CN111235045A - 异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母及构建方法 - Google Patents

异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母及构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了异源合成β‑香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母及构建方法，构建方法为：向解脂耶氏酵母中导入优化后的β‑香树脂醇合酶编码基因、优化后的齐墩果酸合酶编码基因和优化后的细胞色素‑NADPH‑还原酶1的编码基因，得到重组菌2；实验证明，通过同源重组的方法，获得产β‑香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母菌使β‑香树脂醇和齐墩果酸的产量提高，本发明的方法为人工合成β‑香树脂醇和齐墩果酸提供了依据。

Description

异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母及构建 方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母及构建方法。
背景技术
五环三萜的代表化合物是齐墩果烷型皂苷的苷元齐墩果酸(OA)和熊果烷型苷元熊果酸(UA)。二者互为同分异构体，熊果酸具有抗炎、抗菌等多种生物学效应，齐墩果酸最重要的药理活性是保肝作用。此外有研究表明，熊果酸和齐墩果酸协同用药能够相互增强彼此抗恶性细胞增殖的能力。
齐墩果酸的生物合成途径起始于2，3-氧化鲨烯，经环化形成五环三萜骨架β-香树脂醇，β-香树脂醇为α-香树脂醇互为同分异构体，β-香树脂醇合酶基因广泛的存在于不同类型的植物中，已经被克隆和表征的植物包括人参，豌豆，光果甘草，粗毛燕麦，蒺藜苜蓿等。β-香树脂醇是多种五环三萜皂苷的前体化合物，包括大豆皂苷、甘草酸、燕麦根皂苷等；β-香树脂醇合酶既有单一功能合酶由2，3-氧化鲨烯单独合成β-香树脂醇，又有多功能合酶如mixedAS可将2，3-氧化鲨烯同时环化成为合成β-香树脂醇和α-香树脂醇，而迄今为止，单一功能的α-香树脂醇合酶仍然没有被发现。
解脂耶氏酵母作为一种GRAS(generallyregarded as safe)非常规酵母，已有研究表明其适合作为萜类化合物生产底盘细胞。其中，在解脂耶氏酵母中实现四萜化合物β-胡萝卜素的合成，并达到目前微生物异源合成的最高产量4g/L(Shuliang Gaoet al.,Metabolic Engineering,2017)；倍半萜化合物α-金合欢烯首次在解脂耶氏酵母中合成并实现产量259.98mg/L(XiaYang et al.，Bioresource Technology,2016)；单萜化合物柠檬烯在解脂耶氏酵母中也达到了23.56mg/L(Xuan Cao et al.Biotechnology forBiofuels,2016)。然而，利用合成生物学方法在解脂耶氏酵母中异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸还未见报道。(看过了，可以)
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种异源合成β-香树脂醇的重组解脂耶氏酵母的构建方法。
本发明的第二个目的是提供一种异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法。
本发明的第三个目的是提供第二种异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法。
本发明的第四个目的是提供第三种异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法。
本发明的第五个目的是提供第四种异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法。
本发明的第六个目的是提供第五种异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法。
本发明的第七个目的是提供第六种异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法。
本发明的第八个目的是提供第七种异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法。
本发明的第九个目的是提供第八种异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法。
本发明的第十个目的是提供第九种异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法。
本发明的第十一个目的是提供第十种异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法。
本发明的第十二个目的是提供第十一种异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法。
本发明的第十三个目的是提供上述异源合成β-香树脂醇的重组解脂耶氏酵母的构建方法构建的β-香树脂醇的重组解脂耶氏酵母。
本发明的第十四个目的是提供上述异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法构建的异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母。
本发明的第十五个目的是提供上述各个异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母发酵生产达β-香树脂醇和齐墩果酸的用途。
本发明的技术方案概述如下：
一种异源合成β-香树脂醇的重组解脂耶氏酵母的构建方法，包括如下步骤：向解脂耶氏酵母中导入优化后的β-香树脂醇合酶编码基因，得到重组菌1；
所述优化后的β-香树脂醇合酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法，包括如下步骤：
向解脂耶氏酵母中导入优化后的β-香树脂醇合酶编码基因、优化后的齐墩果酸合酶编码基因和优化后的细胞色素-NADPH-还原酶1的编码基因，得到重组菌2；
所述优化后的β-香树脂醇合酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述优化后的齐墩果酸合酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述优化后的细胞色素-NADPH-还原酶1的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
第二种异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法，包括如下步骤：
向重组菌2中导入3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的编码基因HMG1，得到重组菌3。
所述3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的编码基因HMG1如SEQ ID NO.4所示。
第三种异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法，包括如下步骤：
(1)将编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因HMG1的5'端的核苷酸去除1500个，得到截短的编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因tHMG1；
所述3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的的编码基因HMG1的核苷酸序列如SEQID NO.4所示；所述截短的编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
(2)将截短的编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因导入重组菌2中，得到重组菌4。
第四种异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法，包括如下步骤：
向重组菌2中导入氧化鲨烯环化酶的编码基因ERG1，得到重组菌5；
所述氧化鲨烯环化酶的编码基因ERG1如SEQ ID NO.6所示。
第五种异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法，包括如下步骤：
向重组菌2中导入磷酸甲羟戊酸激酶的编码基因ERG8，得到重组菌6；
所述磷酸甲羟戊酸激酶的编码基因ERG8如SEQ ID NO.7所示。
第六种异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法，包括如下步骤：
向重组菌2中导入鲨烯合酶的编码基因ERG9，得到重组菌7；
所述鲨烯合酶的编码基因ERG9如SEQ ID NO.8所示。
第七种异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法，包括如下步骤：
向重组菌2中导入乙酰乙酰辅酶A硫解酶的编码基因ERG10，得到重组菌8；
所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶的编码基因ERG10如SEQ ID NO.9所示。
第八种异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法，包括如下步骤：
向重组菌2中导入甲羟戊酸激酶的编码基因ERG12的表达盒，得到重组菌9；
所述甲羟戊酸激酶的编码基因ERG12如SEQ ID NO.10所示。
第九种异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法，包括如下步骤：
向重组菌2中导入甲羟戊酸二磷酸脱羧酶的编码基因ERG19，得到重组菌10；
所述甲羟戊酸二磷酸脱羧酶的编码基因ERG19如SEQ ID NO.11所示。
第十种异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法，包括如下步骤：
向重组菌2中导入法尼基焦磷酸合酶的编码基因ERG20，得到重组菌11；
所述法尼基焦磷酸合酶的编码基因ERG20如SEQ ID NO.12所示。
第十一种异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法，包括如下步骤：
向重组菌2中导入异戊烯基焦磷酸异构酶的编码基因IDI，得到重组菌12；
所述异戊烯基焦磷酸异构酶的编码基因IDI如SEQ ID NO.13所示。
上述异源合成β-香树脂醇的重组解脂耶氏酵母的构建方法构建的异源合成β-香树脂醇的重组解脂耶氏酵母。
上述异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法构建的异源合成β-香树脂醇的重组解脂耶氏酵母。
上述异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母发酵生产达β-香树脂醇和齐墩果酸的用途。
本发明的优点：实验证明，通过同源重组的方法，获得产β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母菌使β-香树脂醇和齐墩果酸的产量提高，本发明的方法为人工合成β-香树脂醇和齐墩果酸提供了依据。
具体实施方式
β-香树脂醇和齐墩果酸的定性用LC-MS进行。液相色谱条件：进样量5μL，安捷伦ZORBAX SB-Aq；流动相为90％乙腈，流速：0.2mL/min。质谱条件：雾化气和干燥气都为N2；碰撞电压：-70V；喷雾电压：3.8kV；离子源：APCI；离子源温度：120℃；脱溶温度：300℃；柱后流出物导入离子源速率：5μL/min；质谱扫描质量数范围：200-1000Da。
β-香树脂醇和齐墩果酸的定量用HPLC进行。液相色谱条件：进样量20μL，安捷伦ZORBAX SB-Aq；流动相为甲醇：乙腈＝4:6(V/V)，流速：1mL/min。
原菌株为解脂耶氏酵母ATCC 201249，以下简称解脂耶氏酵母。
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)购买时间，2017.6网址https://www.atcc.org/
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、异源合成β-香树脂醇的重组解脂耶氏酵母YL-BAS(重组菌1)的构建
一、模块构建
来源于光果甘草(Glycyrrhiza glabra)的基因bAS(β-香树脂醇合酶编码基因)(GenBank：BAA89815.1)由武汉金开瑞公司负责针对解脂耶氏酵母的密码子优化与全化学合成，得到优化后的β-香树脂醇合酶编码基因，优化后的β-香树脂醇合酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
启动子TEF1(SEQ ID NO.14)，终止子XPR2(SEQ ID NO.17)，rDNA-up(SEQ IDNO.22)，rDNA-down(SEQ ID NO.23)均来自解脂耶氏酵母ATCC 201249基因组，筛选标记基因URA3(SEQ ID NO.20)序列来自解脂耶氏酵母ATCC 201249，基因由武汉金开瑞生物工程有限公司通过化学合成的方法合成；
以解脂耶氏酵母ATCC201249基因组为模板，以rDNAup-F(SEQ ID NO.24)，rDNAup-R-tef(SEQ ID NO.25)为引物，扩增rDNA-up；
以TEF1p-F-rdnaup(SEQ ID NO.26)，TEF1p-R-opylbAS(SEQ ID NO.27)为引物扩增启动子TEF1；以opYlBAS-F-tef(序列SEQ ID NO.28)，opYlBAS-R-xpr(SEQ ID NO.29)为引物扩增bAS(优化后的β-香树脂醇合酶编码基因)；
以XPR2t-F-opylbAS(SEQ ID NO.30)，XPR2t-R-ura(SEQ ID NO.31)为引物扩增终止子XPR2；
以URA-F-xpr(SEQ ID NO.32)，URA-R-rdnadown(SEQ ID NO.33)为引物扩增URA3；
以rDNAdown-F-ura(SEQ ID NO.68)，rDNAdown-R为引物(SEQ ID NO.69)，扩增rDNA-down。
本发明所用PCR酶为南京诺唯赞生物科技有限公司的
Figure BDA0002374364360000051
Max Super-Fidelity聚合酶。50μL的PCR扩增体系如下：DNA模板，1μL；前引(10μM)和后引(10μM)各2μL；dNTP(10mM)，1μL；2×Phanta Max Buffer，25μL；
Figure BDA0002374364360000052
Max Super-Fidelity聚合酶，1μL；最后用双蒸水补齐50μL。在PCR仪上设置扩增程序。扩增条件为95℃预变性4min(1个循环)；95℃变性15sec、退火60℃15sec、72℃延伸1min(34个循环)；72℃延伸5min(1个循环)。
本发明所用融合PCR体系如下：DNA片段总量800ng，摩尔比1:1；dNTP(10mM)，1μL；2×Phanta Max Buffer，25μL；
Figure BDA0002374364360000053
Max Super-Fidelity聚合酶，1μL；最后用双蒸水补齐50μL。在PCR仪上设置扩增程序。扩增条件为95℃预变性4min(1个循环)；95℃变性15sec、60℃退火30sec、72℃延伸1min(11个循环)，72℃延伸5min(1个循环)。
最后得到转化解脂耶氏酵母所用的DNA片段，分别连有上游同源臂rDNAup的基因BAS表达盒PTEF1-BAS-TXPR2和含有筛选标记基因URA3的下游同源臂URA3-rDNAdown。
二、解脂耶氏酵母转化
初始菌株解脂耶氏酵母ATCC 201249在YPD培养基中培养12h后取300μL加入至3mL新鲜YPD培养基中，培养5h。3000rpm离心5min，收集菌体，弃上清，用灭菌的ddH2O洗涤菌体，在3000rpm离心5min，收集菌体，弃上清。然后将1mL 100mM的醋酸锂加入菌体中，轻轻吹打使细胞悬浮均匀，室温下放置5min后在3000rpm常温离心5min，收集菌体，制备酵母感受态细胞。转化混合体系包括240μL PEG(50％W/V)，36μL 1.0M醋酸锂，10μL ss-DNA，转化片段分别连有上游同源臂rDNAup的基因BAS表达盒PTEF1-BAS-TXPR2和含有筛选标记基因URA3的下游同源臂URA3-rDNAdown的两段片段各400ng。最后用灭菌的ddH2O补齐至360μL。按上述顺序将各项依次加入刚制备的解脂耶氏酵母感受态细胞中，用移液枪吹打均匀，在42℃水浴放置30min，4000rpm离心2min，弃上清后加入1mLYPD液体培养基，30℃220rpm培养2h。然后4000rpm常温离心5min，弃上清，无菌水洗涤2次，最后用100μL无菌水重悬细胞，涂缺失URA的平板进行筛选。筛选培养条件为30℃，培养48h以上。挑取转化子过夜培养，提基因组，并pcr验证，得到正确目的片段的为正确克隆，命名为菌株YL-BAS(重组菌1)。
实施例2、异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母YL-CYP716A12(重组菌2)的构建方法
来源于光果甘草(Glycyrrhiza glabra)的基因bAS(GenBank：BAA89815.1)和来源于蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的CYP716A12(GenBank：CBN88268.1)由武汉金开瑞公司负责针对解脂耶氏酵母的密码子优化与全化学合成。得到优化后的β-香树脂醇合酶编码基因和优化后的齐墩果酸合酶编码基因，优化后的齐墩果酸合酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
细胞色素-NADPH-还原酶1的编码基因AtCPR1来源于拟南芥，基因由武汉金开瑞生物工程有限公司通过化学合成的方法合成，并针对解脂耶氏酵母进行密码子优化，得到优化后的细胞色素-NADPH-还原酶1的编码基因，优化后的细胞色素-NADPH-还原酶1的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
启动子TEF1(SEQ ID NO.14)，EXP1(SEQ ID NO.15)，GPD1(SEQ ID NO.16)；终止子XPR2(SEQ ID NO.17)，MIG1(SEQ ID NO.18)，LIP2(SEQ ID NO.19)，rDNA-up(SEQ IDNO.22)，rDNA-down(SEQ ID NO.23)均来自解脂耶氏酵母ATCC 201249基因组，筛选标记基因URA3(SEQ ID NO.20)序列来自解脂耶氏酵母ATCC 201249，基因由武汉金开瑞生物工程有限公司通过化学合成的方法合成；以解脂耶氏酵母ATCC 201249基因组为模板，以rDNAup-F(SEQ ID NO.24)，rDNAup-R-tef(SEQ ID NO.25)为引物，扩增rDNA-up；
以TEF1p-F-rdnaup(SEQ ID NO.26)，TEF1p-R-opylbAS(SEQ ID NO.27)为引物扩增启动子TEF1；
以opYlBAS-F-tef(SEQ ID NO.28)，opYlBAS-R-xpr(SEQ ID NO.29)为引物扩增BAS；
以XPR2t-F-opylbAS(SEQ ID NO.30)，XPR2t-R-exp(SEQ ID NO.34)为引物扩增终止子XPR2；
以EXP1p-F-xpr(SEQ ID NO.35)，EXP1p-R-ylCYP716A12(SEQ ID NO.36)为引物扩增启动子EXP1；
以YLCYP716A12-F-exp(SEQ ID NO.37)，YLCYP716A12-R-mig(SEQ ID NO.38)为引物扩增CYP716A12；
以MIG1t-F-ylCYP716A12(SEQ ID NO.39)，MIG1t-R-gpd(SEQ ID NO.40)为引物，扩增终止子MIG1；
以GPDp-F-mig(SEQ ID NO.41)，GPDp-R-ylatr1(SEQ ID NO.42)为引物，扩增启动子GPD1；
以YLATR1-F-gpd(SEQ ID NO.43)，YLATR1-R-lip(SEQ ID NO.44)为引物，扩增AtCPR1；
以LIP2t-F-ylatr1(SEQ ID NO.45)，LIP2t-R-ura(SEQ ID NO.46)为引物，扩增终止子LIP2；
以URA3-F-lip(SEQ ID NO.47)，URA-R-rdnadown(SEQ ID NO.33)为引物扩增URA3，
以rDNAdown-F-ura(SEQ ID NO.68)，rDNAdown-R(SEQ ID NO.69)为引物，扩增rDNA-down。
本发明所用PCR酶为南京诺唯赞生物科技有限公司的
Figure BDA0002374364360000071
Max Super-Fidelity聚合酶。50μL的PCR扩增体系如下：DNA模板，1μL；前引(10μM)和后引(10μM)各2μL；dNTP(10mM)，1μL；2×Phanta Max Buffer，25μL；
Figure BDA0002374364360000072
Max Super-Fidelity聚合酶，1μL；最后用双蒸水补齐50μL。在PCR仪上设置扩增程序。扩增条件为95℃预变性4min(1个循环)；95℃变性15sec、退火60℃15sec、72℃延伸1min(34个循环)；72℃延伸5min(1个循环)。
本发明所用融合PCR体系如下：DNA片段总量800ng，摩尔比1:1；dNTP(10mM)，1μL；2×Phanta Max Buffer，25μL；
Figure BDA0002374364360000081
Max Super-Fidelity聚合酶，1μL；最后用双蒸水补齐至50μL。在PCR仪上设置扩增程序。扩增条件为95℃预变性4min(1个循环)；95℃变性15sec、退火60℃30sec、72℃延伸1min(11个循环)，72℃延伸5min(1个循环)。
最后得到转化解脂耶氏酵母所用的DNA片段，分别连有上游同源臂rDNAup的基因BAS表达盒PTEF1-BAS-TXPR2，齐墩果酸合酶编码基因表达盒PEXP1p-CYP716A12-TMIG1t，细胞色素-NADPH-还原酶1的编码基因表达盒PGPD1p-AtCPR1-TLIP2t和含有筛选标记基因URA3的rDNA位点下游同源臂URA3-rDNA-down；
利用与实施例1中相同的酵母转化方法，转化分别连有上游同源臂rDNAup的基因BAS表达盒PTEF1-BAS-TXPR2，齐墩果酸合酶编码基因表达盒PEXP1p-CYP716A12-TMIG1t，细胞色素-NADPH-还原酶1的编码基因表达盒PGPD1p-AtCPR1-TLIP2t和含有筛选标记基因URA3的rDNA位点下游同源臂URA3-rDNA-down的四段片段各400ng。在缺失URA的酵母合成培养基上培养，筛选培养条件为在30℃培养48h以上，挑取转化子过夜培养，提基因组，并用pcr验证，得到全部正确目的片段的为正确克隆，命名为菌株YL-CYP716A12(重组菌2)。
实施例3、基因元件克隆和含有对应基因元件的质粒构建
一、PCR扩增基因元件
以解脂耶氏酵母ATCC201249基因组为模板，用表1中的引物，分别扩增HMG1、tHMG1、ERG1、ERG8、ERG9、ERG10、ERG12、ERG19、ERG20和IDI。扩增后所得基因片段纯化回收备用。
表1 PCR扩增基因引物表
Figure BDA0002374364360000082
Figure BDA0002374364360000091
本发明所用PCR酶为南京诺唯赞生物科技有限公司的
Figure BDA0002374364360000092
Max Super-Fidelity聚合酶。50μL的PCR扩增体系如下：DNA模板，1μL；前引(10μM)和后引(10μM)各2μL；dNTP(10mM)，1μL；2×Phanta Max Buffer，25μL；
Figure BDA0002374364360000093
Max Super-Fidelity聚合酶，1μL；最后用双蒸水补齐50μL。在PCR仪上设置扩增程序。扩增条件为95℃预变性4min(1个循环)；95℃变性15sec、退火60℃15sec、7℃延伸1min(34个循环)；72℃延伸5min(1个循环)。
二、pHMG1质粒构建
PmlI酶切质粒pINA1269(普如汀生物技术(北京)有限公司)，纯化回收片段约7259bp。
该质粒构建使用南京诺唯赞生物科技有限公司的一步克隆试剂盒，在冰水浴中配制如表2所示反应体系。
表2 pHMG1质粒构建反应体系
Figure BDA0002374364360000094
体系配制完成后，使用微量移液枪温和吹打混匀。置于37℃反应30min。之后立即将反应体系放置在冰水浴中冷却5min。
大肠杆菌感受态细胞的化学转化法(热激法)
1.从-80℃冰箱中取出Trans5α化学感受态细胞成品，在冰盒中放置10min解冻，无菌环境下吸取50μL菌液至灭菌的1.5mLPE离心管中；
2.向离心管中加入5μL重组体系溶液，温和混匀，在冰盒中放置30min；
3.从冰盒中取出离心管，在42℃恒温水浴中热激30sec，取出并立刻在冰盒中放置2min；
4.向离心管中加入500μL灭菌的LB液体培养基，放入设定条件为37℃，200rpm的摇床中复苏1h；
5.在4000rmp条件下离心3min，吸去上清液350μL，收集菌体并重悬；
6.在无菌条件下，将菌液涂布在含有抗生素Amp的LB平板培养基上，在37℃培养箱中倒置过夜培养。
挑取转化子菌落PCR验证，得到正确目的片段的为正确转化子，提取质粒PmlI单酶切验证正确的质粒为正确质粒，命名为pHMG1质粒。
三、ptHMG1、pERG1、pERG8、pERG9、pERG10、pERG12、pERG19、pERG20和pIDI的质粒构建
利用上述“二、pHMG1质粒构建”的相同方法，将扩增获得的tHMG1、ERG1、ERG8、ERG9、ERG10、ERG12、ERG19、ERG20和IDI基因片段，利用一步克隆试剂盒，分别与PmlI线性化后的pINA1269质粒重组，经过大肠杆菌转化，转化子验证，提取质粒酶切验证，得到正确重组质粒，分别命名为ptHMG1、pERG1、pERG8、pERG9、pERG10、pERG12、pERG19、pERG20和pIDI。
实施例4、解脂耶氏酵母重组菌YL-CYP716A12-01(重组菌3)的构建
用BsrGI单酶切质粒pHMG1，纯化回收约10259bp的线性化质粒片段(含有表达盒Php4d-HMG1-TXPR2)。
采取与实施例1中相同的方法，进行YL-CYP716A12感受态细胞的制备及转化，转入线性化的pHMG1，在缺失LEU和URA的培养基中筛选培养，得到转化子。筛选培养条件为30℃，培养48h以上，挑取转化子过夜培养，提基因组，并用check引物验证，得到正确目的片段的为正确克隆，命名为菌株YL-CYP716A12-01(重组菌3)。LEU2为筛选标记，LEU2的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
实施例5、解脂耶氏酵母重组菌YL-CYP716A12-02(重组菌4)至YL-CYP716A12-10(重组菌12)的构建
用BsrGI单酶切质粒ptHMG1，pERG1、pERG8、pERG9、pERG10、pERG12、pERG19、pERG20和pIDI，纯化回收约10259bp的线性化质粒片段。
采取与实施例1中相同的方法，进行YL-CYP716A12感受态细胞的制备及转化，转入线性化的pHMG1，在缺失LEU和URA的培养基中筛选培养，得到转化子。筛选培养条件为30℃，培养48h以上，挑取转化子过夜培养，提基因组，并用check引物验证，得到正确目的片段的为正确克隆，命名为菌株YL-CYP716A12-02(重组菌4)，YL-CYP716A12-03(重组菌5)，YL-CYP716A12-04(重组菌6)，YL-CYP716A12-05(重组菌7)，YL-CYP716A12-06(重组菌8)，YL-CYP716A12-07(重组菌9)，YL-CYP716A12-08(重组菌10)，YL-CYP716A12-09(重组菌11)，YL-CYP716A12-10(重组菌12)。
实施例6、工程菌生产β-香树脂醇和齐墩果酸
1、工程菌培养和产物提取
将实施例1、2、4、5中得到的重组解脂耶氏酵母菌株YL-BAS，YL-CYP716A12，YL-CYP716A12-01，YL-CYP716A12-02，YL-CYP716A12-03，YL-CYP716A12-04，YL-CYP716A12-05，YL-CYP716A12-06，YL-CYP716A12-07，YL-CYP716A12-08，YL-CYP716A12-09和YL-CYP716A12-10，连同ATCC 201249，在固体筛选培养基上活化；于YPD液体培养基中制备发酵种子液(30℃,220rmp，16h)，离心收集菌体，转移至含30mL YPD发酵培养基的250mL三角瓶中，调节OD至0.5进行培养(30℃，220rmp)。6d后离心收集细胞，加入丙酮，在冰水浴中进行超声波破碎10min，然后在12000rpm常温条件下离心2min，取上清过0.22mm有机膜后备用。
2、LC-MS鉴定β-香树脂醇和齐墩果酸
β-香树脂醇和齐墩果酸的定性用LC-MS进行。液相色谱条件：进样量5μL，安捷伦ZORBAX SB-Aq；流动相为90％乙腈，流速：0.2mL/min。质谱条件：雾化气和干燥气都为N2；碰撞电压：-70V；喷雾电压：3.8kV；离子源：APCI；离子源温度：120℃；脱溶温度：300℃；柱后流出物导入离子源速率：5μL/min；质谱扫描质量数范围：200-1000Da。
β-香树脂醇和齐墩果酸的定量用HPLC进行，液相色谱条件：进样量20μL，安捷伦ZORBAX SB-Aq；流动相为甲醇：乙腈＝4:6，流速：1mL/min。β-香树脂醇标准品购自云南西力生物技术有限公司(www.biobiopha.com)。齐墩果酸标准品购自北京索莱宝科技有限公司(www.solarbio.cn)。
3、结果
解脂耶氏酵母ATCC 201249没有合成β-香树脂醇或齐墩果酸。
YL-BAS(重组菌1)和YL-CYP716A12(重组菌2)其提取产物经LC-MS检测：重组菌1的提取产物与β-香树脂醇标准品保留时间相同，质谱图相同，表明重组菌1提取产物中有β-香树脂醇；
重组菌2的提取产物与齐墩果酸标准品保留时间相同，质谱图相同，表明重组菌2提取产物中有齐墩果酸。
结果为重组菌1β-香树脂醇发酵产量达到22.8mg/L；重组菌2齐墩果酸发酵产量达24.5mg/L。
在重组菌2的基础上，通过对解脂耶氏酵母中HMG1、tHMG1、ERG1、ERG8、ERG9、ERG10、ERG12、ERG19、ERG20和IDI基因的表达上调后获得系列提高目标产物齐墩果酸产量的工程菌，各工程菌发酵6d后的产量如表3所示。表中所列数据均为三次平行实验取平均值。
表3工程菌齐墩果酸产量
工程菌株 上调基因 齐墩果酸产量(mg/L)
YL-CYP716A12-01(重组菌3) HMG1 51.7
YL-CYP716A12-02(重组菌4) tHMG1 56.4
YL-CYP716A12-03(重组菌5) ERG1 26.5
YL-CYP716A12-04(重组菌6) ERG8 25.1
YL-CYP716A12-05(重组菌7) ERG9 68.0
YL-CYP716A12-06(重组菌8) ERG10 43.1
YL-CYP716A12-07(重组菌9) ERG12 40.3
YL-CYP716A12-08(重组菌10) ERG19 47.5
YL-CYP716A12-09(重组菌11) ERG20 28.5
YL-CYP716A12-10(重组菌12) IDI 28.8
序列表
<110> 天津大学
<120> 异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母及构建方法
<160> 69
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2310
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtggaagc tgaaggtcgc ccagggtaac gacccttacc tgtactccac caacaacttc 60
gtcggccgac agtactggga gttccagccc gacgccggca cccccgagga gcgagaggag 120
gtcgagaagg cccgaaagga ttacgtcaac aacaagaagc tgcacggcat ccacccctgc 180
tctgatatgc tgatgcgacg acagctgatc aaggagtccg gcatcgacct gctgtccatc 240
ccccctctgc gactggacga gaacgagcag gttaactacg acgccgtcac caccgctgtc 300
aagaaggctc tgcgactgaa ccgagccatc caggctcatg acggtcactg gcctgctgag 360
aacgctggtt ctctgctgta caccccccct ctgatcatcg ctctgtacat ctccggcacc 420
atcgacacca tcctgaccaa gcagcacaag aaggagctga tccgattcgt ctacaaccac 480
cagaacgagg acggcggttg gggttcctac atcgagggtc attccaccat gatcggctcc 540
gtcctgtcct acgtcatgct gcgactgctg ggtgagggtc tggctgagtc cgacgacggt 600
aacggtgctg ttgagcgagg tcgaaagtgg atcttggacc acggcggtgc tgctggtatc 660
ccttcctggg gtaagaccta cctggccgtt ctgggtgtct acgagtggga gggttgcaac 720
cctctgcctc ctgagttctg gctgttccct tcctccttcc ccttccaccc tgctaagatg 780
tggatctact gccgatgcac ctacatgccc atgtcctacc tgtacggcaa gcgataccac 840
ggccctatca ccgatctggt cctgtctctg cgacaggaga tctacaacat cccctacgag 900
cagatcaagt ggaaccagca gcgacacaac tgctgcaagg aggacctgta ctacccccac 960
accctggttc aggacctggt ttgggacggt ctgcactact tctccgagcc tttcctgaag 1020
cgatggccct tcaacaagct gcgaaagcga ggcctgaagc gagtcgttga gctgatgcga 1080
tacggcgcta ccgagactcg attcatcacc accggcaacg gcgagaaggc tctgcagatt 1140
atgtcctggt gggccgagga ccctaacggt gacgagttta agcaccacct ggcccgaatc 1200
cccgactttc tgtggatcgc tgaggacggt atgaccgtcc agtccttcgg ttcccagctg 1260
tgggattgca tcctggctac ccaggctatc atcgccacca acatggtcga ggagtacggc 1320
gattccctga agaaggccca cttcttcatc aaggagtccc agatcaagga gaacccccga 1380
ggtgacttcc tgaagatgtg ccgacagttc accaagggcg cctggacctt ttccgaccag 1440
gatcatggct gcgtcgtctc tgactgcacc gctgaggctc tgaagtgcct gctgctgctg 1500
tctcagatgc cccaggatat cgtcggcgag aagcctgagg tcgagcgact gtacgaggct 1560
gttaacgtcc tgctgtacct gcagtcccga gtctctggtg gtttcgctgt ctgggagcct 1620
cctgttccta agccttacct ggagatgctg aacccctccg agatcttcgc cgacatcgtc 1680
gttgagcgag agcacatcga gtgcaccgct tctgtcatca agggcctgat ggccttcaag 1740
tgcctgcacc ctggtcaccg acagaaggag atcgaggact ccgtcgctaa ggccatccga 1800
tacctggagc gaaaccagat gcccgacggt tcttggtacg gcttctgggg tatctgcttc 1860
ctgtacggca ccttcttcac cctgtccggt ttcgcttccg ccggtcgaac ctacgataac 1920
tccgaggctg tccgaaaggg cgtcaagttc ttcctgtcca cccagaacga ggagggcggt 1980
tggggtgagt ccctggagtc ctgcccttcc gagaagttca cccctctgaa gggcaaccga 2040
accaacctgg tccagacctc ttgggctatg ctgggtctga tgttcggcgg tcaggctgag 2100
cgagatccta ctcctctgca ccgagctgct aagctgctga tcaacgccca gatggacaac 2160
ggcgacttcc ctcagcagga gatcaccggt gtctactgca agaactccat gctgcactac 2220
gccgagtacc gaaacatctt ccccctgtgg gccctgggtg agtaccgaaa gcgagtttgg 2280
ctgcccaagc accagcagct gaagatctaa 2310
<210> 2
<211> 1449
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggtcctgt tcttctccct gtccctgctg ctgctgcctc tgctgctgct gtttgcttac 60
ttctcctaca ccaagcgaat cccccagaag gagaacgact ccaaggcccc cctgcctcct 120
ggtcagaccg gttggcctct gattggtgag accctgaact acctgtcctg cgtcaagtcc 180
ggcgtctctg agaacttcgt caagtaccga aaggagaagt actcccccaa ggtcttccga 240
acctccctgc tgggtgagcc tatggctatc ctgtgcggtc ctgagggtaa caagttcctg 300
tactccaccg agaagaagct ggtccaggtc tggttcccct cctctgttga gaagatgttc 360
ccccgatccc acggcgagtc taacgctgac aacttctcca aggtccgagg caagatgatg 420
ttcctgctga aggtcgatgg catgaagaag tacgtcggcc tgatggaccg agtcatgaag 480
cagttcctgg agaccgactg gaaccgacag cagcagatca acgtccacaa caccgtcaag 540
aagtacaccg tcaccatgtc ctgccgagtc ttcatgtcca tcgacgacga ggagcaggtc 600
acccgactgg gttcctccat tcagaacatc gaggccggcc tgctggctgt ccctatcaac 660
attcccggca ccgctatgaa ccgagccatc aagaccgtca agctgctgac ccgagaggtc 720
gaggctgtta tcaagcagcg aaaggtcgat ctgctggaga acaagcaggc ctcccagcct 780
caggatctgc tgtcccacct gctgctgact gctaaccagg acggtcagtt cctgtccgag 840
tccgatatcg cctcccacct gatcggtctg atgcagggtg gttacaccac cctgaacggc 900
actatcacct tcgtcctgaa ctacctggcc gagttccccg atgtctacaa ccaggtcctg 960
aaggagcagg tcgagatcgc taactccaag caccccaagg agctgctgaa ctgggaggat 1020
ctgcgaaaga tgaagtactc ctggaacgtc gcccaggagg tcctgcgaat tatccctcct 1080
ggcgtcggta ctttccgaga ggctatcacc gacttcacct acgccggtta cctgatcccc 1140
aagggttgga agatgcacct gatcccccac gacacccaca agaaccctac ctacttcccc 1200
tcccccgaga agttcgaccc tactcgattc gagggcaacg gccctgctcc ttacactttc 1260
acccccttcg gcggtggtcc tcgaatgtgc cctggtattg agtacgcccg actggtcatc 1320
ctgatcttca tgcacaacgt cgtcaccaac ttccgatggg agaagctgat ccccaacgag 1380
aagatcctga ccgaccccat cccccgattc gctcacggtc tgcctatcca tctgcaccct 1440
cacaactaa 1449
<210> 3
<211> 2079
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgacctccg ctctgtacgc ttccgacctg ttcaagcagc tgaagtccat catgggcacc 60
gactccctgt ccgatgacgt tgttctggtc atcgccacca cctccctggc cctggtcgcc 120
ggcttcgtcg tcctgctgtg gaagaagacc accgctgacc gatccggtga gctgaagccc 180
ctgatgatcc ctaagtccct gatggccaag gacgaggacg acgatctgga cctgggttct 240
ggtaagaccc gagtctccat cttcttcggc acccagaccg gtactgccga gggcttcgcc 300
aaggccctgt ccgaggagat caaggcccga tacgagaagg ccgctgtcaa ggttatcgac 360
ctggacgact acgccgccga tgatgatcag tacgaggaga agctgaagaa ggagaccctg 420
gccttcttct gcgtcgctac ttacggcgac ggcgagccca ccgacaacgc cgcccgattc 480
tacaagtggt tcaccgagga gaacgagcga gacatcaagc tgcagcagct ggcttacggc 540
gtcttcgccc tgggcaaccg acagtacgag catttcaaca agatcggcat cgtcctggac 600
gaggagctgt gtaagaaggg cgctaagcga ctgatcgagg tcggtctggg tgacgatgac 660
cagtctatcg aggacgactt caacgcctgg aaggagtccc tgtggtccga gctggataag 720
ctgctgaagg acgaggacga caagtccgtc gctaccccct acactgctgt catccctgag 780
taccgagtcg tcacccacga cccccgattt actacccaga agtccatgga gtccaacgtc 840
gccaacggca acaccactat cgacatccac cacccctgcc gagtcgatgt tgctgttcag 900
aaggagctgc acacccacga gtccgatcga agctgtatcc acctggagtt cgacatctcc 960
cgaaccggta tcacctacga gaccggtgac cacgtcggtg tttacgctga gaaccacgtc 1020
gagatcgtcg aggaggctgg taagctgctg ggtcattccc tggacctggt cttctccatc 1080
cacgctgaca aggaggacgg ctctcctctg gagtctgctg ttcctcctcc cttccctggt 1140
ccttgtaccc tgggcaccgg cctggcccga tacgccgacc tgctgaaccc ccctcgaaag 1200
tccgctctgg ttgctctggc tgcttacgct accgagcctt ctgaggctga gaagctgaag 1260
cacctgacct cccctgacgg taaggacgag tactcccagt ggatcgtcgc ctctcagcga 1320
tctctgctgg aggttatggc cgctttcccc tctgctaagc cccctctggg tgttttcttc 1380
gccgctatcg cccctcgact gcagcctcga tactactcta tctcctcctc cccccgactg 1440
gctccttccc gagtccacgt cacctccgct ctggtctacg gtcctactcc taccggtcga 1500
atccacaagg gcgtctgttc cacctggatg aagaacgccg tccccgctga gaagtcccat 1560
gagtgctctg gtgcccctat cttcatccga gcctccaact tcaagctgcc ctccaaccct 1620
tccaccccta tcgttatggt cggccctggt actggcctgg ctcctttccg aggtttcctg 1680
caggagcgaa tggccctgaa ggaggatggt gaggagctgg gttcctccct gctgtttttc 1740
ggctgccgaa accgacagat ggacttcatc tacgaggacg agctgaacaa cttcgtcgat 1800
cagggcgtca tctccgagct gatcatggct ttctcccgag agggcgctca gaaggagtac 1860
gttcagcaca agatgatgga gaaggccgcc caggtctggg atctgattaa ggaggagggc 1920
tacctgtacg tctgcggtga tgctaagggc atggcccgag atgtccaccg aactctgcac 1980
actatcgtcc aggagcagga gggtgtctcc tcttctgagg ctgaggctat cgtcaagaag 2040
ctgcagaccg agggccgata cctgcgagac gtctggtaa 2079
<210> 4
<211> 3000
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 4
atgctacaag cagctattgg aaagattgtg ggatttgcgg tcaaccgacc catccacaca 60
gttgtcctga cgtccatcgt ggcgtcaacc gcatacctcg ccatcctcga cattgccatc 120
ccgggtttcg agggcacaca acccatctca tactaccacc ctgcagcaaa atcttacgac 180
aaccctgctg attggaccca cattgcagag gccgacatcc cttcagacgc ctaccgactt 240
gcatttgccc agatccgtgt cagtgatgtt cagggcggag aggcccccac catccctggc 300
gccgtggccg tgtctgatct cgaccacaga atcgtcatgg actacaaaca gtgggccccc 360
tggaccgcca gcaacgagca gatcgcctcg gagaaccaca tctggaagca ctccttcaag 420
gaccacgtgg ccttcagctg gatcaagtgg ttccgatggg cctacctgcg tttgtccact 480
ctcatccagg gggcagacaa cttcgacatt gccgtggtcg cccttggcta tcttgccatg 540
cactacacct tcttcagtct cttccgatcc atgcgaaagg ttggctcgca cttttggctt 600
gcctccatgg ctctggtctc ttccaccttc gctttcctgc ttgcggtggt ggcttcctct 660
agcctgggtt accgacctag catgatcacc atgtccgagg gcctgccctt cctcgtggtc 720
gccattggct ttgaccgaaa ggtcaacctg gctagcgagg tgctcacatc caagagcagc 780
cagctcgctc ccatggtgca ggtgatcaca aagatcgcct ccaaggcgct gtttgagtac 840
agccttgagg tggccgccct gtttgctggc gcctataccg gagttcctcg actgtcccag 900
ttttgcttct tatctgcttg gatcctcatc ttcgactaca tgtttttgct gaccttctac 960
tctgctgtcc ttgctatcaa gtttgagatc aatcacatta agcgaaaccg aatgatccag 1020
gatgctctca aggaggatgg tgtatctgct gctgttgccg agaaggtagc cgactcttct 1080
cccgacgcca agctcgaccg aaagtccgac gtttctcttt ttggagcctc tggcgccatt 1140
gcggtgttca agatcttcat ggtccttggg ttccttggtc tcaacctcat caacctgact 1200
gccatccctc accttggcaa ggcggccgcc gctgcccagt ctgtgactcc catcaccctc 1260
tcccccgagc ttctccatgc catccccgcc tctgtgcccg ttgttgtcac ctttgtgccc 1320
agcgttgtgt acgagcactc ccagctcatt ctgcagctgg aggacgccct cactaccttc 1380
ctggctgcct gctccaaaac tattggtgac cccgtcatct ccaagtacat cttcctgtgc 1440
ctgatggtct ccaccgccct gaacgtctac ctgtttggag ccacccgaga agttgtgcga 1500
acccagtctg tgaaggtggt tgagaagcac gttcctatcg tcattgagaa gcccagcgag 1560
aaggaggagg acacctcttc tgaagactcc attgagctga ctgtcggaaa gcagcccaag 1620
cccgtgaccg agacccgttc tctggacgac ctagaggcta tcatgaaggc aggtaagacc 1680
aagcttctgg aggaccacga ggttgtcaag ctctctctcg agggcaagct tcctttgtat 1740
gctcttgaga agcagcttgg tgacaacacc cgagctgttg gcatccgacg atctatcatc 1800
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gcttggcctg gcgcccagct cgcgaaacgc acctaggacc ctttggcacg ccgaaatgtg 420
ccacttttca gtctagtaac gccttaccta cgtcattcca tgcatgcatg tttgcgcctt 480
ttttcccttg cccttgatcg ccacacagta cagtgcactg tacagtggag gttttggggg 540
ggtcttagat gggagctaaa agcggcctag cggtacacta gtgggattgt atggagtggc 600
atggagccta ggtggagcct gacaggacgc acgaccggct agcccgtgac agacgatggg 660
tggctcctgt tgtccaccgc gtacaaatgt ttgggccaaa gtcttgtcag ccttgcttgc 720
gaacctaatt cccaattttg tcacttcgca cccccattga tcgagcccta acccctgccc 780
atcaggcaat ccaattaagc tcgcattgtc tgccttgttt agtttggctc ctgcccgttt 840
cggcgtccac ttgcacaaac acaaacaagc attatatata aggctcgtct ctccctccca 900
accacactca cttttttgcc cgtcttccct tgctaacaca aaagtcaaga acacaaacaa 960
ccaccccaac ccccttacac acaagacata tctacagca 999
<210> 16
<211> 931
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 16
cgcagtagga tgtcctgcac gggtcttttt gtggggtgtg gagaaagggg tgcttggaga 60
tggaagccgg tagaaccggg ctgcttgggg ggatttgggg ccgctgggct ccaaagaggg 120
gtaggcattt cgttggggtt acgtaattgc ggcatttggg tcctgcgcgc atgtcccatt 180
ggtcagaatt agtccggata ggagacttat cagccaatca cagcgccgga tccacctgta 240
ggttgggttg ggtgggagca cccctccaca gagtagagtc aaacagcagc agcaacatga 300
tagttggggg tgtgcgtgtt aaaggaaaaa aaaagaagct tgggttatat tcccgctcta 360
tttagaggtt gcgggataga cgccgacgga gggcaatggc gccatggaac cttgcggata 420
tcgatacgcc gcggcggact gcgtccgaac cagctccagc agcgtttttt ccgggccatt 480
gagccgactg cgaccccgcc aacgtgtctt ggcccacgca ctcatgtcat gttggtgttg 540
ggaggccact ttttaagtag cacaaggcac ctagctcgca gcaaggtgtc cgaaccaaag 600
aagcggctgc agtggtgcaa acggggcgga aacggcggga aaaagccacg ggggcacgaa 660
ttgaggcacg ccctcgaatt tgagacgagt cacggcccca ttcgcccgcg caatggctcg 720
ccaacgcccg gtcttttgca ccacatcagg ttaccccaag ccaaaccttt gtgttaaaaa 780
gcttaacata ttataccgaa cgtaggtttg ggcgggcttg ctccgtctgt ccaaggcaac 840
atttatataa gggtctgcat cgccggctca attgaatctt ttttcttctt ctcttctcta 900
tattcattct tgaattaaac acacatcaac a 931
<210> 17
<211> 411
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 17
cctgtcccca cgttgccggt cttgcctcct actacctgtc catcaatgac gaggttctca 60
cccctgccca ggtcgaggct cttattactg agtccaacac cggtgttctt cccaccacca 120
acctcaaggg ctctcccaac gctgttgcct acaacggtgt tggcatttag gcaattaaca 180
gatagtttgc cggtgataat tctcttaacc tcccacactc ctttgacata acgatttatg 240
taacgaaact gaaatttgac cagatattgt tgtaaataga aaatctggct tgtaggtggc 300
aaaatcccgt ctttgttcat caattccctc tgtgactact cgtcatccct ttatgttcga 360
ctgtcgtatt tttattttcc atacatacgc aagtgagatg cccgtgtccg a 411
<210> 18
<211> 502
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 18
cactggccgg tcgataattt aacgtgctga gctcagcaca cgcattgccc attggctgta 60
tatagatgaa tgtaatgata ccgtaagaga atgagagcac ggtattgtat tacaggggat 120
taagtacaca ttacttggag ttctgtacca gaagacacta ctatacatgg tatcacttac 180
attagagtcg gtgaccgtat tcgtctcgta tagacataat attttcctac cccacattgt 240
tcctgggcct tcggagcaca tctacagtga gtgactgttt cagttgagct tgaggggtta 300
agtaagtggg ggaagggttt gcgattctga aaaagagcat gactaatctc tctgtggagg 360
agcaatgaag tcacgtgatg caatcatacc ggtgtatcgg atctgcctgg gtgtctgatt 420
actaatcatt tactcacctg ttttccccag ctatctcatc catctcagag cctcggccca 480
gccttcggcc cttttgggtt tc 502
<210> 19
<211> 200
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 19
gctatttatc actctttaca acttctacct caactatcta ctttaataaa tgaatatcgt 60
ttattctcta tgattactgt atatgcgttc ctctaagaca aatcgaaacc agcatgcgat 120
cgaatggcat acaaaagttt cttccgaagt tgatcaatgt cctgatagtc aggcagcttg 180
agaagattga cacaggtgga 200
<210> 20
<211> 1907
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggtgtgttct gtggagcatt ctcacttttg gtaaacgaca ttgcttcaag tgcagcggaa 60
tcaaaaagta taaagtgggc agcgagtata cctgtacaga ctgtaggcga taactcaatc 120
caattacccc ccacaacatg actggccaaa ctgatctcaa gactttattg aaatcagcaa 180
caccgattct caatgaaggc acatacttct tctgcaacat tcacttgacg cctaaagttg 240
gtgagaaatg gaccgacaag acatattctg ctatccacgg actgttgcct gtgtcggtgg 300
ctacaatacg tgagtcagaa gggctgacgg tggtggttcc caaggaaaag gtcgacgagt 360
atctgtctga ctcgtcattg ccgcctttgg agtacgactc caactatgag tgtgcttgga 420
tcactttgac gatacattct tcgttggagg ctgtgggtct gacagctgcg ttttcggcgc 480
ggttggccga caacaatatc agctgcaacg tcattgctgg ctttcatcat gatcacattt 540
ttgtcggcaa aggcgacgcc cagagagcca ttgacgttct ttctaatttg gaccgatagc 600
cgtatagtcc agtctatcta taagttcaac taactcgtaa ctattaccat aacatatact 660
tcactgcccc agataaggtt ccgataaaaa gttctgcaga ctaaatttat ttcagtctcc 720
tcttcaccac caaaatgccc tcctacgaag ctcgagctaa cgtccacaag tccgcctttg 780
ccgctcgagt gctcaagctc gtggcagcca agaaaaccaa cctgtgtgct tctctggatg 840
ttaccaccac caaggagctc attgagcttg ccgataaggt cggaccttat gtgtgcatga 900
tcaagaccca tatcgacatc attgacgact tcacctacgc cggcactgtg ctccccctca 960
aggaacttgc tcttaagcac ggtttcttcc tgttcgagga cagaaagttc gcagatattg 1020
gcaacactgt caagcaccag tacaagaacg gtgtctaccg aatcgccgag tggtccgata 1080
tcaccaacgc ccacggtgta cccggaaccg gaatcattgc tggcctgcga gctggtgccg 1140
aggaaactgt ctctgaacag aagaaggagg acgtctctga ctacgagaac tcccagtaca 1200
aggagttcct ggtcccctct cccaacgaga agctggccag aggtctgctc atgctggccg 1260
agctgtcttg caagggctct ctggccactg gcgagtactc caagcagacc attgagcttg 1320
cccgatccga ccccgagttt gtggttggct tcattgccca gaaccgacct aagggcgact 1380
ctgaggactg gcttattctg acccccgggg tgggtcttga cgacaaggga gacgctctcg 1440
gacagcagta ccgaactgtt gaggatgtca tgtctaccgg aacggatatc ataattgtcg 1500
gccgaggtct gtacggccag aaccgagatc ctattgagga ggccaagcga taccagaagg 1560
ctggctggga ggcttaccag aagattaact gttagaggtt agactatgga tatgtaattt 1620
aactgtgtat atagagagcg tgcaagtatg gagcgcttgt tcagcttgta tgatggtcag 1680
acgacctgtc tgatcgagta tgtatgatac tgcacaacct gtgtatccgc atgatctgtc 1740
caatggggca tgttgttgtg tttctcgata cggagatgct gggtacaagt agctaatacg 1800
attgaactac ttatacttat atgaggcttg aagaaagctg acttgtgtat gacttattct 1860
caactacatc cccagtcaca ataccaccac tgcactacca ctacacc 1907
<210> 21
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cgcttttatg tatcatgatc tagtgatccc ccacacacca ta 42
<210> 22
<211> 700
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 22
tcgatcctaa ggggtggcat aactgtcgcg tacggcccga taagggcctt ctccaaaagg 60
gaagccggtt gaaattccgg cacttggatg tggattctcc acggcaacgt aactgaatgt 120
ggggacggtg gcacaagtct tggaaggagt tatcttttct ttttaacgga gtcaacaccc 180
tggaattagt ttgtctagag atagggtatc gttccggaag aggggggcag ctttgtcccc 240
tccgatgcac ttgtgacgcc ccttgaaaac ccgcaggaag gaatagtttt cacgccaagt 300
cgtactgata accgcagcag gtctccaagg tgaacagcct ctagttgata gaataatgta 360
gataagggaa gtcggcaaaa tagatccgta acttcgggat aaggattggc tctgggggtt 420
ggtggatgga agcgtgggag accccaaggg actggcggct gggcaactgg cagccggacc 480
cgcggcagac actgcgtcgc tccgtccaca tcatcaaccg ccccagaact ggtacggaca 540
aggggaatct gactgtctaa ttaaaacata gctttgcgat ggttgtaaaa caatgttgac 600
gcaaagtgat ttctgcccag tgctctgaat gtcaaagtga agaaattcaa ccaagcgcgg 660
gtaaacggcg ggagtaacta tgactctctt aaggtagcca 700
<210> 23
<211> 599
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 23
aatgcctcgt catctaatta gtgacgcgca tgaatggatt aacgagattc ccactgtccc 60
tatctactat ctagcgaaac cacagccaag ggaacgggct tggcagaatc agcggggaaa 120
gaagaccctg ttgagcttga ctctagtttg acattgtgaa gagacatagg gggtgtagaa 180
taagtgggag cttcggcgcc ggtgaaatac cactaccctt atcgtttctt tacttattta 240
gtaagtggaa gtggtttaac aaccattttc tagcattcct ttccaggctg aagacattgt 300
caggtgggga gtttggctgg ggcggcacat ctgttaaaag ataacgcaga tgtcctaagg 360
gggactcaat gagaacagaa atctcatgta gaacaaaagg gtaaaagtcc ccttgatttt 420
gattttcagt gtgaatacaa accatgaaag tgtggcctat cgatccttta gttgttcgga 480
gtttgaacct agaggtgcca gaaaagttac cacagggata actggcttgt ggcagtcaag 540
cgttcatagc gacattgctt tttgatcctt cgatgtcggc tcttcctatc ataccgaag 599
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tcgatcctaa ggggtggcat aactgtcgc 29
<210> 25
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
acgccgccaa cccggtctct tggctacctt aagagagtca t 41
<210> 26
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
atgactctct taaggtagcc aagagaccgg gttggcggcg ta 42
<210> 27
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gcgaccttca gcttccacat tttgaatgat tcttatactc a 41
<210> 28
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gagtataaga atcattcaaa atgtggaagc tgaaggtcgc c 41
<210> 29
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
accggcaacg tggggacagg ttagatcttc agctgctggt g 41
<210> 30
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
accagcagct gaagatctaa cctgtcccca cgttgccggt c 41
<210> 31
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
aatgtcgttt accaaaagtg agaatgctcc acagaacaca cctcggacac gggcatctca 60
ct 62
<210> 32
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ttttattttc catacatacg caagtgagat gcccgtgtcc gaggtgtgtt ctgtggagca 60
ttc 63
<210> 33
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gtcactaatt agatgacgag gcattggtgt agtggtagtg cagtgg 46
<210> 34
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tcaccgaaac gtgtggggct cgaaaaaacg ggcgccaaac tctcggacac gggcatctca 60
cttgc 65
<210> 35
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tatttttatt ttccatacat acgcaagtga gatgcccgtg tccgagagtt tggcgcccgt 60
tttttc 66
<210> 36
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
agggagaaga acaggaccat tgctgtagat atgtcttgtg t 41
<210> 37
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
cacaagacat atctacagca atggtcctgt tcttctccct g 41
<210> 38
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
taaattatcg accggccagt gttagttgtg agggtgcaga tg 42
<210> 39
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
atctgcaccc tcacaactaa cactggccgg tcgataattt a 41
<210> 40
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
tccacacccc acaaaaagac ccgtgcagga catcctactg cgaaacccaa aagggccgaa 60
gg 62
<210> 41
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tccatctcag agcctcggcc cagccttcgg cccttttggg tttcgcagta ggatgtcctg 60
cac 63
<210> 42
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
gcgtacagag cggaggtcat tgttgatgtg tgtttaattc a 41
<210> 43
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gaattaaaca cacatcaaca atgacctccg ctctgtacgc t 41
<210> 44
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
tgtaaagagt gataaatagc ttaccagacg tctcgcaggt a 41
<210> 45
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tacctgcgag acgtctggta agctatttat cactctttac aa 42
<210> 46
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
aatgtcgttt accaaaagtg agaatgctcc acagaacaca cctccacctg tgtcaatctt 60
ctc 63
<210> 47
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
gtcctgatag tcaggcagct tgagaagatt gacacaggtg gaggtgtgtt ctgtggagca 60
ttc 63
<210> 48
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
acaaccacac acatccacgt gatgctacaa gcagctattg gaaag 45
<210> 49
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ttagtttcgg gttcccacgt gctatgaccg tatgcaaata ttcgaa 46
<210> 50
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
acaaccacac acatccacgt gatgacccag tctgtgaagg tgg 43
<210> 51
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
ttagtttcgg gttcccacgt gctatgaccg tatgcaaata ttcgaa 46
<210> 52
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
acaaccacac acatccacgt gatggtcacc caacagtctg ca 42
<210> 53
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ttagtttcgg gttcccacgt gctaagtcag ctcgctccaa atgt 44
<210> 54
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
acaaccacac acatccacgt gatgaccacc tattcggctc cg 42
<210> 55
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
ttagtttcgg gttcccacgt gctacttgaa ccccttctcg agc 43
<210> 56
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
acaaccacac acatccacgt gatgggaaaa ctcatcgaac tgc 43
<210> 57
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ttagtttcgg gttcccacgt gctaatctct cagaggaaac atcttagagt c 51
<210> 58
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
acaaccacac acatccacgt gatgcgactc actctgcccc g 41
<210> 59
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
ttagtttcgg gttcccacgt gctactcgac agaagagacc t 41
<210> 60
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
acaaccacac acatccacgt gatggactac atcatttcgg cg 42
<210> 61
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ttagtttcgg gttcccacgt gctaatgggt ccagggaccg a 41
<210> 62
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
acaaccacac acatccacgt gatgatccac caggcctcca 40
<210> 63
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
ttagtttcgg gttcccacgt gctacttgct gttcttcaga gaacc 45
<210> 64
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
acaaccacac acatccacgt gatgtccaag gcgaaattcg a 41
<210> 65
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
ttagtttcgg gttcccacgt gctacttctg tcgcttgtaa atcttgg 47
<210> 66
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
acaaccacac acatccacgt gatgacgacg tcttacagcg aca 43
<210> 67
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
ttagtttcgg gttcccacgt gctacttgat ccaccgccga a 41
<210> 68
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
accactgcac taccactaca ccaatgcctc gtcatctaat tag 43
<210> 69
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
cttcggtatg ataggaagag ccgacatcg 29

Claims (15)

1.异源合成β-香树脂醇的重组解脂耶氏酵母的构建方法，其特征是包括如下步骤：向解脂耶氏酵母中导入优化后的β-香树脂醇合酶编码基因，得到重组菌1；
所述优化后的β-香树脂醇合酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法，其特征是包括如下步骤：
向解脂耶氏酵母中导入优化后的β-香树脂醇合酶编码基因、优化后的齐墩果酸合酶编码基因和优化后的细胞色素-NADPH-还原酶1的编码基因，得到重组菌2；
所述优化后的β-香树脂醇合酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述优化后的齐墩果酸合酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述优化后的细胞色素-NADPH-还原酶1的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法，其特征是包括如下步骤：
向重组菌2中导入3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的编码基因HMG1，得到重组菌3。
所述3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的编码基因HMG1如SEQ ID NO.4所示。
4.异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法，其特征是包括如下步骤：
(1)将编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因HMG1的5'端的核苷酸去除1500个，得到截短的编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因tHMG1；
所述3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的的编码基因HMG1的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；所述截短的编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
(2)将截短的编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因导入重组菌2中，得到重组菌4。
5.异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法，其特征是包括如下步骤：
向重组菌2中导入氧化鲨烯环化酶的编码基因ERG1，得到重组菌5；
所述氧化鲨烯环化酶的编码基因ERG1如SEQ ID NO.6所示。
6.异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法，其特征是包括如下步骤：
向重组菌2中导入磷酸甲羟戊酸激酶的编码基因ERG8，得到重组菌6；
所述磷酸甲羟戊酸激酶的编码基因ERG8如SEQ ID NO.7所示。
7.异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法，其特征是包括如下步骤：
向重组菌2中导入鲨烯合酶的编码基因ERG9，得到重组菌7；
所述鲨烯合酶的编码基因ERG9如SEQ ID NO.8所示。
8.异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法，其特征是包括如下步骤：
向重组菌2中导入乙酰乙酰辅酶A硫解酶的编码基因ERG10，得到重组菌8；
所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶的编码基因ERG10如SEQ ID NO.9所示。
9.异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法，其特征是包括如下步骤：
向重组菌2中导入甲羟戊酸激酶的编码基因ERG12的表达盒，得到重组菌9；
所述甲羟戊酸激酶的编码基因ERG12如SEQ ID NO.10所示。
10.异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法，其特征是包括如下步骤：
向重组菌2中导入甲羟戊酸二磷酸脱羧酶的编码基因ERG19，得到重组菌10；
所述甲羟戊酸二磷酸脱羧酶的编码基因ERG19如SEQ ID NO.11所示。
11.异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法，其特征是包括如下步骤：
向重组菌2中导入法尼基焦磷酸合酶的编码基因ERG20，得到重组菌11；
所述法尼基焦磷酸合酶的编码基因ERG20如SEQ ID NO.12所示。
12.异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法，其特征是包括如下步骤：
向重组菌2中导入异戊烯基焦磷酸异构酶的编码基因IDI，得到重组菌12；
所述异戊烯基焦磷酸异构酶的编码基因IDI如SEQ ID NO.13所示。
13.权利要求1的异源合成β-香树脂醇的重组解脂耶氏酵母的构建方法构建的异源合成β-香树脂醇的重组解脂耶氏酵母。
14.权利要求2-12之一的异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法构建的异源合成β-香树脂醇的重组解脂耶氏酵母。
15.权利要求14的异源合成β-香树脂醇和齐墩果酸的重组解脂耶氏酵母发酵生产达β-香树脂醇和齐墩果酸的用途。
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