养的褐化率。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

Claims (5)

1.一种定心藤的组织培养繁殖方法，其特征在于，取定心藤的2-3cm带芽茎段作为外植体组培得到无根植株，将无根植株置于生根培养基中培养得生根苗，所述生根培养基为1/2MS、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、0.1mg/LN-甲基牛磺酸和0.1-0.3mg/L的中药提取物，其中所述中药提取液由生南星提取物和旱莲草提取物分按质量比1:2混合而成。
2.如权利要求1所述的定心藤的组织培养繁殖方法，其特征在于，所述外植体培育得到无根植株，具体为：
将外植体置于诱导培养基中进行培养18～22天，得到无菌试管苗，其中，所述诱导培养基包括：MS、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、1mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.1mg/L的萘乙酸，调节诱导培养基pH值为5.8；
将无菌试管苗置于增殖培养基中进行增殖培养28～32天，得到丛生芽，其中，所述增殖培养基包括：MS、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、1g/L活性炭、1～2mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.1～1mg/L的灵发素、0.3-0.5mg/L的吲哚乙酸，调节增殖培养基pH值为5.8；
将丛生芽置于壮苗培养基中进行壮苗培养28～32天，得到无根植株，其中，所述壮苗培养基包括：MS、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、1g/L活性炭、0.5～1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.2～0.6mg/L的灵发素，调节壮苗培养基pH值为5.8。
3.如权利要求1所述的定心藤的组织培养繁殖方法，其特征在于，所述外植体在进行组培前，进行了消毒处理。
4.如权利要求1所述的定心藤的组织培养繁殖方法，其特征在于，将所述生根苗进行炼苗后移栽至基质，所述基质由姜黄素、珍珠岩、松鳞、秸秆发酵产物按质量比3:20:2:10混合而成；所述秸秆发酵产物由棉花秸秆和油菜秸秆按质量比3:2混合发酵制成。
5.如权利要求1所述的定心藤的组织培养繁殖方法，其特征在于，所述外植体在进行组织培养前进行了防褐化预处理，具体为：将外植体置于浓度为0.8-1.2mg/L的Omega-3脂肪酸溶液中超声震荡2-3min，频率为20千赫兹。
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