CN100575350C

CN100575350C - 一种具有抗氧化活性的大环甘油酯及其制备方法和应用

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Publication number: CN100575350C
Application number: CN200710069790A
Authority: CN
Inventors: 王鸿; 应国清; 田瑄; 易喻; 陈建澍; 梅建凤
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2007-06-29
Filing date: 2007-06-29
Publication date: 2009-12-30
Anticipated expiration: 2027-06-29
Also published as: CN101104613A

Abstract

本发明公开了大环甘油酯，即1，2-环-(4，7-顺二烯-9-醇-)十六烷二酰氧基-3-(顺-9-烯-)十八烷酰氧基-甘油酯，该大环甘油酯的制备方法是将卫矛科植物拟矮卫矛种子的石油醚提取物，用200～300目柱层析硅胶进行柱层析分离，以体积比为10～16∶1的石油醚/丙酮洗脱，收集R_f为0.3～0.5的组份，用甲醇进行纯化，得到所述的大环甘油酯。所述大环甘油酯可以有效的清除自由基，具有抗氧化作用，可能是潜在的抗氧化药物，有可能减少由于羟基自由基氧化引起的DNA损伤。

Description

一种具有抗氧化活性的大环甘油酯及其制备方法和应用

(一)技术领域

本发明涉及一种具有抗氧化活性的大环甘油酯及其制备方法和应用。

(二)背景技术

当今世界，崇尚回归自然蔚然成风，天然药物越来越受到世界各国各地医药卫生部门和研究机构的重视，“绿色药物”越来越受到世界各地消费者的欢迎。我国植物资源丰富，是天然药物研究和寻找新药极为重要的源泉和基础。事实上目前全世界许多的药物都是来源于天然产物，如：从麻黄科植物草麻黄中得到的盐酸麻黄碱是一种拟肾上腺素药，具有松弛支气管平滑肌，收缩血管，兴奋中枢的作用；许多植物都含有的齐墩果酸是一种降转氨酶药，用于治疗急性黄疸型肝炎；豆科植物槐中得到的芦丁是一种心血管疾病的辅助治疗药等。

卫矛科植物种类繁多，其化学成分也较复杂，至目前，从卫矛科植物中分离鉴定出的化合物包括单萜、二萜、三萜类、黄酮类、生物碱类、甾体类、脂肪类及大环双内酯化合物等。对这些化学成分的药理研究也是许多学者关注的焦点，近年来被报道具有抗艾滋病、抗癌、抗炎、抗菌、免疫抑制作用、杀虫等活性，这些化合物在药理学研究和从卫矛科植物中寻找潜在药剂等方面扮演着非常重要的角色。

我们从卫矛科植物拟矮卫矛(Euonymus nanoides Loes.)种子中分离得到天然化合物1，2-环-(4，7-顺二烯-9-醇-)十六烷二酰氧基-3-(顺-9-烯-)十八烷酰氧基-甘油酯，属于大环甘油酯类化合物，该化合物具有一定的生物活性。

另一方面，我们考虑到影响人类寿命的主要因素不是衰老死亡，而是疾病死亡或某个器官老化死亡引起的。因此研究开发治疗这些衰老退行性疾病(如：心脑血管、肿瘤、糖尿病、免疫性疾病和老年性疾病等)的药物，开发有效传统药物防止这些疾病损害人类身体健康及生命，对于防治衰老退行性疾病、防老延寿，增进人类健康具有重要的意义。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗氧化活性的大环甘油酯及其制备方法和应用。

本发明所述大环甘油酯为如式(I)所述的1，2-环-(4，7-顺二烯-9-醇-)十六烷二酰氧基-3-(顺-9-烯-)十八烷酰氧基-甘油酯：

所述1，2-环-(4，7-顺二烯-9-醇-)十六烷二酰氧基-3-(顺-9-烯-)十八烷酰氧基-甘油酯的制备方法如下：将卫矛科植物拟矮卫矛种子的石油醚提取物，用200～300目柱层析硅胶进行柱层析分离，以石油醚/丙酮洗脱液洗脱，收集R_f为0.3～0.5的组份，用甲醇进行纯化，得到所述的化合物1，2-环-(4，7-顺二烯-9-醇-)十六烷二酰氧基-3-(顺-9-烯-)十八烷酰氧基-甘油酯。

所述石油醚/丙酮洗脱液中石油醚和丙酮的体积比为10～16∶1。

所述R_f按如下方法取得：回收洗脱溶剂，后经薄层层析取得R_f值为0.3～0.5的组份。

所述的薄层层析使用硅胶GF₂₅₄板，展开剂使用体积比为10～16∶1的石油醚/丙酮混合液，优选为10∶1的混合液。在薄层层析中，可用紫外灯进行检测，显色剂使用5％H₂SO₄/EtOH。

具体地，所述大环甘油酯的制备方法步骤如下：拟矮卫矛种子阴干粉碎后，用石油醚室温冷浸，回收溶剂后得到浸膏，用200～300目柱层析硅胶进行柱层析分离，以体积比为10～16∶1的石油醚/丙酮混合液洗脱，回收溶剂，以10～16∶1石油醚/丙酮混合液为薄层展开剂，GF₂₅₄板层析，以5％H₂SO₄/EtOH显色，将R_f为0.3～0.5的组份合并，用甲醇进行纯化，得到所述的大环甘油酯。

本发明所述的大环甘油酯1，2-环-(4，7-顺二烯-9-醇-)十六烷二酰氧基-3-(顺-9-烯-)十八烷酰氧基-甘油酯在制备抗氧化药物中的应用。

我们进行的体外对Fe²⁺-VitC诱导的大鼠心、肝、肾丙二醛生成影响的研究结果可以看到该化合物表现了体外对Fe²⁺-VitC诱导的大鼠心、肝、肾组织匀浆MDA生成具有明显的抑制作用，IC₅₀值分别为0.65、0.34和0.78μg/ml；另一方面，该化合物表现了好的抑制二苯代苦味酰基自由基作用，IC₅₀值为0.21μg/ml。这表明该化合物可以有效的清除自由基，有抗氧化作用，可能是潜在的抗氧化药物，有可能减少由于羟基自由基氧化引起的DNA损伤。

(四)具体实施例

实施例1

大环甘油酯的制备：

拟矮卫矛种子(1.2kg)阴干粉碎后，用2L石油醚(60-90℃)冷浸一周共三次，回收溶剂后得到浸膏102.8g，用200-300目柱层析硅胶(800g)进行柱层析分离，以石油醚/丙酮(10∶1)梯度洗脱至丙酮冲柱(4000ml)，以每份500ml接收，回收溶剂后以石油醚/丙酮(10∶1)作薄层条件以紫外灯检测，GF₂₅₄板以5％H₂SO₄/EtOH显色后，根据R_f值分组。当石油醚/丙酮体积比为10∶1时，R_f＝0.45的组份合并，用甲醇进行纯化，得到化合物大环甘油酯50.2mg。

实施例2

拟矮卫矛种子(3.5kg)阴干粉碎后，用5L石油醚(60-90℃)冷浸一周共三次，回收溶剂后得到浸膏286.3g，用200-300目柱层析硅胶(1500g)进行柱层析分离，以石油醚/丙酮(16∶1)梯度洗脱至丙酮冲柱(7000ml)，以每份500ml接收，回收溶剂后以石油醚/丙酮(16∶1)作薄层条件以紫外灯检测，GF₂₅₄板以5％H₂SO₄/EtOH显色后，根据R_f值分组。当石油醚/丙酮体积比为16∶1时，R_f＝0.32的组份合并，用甲醇进行纯化，得到化合物大环甘油酯164.8mg。

实施例3

我们对实施例1制得的大环甘油酯化合物进行了体外对Fe²⁺-VitC诱导的大鼠心、肝、肾丙二醛(MDA)生成影响的实验。

试剂：硫代巴比妥酸(TBA)为上海试剂二厂产品，其余试剂均为国产分析纯。

动物：Wistar大鼠，雌雄兼用，由杭州医学科学研究院动物中心提供。

方法：Wistar大鼠脱颈处死，迅速剖取心脏、肝脏和肾脏，用生理盐水制成5％的组织匀浆，实验分空白组(加二甲基亚砜溶媒)，对照组(加FeSO₄和抗坏血酸即Fe²⁺-VitC各50μmol·L^-1)和给药组(加Fe²⁺-VitC和各浓度药液：11.1、33.3、100μg/ml)，每组平行5管，每管1ml组织匀浆，以上各步均在冰浴中进行。在相应管中加入各浓度药液或溶媒，37℃水浴温育10min，再给相应管中加入Fe²⁺-VitC，继续温育30min，按TBA法测MDA。以稳定氮氧自由基HTMPO为对照品测定半抑制率浓度(IC₅₀μg/ml)。

结果：

体外对Fe²⁺-VitC诱导的大鼠心、肝、肾MDA生成影响的研究(IC₅₀μg/ml)结果

原理：细胞膜脂质受到氧自由基攻击时，脂质发生过氧化，生成脂质过氧化物，后者进一步降解为稳定产物丙二醛(MDA)。MDA可与细胞膜内脂质蛋白等发生交联，使细胞膜功能障碍。由于MDA性质稳定、易测，常作为研究抗炎、抗衰老、抗缺血-再灌注损伤和抗辐射药物作用的一个指标。本测定系统采用Fe²⁺-VitC作为羟基自由基(·OH)生成系统，用大鼠心、肝和肾细胞匀浆作为脂质供体，硫代巴比妥酸(TBA)显色法检测生成的MDA。TBA在碱性条件下显红色，在酸性条件下无色，与MDA反应生成稳定产物，在90-100℃煮沸后酸性条件下显红色，可在532nm波长处检测到吸收峰。

实施例4

我们对实施例1制得的大环甘油酯化合物进行了体外对二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)清除能力的测定实验。

试剂：二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)购自上海百灵威公司，其余试剂均为国产分析纯。

方法：称取一定量大环甘油酯化合物样品放入试管中，分别加入一定体积的80％甲醇超声溶解，配得药物母液浓度为1mg/ml，以此溶液配成药物浓度为100μg/ml、33.3μg/ml、11.1μg/ml的溶液。加各浓度的样品溶液100μl和0.1mmol/l DPPH溶液100μl于96孔板中(样品实际反应浓度为50μg/ml、16.7μg/ml、5.6μg/ml)，每份设5个平行。样品加入后中速振荡30s，在室温(25℃)和517nm波长下测定其吸光值(A_p)；室温下放置20min后再测定依次；同时测定不加DPPH的样品空白吸收光(A_c：100μl样品+100μl甲醇)和加DPPH但不加样品的吸光值(A_max：100μl DPPH+100μl甲醇)。以100μg/ml V_C作为对照测定抑制率(IR％)。

结果：

体外对二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)清除能力的测定结果(IR％)

原理：二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)是一种很稳定的以氮为中心的自由基，其醇溶液呈深紫色，在517nm处有一吸收峰。当反应系统中存在自由基清除剂时，它可以和DPPH·的单电子配对而使517nm处的吸收峰渐渐消退，而且这种颜色变浅的程度与配对电子数成化学计量关系。因此根据消退速度和峰值改变程度可以用来检测自由基的清除情况，从而评价试验样品的抗氧化能力。与其它方法相比用DPPH·筛选自由基清除剂具有简便，快速的优点。

实施例5：化合物测试

仪器：Nicolet 5DX-FT-IR红外光谱仪(KBr压片)，岛津UV-260紫外分光光度计，HP-5988型、VGZAB-HS(70ev)和APEX^TMII Bruker4.7T AS型质谱仪，日产JASCO J-20C自动记录旋光仪，BruckerAM-400型超导核磁共振波谱仪(δ/ppm，TMS内标)，254nm紫外灯。试剂：溶剂均为分析纯试剂，未进行处理。

对实施例1制得的大环甘油酯化合物进行化合物测试：C₃₇H₆₂O₇，黄色油状物，[α]_D ²⁰：-0.7°(CHCl₃，c 1.20)；IR v_max ^KBr：3470，2926，2854，1746，1463，1370，1229，1167，1100，1051，969，723cm^-1；UV_max ^MeOH：239nm；EI-MS：m/z(％)618[M]⁺(10.8)，600[M-H₂O]⁺(29.5)，338[M+H-C₁₈H₃₃O₂]⁺(35.2)，262(91.0)，50(100)；FAB-MS：m/z619[M+H]⁺；¹H-和₁₃C-NMR(CDCl₃，400MHz)见表1；

表1大环甘油酯化合物的NMR数据(400MHz，CDCl₃)

对实施例2制得的大环甘油酯化合物进行化合物测试：

C₃₇H₆₂O₇，黄色油状物，[α]_D ²⁰：-0.56°(CHCl₃，c 1.12)；IR v_max ^KBr：3470，2926，2854，1746，1463，1370，1229，1167，1100，1051，969，723cm^-1；UV_max ^MeOH：239nm；EI-MS：m/z(％)618[M]⁺(10.8)，600[M-H₂O]⁺(29.5)，338[M+H-C₁₈H₃₃O₂]⁺(35.2)，262(91.0)，50(100)；FAB-MS：m/z 619[M+H]⁺；¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)与实施例1相同。

Claims

1.一种大环甘油酯，其特征在于所述大环甘油酯为如式(I)所述的1，2-环-(4，7-顺二烯-9-醇-)十六烷二酰氧基-3-(顺-9-烯-)十八烷酰氧基-甘油酯：

2.一种制备如权利要求1所述的大环甘油酯的方法，其特征在于所述制备方法是将卫矛科植物拟矮卫矛种子的石油醚提取物，用200～300目柱层析硅胶进行柱层析分离，以体积比为10～16∶1的石油醚/丙酮洗脱液洗脱，回收洗脱溶剂，后经薄层层析收集R_f为0.3～0.5的组份，用甲醇进行纯化，得到所述的化合物1，2-环-(4，7-顺二烯-9-醇-)十六烷二酰氧基-3-(顺-9-烯-)十八烷酰氧基-甘油酯；所述的薄层层析使用硅胶GF₂₅₄板，展开剂使用体积比为10～16∶1的石油醚/丙酮混合液。

3.如权利要求2所述的大环甘油酯的制备方法，其特征在于所述的薄层层析展开剂使用体积比为10∶1的石油醚/丙酮混合液。

4.根据权利要求2所述的一种大环甘油酯的制备方法，其特征在于所述的薄层层析显色剂使用5％H₂SO₄/EtOH。

5.根据权利要求2所述的一种大环甘油酯的制备方法，其特征在于所述的制备方法步骤如下：拟矮卫矛种子阴干粉碎后，用石油醚室温冷浸，回收溶剂后得到浸膏，用200-300目柱层析硅胶进行柱层析分离，以体积比为10～16∶1的石油醚/丙酮洗脱，回收溶剂，以10～16∶1石油醚/丙酮混合液为薄层展开剂，GF₂₅₄板层析，以5％H₂SO₄/EtOH显色，将R_f为0.3～0.5的组份合并，用甲醇进行纯化，得到所述的大环甘油酯。

6.如权利要求1所述的大环甘油酯在制备抗氧化药物中的应用。