CN111019850A - 重组微生物及构建方法和获得α-法尼烯的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种重组微生物及构建方法和获得α‑法尼烯的方法。所提供的重组微生物用于表达α‑法尼烯，所述重组微生物含有2个拷贝数的硫解酶编码基因，2个拷贝数的HMG‑CoA合成酶编码基因，至少3个拷贝数的HMG‑CoA还原酶编码基因，2个拷贝数的甲羟戊酸激酶编码基因，2个拷贝数的磷酸甲羟戊酸激酶编码基因，2个拷贝数的5‑焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶编码基因，2个拷贝数的异戊二烯焦磷酸异构酶编码基因，2个拷贝数的法尼基焦磷酸合成酶编码基因，以及至少1个拷贝数的α‑法尼烯合成酶编码基因。对该重组微生物进行培养，可以获得高产量的α‑法尼烯。

Description

重组微生物及构建方法和获得α-法尼烯的方法
技术领域
本发明涉及微生物制药领域，具体涉及一种重组微生物及构建方法和获得α-法尼烯的方法。
背景技术
酵母菌株作为在工业化生产中最常用的微生物，其也可用于合成α-法尼烯，目前有研究者利用包括酿酒酵母、解脂耶氏酵母来实现α-法尼烯的微生物合成。其中研究者利用代谢工程改造解脂耶氏酵母合成α-法尼烯，在解脂耶氏酵母中过表达tHMG1、IDI、ERG20以及密码子优化的苹果来源的α-Fs，使得最终发酵罐上α-法尼烯的产量为260mg/L。在酿酒酵母中，通过Tya(反转录转座子元件)与关键基因(tHMG1、IspA、苹果来源的aFS)融合表达实现空间隔离(如此可以使得反应底物与酶接触更紧密)，使得alpha-法尼烯产量在发酵罐上达到930mg/L。
如何通过微生物发酵进一步获得高产量的α-法尼烯，还需要进一步改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种重组微生物及构建方法和获得α-法尼烯的方法。
发明人通过研究发现：在对微生物进行培养获得α-法尼烯时，反应路径中酶量对于反应催化有着重要的影响。其不仅仅表现为提高反应路径中各酶的量，来提高α-法尼烯的产量，还表现为几种酶的量对于α-法尼烯的产量有着关键的影响，例如催化3-羟-3甲基戊二酰-CoA(HMG-CoA)合成甲羟戊酸(MVA)的HMG-CoA还原酶，其含量的提高能够显著提高α-法尼烯的产量；再例如催化法尼基焦磷酸合成α-法尼烯的α-法尼烯合成酶的量的提高也能显著提高α-法尼烯的产量。通过摸索，发明人在微生物体内构建了α-法尼烯的反应路径，使得获得的重组微生物中有关α-法尼烯的反应路径的各酶维持一定的比例和含量，并对该重组微生物进行培养，从而可以获得高产量的α-法尼烯。
具体而言，本发明提供了如下技术方案：
在本发明的第一方面，本发明提供了一种重组微生物，所述重组微生物用于表达α-法尼烯，所述重组微生物含有：2个拷贝数的硫解酶编码基因，2个拷贝数的HMG-CoA合成酶编码基因，至少3个拷贝数的HMG-CoA还原酶编码基因，2个拷贝数的甲羟戊酸激酶编码基因，2个拷贝数的磷酸甲羟戊酸激酶编码基因，2个拷贝数的5-焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶编码基因，2个拷贝数的异戊二烯焦磷酸异构酶编码基因，2个拷贝数的法尼基焦磷酸合成酶编码基因，以及至少1个拷贝数的α-法尼烯合成酶编码基因。本发明所提供的重组微生物，其基因组上含有不同拷贝数的各酶的编码基因，各酶的编码基因的拷贝数增加，能够提高微生物体内各酶的表达量，从而使得相应的催化反应提高，从而可以利用该重组微生物培养获得高产量的α-法尼烯。
根据本发明的实施例，以上所述的重组微生物进一步包括如下附加技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述重组微生物为酵母细胞，优选为酿酒酵母细胞。酵母细胞作为真核细胞，反应条件简单可控，尤其是酿酒酵母细胞简单可得，可以通过对该细胞培养，获得高产量的α-法尼烯。
在本发明的一些实施例中，所述重组微生物含有2～3个拷贝数的α-法尼烯合成酶编码基因，优选含有2个拷贝数的α-法尼烯合成酶编码基因。微生物体内α-法尼烯合成酶编码基因的拷贝数变化对于α-法尼烯产量表现出较大影响，当α-法尼烯合成酶编码基因的拷贝数由1个增加为2个或3个时，α-法尼烯的产量显著提高，尤其是α-法尼烯合成酶编码基因的拷贝数为2个时，α-法尼烯的产量最高。当继续增加α-法尼烯合成酶编码基因的拷贝数，例如增加为4个，甚至是5个时，α-法尼烯的产量变化不大。
在本发明的一些实施例中，所述重组微生物含有4个拷贝数的HMG-CoA还原酶编码基因。HMG-CoA还原酶作为影响α-法尼烯合成的关键酶，其编码基因表现为4个拷贝数时，能够显著提高α-法尼烯的产量。
在本发明的一些实施例中，所述重组微生物中选自下列的至少之一为外源编码序列：1个拷贝数的所述硫解酶编码基因，1个拷贝数的所述HMG-CoA合成酶编码基因，至少2个拷贝数的所述HMG-CoA还原酶编码基因，1个拷贝数的所述甲羟戊酸激酶编码基因，1个拷贝数的所述磷酸甲羟戊酸激酶编码基因，1个拷贝数的所述5-焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶编码基因，1个拷贝数的所述异戊二烯焦磷酸异构酶编码基因，1个拷贝数的所述法尼基焦磷酸合成酶编码基因，以及至少1个拷贝数的所述α-法尼烯合成酶编码基因。自然界或者天然存在的微生物体内，通常不含有α-法尼烯合成酶编码基因，分别含有1个拷贝数的其他酶的编码基因，因此本发明所提供的重组微生物通过人为构建获得含有特定拷贝数的各酶编码基因，通过提高这些酶的量以及赋予重组微生物以α-法尼烯合成酶，使得重组微生物可以发酵培养获得高产量的α-法尼烯。通过对自然界或者天然存在的微生物进行人工改造获得该重组微生物，该重组微生物中含有特定拷贝数的外源编码序列。
在本发明的一些实施例中，所述外源的硫解酶编码基因、所述外源的5-焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶编码基因和所述外源的异戊二烯焦磷酸异构酶编码基因位于同一染色体上；所述外源的磷酸甲羟戊酸激酶编码基因，所述外源的HMG-CoA还原酶编码基因和所述甲羟戊酸激酶编码基因位于同一染色体上；所述外源的HMG-CoA还原酶编码基因和所述外源的HMG-CoA合成酶编码基因位于同一染色体上；所述外源的α-法尼烯合成酶编码基因和所述外源的法尼基焦磷酸合成酶编码基因位于同一染色体上。催化异戊二烯焦磷酸在微生物体内积累，会表现出一定的毒性，在所提供的重组微生物中，外源的5-焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶编码基因和外源的异戊二烯焦磷酸异构酶编码基因位于同一染色体上，降低异戊二烯焦磷酸的积累，从而不会使得各产物过量表达，影响到重组微生物的生长。同样地，3-羟-3甲基戊二烯-CoA在微生物体内积累，会表现出一定的毒性，在所提供的重组微生物中，外源的HMG-CoA还原酶编码基因和外源的HMG-CoA合成酶编码基因位于同一染色体上，从降低3-羟-3甲基戊二烯-CoA的积累，从而不会使得各产物过量表达，影响到重组微生物的生长。
在本发明的一些实施例中，所述外源的α-法尼烯合成酶编码基因和所述外源的HMG-CoA还原酶编码基因位于同一染色体上。
在本发明的一些实施例中，所述外源的HMG-CoA还原酶编码基因不含有跨膜区编码序列。所提供的外源的HMG-CoA还原酶编码基因不含有跨膜区编码序列，仅编码HMG-CoA还原酶活性区域(tHMG1)，从而可以提高HMG-CoA还原酶的活性，提高α-法尼烯的产量。
在本发明的一些实施例中，所述硫解酶编码基因和所述异戊二烯焦磷酸异构酶编码基因共用第一双向启动子；所述磷酸甲羟戊酸激酶编码基因和所述HMG-CoA还原酶编码基因共用第二双向启动子；所述HMG-CoA还原酶编码基因和所述HMG-CoA合成酶编码基因共用第三双向启动子；所述α-法尼烯合成酶编码基因和所述HMG-CoA还原酶编码基因共用第四双向启动子。双向启动子是位于两个相邻且转录方向相反的基因之间的一段DNA序列。不同编码基因共用双向启动子，不仅可以避免不同基因引入时的繁琐的步骤和过程，减少引入受体中启动子的数目，同时可以有效避免由于引入的启动子序列同源所引发的基因沉默现象，从而可以稳定高效表达各基因。
在本发明的一些实施例中，所述第一双向启动子、所述第二双向启动子、所述第三双向启动子和所述第四双向启动子的至少之一为Gal1/Gal10双向启动子。Gal1/Gal10双向启动子作为酵母细胞中常用的双向启动子，应用该双向启动子可以实现基因的稳定表达。
在本发明的一些实施例中，所述重组微生物不具有Gal80基因。所提供的重组微生物通过沉默Gal80的表达，可以使得半乳糖诱导型启动子组成性表达，从而可以降低半乳糖的使用，节省成本。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种构建重组微生物的方法，所述重组微生物为本发明第一方面所述的重组微生物，所述方法包括使宿主微生物表达下列基因，以便获得所重组微生物：2个拷贝数的硫解酶编码基因，2个拷贝数的HMG-CoA合成酶编码基因，至少3个拷贝数的HMG-CoA还原酶编码基因，2个拷贝数的甲羟戊酸激酶编码基因，2个拷贝数的磷酸甲羟戊酸激酶编码基因，2个拷贝数的5-焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶编码基因，2个拷贝数的异戊二烯焦磷酸异构酶编码基因，2个拷贝数的法尼基焦磷酸合成酶编码基因，以及至少1个拷贝数的α-法尼烯合成酶编码基因。通过使得宿主微生物表达特定拷贝数的基因，可以获得重组微生物，利用构建的重组微生物，可以发酵获得高产量的α-法尼烯。
根据本发明的实施例，以上所述的构建重组微生物的方法可以进一步包括如下技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述宿主微生物携带：1个拷贝数的硫解酶编码基因，1个拷贝数的HMG-CoA合成酶编码基因，1个拷贝数的HMG-CoA还原酶编码基因，1个拷贝数的甲羟戊酸激酶编码基因，1个拷贝数的磷酸甲羟戊酸激酶编码基因，1个拷贝数的5-焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶编码基因，以及1个拷贝数的异戊二烯焦磷酸异构酶编码基因。
在本发明的一些实施例中，所述方法包括将下列外源编码基因的核酸序列引入所述宿主微生物：1个拷贝数的所述硫解酶编码基因，1个拷贝数的所述HMG-CoA合成酶编码基因，至少2个拷贝数的所述HMG-CoA还原酶编码基因，1个拷贝数的所述甲羟戊酸激酶编码基因，1个拷贝数的所述磷酸甲羟戊酸激酶编码基因，1个拷贝数的所述5-焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶编码基因，1个拷贝数的所述异戊二烯焦磷酸异构酶编码基因，1个拷贝数的所述法尼基焦磷酸合成酶编码基因，以及至少1个拷贝数的所述α-法尼烯合成酶编码基因。
在本发明的一些实施例中，所述方法包括：将第一插入片段、第二插入片段、第三插入片段、第四插入片段、第五插入片段、以及可选的第六插入片段引入所述宿主微生物中，以便获得所述重组微生物，其中，所述第一插入片段、第二插入片段、第三插入片段、第四插入片段、第五插入片段、以及第六插入片段适于与所述重组微生物基因组的预定区域发生同源重组；所述第一插入片段携带串联的所述硫解酶编码基因，所述5-焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶编码基因和所述异戊二烯焦磷酸异构酶编码基因；所述第二插入片段携带串联的所述磷酸甲羟戊酸激酶编码基因，所述HMG-CoA还原酶编码基因和所述甲羟戊酸激酶编码基因；所述第三插入片段携带串联的所述HMG-CoA还原酶编码基因和所述HMG-CoA合成酶编码基因；所述第四插入片段携带串联的所述α-法尼烯合成酶编码基因和所述法尼基焦磷酸合成酶编码基因；所述第五插入片段携带串联的所述α-法尼烯合成酶编码基因和所述HMG-CoA还原酶编码基因；所述第六插入片段携带适于沉默所述Gal80基因的序列，任选所述适于沉默所述Gal80基因的序列为抗性标记基因，任选所述抗性标记基因为潮霉素抗性标记基因。这里“串联的”各编码基因，是指各编码基因适于引入到微生物体内的同一染色体上，而不表示这些编码基因必须一同引入到微生物体内，也不表示各编码基因在同一染色体上的前后位置关系。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种获得α-法尼烯的方法，包括在适于生成α-法尼烯的条件下，培养本发明第一方面任一实施例所述的重组微生物，以便获得所述α-法尼烯。通过对本发明所提供的重组微生物进行培养，使得重组微生物表达α-法尼烯，从而可以获得高产量的α-法尼烯，适于工业生产应用。
附图说明
图1是根据本发明的实施例提供的利用MVA途径合成α-法尼烯的流程图。
图2是根据本发明的实施例提供的含有5-焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶编码基因、硫解酶编码基因和异戊二烯焦磷酸异构酶编码基因的表达系统的示意图。
图3是根据本发明的实施例提供的含有磷酸甲羟戊酸激酶编码基因、HMG-CoA还原酶编码基因和甲羟戊酸激酶编码基因的表达系统的示意图。
图4是根据本发明的实施例提供的含有HMG-CoA还原酶编码基因和HMG-CoA合成酶编码基因的表达系统的示意图。
图5是根据本发明的实施例提供的含有α-法尼烯合成酶编码基因和法尼基焦磷酸合成酶编码基因的表达系统的示意图。
图6是根据本发明的实施例提供的含有α-法尼烯合成酶编码基因和HMG-CoA还原酶编码基因的表达系统的示意图。
图7是根据本发明的实施例提供的含有α-法尼烯合成酶编码基因的表达系统的示意图。
图8是根据本发明的实施例提供的含有潮霉素抗性标记基因(Hygr)的表达系统的示意图。
图9是根据本发明的实施例提供的不同微生物菌株发酵生产α-法尼烯的产量图。
具体实施方式
下面参考附图详细描述本发明的实施例，需要说明的是，所示出的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本文中，“拷贝数”是指某基因在某一生物的基因组中的个数。1个拷贝数是指该基因在该生物基因组中只有一个，2个拷贝数是指该基因在该生物基因组中有两个。
参照图1所示，在利用微生物合成α-法尼烯的过程中，以乙酰CoA作为原料可以借助于MVA途径以及α-法尼烯产生代谢途径，合成α-法尼烯。即以乙酰-CoA为原料，利用硫解酶(ERG10)生成乙酰乙酰-CoA，进一步利用HMG-CoA合成酶(EGR13)催化合成3-羟-3甲基戊二酰-CoA(HMG-CoA)，进一步利用HMG-CoA还原酶(HMGR)催化合成甲羟戊酸(MVA)，进一步利用甲羟戊酸激酶(ERG12)催化合成5-磷酸-甲羟戊酸，进一步利用磷酸甲羟戊酸激酶(ERG8)催化合成5-焦磷酸-甲羟戊酸，进一步利用5-焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD1)催化合成异戊二烯焦磷酸，进一步利用异戊二烯焦磷酸异构酶(IDI)催化合成二甲基烯丙基焦磷酸，然后以异戊二烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸为底物，利用法尼基焦磷酸合成酶(ERG20)合成法尼基焦磷酸，进一步利用α-法尼烯合成酶(α-FS)合成α-法尼烯。发明人在研究过程中发现，在利用微生物培养获得α-法尼烯的过程中，上述途径中酶的量对于α-法尼烯的表达量有着重要的影响。这种影响不仅体现在将途径中各个酶的表达量提升，能够使得α-法尼烯的表达量增加；更重要的是，途径中各个酶的量的变化在一个合适的条件下，能够获得高产量的α-法尼烯。而且α-法尼烯合成酶以及HMG-CoA还原酶相对于其他酶，对于α-法尼烯的表达量的影响更为关键。为此，发明人经过摸索，找个微生物利用上述途径合成高效合成α-法尼烯的条件，即控制途径中各酶比例，并通过人工构建重组微生物，可以用来培养获得高产量的α-法尼烯，从而可以应用于工业生产中。
为此，在本发明的一个方面，本发明提供了一种所述重组微生物含有：2个拷贝数的硫解酶编码基因，2个拷贝数的HMG-CoA合成酶编码基因，至少3个拷贝数的HMG-CoA还原酶编码基因，2个拷贝数的甲羟戊酸激酶编码基因，2个拷贝数的磷酸甲羟戊酸激酶编码基因，2个拷贝数的5-焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶编码基因，2个拷贝数的异戊二烯焦磷酸异构酶编码基因，2个拷贝数的法尼基焦磷酸合成酶编码基因，以及至少1个拷贝数的α-法尼烯合成酶编码基因。
其中所提供的重组微生物中选自下列的至少之一为外源编码序列：1个拷贝数的所述硫解酶编码基因，1个拷贝数的所述HMG-CoA合成酶编码基因，至少2个拷贝数的所述HMG-CoA还原酶编码基因，1个拷贝数的所述甲羟戊酸激酶编码基因，1个拷贝数的所述磷酸甲羟戊酸激酶编码基因，1个拷贝数的所述5-焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶编码基因，1个拷贝数的所述异戊二烯焦磷酸异构酶编码基因，1个拷贝数的所述法尼基焦磷酸合成酶编码基因，以及至少1个拷贝数的所述α-法尼烯合成酶编码基因。
这些外源编码序列可以通过引入到自然界天然存在的微生物体内，获得相应的重组微生物。在将这些外源编码序列引入到微生物的基因上时，不做特定的要求，只要不对微生物生长产生影响即可。例如可以将这些外源编码序列引入到微生物基因组上不编码蛋白或者不具有实质功能的部位。在本发明的至少一些优选实施方式中，在将这些外源编码基因引入到微生物体内时，可以引入到下述表1示出的位置。其中表1中所列出的位置信息是根据NCIB gene数据库中所提供的。在本发明的至少一些实施方式中，在Chromosome XII中引入外源的硫解酶编码基因，外源的5-焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶编码基因和外源的异戊二烯焦磷酸异构酶编码基因；在本发明的另一些实施方式中，在Chromosome XI中引入外源的磷酸甲羟戊酸激酶编码基因，外源的HMG-CoA还原酶编码基因和外源的甲羟戊酸激酶编码基因；在本发明的又一些实施方式中，在Chromosome XII中引入外源的HMG-CoA还原酶编码基因和外源的HMG-CoA合成酶编码基因；在本发明的又一些实施方式中，在Chromosome III中引入外源的α-法尼烯合成酶编码基因和外源的法尼基焦磷酸合成酶编码基因；在本发明的另一些实施方式中，在Chromosome V中引入外源的α-法尼烯合成酶编码基因和外源的HMG-CoA还原酶编码基因；在本发明的又一些实施方式中，在Chromosome XV中引入外源的α-法尼烯合成酶编码基因。在本发明的再一些实施方式中，在Chromosome XIII中引入外源的潮霉素抗性标记基因(Hypr)。
表1不同外源编码基因的插入信息
gene 染色体 染色体编号 位置
ChrXII-4 Chromosome XII CM001533.1 833878-833963
ChrXI-3 Chromosome XI CM001532.1 94109-94173
ChrXII-2 Chromosome XII CM001533.1 812568-812578
LEU2 Chromosome III CM001524.1 99730-99731
URA3 Chromosome V CM001527.1 116715to 117540
HIS3 Chromosome XV CM001536.1 717553-718461
GAL80 Chromosome XIII NC_001145.3 171594-172901
本发明所提供的重组微生物可以通过对宿主微生物进行人工改造获得。所用到的宿主微生物可以是天然存在的微生物，例如可以为酿酒酵母细胞。其中所引入的外源编码基因除了HMG-CoA还原酶编码基因和α-法尼烯合成酶编码基因之外，其他的外源编码基因可以与宿主微生物体内各基因序列一致。在向宿主微生物中引入外源的HMG-CoA还原酶编码基因时，可以不引入跨膜区编码序列，即仅引入编码HMG-CoA还原酶活性区域(tHMG1)的序列。以酿酒酵母细胞为例，根据NCBIgene数据库中的记载，各基因的原始位置信息如下表2所示：
表2酵母细胞中不同基因的原始位置信息
gene 染色体 染色体编号 位置
IDI1 Chromosome XVI NC_001148.4 327864-328730
ERG10 Chromosome XVI NC_001148.4 498096-499292
MVD1 Chromosome XIV NC_001146.8 701895-703085
ERG8 Chromosome XIII NC_001145.3 712316-713671
HMG1 Chromosome XIII NC_001145.3 115734-118898
ERG12 Chromosome XIII NC_001145.3 684467-685798
ERG13 Chromosome XIII NC_001145.3 19060-20535
ERG20 Chromosome X NC_001142.9 105014-106072
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在获取各基因片段时，可以通过构建质粒，然后利用引物进行PCR扩增的方式获得，在不考虑成本的情况下，也可以直接委托公司进行人工合成。
实施例1酵母菌中MVA途径优化比例蛋白表达质粒的构建
实施例1提供了MVA途径中所应用的酶蛋白的表达质粒的构建方法，包括质粒pZY401，质粒pZY402以及质粒pZY410。
(1)质粒pZY401
△ChrXII-4：：G418_IDI1_pGAL1pGAL10_ERG10_pGAL7_MVD1_tADH1
图2为含有5-焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶编码基因、硫解酶编码基因和异戊二烯焦磷酸异构酶编码基因的表达系统的示意图。参照如2所示，质粒pZY401的具体构建过程如下：
以酿酒酵母30000B的基因组为模板，用引物G4011_new_F和G4011_R通过PCR扩增得到片段4011_new(用于整合至ChrXII-4位点的同源左臂，引入NotI酶切位点)；
用引物G4012_F和4012_R通过PCR扩增得到片段y4012(该片段为终止子tADH1)；
用引物4013_F和4013_R通过PCR扩增得到片段y4013(该片段为基因MVD1)；
用引物4014_F和4014_R通过PCR扩增得到片段y4014(该片段为终止子tGAL10以及启动子pGAL7)；
用引物4015_F和4015_R通过PCR扩增得到片段y4015(该片段为基因ERG10)；
用引物4016_F和4016_R通过PCR扩增得到片段y4016(该片段为双向启动子pGAL1-pGAL10)；
用引物4017_F和4017_R通过PCR扩增得到片段y4017(该片段为基因IDI1)；
用引物4018_F和4018_R通过PCR扩增得到片段y4018(该片段为终止子tCYC1)；
以载体pUG6为模板，用引物4019_F和G4013_R通过PCR扩增得到片段y4019(筛选标记KanMX)；
以酿酒酵母30000B的基因组为模板，用引物G4014_F和G4014_new_R通过PCR扩增得到片段4014_new(用于整合至ChrXII-4位点的同源左臂，引入NotI酶切位点)；
以载体pRS426为模板用引物G4015_new_F和G4015_new_R通过PCR扩增得到片段4015_new(载体骨架)。
通过DNA assemble的方法将以上片段在酿酒酵母体内重组构建pZY401，然后在大肠杆菌内扩增，酶切验证以及测序正确后，用NotI线性化质粒pZY401，回收带有目的基因的片段。该敲除盒序列如SEQ ID NO:1所示。
(2)质粒pZY402
△ChrXI-3：：Hygr_ERG8_pGAL1pGAL10_tHMG1_pGAL7_ERG12
参照图3所示，质粒pZY402的具体构建过程如下：
以酿酒酵母30000B的基因组为模板，用引物G4021_new_F和4021_R通过PCR扩增得到片段y4021(用于整合至ChrXI-3位点的同源左臂，引入NotI酶切位点)；
用引物4022_F和4022_R通过PCR扩增得到片段y4022(终止子tCYC1)；
用引物4023_F和4023_R通过PCR扩增得到片段y4023(基因ERG8)；
用引物4024_F和4024_R通过PCR扩增得到片段y4024(双向启动子pGAL1-pGAL10)；
用引物4025_F和4025_R通过PCR扩增得到片段y4025(基因tHMG1)；
用引物4026_F和4026_R通过PCR扩增得到片段y4026(终止子tGAL10以及启动子pGAL7)；
用引物4027_F和4027_R通过PCR扩增得到片段y4027(基因ERG12)；
用引物4028_F和4028_R通过PCR扩增得到片段y4028(终止子tADH1)；
载体pTM36为模板，用引物4029_F和4029_R通过PCR扩增得到片段y4029(筛选标记HygMX)；
酿酒酵母30000B的基因组为模板，用引物40210_F和G4024_new_R通过PCR扩增得到片段y40210(用于整合至ChrXI-3位点的同源左臂，引入NotI酶切位点)；
载体pRS426为模板用引物G4025_new_F和G4025_new_R通过PCR扩增得到片段4025_new(载体骨架)。
通过DNA assemble的方法将以上片段在酿酒酵母体内重组构建pZY402，然后在大肠杆菌内扩增，酶切验证以及测序正确后，用NotI线性化质粒pZY402，回收带有目的基因的片段，该敲除盒序列如SEQ ID NO:2所示。
(3)质粒pZY410
△ChrXII-2：：G418_pGAL1_ERG13_pGAL10_tHMG1
参照图4所示，质粒pZY410的具体构建过程：
以酿酒酵母30000B的基因组为模板，用引物4101_F和4101_R通过PCR扩增得到片段4101(用于整合至ChrXII-2位点的同源左臂，引入NotI酶切位点)；
以酿酒酵母S288C的基因组为模板，用引物4102_F和4102_R通过PCR扩增得到片段4102(基因tHMG1以及终止子tTHMG1)；
以酿酒酵母30000B的基因组为模板，用引物4103_F和4103_R通过PCR扩增得到片段4103(双向启动子pGAL1-pGAL10)；
载体pZY403为模板，用引物4104_F和4104_R通过PCR扩增得到片段4104(基因ERG13以及终止子tCYC1)；
载体pUG6为模板，用引物4105_F和4105_R通过PCR扩增得到片段4105(筛选标记KanMX)；
酿酒酵母30000B的基因组为模板，用引物4106_F和4106_R通过PCR扩增得到片段4106(用于整合至ChrXII-2位点的同源左臂，引入NotI酶切位点)；
载体pRS426为模板用引物4107_F和4107_R通过PCR扩增得到片段4107(载体骨架)。
通过DNA assemble的方法将以上片段在酿酒酵母体内重组构建pZY410，然后在大肠杆菌内扩增，酶切验证以及测序正确后，用NotI线性化质粒pZY410，回收带有目的基因的片段，该敲除盒序列如SEQ ID NO:3所示。
实施例2酵母菌中α-法尼烯产生代谢途径质粒的构建
来源于苹果Malus x domestica的α-法尼烯基因由南京金斯瑞生物科技有限公司按照酿酒酵母密码子优化后合成，序列如SEQ ID NO:4所示。
(1)质粒pZY901
△LEU2：：LEU2(URA3)_TCYC1_aFS_pGAL10pGAL1_ERG20_tERG20
参照图5所示，质粒pZY901的具体构建过程如下：
以质粒pZY514为模板，用引物9011-F和3302-R通过PCR扩增得到片段9011；
以pYH327为模板，用引物1804-F和9012-R通过PCR扩增得到片段9012；
以pYH327为模板，用引物3302-F和1802-R通过PCR扩增得到片段3302；
以pYH327为模板，用引物1803-F和1803-R通过PCR扩增得到片段3303。
通过DNA assemble(酵母组装)的方法将以上片段在酿酒酵母体内重组构建pZY901，然后在大肠杆菌内扩增，酶切验证以及测序正确后，得到pZY901。用NotI线性化质粒pZY901，回收带有目的基因的片段。该敲除盒序列如SEQ ID NO:5所示。
(2)质粒pZY902
△URA3：：HIS3_TCYC1_tHMG1_pGAL10_pGAL1_aFS_TPGK1
参照图6所示，质粒pZY902的具体构建过程如下：
以质粒pYH300为模板，用引物9021-F和9021-R通过PCR扩增得到片段9021；
以pZY517为模板，用引物9022-F和9022-R通过PCR扩增得到片段9022；
以pZY517为模板，用引物9023-F和9023-R通过PCR扩增得到片段9023；
以pZY901为模板，用引物9024-F和9024-R通过PCR扩增得到片段9024；
以pZY517为模板，用引物9025-F和9025-R通过PCR扩增得到片段9025。
通过DNA assemble(酵母组装)的方法将以上片段在酿酒酵母体内重组构建pZY902，然后在大肠杆菌内扩增，酶切验证以及测序正确后，得到pZY902。用MssI线性化质粒pZY902，回收带有目的基因的片段。该敲除盒序列如SEQ ID NO:6所示。
(3)质粒pZY903
△HIS3：：TRP1_TADH1_aFS_pGAL10pGAL1_tCPS1
参照图7所示，质粒pZY903的具体构建过程如下：
以质粒pYH300为模板，用引物9031-F和9031-R通过PCR扩增得到片段9031；
以pZY518为模板，用引物9032-F和9032-R通过PCR扩增得到片段9032；
以pZY901为模板，用引物9033-F和9033-R通过PCR扩增得到片段9033；
以pZY518为模板，用引物9034-F和9034-R通过PCR扩增得到片段9034。
通过DNA assemble(酵母组装)的方法将以上片段在酿酒酵母体内重组构建pZY903，然后在大肠杆菌内扩增，酶切验证以及测序正确后，得到pZY903。用MssI线性化质粒pZY903，回收带有目的基因的片段。该敲除盒序列如SEQ ID NO:7所示。
(4)敲除盒pZY520
△GAL80：：Hygr
参照图8所示，敲除盒pZY520的具体构建过程如下：
以酿酒酵母30000B的基因组为模板，用引物5201_F和5201_R通过PCR扩增得到片段5201(用于整合至GAL80位点的同源左臂)；
以载体pTM36为模板，用引物5202_F和5202_R通过PCR扩增得到片段5202(筛选标记Hygr)；
以酿酒酵母30000B的基因组为模板，用引物5203_F和5203_R通过PCR扩增得到片段5203(用于整合至GAL80位点的同源右臂)；通过重叠延伸PCR将三个片段连接在一起。该敲除盒序列如SEQ ID NO:8所示。
实施例3α-法尼烯产生菌的构建
将质粒pZY402线性化后片段(SEQ ID NO:2)转入酿酒酵母菌株CEN.PK2-1D，根据同源重组来整合到染色体上，其整合位点为ChrXI-3，筛选标记为潮霉素(Hygr)，至此成功构建背景菌株JYF21。
在菌株JYF21转入质粒pZY401线性化后片段(SEQ ID NO:1)，根据同源重组来整合到染色体上，其整合位点为ChrXII-4，筛选标记为G418，至此成功构建菌株JYF22。
向菌株JYF22转入含Cre酶的质粒，使得其丢掉筛选标记，获得菌株JYF23。
在菌株JYF23转入质粒pZY410线性化后片段(SEQ ID NO:3)，根据同源重组来整合到染色体上，其整合位点为ChrXII-2，筛选标记为G418，至此成功构建菌株JYF24。
在菌株JYF24转入质粒pZY901线性化后片段(SEQ ID NO:5)，根据同源重组来整合到染色体上，其整合位点为LEU2，筛选标记为亮氨酸(LEU2)，至此成功构建菌株JVA31。
在菌株JVA31转入质粒pZY902线性化后片段(SEQ ID NO:6)，根据同源重组来整合到染色体上，其整合位点分别为URA3，筛选标记为组氨酸(HIS3)，至此成功构建菌株JSA8。
在菌株JSA8转入质粒pZY903线性化后片段(SEQ ID NO:7)，根据同源重组来整合到染色体上，其整合位点分别为HIS3，筛选标记为色氨酸(TRP1)，至此成功构建菌株JSA14。
在菌株JSA8以及JSA14分别转入pZY520敲除盒片段(SEQ ID NO:8)，根据同源重组来整合到染色体上，其整合位点为GAL80，筛选标记为尿嘧啶(Hygr)，至此成功构建菌株JSA15以及JSA17。
这些菌株通过摇瓶发酵培养，具体方法如下：将保种管中吸取适量甘油菌到含有5mL种子培养基的PA瓶中，种子培养基配方为：蛋白胨(20g/L)，酵母粉(10g/L)，葡萄糖(20g/L)，种子30度摇床培养过夜后进行转接，按照初始OD＝0.1转接，转接后覆盖20％的有机相(正十二烷或肉豆蔻酸异丙酯)置于30℃摇床开始摇瓶发酵，发酵培养基配方为：蛋白胨(20g/L)，酵母粉(10g/L)，葡萄糖(10g/L)，半乳糖(10g/L)(敲除Gal80的菌株不需要添加)。72h收样，取菌液测OD，有机相用正己烷稀释测产量。
将菌株JVA31、JSA8、JSA14、JSA15和JSA17按照上述方法进行发酵，结果如图9所示显示，在发酵72小时后，产量趋势为菌株JSA8的α-法尼烯的产量大于菌株JSA14，也大于菌株JVA31；菌株JSA15的产量大于菌株JSA17。
从以上结果可以看出，本发明所提供的以上菌均可产生α-法尼烯，实验结果表明，实验构建的借助于MVA途径生产法尼烯的重组微生物菌株可用于生产α-法尼烯。其中尤以菌株JSA8和菌株JSA15的产量更高，表明所构建的微生物菌株发酵生产法尼烯更加依赖于HMG-CoA还原酶基因的拷贝数以及α-法尼烯合成酶基因的拷贝数，尤其是当α-法尼烯合成酶基因的拷贝数为2个时，α-法尼烯的产量最优。
实施例4α-法尼烯高产菌的发酵罐发酵
参照文献(van Hoek,P.；de Hulster,E.；van Dijken,J.P.；Pronk,J.T.Fermentative capacity in high-cell-density fed-batch cultures of baker’syeast.Biotechnol.Bioeng.2000,68,517-523.)中所记载的发酵培养基，对所构建的JSA15菌株进行分批补料发酵。实验结果发现：本申请构建的α-法尼烯合成菌株(菌株JSA15)，在发酵罐上最高可以达到10g/L，使得通过微生物发酵获得α-法尼烯产量有了明显提高。
本文中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
附录
>G4011_new_F
CTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCTAGTAGCGGCCGCgactcaatgacttcgggatct(SEQ IDNO:9)
>G4011_R
CATGAGGTCGCTCTTATTGACCACACCTCTACCGGctgaacaggaacttaagtagctac(SEQ IDNO:10)
>片段4011_new
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>G4021_new_F
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>4021_R
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>4022_F
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>4022_R
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>片段y4022
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>4023_F
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>4023_R
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>片段y4023
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>4024_R
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>片段y4024
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>4025_F
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>片段y4026
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>片段y4027
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>片段y4028
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>4107_F
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>4107_R
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>片段4107
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>SEQ ID NO:3(pZY410目的片段)
GGCCGCgacattgaactcttggccgactcttctgatgaggctttcgaaaaatctactttcattaacacaattgagttcattgtgcacgatatttgggtcgaaacgttgataaagaacataaacttattacaaatgtttgatgcagatttgaaatgctacaatgacaagtacataatttgcaagctaaagggtcagtatccctccacaaatatagtggacataatgtgccgtttgaagcatttttccaattctattttggaaactttcaaattcggaatcgagctaaaagaacaagatcaatgccacaatagaaacactattatcaactacgttcttttcagtagagtattttcaacgattgttttagagattcaaaaatgctttatcttgatcgttaagttcatgtattctgtcaattttttagaaaaattttccgatgaagtatttttgtcatttattgaaattctcataaaaattgtctttgagcaccagattccgcagttatttttgggaattgatgaaattattcaactctggttaaagaacaatgaaggaaaacggcaacaactcttgagcgcttggtgcaacggaactgttcaagatatgaagcaaagccaacaaagagagtcctcaaacgcagaatctgaatcaatcacttcaagtacagaagaggacgaagaaggcctgcaattcaataaatgggatgtgattgaaccatttattgataatatcaaggctttgaatcaatcaaaatcccatatgtgacgcagcgataaaaccgcggcatgcaaacatctacacaattagcaagggcaatccatattttgtcttttcgcgccctggaaaggcctaagtaatgtcgtaaacgcattctatctgtacttcaactctcctctgtgcattggtttgtgcaaatcacattttacgatactgccagatatatgcaaaaagagaaaaccaagggaccagaacaaagcaaaattacgatattcttcgaattccttcgtgcttgactaagacaaagggatggacgtagcgatttttagcgggccaagaactggttccgaaaaagcacaggtacaccgaaccctcagctaaggagggacagcaccgatgcggaaggacaaactttctttttgcctatcacagtatcttatcgagctaactattttcgacacacatgaaaaagcagaaatattaacgaaaaagaaaagaaagaccatgtcatgtacgggcaatcagaatctgtaacaagcgccatttttttttctgtatcgggccctccttactgctctccttccgtgtaacgcgttatgGCTTCATTGCTCCTACATTTATCGGATGGCGCACATAGCTAAAAAAGGAAGATTTTCACTCATAAGGGAAAGGAACCGCATGACTCAAGAGAAGCATGTGGTTTTTGAGTTTTTTTCGTTGAATTTTCAGGTAAAGCTCAATAGTTATGACAATTACAACAACAGAATTCTTTCTATATATGCACGAACTTGTAATATGGAAGAAATTATGACGTACAAACTATAAAGTAAATATTTTACGTAACACATGGTGCTGTTGTGCTTCTTTTTCAAGAGAATACCAATGACGTATGACTAAGTTTAGGATTTAATGCAGGTGACGGACCCATCTTTCAAACGATTTATATCAGTGGCGTCCAAATTGTTAGGTTTTGTTGGTTCAGCAGGTTTCCTGTTGTGGGTCATATGACTTTGAACCAAATGGCCGGCTGCTAGGGCAGCACATAAGGATAATTCACCTGCCAAGACGGCACAGGCAACTATTCTTGCTAATTGACGTGCGTTGGTACCAGGAGCGGTAGCATGCGGGCCTCTTACACCTAATAAGTCCAACATGGCACCTTGTGGTTCTAGAACAGTACCACCACCGATGGTACCTACTTCGATGGATGGCATGGATACGGAAATTCTCAAATCACCGTCCACTTCTTTCATCAATGTTATACAGTTGGAACTTTCAACATTTTGTGCAGGATCTTGTCCTAATGCCAAGAAAACAGCTGTCACTAAATTAGCTGCATGTGCGTTAAATCCACCAACAGACCCAGCCATTGCAGATCCAACCAAATTCTTAGCAATGTTCAACTCAACCAATGCGGAAACATCACTTTTTAACACTTTTCTGACAACATCACCAGGAATAGTAGCTTCTGCGACGACACTCTTACCACGACCTTCGATCCAGTTGATGGCAGCTGGTTTTTTGTCGGTACAGTAGTTACCAGAAACGGAGACAACCTCCATATCTTCCCAGCCATACTCTTCTACCATTTGCTTTAATGAGTATTCGACACCTTTAGAAATCATATTCATACCCATTGCGTCACCAGTAGTTGTTCTAAATCTCATGAAGAGTAAATCTCCTGCTAGACAAGTTTGAATATGTTGCAGACGTGCAAATCTTGATGTAGAGTTAAAAGCTTTTTTAATTGCGTTTTGTCCCTCTTCTGAGTCTAACCATATCTTACAGGCACCAGATCTTTTCAAAGTTGGGAAACGGACTACTGGGCCTCTTGTCATACCATCCTTAGTTAAAACAGTTGTTGCACCACCGCCAGCATTGATTGCCTTACAGCCACGCATGGCAGAAGCTACCAAACAACCCTCTGTAGTTGCCATTGGTATATGATAAGATGTACCATCGATAACCAAGGGGCCTATAACACCAACGGGCAAAGGCATGTAACCTATAACATTTTCACAACAAGCGCCAAATACGCGGTCGTAGTCATAATTTTTATATGGTAAACGATCAGATGCTAATACAGGAGCTTCTGCCAAAATTGAAAGAGCCTTCCTACGTACCGCAACCGCTCTCGTAGTATCACCTAATTTTTTCTCCAAAGCGTACAAAGGTAACTTACCGTGAATAACCAAGGCAGCGACCTCTTTGTTCTTCAATTGTTTTGTATTTCCACTACTTAATAATGCTTCTAATTCTTCTAAAGGACGTATTTTCTTATCCAAGCTTTCAATATCGCGGGAATCATCTTCCTCACTAGATGATGAAGGTCCTGATGAGCTCGATTGCGCAGATGATAAACTTTTGACTTTCGATCCAGAAATGACTGTTTTATTGGTTAAAACCATttatattgaattttcaaaaattcttactttttttttggatggacgcaaagaagtttaataatcatattacatggcaataccaccatatacatatccatatctaatcttacttatatgttgtggaaatgtaaagagccccattatcttagcctaaaaaaaccttctctttggaactttcagtaatacgcttaactgctcattgctatattgaagtacggattagaagccgccgagcgggcgacagccctccgacggaagactctcctccgtgcgtcctggtcttcaccggtcgcgttcctgaaacgcagatgtgcctcgcgccgcactgctccgaacaataaagattctacaatactagcttttatggttatgaagaggaaaaattggcagtaacctggccccacaaaccttcaaatcaacgaatcaaattaacaaccataggataataatgcgattagttttttagccttatttctggggtaattaatcagcgaagcgatgatttttgatctattaacagatatataaatgcaaaagctgcataaccactttaactaatactttcaacattttcggtttgtattacttcttattcaaatgtcataaaagtatcaacaaaaaattgttaatatacctctatactttaacgtcaaggagaaaaaactataATGAAACTCTCAACTAAACTTTGTTGGTGTGGTATTAAAGGAAGACTTAGGCCGCAAAAGCAACAACAATTACACAATACAAACTTGCAAATGACTGAACTAAAAAAACAAAAGACCGCTGAACAAAAAACCAGACCTCAAAATGTCGGTATTAAAGGTATCCAAATTTACATCCCAACTCAATGTGTCAACCAATCTGAGCTAGAGAAATTTGATGGCGTTTCTCAAGGTAAATACACAATTGGTCTGGGCCAAACCAACATGTCTTTTGTCAATGACAGAGAAGATATCTACTCGATGTCCCTAACTGTTTTGTCTAAGTTGATCAAGAGTTACAACATCGACACCAACAAAATTGGTAGATTAGAAGTCGGTACTGAAACTCTGATTGACAAGTCCAAGTCTGTCAAGTCTGTCTTGATGCAATTGTTTGGTGAAAACACTGACGTCGAAGGTATTGACACGCTTAATGCCTGTTACGGTGGTACCAACGCGTTGTTCAACTCTTTGAACTGGATTGAATCTAACGCATGGGATGGTAGAGACGCCATTGTAGTTTGCGGTGATATTGCCATCTACGATAAGGGTGCCGCAAGACCAACCGGTGGTGCCGGTACTGTTGCTATGTGGATCGGTCCTGATGCTCCAATTGTATTTGACTCTGTAAGAGCTTCTTACATGGAACACGCCTACGATTTTTACAAGCCAGATTTCACCAGCGAATATCCTTACGTCGATGGTCATTTTTCATTAACTTGTTACGTCAAGGCTCTTGATCAAGTTTACAAGAGTTATTCCAAGAAGGCTATTTCTAAAGGGTTGGTTAGCGATCCCGCTGGTTCGGATGCTTTGAACGTTTTGAAATATTTCGACTACAACGTTTTCCATGTTCCAACCTGTAAATTGGTCACAAAATCATACGGTAGATTACTATATAACGATTTCAGAGCCAATCCTCAATTGTTCCCAGAAGTTGACGCCGAATTAGCTACTCGCGATTATGACGAATCTTTAACCGATAAGAACATTGAAAAAACTTTTGTTAATGTTGCTAAGCCATTCCACAAAGAGAGAGTTGCCCAATCTTTGATTGTTCCAACAAACACAGGTAACATGTACACCGCATCTGTTTATGCCGCCTTTGCATCTCTATTAAACTATGTTGGATCTGACGACTTACAAGGCAAGCGTGTTGGTTTATTTTCTTACGGTTCCGGTTTAGCTGCATCTCTATATTCTTGCAAAATTGTTGGTGACGTCCAACATATTATCAAGGAATTAGATATTACTAACAAATTAGCCAAGAGAATCACCGAAACTCCAAAGGATTACGAAGCTGCCATCGAATTGAGAGAAAATGCCCATTTGAAGAAGAACTTCAAACCTCAAGGTTCCATTGAGCATTTGCAAAGTGGTGTTTACTACTTGACCAACATCGATGACAAATTTAGAAGATCTTACGATGTTAAAAAATAATCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCCCCCACATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTTATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTATATTTCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAGACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAACCTTGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCacgctgcaggtcgacaacccttaatataacttcgtataatgtatgctatacgaagttattaggtctagagatctgtttagcttgcctcgtccccgccgggtcacccggccagcgacatggaggcccagaataccctccttgacagtcttgacgtgcgcagctcaggggcatgatgtgactgtcgcccgtacatttagcccatacatccccatgtataatcatttgcatccatacattttgatggccgcacggcgcgaagcaaaaattacggctcctcgctgcagacctgcgagcagggaaacgctcccctcacagacgcgttgaattgtccccacgccgcgcccctgtagagaaatataaaaggttaggatttgccactgaggttcttctttcatatacttccttttaaaatcttgctaggatacagttctcacatcacatccgaacataaacaaccatgggtaaggaaaagactcacgtttcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccggcaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataagcttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaatcagtactgacaataaaaagattcttgttttcaagaacttgtcatttgtatagtttttttatattgtagttgttctattttaatcaaatgttagcgtgatttatattttttttcgcctcgacatcatctgcccagatgcgaagttaagtgcgcagaaagtaatatcatgcgtcaatcgtatgtgaatgctggtcgctatactgctgtcgattcgatactaacgccgccatccagtgtcgaaaacgagctctcgagaacccttaatataacttcgtataatgtatgctatacgaagttattaggtgatatcagatccactagtggctactatcggcgactctctcgaaatttttcttaacgcgtccttgtactgcgtctaacgcttttgccacttggatttctattataggaaatagtctcacttactgggcgacgaattttcgcgttttgatgaagcacaggaagaatttcttttttttttggcttcttctggttccgttttttacgcgcacaaatctaaaaaaagaaataattataacctagtctcgaaaattttcatcgatccattcgttcctttttttcgattttttcagatcaaaattcttgtttctttctttgtcttagtttatattaaaagatattttgattttactcctgaactatttattctttctaagaaggccagaacactacagctgttttaaccgactacgaagttctccattctcgaacactagccttcatttaccaaacaggaactagcgtatatcattagtccttattcgaaaagagattggtagatatttattgtagtttgtgagaaggagaaaatactgtcattggactgatagttagaggacattaacctctcttacgttcgctcaaaaaaattaaaataagcaagtagctgaaatcaagtctttcatacaacggtcagaccatgaacactgatcaacaaccttatcagggccaaacggactatacccagggaccaggtaacgggcaaagtcaggaacaagactatgaccaatatggccagcctttgtatccttcacaagctgatggttactacgatccaaatgtcgctgctggtactgaagctgatatgtatggtcaacaaccaccaaacgagtcttacgaccaagactacacaaacggtgaatactatggtcaaccgccaaatatggctgctcaagacggtgaaaacttctcggattttagcagttacggccctcctggaacacctggatatgatagctatggtggtcagtataccgcttctcaaatgagttatggagaaccaaattcgtcgggtacctcgactccaatttacggtaattatgacccaaatgctatcgctatggctttgccaaatgaaccttatcccgcttggactgctgactctcaatctcccgtttcgatcgagcaaatcgaagatatctttattgatttgaccaacagactcgggttccaaagagactccatgagaaatatgtttgatcattttatggttctcttggactctaggtcctcgagaatgtctcctgatcaagctttactatctttacatgccgactacattggtggcgatactgctaactataaaaaatggtattttgctgctcagGC(SEQ 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>SEQ ID NO:4(来源于苹果Malus x domestica的α-法尼烯基因)
ATGGAATTCAGAGTTCATTTGCAAGCTGATAACGAACAAAAGATTTTCCAAAACCAAATGAAGCCAGAACCAGAAGCTTCATATTTGATTAATCAAAGAAGATCTGCAAACTACAAGCCAAACATCTGGAAGAACGATTTCTTGGATCAATCATTGATCTCTAAGTACGATGGTGACGAATACAGAAAGTTATCAGAAAAGTTGATCGAAGAAGTTAAGATCTATATTTCTGCTGAAACTATGGATTTGGTTGCAAAGTTGGAATTGATCGATTCTGTTAGAAAGTTGGGTTTGGCTAATTTGTTCGAAAAGGAAATTAAAGAAGCATTGGATTCAATCGCTGCAATCGAATCTGATAATTTGGGTACTAGAGATGATTTGTACGGTACAGCTTTGCATTTCAAGATTTTGAGACAACATGGTTACAAAGTTTCACAAGATATCTTCGGTAGATTCATGGATGAAAAGGGTACTTTGGAAAACCATCATTTCGCTCATTTGAAGGGCATGTTGGAATTGTTCGAAGCATCTAATTTGGGTTTCGAAGGTGAAGATATCTTGGATGAAGCTAAAGCATCATTGACATTAGCTTTGAGAGATTCTGGTCATATCTGTTACCCAGATTCAAATTTGTCTAGAGATGTTGTTCATTCATTAGAATTGCCATCTCATAGAAGAGTTCAATGGTTCGATGTTAAGTGGCAAATTAATGCTTACGAAAAGGATATCTGTAGAGTTAACGCTACTTTGTTGGAATTGGCAAAGTTGAACTTCAATGTTGTTCAAGCACAATTGCAAAAGAATTTGAGAGAAGCTTCTAGATGGTGGGCAAATTTGGGTATCGCTGATAATTTGAAGTTCGCTAGAGATAGATTGGTTGAATGTTTTGCTTGTGCAGTTGGTGTTGCATTCGAACCAGAACATTCTTCTTTTAGAATCTGTTTGACAAAAGTTATTAATTTGGTTTTGATTATTGATGATGTTTATGATATCTATGGTTCAGAAGAAGAATTGAAGCATTTCACTAATGCTGTTGATAGATGGGATTCTAGAGAAACAGAACAATTGCCAGAATGTATGAAGATGTGTTTCCAAGTTTTGTACAACACTACATGTGAAATCGCAAGAGAAATCGAAGAAGAAAATGGTTGGAACCAAGTTTTGCCACAATTGACTAAGGTTTGGGCAGATTTTTGTAAAGCTTTGTTGGTTGAAGCAGAATGGTACAATAAGTCACATATCCCAACATTGGAAGAATACTTGAGAAACGGTTGTATCTCTTCATCTGTTTCTGTTTTGTTGGTTCATTCTTTCTTTTCTATCACTCATGAAGGTACAAAGGAAATGGCTGATTTCTTGCATAAGAACGAAGATTTGTTGTACAACATCTCATTAATTGTTAGATTGAATAATGATTTGGGTACTTCAGCTGCAGAACAAGAAAGAGGTGACTCTCCATCATCTATCGTTTGTTACATGAGAGAAGTTAATGCTTCTGAAGAAACAGCAAGAAAGAATATCAAGGGTATGATCGATAACGCTTGGAAGAAAGTTAACGGTAAATGTTTCACTACAAACCAAGTTCCATTTTTATCATCTTTTATGAATAATGCAACTAATATGGCTAGAGTTGCACATTCATTGTACAAAGATGGTGACGGTTTTGGTGACCAAGAAAAGGGTCCAAGAACACATATCTTGTCTTTGTTATTTCAACCATTGGTTAATTAA(SEQ IDNO:4)
>9011-F
TGATATCGACAAAGGAAAAGGGGCCTGTTTAATTAACCAATGGTTGAAATAACAAAGAC(SEQ IDNO:96)
>3302-R
CTTCATATTCGTGGTATAGCTGTT(SEQ ID NO:97)
>片段9011
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>1804-F
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>9012-R
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>片段9012
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>1802-R
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>片段3302
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>1803-F
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>1803-R
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>片段3303
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ID NO:5)
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>9021-R
tgcttcaaaatacctggaattatctgcgtGTTTAAACGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGG(SEQ IDNO:109)
>片段9021
ttccttctgcgagagtacatttgcccttaaacgGTTTAAACACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGTATGATCCAATATCAAAGGAAATGATAGCATTGAAGGATGAGACTAATCCAATTGAGGAGTGGCAGCATATAGAACAGCTAAAGGGTAGTGCTGAAGGAAGCATACGATACCCCGCATGGAATGGGATAATATCACAGGAGGTACTAGACTACCTTTCATCCTACATAAATAGACGCATATAAGTACGCATTTAAGCATAAACACGCACTATGCCGTTCTTCTCATGTATATATATATACAGGCAACACGCAGATATAGGTGCGACGTGAACAGTGAGCTGTATGTGCGCAGCTCGCGTTGCATTTTCGGAAGCGCTCGTTTTCGGAAACGCTTTGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCAGAGCGCTTTTGAAAACCAAAAGCGCTCTGAAGACGCACTTTCAAAAAACCAAAAACGCACCGGACTGTAACGAGCTACTAAAATATTGCGAATACCGCTTCCACAAACATTGCTCAAAAGTATCTCTTTGCTATATATCTCTGTGCTATATCCCTATATAACCTACCCATCCACCTTTCGCTCCTTGAACTTGCATCTAAACTCGACCTCTACATTTTTTATGTTTATCTCTAGTATTACTCTTTAGACAAAAAAATTGTAGTAAGAACTATTCATAGAGTGAATCGAAAACAATACGAAAATGTAAACATTTCCTATACGTAGTATATAGAGACAAAATAGAAGAAACCGTTCATAATTTTCTGACCAATGAAGAATCATCAACGCTATCACTTTCTGTTCACAAAGTATGCGCAATCCACATCGGTATAGAATATAATCGGGGATGCCTTTATCTTGAAAAAATGCACCCGCAGCTTCGCTAGTAATCAGTAAACGCGGGAAGTGGAGTCAGGCTTTTTTTATGGAAGAGAAAATAGACACCAAAGTAGCCTTCTTCTAACCTTAACGGACCTACAGTGCAAAAAGTTATCAAGAGACTGCATTATAGAGCGCACAAAGGAGAAAAAAAGTAATCTAAGATGCTTTGTTAGAAAAATAGCGCTCTCGGGATGCATTTTTGTAGAACAAAAAAGAAGTATAGATTCTTTGTTGGTAAAATAGCGCTCTCGCGTTGCATTTCTGTTCTGTAAAAATGCAGCTCAGATTCTTTGTTTGAAAAATTAGCGCTCTCGCGTTGCATTTTTGTTTTACAAAAATGAAGCACAGATTCTTCGTTGGTAAAATAGCGCTTTCGCGTTGCATTTCTGTTCTGTAAAAATGCAGCTCAGATTCTTTGTTTGAAAAATTAGCGCTCTCGCGTTGCATTTTTGTTCTACAAAATGAAGCACAGATGCTTCGTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCgCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTACCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCCTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCGCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCGTTTAAACacgcagataattccaggtattttgaagca(SEQ ID NO:110)
>9022-F
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>9022-R
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>片段9022
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>9023-F
CATCCGCTAGGGGAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO:114)
>9023-R
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>片段9023
CATCCGCTAGGGGAAAAAAAAAAATGAAAATCATTACCGAGGCATAAAAAAATATAGAGTGTACTAGAGGAGGCCAAGAGTAATAGAAAAAGAAAATTGCGGGAAAGGACTGTGTTATGACTTCCCTGACTAATGCCGTGTTCAAACGATACCTGGCAGTGACTCCTAGCGCTCACCAAGCTCTTAAAACGGGAATTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACGCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGAGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTCCCAAAACCTTCTCAAGCAAGGTTTTCAGTATAATGTTACATGCGTACACGCGTTTGTACAGAAAAAAAAGAAAAATTTGAAATATAAATAACGTTCTTAATACTAACATAACTATAAAAAAATAAATAGGGACCTAGACTTCAGGTTGTCTAACTCCTTCCTTTTCGGTTAGAGCGGATGTGGGGGGAGGGCGTGAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGATATCGACAAAGGAAAAGGGGCCTGTTTAGGATTTAATGCAGGTGACGGACCCATCTTTCAAACGATTTATATCAGTGGCGTCCAAATTGTTAGGTTTTGTTGGTTCAGCAGGTTTCCTGTTGTGGGTCATATGACTTTGAACCAAATGGCCGGCTGCTAGGGCAGCACATAAGGATAATTCACCTGCCAAGACGGCACAGGCAACTATTCTTGCTAATTGACGTGCGTTGGTACCAGGAGCGGTAGCATGCGGGCCTCTTACACCTAATAAGTCCAACATGGCACCTTGTGGTTCTAGAACAGTACCACCACCGATGGTACCTACTTCGATGGATGGCATGGATACGGAAATTCTCAAATCACCGTCCACTTCTTTCATCAATGTTATACAGTTGGAACTTTCAACATTTTGTGCAGGATCTTGTCCTAATGCCAAGAAAACAGCTGTCACTAAATTAGCTGCATGTGCGTTAAATCCACCAACAGACCCAGCCATTGCAGATCCAACCAAATTCTTAGCAATGTTCAACTCAACCAATGCGGAAACATCACTTTTTAACACTTTTCTGACAACATCACCAGGAATAGTAGCTTCTGCGACGACACTCTTACCACGACCTTCGATCCAGTTGATGGCAGCTGGTTTTTTGTCGGTACAGTAGTTACCAGAAACGGAGACAACCTCCATATCTTCCCAGCCATACTCTTCTACCATTTGCTTTAATGAGTATTCGACACCTTTAGAAATCATATTCATACCCATTGCGTCACCAGTAGTTGTTCTAAATCTCATGAAGAGTAAATCTCCTGCTAGACAAGTTTGAATATGTTGCAGACGTGCAAATCTTGATGTAGAGTTAAAAGCTTTTTTAATTGCGTTTTGTCCCTCTTCTGAGTCTAACCATATCTTACAGGCACCAGATCTTTTCAAAGTTGGGAAACGGACTACTGGGCCTCTTGTCATACCATCCTTAGTTAAAACAGTTGTTGCACCACCGCCAGCATTGATTGCCTTACAGCCACGCATGGCAGAAGCTACCAAACAACCCTCTGTAGTTGCCATTGGTATATGATAAGATGTACCATCGATAACCAAGGGGCCTATAACACCAACGGGCAAAGGCATGTAACCTATAACATTTTCACAACAAGCGCCAAATACGCGGTCGTAGTCATAATTTTTATATGGTAAACGATCAGATGCTAATACAGGAGCTTCTGCCAAAATTGAAAGAGCCTTCCTACGTACCGCAACCGCTCTCGTAGTATCACCTAATTTTTTCTCCAAAGCGTACAAAGGTAACTTACCGTGAATAACCAAGGCAGCGACCTCTTTGTTCTTCAATTGTTTTGTATTTCCACTACTTAATAATGCTTCTAATTCTTCTAAAGGACGTATTTTCTTATCCAAGCTTTCAATATCGCGGGAATCATCTTCCTCACTAGATGATGAAGGTCCTGATGAGCTCGATTGCGCAGATGATAAACTTTTGACTTTCGATCCAGAAATGACTGTTTTATTGGTTAAAACCATttatattgaattttcaaaaattcttactttttttttggatggacgcaaagaagtttaataatcatattacatggcaataccaccatatacatatccatatctaatcttacttatatgttgtggaaatgtaaagagccccattatcttagcctaaaaaaaccttctctttggaactttcagtaatacgcttaactgctcattgctatattgaagtacggattagaagccgccgagcgggcgacagccctccgacggaagactctcctccgtgcgtcctggtcttcaccggtcgcgttcctgaaacgcagatgtgcctcgcgccgcactgctccgaacaataaagattctacaatactagcttttatggttatgaagaggaaaaattggcagtaacctggccccacaaaccttcaaatcaacgaatcaaattaacaaccataggataataatgcgattagttttttagccttatttctggggtaattaatcagcgaagcgatgatttttgatctattaacagatatataaatgcaaaagctgcataaccactttaactaatactttcaacattttcggtttgtattacttcttattcaaatgtcataaaagtatcaacaaaaaattgttaatatacctctatactttaacgtcaaggagaaaaaactataATGGAATTCAGAGTTCATTTGCAAGCTGATA(SEQ ID NO:116)
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>片段9024
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>片段9025
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>SEQ ID NO:6(pZY902目的片段)
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Claims (10)

1.一种重组微生物，所述重组微生物用于表达α-法尼烯，其特征在于，所述重组微生物含有：
2个拷贝数的硫解酶编码基因，
2个拷贝数的HMG-CoA合成酶编码基因，
至少3个拷贝数的HMG-CoA还原酶编码基因，
2个拷贝数的甲羟戊酸激酶编码基因，
2个拷贝数的磷酸甲羟戊酸激酶编码基因，
2个拷贝数的5-焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶编码基因，
2个拷贝数的异戊二烯焦磷酸异构酶编码基因，
2个拷贝数的法尼基焦磷酸合成酶编码基因，以及
至少1个拷贝数的α-法尼烯合成酶编码基因。
2.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物为酵母细胞，优选为酿酒酵母细胞。
3.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物含有2～3个拷贝数的α-法尼烯合成酶编码基因，优选含有2个拷贝数的α-法尼烯合成酶编码基因；
任选地，所述重组微生物含有4个拷贝数的HMG-CoA还原酶编码基因。
4.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，选自下列的至少之一为外源编码序列：
1个拷贝数的所述硫解酶编码基因，
1个拷贝数的所述HMG-CoA合成酶编码基因，
至少2个拷贝数的所述HMG-CoA还原酶编码基因，
1个拷贝数的所述甲羟戊酸激酶编码基因，
1个拷贝数的所述磷酸甲羟戊酸激酶编码基因，
1个拷贝数的所述5-焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶编码基因，
1个拷贝数的所述异戊二烯焦磷酸异构酶编码基因，
1个拷贝数的所述法尼基焦磷酸合成酶编码基因，以及
至少1个拷贝数的所述α-法尼烯合成酶编码基因。
5.根据权利要求4所述的重组微生物，其特征在于，所述外源的硫解酶编码基因、所述外源的5-焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶编码基因和所述外源的异戊二烯焦磷酸异构酶编码基因位于同一染色体上；
所述外源的磷酸甲羟戊酸激酶编码基因，所述外源的HMG-CoA还原酶编码基因和所述甲羟戊酸激酶编码基因位于同一染色体上；
所述外源的HMG-CoA还原酶编码基因和所述外源的HMG-CoA合成酶编码基因位于同一染色体上；
所述外源的α-法尼烯合成酶编码基因和所述外源的法尼基焦磷酸合成酶编码基因位于同一染色体上；
任选的，所述外源的α-法尼烯合成酶编码基因和所述外源的HMG-CoA还原酶编码基因位于同一染色体上；
任选的，所述外源的HMG-CoA还原酶编码基因不含有跨膜区编码序列。
6.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，
所述硫解酶编码基因和所述异戊二烯焦磷酸异构酶编码基因共用第一双向启动子；
所述磷酸甲羟戊酸激酶编码基因和所述HMG-CoA还原酶编码基因共用第二双向启动子；
所述HMG-CoA还原酶编码基因和所述HMG-CoA合成酶编码基因共用第三双向启动子；
所述α-法尼烯合成酶编码基因和所述HMG-CoA还原酶编码基因共用第四双向启动子；
任选的，所述第一双向启动子、所述第二双向启动子、所述第三双向启动子和所述第四双向启动子的至少之一为Gal1/Gal10双向启动子。
7.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物不具有Gal80基因。
8.一种构建权利要求1～7中任一项所述的重组微生物的方法，其特征在于，包括使宿主微生物表达下列基因，以便获得所重组微生物：
2个拷贝数的硫解酶编码基因，
2个拷贝数的HMG-CoA合成酶编码基因，
至少3个拷贝数的HMG-CoA还原酶编码基因，
2个拷贝数的甲羟戊酸激酶编码基因，
2个拷贝数的磷酸甲羟戊酸激酶编码基因，
2个拷贝数的5-焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶编码基因，
2个拷贝数的异戊二烯焦磷酸异构酶编码基因，
2个拷贝数的法尼基焦磷酸合成酶编码基因，以及
至少1个拷贝数的α-法尼烯合成酶编码基因；
任选的，所述宿主微生物携带：
1个拷贝数的硫解酶编码基因，
1个拷贝数的HMG-CoA合成酶编码基因，
1个拷贝数的HMG-CoA还原酶编码基因，
1个拷贝数的甲羟戊酸激酶编码基因，
1个拷贝数的磷酸甲羟戊酸激酶编码基因，
1个拷贝数的5-焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶编码基因，以及
1个拷贝数的异戊二烯焦磷酸异构酶编码基因，
可选的，所述方法包括：将下列外源编码基因的核酸序列引入所述宿主微生物：
1个拷贝数的所述硫解酶编码基因，
1个拷贝数的所述HMG-CoA合成酶编码基因，
至少2个拷贝数的所述HMG-CoA还原酶编码基因，
1个拷贝数的所述甲羟戊酸激酶编码基因，
1个拷贝数的所述磷酸甲羟戊酸激酶编码基因，
1个拷贝数的所述5-焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶编码基因，
1个拷贝数的所述异戊二烯焦磷酸异构酶编码基因，
1个拷贝数的所述法尼基焦磷酸合成酶编码基因，以及
至少1个拷贝数的所述α-法尼烯合成酶编码基因。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
将第一插入片段、第二插入片段、第三插入片段、第四插入片段、第五插入片段、以及可选的第六插入片段引入所述宿主微生物中，以便获得所述重组微生物，
其中，所述第一插入片段、所述第二插入片段、所述第三插入片段、所述第四插入片段、所述第五插入片段、以及所述第六插入的片段适于与所述重组微生物基因组的预定区域发生同源重组；
所述第一插入片段携带串联的所述硫解酶编码基因，所述5-焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶编码基因和所述异戊二烯焦磷酸异构酶编码基因；
所述第二插入片段携带串联的所述磷酸甲羟戊酸激酶编码基因，所述HMG-CoA还原酶编码基因和所述甲羟戊酸激酶编码基因；
所述第三插入片段携带串联的所述HMG-CoA还原酶编码基因和所述HMG-CoA合成酶编码基因；
所述第四插入片段携带串联的所述α-法尼烯合成酶编码基因和所述法尼基焦磷酸合成酶编码基因；
所述第五插入片段携带串联的所述α-法尼烯合成酶编码基因和所述HMG-CoA还原酶编码基因；
所述第六插入片段携带适于沉默所述Gal80基因的序列，任选所述适于沉默所述Gal80基因的序列为抗性标记基因，任选所述抗性标记基因为潮霉素抗性标记基因。
10.一种获得α-法尼烯的方法，其特征在于，包括在适于生成α-法尼烯的条件下，培养权利要求1～7任一项所述的重组微生物，以便获得所述α-法尼烯。
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