CN109234291A - 远志齐墩果酸合酶基因PtOAS及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种远志齐墩果酸合酶基因PtOAS及其应用，具体公开了远志齐墩果酸合酶基因PtOAS及含所述基因PtOAS的酵母表达载体的构建，同时还公开了所述基因PtOAS及含所述基因PtOAS的酿酒酵母表达载体在制备齐墩果酸中的应用。本发明为远志中齐墩果酸合酶基因的功能验证提供理论依据，同时为通过酿酒酵母制备齐墩果酸提供实践基础。

Description

远志齐墩果酸合酶基因PtOAS及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及齐墩果酸相关基因-远志齐墩果酸合酶基因PtOAS及其在制备齐墩果酸中的应用。

背景技术

远志(Polygala tenuifolia Willd.)，是我国重要的大宗药材之一。2015年版《中国药典》记载远志具有安神益智、交通心肾、祛痰、消肿之功效。植物次生代谢物是中药发挥药效的物质基础，而皂苷类成分则是远志发挥益智等传统功效和抗衰老及脑保护等现代药理作用的主要贡献者。远志皂苷，属齐墩果烷型的五环三萜类化合物，以原远志皂苷元为主要母核，结构复杂且较为相似，采用传统化学方法制备目前面临着诸多困难，而通过植物组培方式生产则相关研究又进展缓慢，导致至今仍处于无法大量获得此类化合物的窘况，进一步限制了远志益智、抗衰老及脑保护等作用与机制的深入研究。这一现状已严重制约了远志的先导化合物发现和新适应症寻找等新药研发进程。

而在体外进行天然产物的异源合成为远志皂苷的开发提供了新的思路，即通过研究远志皂苷合成途径中的催化酶，将合成途径导入微生物细胞，从而大量获得天然产物或其前体。远志皂苷的生物合成分为三个阶段：(1)以乙酰辅酶A为原料，通过MVA、途径合成前体IPP和DMAPP；(2)前体物质经过酶的催化合成骨架2，3-氧化角鲨烯；(3)细胞色素CYP450对骨架加氧及糖基转移酶UGT的加糖促进皂苷的合成。在这一过程中，研究参与远志皂苷生物合成途径中的关键酶显得至关重要。其中前两个阶段的合成过程已经基本明确。Jin等在远志中发现了β-AS(β-香树脂醇合酶)，可催化2，3-氧化角鲨烯生成β-香树脂醇。张根林在酿酒酵母中构建了β-香树脂醇合成途径，并对途径及发酵条件进行优化，优化后酿酒酵母中β-香树脂醇的产量为156.7mg/L。Dai等构建了产人参皂苷苷元的酵母工程菌，其中引入的苜蓿齐墩果酸合酶(MtOAS)可催化β-香树脂醇生成齐墩果酸。

前期研究结果发现，PtOAS可能以β-香树脂醇为底物，催化其生成远志皂苷的苷元齐墩果酸。因此，本发明通过在远志中克隆得到基因PtOAS，经序列比对发现PtOAS与其他物种中的类似基因相比同源性在75％左右，因此，PtOAS可能发挥氧化β-香树脂醇C-28位，即合成齐墩果酸的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种远志中齐墩果酸相关基因-齐墩果酸合酶基因及其在制备齐墩果酸中的应用。

本发明提供了一种远志齐墩果酸合酶基因PtOAS，所述基因PtOAS的cDNA序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种含有上述远志齐墩果酸合酶基因PtOAS的酿酒酵母表达载体，所述载体克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

产齐墩果酸酿酒酵母的构建方法：从远志中克隆得到齐墩果酸合酶基因PtOAS，使用重叠延伸PCR技术构建基因元件，使用酶切连接的方式构建质粒pRS304-ADH1p-PtOAS-ADH1t-ALA1p-CPR-ALA1t，经测序验证后，将此质粒以醋酸锂转化的方式转入产β-香树脂醇的酿酒酵母中，经酵母代谢物检测得到产齐墩果酸的酿酒酵母菌株。

本发明所述远志齐墩果酸合酶基因PtOAS可用于在酿酒酵母中制备齐墩果酸。

实验证实：将远志齐墩果酸合酶基因PtOAS转入酿酒酵母，经代谢物检测齐墩果酸的产量为0.28mg/L。

本发明的有益效果：本发明利用植物基因工程技术，克隆得到远志齐墩果酸合酶基因PtOAS，并构建含有远志齐墩果酸合酶基因PtOAS的酿酒酵母表达载体，将该载体转入产β-香树脂醇的酿酒酵母中，经过代谢物检测，本发明构建的酿酒酵母中齐墩果酸的产量为0.28mg/L。本发明远志齐墩果酸合酶基因PtOAS可在制备齐墩果酸中应用。

附图说明

图1为构建质粒pRS304-ADH1p-PtOAS-ADH1t-ALA1p-CPR-ALA1t的琼脂糖凝胶电泳图。M：DL 10000Marker；1：ADH1p；2：PtOAS；3：ADH1t；4：ADH1p-PtOAS-ADH1t；5：pRS304；6：pRS304-ADH1p-PtOAS-ADH1t；7：pRS304-ADH1p-PtOAS-ADH1t-ALA1p-CPR-ALA1t

图2为pRS304-ADH1p-PtOAS-ADH1t-ALA1p-CPR-ALA1t的载体示意图

图3为对照品齐墩果酸与PtOAS菌株中齐墩果酸的LC-MS提取离子流图(A：对照品；B：PtOAS菌株)

图4为对照品与PtOAS菌株中齐墩果酸的二级质谱图(A：对照品；B：PtOAS菌株)

具体实施方式

实施例1远志PtOAS的时空表达分析

1.1样品来源

本实施例中采用的远志药材采集于山西新绛。样品以每一铝箔纸包为计数单位，每一包样品至少采集3株以上远志，用铝箔纸包好，迅速保存于液氮中，再转移至-80℃保存。样品包含一年、二年、三年生的根、茎、叶、花样品。

1.2远志总RNA的提取

采用Trizol法提取不同年限远志及不同组织的RNA，提取过程中离心操作均为4℃、12000rpm，离心5min。具体操作如下：

(1)枪头、EP管用121℃灭菌20min，待用；干净的研钵、药勺用铝箔纸包好，180℃干烘5h，待用；

(2)研钵用液氮预冷，取新鲜的植物样本于研钵中，加入液氮，研至粉末；

(3)在无RNase的EP管中加入1mL Trizol，再加大约100mg的样品粉末至EP管中，用力摇晃使细胞壁破碎，保证Trizol可以充分裂解细胞释放的RNase，室温静置5min后离心；

(4)转移上清至另一无RNase的EP管，加200μL氯仿萃取，上下颠倒混匀，静置5min后离心，此时RNA在上层水相中；

(5)小心将上层水相转移至另一无RNase的EP管(在吸上层水相时，尽量避免吸入蛋白质，以免影响RNA质量。若不慎混有蛋白质，可重复步骤4，再用氯仿萃取一次)，加等体积异丙醇，静置10min后离心，弃上清；

(6)加入1mL的75％乙醇清洗沉淀，离心，重复两次；

(7)弃上清，待乙醇挥尽，用DEPC水溶解RNA，-80℃保存。

提取后总RNA用NanoDrop2000检测浓度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。浓度及完整性均符合要求，方可进行下一步操作。

1.3.cDNA的合成

(1)配制混合液1(见表1)，在PCR仪上70℃保温10min，迅速转移至冰上，放置2min以上；

(2)离心，配制混合液2(见表2)，42℃孵育1h；

(3)在PCR仪上70℃保温15min后，冰上冷却，便得到cDNA溶液。

表1混合液1的配制表

表2混合液2的配制表

1.4引物设计与合成

根据远志PtOAS的全长序列设计引物，由Primer Premier 5执行。内参基因为Cdc42，其unigene来源于远志转录组测序得到的c26151_g1_i1。引物由南京金斯瑞公司进行合成。引物PtOAS-F为5′-ACCGTGGTATCAAAGCCTC-3′，PtOAS-R为5′-AAGAATCTTGTCAGCGATGTCC-3′；Cdc42-F为5′-CTGCTGGACAGGAAGATTACG-3′，Cdc42-R为5′-CTCGGACATTCTCGAATGAAG-3′。

1.5实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

将cDNA稀释10倍后作为模板，用SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ型试剂盒及CG-05型RealTime PCR仪进行RT-qPCR实验，分析PtOAS在不同年限远志的不同组织中mRNA的表达水平。内参基因为Cdc42。每个样本进行3个生物学重复，每个生物学重复进行3个技术重复。反应体系共20μL如表3，反应程序：95℃1min；95℃15s，60℃15s，72℃45s；40个循环。反应后进行熔解度实验。

表3 RT-qPCR体系

1.6数据处理

mRNA表达量根据PtOAS及Cdc42获得的Ct值，用2^-ΔCT转化为相对定量数据。根据mRNA的时空表达量，最终选择二年生远志根作为模板进行PtOAS基因全长的获取。

实施例2构建产β-香树脂醇的酿酒酵母

2.1构建GgbAS表达载体

2.2.1引物合成

PCR引物由南京金斯瑞公司合成，构建GgbAS表达载体所用引物见表4。表中下划线部分为各片段之间的重叠区。

表4实验所用引物

2.2.2基因元件的扩增

对GgbAS(Genebank：AB037203.1)进行密码子优化，得到pUC57-GgbAS质粒，并以其为模板，扩增GgbAS基因元件。以酿酒酵母DNA为模板，扩增启动子TYS1p与终止子TYS1t。扩增体系见表5，运行程序为98℃10s，55～60℃5s，72℃1kb/min；共30～35个循环。1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的正确性，对目的条带切胶，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)进行胶回收。

表5常规PCR反应体系

2.2.3重叠延伸PCR(OE-PCR)组装基因元件

OE-PCR可通过两步PCR，在体外将两个基因元件连在一起。对TYS1p、GgbAS及TYS1t进行依次连接，得到两端具有酶切位点的TYS1p-GgbAS-TYS1t。具体操作如下：

(1)无引物预连

表6为无引物预连接的反应体系，体系中片段1与片段2的摩尔比相同。预连接程序为：98℃10s，Tm减(5～8)℃5s，72℃1kb/min，扩增13个循环。

(2)连接

连接体系以预连接产物为模板，加入两个片段的外侧引物进行扩增，得到片段1-2。连接的反应体系及运行程序与“2.2.2基因元件的扩增”操作一致。1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定OE-PCR产物，并对目的产物进行切胶回收。

表6无引物预连接反应体系

2.2.4酶切目的片段

以Apa I与BamH I分别双酶切质粒pRS425与TYS1p-GgbAS-TYS1t，酶切体系如表7，在酶最适温度下孵育2-3h或者过夜。酶切后电泳检测，胶回收目的片段。

表7酶切体系

2.2.5目的片段的的转化

(1)在酿酒酵母W303a(购自ATCC)平板上挑取生长良好的酵母单菌落至5mL YPD液体培养基中，30℃200rpm过夜培养16h。

(2)以10％体积比将酵母菌液转置新鲜的培养基中，30℃200rpm培养5-8h；

(3)冰浴冷却30min，使细胞代谢停止，收集1mL菌体于EP管中，4000rpm离心5min，弃上清；

(4)用1mL预冷的无菌水清洗沉淀，4000rpm离心5min，弃上清，重复两次。

(5)0.1M醋酸锂溶液对细胞进行预处理，室温静置5min，4000rpm离心5min，弃上清。

(6)煮沸SS-DNA 10min，冰水中快速冷却，依次加入240μL 50％PEG3350，36μL 1M醋酸锂，10μL单链鱼精DNA(煮沸SS-DNA 10min，使其变为单链)，64μL无菌重蒸水和6μL线性化的pRS425与TYS1p-GgbAS-TYS1t混匀，移液器吹打或涡旋使完全混匀。

(7)30℃孵育30min，42℃热激45min，4000rpm离心5min收集细胞。

(8)用1mL室温无菌水立即清洗沉淀，4000rpm离心5min，重复两次。

(9)弃部分上清，将剩余菌液重悬，涂布于SC-Leu培养基中，静置30min后，30℃培养箱中倒置2-3天观察生长状况。

(10)挑取单菌落至SC-Leu液体培养基中，30℃200rpm过夜培养。利用菌液PCR验证，并经代谢物检测，得到产β-香树脂醇的酿酒酵母菌株。

实施例3构建产齐墩果酸的酿酒酵母

3.1引物合成

PCR引物由南京金斯瑞公司合成，构建远志PtOAS与CPR表达载体所用引物见表8。表中加粗斜体为酶切位点，下划线部分为各片段之间的重叠区。

表8实验所用引物

3.2构建基因表达盒

用酿酒酵母基因组DNA提取试剂盒提取酵母DNA，以其为模板，扩增酿酒酵母启动子ADH1p和ALAIp，终止子ADH1t和ALAIt。以二年生远志根cDNA为模板扩增PtOAS，将产物送至上海桑尼生物科技股份有限公司测序验证，得到测序结果，如SEQ ID No.1所示。对百脉根(Lotus japonicus)CPR(Genebank：AB433810)基因进行密码子优化，以pUC57-CPR质粒为模板，扩增CPR元件。1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的正确性，对目的条带切胶，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)进行胶回收。通过OE-PCR依次连接ADH1p、PtOAS、ADH1t，ALA1p、CPR、ALA1t，得到两端具有酶切位点的ADH1p-PtOAS-ADH1t、ALA1p-CPR-ALA1t片段。

3.3酶切连接构建质粒

以Apa I和EcoR I双酶切pRS304与ADH1p-PtOAS-ADH1t，胶回收目的片段，以质粒与外源基因摩尔比＝1:3用T4连接酶连接，表9为连接体系，16℃连接6h，构建pRS304-ADH1p-PtOAS-ADH1t，测序验证。以EcoR I和BamH I双酶切pRS304-ADH1p-PtOAS-ADH1t与ALA1p-CPR-ALA1t，构建pRS304-ADH1p-PtOAS-ADH1t-ALA1p-CPR-ALA1t，测序验证。图1和图2分别为构建质粒pRS304-ADH1p-PtOAS-ADH1t-ALA1p-CPR-ALA1t的琼脂糖凝胶电泳图及载体示意图。

表9连接体系

3.4连接产物的转化

(1)取DH5α感受态50μL置于冰上，在刚要融化时，加入连接产物5μL，轻悬使其混匀，冰浴静置30min。

(2)42℃热激90s，迅速转移至冰浴冷却2min，该过程不要摇晃EP管。

(3)加入900μL无菌不含抗生素的LB液体培养基，混匀后37℃150rpm摇床孵育50min，使抗性基因表达。

(4)4000rpm离心2min，去上清，剩余200μL菌液涂至含相应抗生素的LB平板上，静置30min，37℃倒置12-16h。

(5)挑单菌落至含抗生素的液体培养基，37℃150rpm摇床培养12-16h。

(6)使用常规PCR扩增目的基因表达盒进行验证。

(7)将PCR验证正确的菌液送至上海桑尼生物科技股份有限公司测序验证。得到测序结果，如SEQ ID No.2所示。

3.5远志PtOAS酿酒酵母表达载体的构建

将质粒pRS304-ADH1p-PtOAS-ADH1t以醋酸锂转化的方式转入产β-香树脂醇的酿酒酵母中，30℃培养箱中倒置2-3天观察生长状况。挑取单菌落至SC-Leu-Trp液体培养基中，30℃200rpm过夜培养。利用菌液PCR进行验证。

实施例4酵母代谢物的提取及检测

4.1对照品溶液的配制

精密称取齐墩果酸对照品适量，甲醇定容，制成质量浓度为1.00mg/mL的对照品溶液。

4.2酵母代谢物的提取

将OD为1的上述酵母菌液以10％的体积比转入50mL的SC-Leu-Trp液体培养基中发酵14天。收集新鲜酵母菌液10mL用液氮研成粉末，以甲醇：丙酮＝1:1进行超声破碎提取30min，提取2次，合并上清液，过0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。

4.3酵母代谢物的检测

仪器：UHPLC-Q Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱。

色谱柱：Kinetex 2.6U C18液相色谱柱(2.1mm×100mm)，流动相为A：0.1％甲酸-10％甲醇水溶液；B：乙腈。柱温为30℃，流速为0.2mL/min，进样量为5μl。洗脱程序：15％A等度洗脱。

质谱条件：HESI离子源，在正离子以及负离子两种模式下进行检测，Mass Range:m/z100-1000，Spray voltage：3.5kV(+)，2.5kV(-)，Sheath gas Volume：35，Auxiliaryvolume：10，Capillary temperature：320℃，Lens voltage：55kPa，Mass resolution：70,000。

结果证实本发明构建的酿酒酵母菌株中齐墩果酸的产量为0.28mg/mL。对照品及PtOAS酿酒酵母菌株的LC-MS提取离子流图及齐墩果酸二级质谱图(正离子模式)见图3和图4。

序列表

<110> 山西大学

<120> 远志齐墩果酸合酶基因PtOAS及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1458

<212> DNA

<213> 远志(Polygala tenuifolia Willd)

<400> 1

atgatggagt tcaatgtcta tgtctccatt ctggttctct ttgtttcttt ggtttctctg 60

tccctcttgg tgctcctgta caggcacaga tcgcactaca gagcggccaa cctgccacct 120

ggtaagattg gattcccgtt gataggagag tcccttgagt tcttgtccac aggatggaaa 180

ggacaccccg agaagttcat tttcgaccgg atgaacaagt tctccaccca tgtcttcaag 240

accaatctgc ttggccaccc tgccgcagtc ttctgtggcg ctgcatgcaa caagttcttg 300

ttctccaacg agaacaaact tgtcactgcc tggtggcctg actctgtcaa caagatcttc 360

ccctcttcac tccagaccag ctctaaggaa gaagccaaaa agatgaggaa gttgcttcct 420

cagttcctca agcccgaagc tcttcagaga tacattggtg tcatggacac catagcccaa 480

aggcactttg ctgccggctg ggagaacaag gagcaggttg aagtcttccc tctggccaag 540

agatatactt tctggctggc ctgccgtttg ttcatcagcg ttgaggatcc cactcatgtt 600

gaaagatttg cagacccttt tcagcttttg gcctctggga tcatatccgt gcccattgac 660

ttgcccggaa caccattcaa ccgtggtatc aaagcctcca acttcatcag aaaggagttg 720

ttgtctatta tcaagcagag aaaaatcgat ttggctgaag gaaaggcttc ttcgaatcaa 780

gacatactct ctcacatgct tttgactagt gacgagaacg gacagtatat gaacgagctg 840

gacatcgctg acaagattct tggcttgtta attggtggcc atgacactgc cagtgctgct 900

tgcactttca tagtcaagtt tctcgctgaa cttcctcata tctacgaaga agtctacaag 960

gaacaaatgg agatcgcaaa atcaaaggga cctggagagt tgttgaattg ggatgacatc 1020

cagaagatga ggtattcgtg gaacgtagct tgtgaagtga tgaggcttgc ttctccactg 1080

caaggtgcct ttagggaagc tctgaacgat ttcatcttca acggtttctc cattcctaaa 1140

ggctggaagt tatactggag cgctaattcg acccacaaga atccagagta cttcccggag 1200

ccggagaaat ttgacccgag cagatttgag ggaaatgggc ctgcaccgta cacattcgtt 1260

ccatttggtg gagggcccag aatgtgccca ggtaaagagt acgcccgatt agagattttg 1320

gtattcatgc acaacctggt gcggaggttc aggtgggaga aagtcattcc agatgagaag 1380

gtggtggttg atccaatgcc catgccagct aagaaccttc ctgttcgtct tttccctcac 1440

aaaccaagcc tgaactga 1458

<210> 2

<211> 5098

<212> DNA

<213> 远志(Polygala tenuifolia Willd)

<400> 2

agacaagaca taatgggcta aacaagacta caccaattac actgcctcat tgatggtggt 60

acataacgaa ctaatactgt agccctagac ttgatagcca tcatcatatc gaagtttcac 120

tacccttttt ccatttgcca tctattgaag taataatagg cgcatgcaac ttcttttctt 180

ttttttcttt tctctctccc ccgttgttgt ctcaccatat ccgcaatgac aaaaaaatga 240

tggaagacac taaaggaaaa aattaacgac aaagacagca ccaacagatg tcgttgttcc 300

agagctgatg aggggtatct cgaagcacac gaaacttttt ccttccttca ttcacgcaca 360

ctactctcta atgagcaacg gtatacggcc ttccttccag ttacttgaat ttgaaataaa 420

aaaaagtttg ctgtcttgct atcaagtata aatagacctg caattattaa tcttttgttt 480

cctcgtcatt gttctcgttc cctttcttcc ttgtttcttt ttctgcacaa tatttcaagc 540

tataccaagc atacaatcaa ctatgatgga gtttaatgtt tacgtttcta tcttggtttt 600

gtttgtttca ttggtttctt tatcattgtt agttttgtta tatagacata gatctcatta 660

cagagctgca aatttgccac caggtaaaat cggtttccca ttgatcggtg aatctttgga 720

atttttgtca actggttgga agggtcatcc agaaaagttt attttcgata gaatgaataa 780

gttttctact catgttttta aaacaaattt gttaggtcat ccagctgctg ttttctgtgg 840

tgctgcatgt aataagttct tgttttctaa cgaaaataag ttagttactg cttggtggcc 900

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gaaaatgaga aagttgttgc cacaattctt gaagccagaa gctttacaaa gatacatcgg 1020

tgttatggat acaattgcac aaagacattt tgctgctggt tgggaaaata aggaacaagt 1080

tgaagttttc ccattggcta agagatacac tttctggttg gcatgtagat tgtttatttc 1140

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tatcatctca gttccaatcg atttgccagg tactcctttt aatagaggta ttaaagcttc 1260

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cggtcaatac atgaacgaat tggatatcgc tgataagatc ttgggtttgt taattggtgg 1440

tcatgatact gcttctgctg catgtacttt tattgttaag ttcttggcag aattgccaca 1500

tatctatgaa gaagtttaca aggaacaaat ggaaatcgca aagtcaaaag gtccaggcga 1560

attgttgaac tgggatgata tccaaaagat gagatactct tggaatgttg cttgtgaagt 1620

tatgagattg gcatcaccat tacaaggtgc ttttagagaa gcattgaacg atttcatttt 1680

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gaacccagaa tactttccag aaccagaaaa gttcgatcca tcaagattcg agggtaatgg 1800

tccagctcca tatacatttg ttccatttgg tggtggtcca agaatgtgtc ctggtaaaga 1860

atacgcaaga ttggaaatct tggtttttat gcataatttg gttagaagat tcagatggga 1920

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gccagttaga ttgttcccac ataaaccatc tttaaattaa taagcgaatt tcttatgatt 2040

tatgattttt attattaaat aagttataaa aaaaataagt gtatacaaat tttaaagtga 2100

ctcttaggtt ttaaaacgaa aattcgaatt caatcaacag aggcactcac actgatacgt 2160

ctatattcta ccaggacaat taatctttaa tatgccacgt tatatagtta gttaattagt 2220

atactaacta tatgagttat tgacaatccg ggtaatgcac acattaataa tctttcatgt 2280

ctttcgaatc aactgaaatt ggatatatac gtaagacaga gcgtgctgag caagattcaa 2340

attgttctag tgacccacca aagctgtatc atgccatgtt cagagacgac tacaccaaga 2400

agttaagtct aaaatcagca atataccgtc ctatgttagc ggtttttagt gccctgcaaa 2460

aaagtcaacg atgacctgaa taatttgcag attaaaccta acaattcaga accctatatt 2520

ttatttaatc atgatcaacg gattggccgt ttcttttttc tctttttttt catccgctcg 2580

atggatgatg agtaaaacaa gaaaaacgca gttggcgact gctatcagat atgaaagcag 2640

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tcttcttatt taagacaaga cgacgtcaac taccggatta aggaacttga ctctttcttt 2760

caagaagcaa ttaactacat caactagaac cataatggaa gaatcttcat ctatgaagat 2820

ctctccattg gatttgatgt cagcaatgat caagggtaca ttagatccat ctaacgtttc 2880

atctacttct ggtgctggtt cagttttctt ggaaaacaga gaatttgtta tggttttgac 2940

tacatcaatc gctgttttga tcggttgtgt tgttgttttt atttggagaa gatctactgg 3000

taataaggca aaatcaattg aaccaccaaa gagagttgtt gaaaagttgt ctgatgaagc 3060

tgaagttgat gatggtacaa gaaaggttac tattttcttt ggtactcaaa caggtactgc 3120

tgaaggtttt gctaaagcaa ttgctgaaga agcaaaagtt agatacgaaa aggctaagtt 3180

taaaattgtt gatatggatg attatgctca agatgatgat gaatacgaag aaaagttgaa 3240

gaaagaaaca ttggcattgt ttttcttggc tacatatggt gacggtgaac caactgataa 3300

cgctgcaaga ttctacaagt ggtttttgga aggtgacgaa aaagaagaag gttggttgag 3360

aaatttggaa tacgctgttt tcggtttggg taacagacaa tacgaacatt tcaataaggt 3420

tgcaatcgaa gttgatgata agttggctga ttttggtggt aaaagattgg ttaaagttgg 3480

tttaggtgac gatgatcaat gtatcgaaga tgatttcact gcatggaaag aagaattgtg 3540

gccagcttta gatgaattgt taagaggtga cgatgatact acagtttcta caccatatac 3600

tgctgctgtt ttggaataca gagttgttat tcatgatcca ttagatgcat cagttgatga 3660

aaagaaatgg cataacgtta atggtcatgc aattgttgat gctcaacatc cagttagatc 3720

taacgttgct gttagaaagg aattgcatac accagtttct gatagatcat gtactcattt 3780

ggaatttgat atttctggta caggtgttgc atatgaaact ggtgaccatg ttggtgttta 3840

ctgtgaaaat ttgtcagaaa ctgttgaaga agctgttaga ttgttaggtt tgtctccaga 3900

tacatacttc tcagttcata ctgatgatga agatggtaaa ccattgtctg gttcatcttt 3960

accaccaaca tttccaccat gtacattgag aactgcaatt gctagatacg ctgatgtttt 4020

gtcatctcca aagaaatctg ttttgttagc attggctgca catgcttcta atccatcaga 4080

agcagataga ttgagacatt tggcatctcc agctggtaaa gatgaatatt cagaatgggt 4140

tattgcttct caaagatcat tgttagaagt tatggcagaa tttccatctg ctaaaccacc 4200

aattggtgtt ttctttgctg caattgctcc aagattacaa ccaagattct actctatctc 4260

atcttcacca agaatggcac catctaggat tcatgttaca tgtgctttgg ttaacgataa 4320

gatgccaact ggtagaatac atagaggtgt ttgttctaca tggatgaaaa attcagttcc 4380

attagaaaaa tctcaagatt gttcatgggc accaatcttc gttagacaat ctaacttcaa 4440

gttgccagct gataataagg ttccaatcat catgattggt ccaggtactg gtttggctcc 4500

ttttagaggt ttcttgcaag aaagattggc attaaaagaa gatggtgctg aattgggtcc 4560

atctgttttg tttttcggtt gtagaaacag acaaatggat tacatctatg aagatgaatt 4620

gaaccatttt gttaattctg gtgcattgtc agaattgatc gttgcttttt caagagaagg 4680

tccaacaaag gaatacgttc aacataagat gatggaaaag gcatctgata tctggaacat 4740

gatctcacaa ggtgcttaca tctatgtttg tggtgacgca aagggtatgg ctagagatgt 4800

tcatagaaca ttgcatacta tcttacaaga acaaggttct ttagattctt caaaggctga 4860

gggtatggtt aaaaatttgc aattgaacgg tagatacttg agagatgttt gggaagttaa 4920

aataaaacga aaaataatgc ataggagttc tttttgttta ttttgctctt aataaaaaag 4980

tgtcattgta taattagtct tagtttaatt atttatgttt ttacaaggac aaaagatttg 5040

ctgttaaaaa gagttttaaa tacccttttt tcttacatat gtatatatac aggtttat 5098

Claims (4)

1.一种远志齐墩果酸合酶基因PtOAS，其特征在于：所述基因cDNA序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种含有权利要求1所述基因PtOAS的酿酒酵母表达载体，其特征在于：所述载体克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.如权利要求1所述远志齐墩果酸合酶基因PtOAS在制备齐墩果酸中的应用。

4.如权利要求2所述酿酒酵母表达载体在制备齐墩果酸中的应用。