CN104116746A

CN104116746A - 人参皂甙组合物及其制备方法和应用

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Publication number: CN104116746A
Application number: CN201310156832.8A
Authority: CN
Inventors: 祁展楷
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-04-28
Filing date: 2013-04-28
Publication date: 2014-10-29

Abstract

本发明公开了一种人参皂甙组合物及其制备方法和应用、所述人参皂甙组合物、包括如下重量百分比的组分：20（S）-原人参二醇10%~80%、25-烯-20（S）-原人参二醇1%~20%、20（S）、24（R）-原人参三醇环氧化物5%~50%、20(S)-原人参三醇5%~50%、20（S）-24-甲基-23-烯-24-羰基-原人参二醇1%~20%、25-羟基-23-烯-20（S）-原人参二醇1%~20%。本发明的人参皂甙组合物、具有如下的有益效果：具有显著的直接抑制杀死肿瘤、逆转肿瘤细胞的多药耐药和増敏肿瘤化疗药物的疗效。临床疗效确切、可以避免大量肿瘤病人因不能耐受化疗药物的毒性而停药或耐药复发后无其他治疗方法的缺陷、能满足临床应用的需要。

Description

人参皂甙组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种人参皂甙组合物及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤、是一种对人类危害极大的疾病。

在用化疗治疗肿瘤的过程中、存在着肿瘤病人不能耐受化疗药物的毒性和癌细胞的抗药性及复发的问题、其中、尤其是如何逆转肿瘤多药耐药问题、増敏肿瘤化疗药物对肿瘤细胞的抑制杀伤问题、以及开发低毒或无毒的抗肿瘤药物的问题、是困扰肿瘤治疗的难题。

目前、尚无有效的解决上述问题的方法、通常的做法是停止化疗、或改用其他药物、或用中药进行辅助治疗、但是、上述方法、存在着临床疗效不确切而导致大量肿瘤病人复发的缺陷、不能满足临床应用的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种人参皂甙组合物及其制备方法和应用、以克服现有技术存在的上述缺陷。

本发明所述的人参皂甙组合物、包括如下重量百分比的组分：

优选的、所述的人参皂甙组合物、包括如下重量百分比的组分：

最优选的为：

人参皂甙组合物中各个组分的化学名和结构式如下：

A:化合物为20（S）-原人参二醇、[20(S)-protopanaxadiol]、

B：化合物为25-烯-20（S）-原人参二醇、[25-ene-20(s)-protopanaxadiol]、

C：化合物为20（S）、24（R）-原人参三醇环氧化物（20(s)、24（R）-epoxy-protopanaxatriol）；

D：化合物为20(S)-原人参三醇、[20(S)-protopanaxadiol]、

E：此化合物与20（S）-原人参二醇相比、少一个碳原子、多一个羰基氧原子、命名为:20（S）-24-甲基-23-烯-24-羰基-原人参二醇、[20（S）-24-methyl-23–ene–24–carbonyl-protopanaxadiol]、

F为25-羟基-23-烯-20（S）-原人参二醇、[25-hydroxy-23-ene-20(S)-protopanaxadiol]、

上述人参皂甙组合物的制备方法、包括如下步骤：

首先将从人参茎叶中获得的总皂甙组合物、溶于碱金属氢氧化物与高沸点脂肪醇类化合物组成的溶液中、在1~3mp压力下加热进行水解、反应时间为4~8小时、水解温度为180~260℃、优选温度为200~240℃、反应时间为4~8小时、尽可能裂解掉达玛烷上的其他化学结构、然后从反应产物中收集本发明所述的人参皂甙组合物；

收集方法一般包括如下步骤：

将反应产物冷却至室温后加水稀释至原体积的4～8倍、通过有机溶剂萃取或大孔树脂吸附、洗脱、收集洗脱物、即可获得本发明产物。

所述大孔树脂可采用天津南开大学化工厂、牌号为AB-8的产品；

所述的总皂甙组合物的制备方法、可参见王键、赵岚峰、东贵华、西洋参茎叶中西洋参皂甙的分析.中成药、1995、17(1):36-38；.李义侠、刘淑芬、潘苏萍等、西洋参茎叶总皂甙水—正丁醇法提取工艺.中草药、1991、22(1):14-15；2.孟祥颖、魏春雁、杨世海等、西洋参茎叶皂甙提取方法的优选.人参研究、1996、(1):31-33等文献报道的方法；

碱金属氢氧化物与高沸点脂肪醇类化合物组成的溶液中、碱金属氢氧化物的重量浓度为5%～40%、优选为10%～20%；

在溶解了总皂甙的碱金属氢氧化物与高沸点脂肪醇类化合物组成的溶液中、总皂甙组合物的重量浓度为2.5%～20%、优选浓度为5～15%；

所述的高沸点脂肪醇类化合物是指沸点高于180℃的脂肪醇、优选沸点在200～250℃、包括乙二醇、丙二醇、1.3-丁二醇、1.4-丁二醇、丙三醇或分子量小于700的聚乙二醇；

所述的碱金属氢氧化物包括NaOH或KOH。

所述萃取剂包括氯仿、乙酸乙酯或正丁醇；

细胞及动物试验证明、本发明的人参皂甙组合物、可以用于制备逆转肿瘤多药耐药的耐药逆转剂药物、制备増敏肿瘤化疗的増敏剂药物或制备直接抑制杀死肿瘤细胞的细胞毒性药物；

所述肿瘤为胃癌、食道癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、肝癌、白血病、鼻咽癌、血癌、骨癌、淋巴癌(包括何杰金淋巴瘤及非包括何杰金淋巴瘤)、盆腔癌(包括子宫癌、宫颈癌)、肺癌（包括纵隔癌）、脑癌、神经癌、喉癌、骨髓瘤、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、黑色素瘤、肾癌、胰腺癌、皮肤癌、甲状腺癌、平滑肌肉瘤、纤维肉瘤。神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、肾母细胞瘤、肌母细胞瘤、软骨母细胞瘤和骨母细胞瘤、恶性脑膜瘤或恶性神经鞘瘤。所述肿瘤包括原发性肿瘤、复发、转移及多药耐药性肿瘤。

术语“逆转多药耐药”指的是指逆转肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药的同时、对其他许多结构不同、作用机制不同的抗肿瘤药物亦产生交叉抗药性；

术语“増敏化疗”指的是指采用小剂量的该种物质与化疗药物合用即能使化疗效果有显著提高的作用；

术语“抑制杀死肿瘤细胞”指的是通过药物的细胞毒性来抑制肿瘤细胞的繁殖或直接杀死肿瘤细胞的作用；

本发明还包括一种药物制剂、包括治疗有效量的所述的人参皂甙组合物和医药学上可接受的载体；所述的载体是指药学领域常规的载体、例如：稀释剂、赋形剂如水等；粘合剂如纤维素衍生物、明胶、聚乙烯吡咯烷酮等；填充剂如淀粉等；崩裂剂如碳酸钙、碳酸氢钠、増溶剂如（Solutol HS-15）聚乙二醇十二羟基硬脂酸酯、（Cremophor EL）聚氧乙烯蓖麻油、另外还可以在组合物中加入其他辅助剂如香味剂和甜味剂。

本发明还涉及一种人参皂甙组合物或其衍生物组合物的液体制剂、其特征是、每1000～2000ml液体制剂中、可含所述的人参皂甙或其衍生物5～40g、（Solutol HS-15）聚乙二醇十二羟基硬脂酸酯65～520g、无水乙醇50～400ml、余为注射用水。

具体步骤以生产1000ml人参皂甙或其衍生物组合物的液体制剂为例、生产的工艺过程如下：

1：溶解：

称取所述人参皂甙或其衍生物10～20g、加入100～180ml食用无水乙醇、待人参皂甙或其衍生物完全溶解后再加入（Solutol HS-15）聚乙二醇十二羟基硬脂酸酯130～260g、搅拌至完全溶解后加入注射用水至1000ml。

2：过滤保存：

将配置好的人参皂甙或其衍生物的液体制剂通过0.45和0.22μm滤膜依次过滤、最后灌装保存。

3：消毒灭菌：

将灌装好的人参皂甙或其衍生物的液体制剂放在灭菌箱中121°C30分钟灭菌。

本发明所述的含有人参皂甙组合物的药物制剂、可通过口服或注射途径施加于需要治疗的患者、剂量一般为500～4000mg/体重天；

本发明的人参皂甙组合物、具有如下的有益效果：具有显著的直接抑制杀死肿瘤、逆转肿瘤细胞的多药耐药和増敏肿瘤化疗药物的疗效。临床疗效确切、可以避免大量肿瘤病人不能耐受高剂量化疗药物的毒性和耐药复发后无法继续治疗的缺陷、能满足临床应用的需要。

附图说明

图1为不同处理组荷B16黑色素瘤小鼠肿瘤体积相对增长速度曲线图。

图2为不同处理组荷Levis肺癌小鼠瘤体相对增长速度曲线。

图3处理后的各种肿瘤生长曲线图。

图1～图3中、纵坐标(Vt/V。)代表测量时的肿瘤体积(Vt)与处理前原初体积(Vo)的比值。

图4是3组的P-GP表达率。。

图5是3组的MDR1表达率

图6是实验荷瘤小鼠。

具体实施方式

实施例1

人参皂甙组合物的制备方法：

首先将10g从人参茎叶中获得的总皂甙组合物、溶于15g碱金属氢氧化物与高沸点脂肪醇类化合物组成的溶液中、在2mp压力下加热进行水解、水解温度为240°C、反应时间为4小时、将反应产物冷却至室温后加水稀释至原体积的6倍、加入到大孔树脂中吸附、洗脱、收集洗脱物、即可获得本发明产物。

大孔树脂为天津南开大学化工厂牌号为AB-8的产品。

碱金属氢氧化物与高沸点脂肪醇类化合物组成的溶液中、碱金属氢氧化物的重量浓度为15%；

所述的高沸点脂肪醇类化合物是丙三醇；

所述的碱金属氢氧化物为NaOH；

经过光谱数据与已知物文献比较、或与标准物质一同TLC定性分析的方法、或用1H-NMR、13C-NMR及DEPT、COSY、HMQC和HMBC等光谱测定、加以结构分析、结果如下：所述的人参皂甙组合物、包括如下重量百分比的组分：

实施例2

人参皂甙组合物的制备方法：

首先将10g从人参茎叶中获得的总皂甙组合物、溶于20g碱金属氢氧化物与高沸点脂肪醇类化合物组成的溶液中、在1.5mp压力下加热进行水解、水解温度为230°C、反应时间为6小时、将反应产物冷却至室温后加水稀释至原体积的8倍、加入到大孔树脂中吸附、洗脱、收集洗脱物、即可获得本发明产物。大孔树脂为天津欧瑞生物科技有限公司牌号为SA-2的产品。

碱金属氢氧化物与高沸点脂肪醇类化合物组成的溶液中、碱金属氢氧化物的重量浓度为20%；

所述的高沸点脂肪醇类化合物是丙三醇；

所述的碱金属氢氧化物为KOH；

经过光谱数据与已知物文献比较、或与标准物质一同TLC定性分析的方法、或用1H-NMR、13C-NMR及DEPT、COSY、HMQC和HMBC等光谱测定、加以结构分析、结果如下：

所述的人参皂甙组合物、包括如下重量百分比的组分：

实施例3

人参皂甙组合物增敏化疗药物对肿瘤的杀伤抑制作用的实验研究

材料与方法

1.实验动物和肿瘤模型

实验采用荷Lewis肺癌、荷B16黑色素瘤、荷EL-4淋巴瘤(ATCC提供)的C57小鼠、雌雄各半共90个、体重20±2克。

2.动物分组

按实验常规技术方法将肿瘤移植于小鼠前肢、待肿瘤长大到200~400mm³后随机进行分组、实验分为空白对照组、单独化疗组及化疗加用人参皂甙组合物组、每组10只动物。

3.药物及剂量

A.人参皂甙组合物

采用实施例1的产物、使用时配制成注射液、浓度为2mg/ml、微孔滤膜压滤除菌、给药剂量为0.01mg/g、于注入化疗药物前1.5h腹腔注射。

B.紫杉醇(paclitaxel)

荷B16小鼠用紫杉醇治疗、每周一次、10mg/kg、共二次、生理盐水溶解后腹腔注射给药。

C.5氟尿嘧啶5FU

荷Levis肺癌小鼠用5FU治疗、每周一次共二次、每次20mg/kg、生理盐水稀释后腹腔注射给药。

D:吉西他滨（gemcitabine）

荷EL-4淋巴瘤小鼠用吉西他滨治疗、每周一次共二次、每次20mg/kg、生理盐水稀释后腹腔注射给药。

4.观察评价指标

1.肿瘤体积的计算：给药前及给药后每2天用毫米游标卡尺逐一测量小鼠肿瘤的长和宽、肿瘤体积等于长x宽x宽。

2.肿瘤相对增长速度(Vt/Vo):

测量时的肿瘤体积(Vt)与处理前原初体积(Vo)的比值。

3.肿瘤抑制率:按如下公式计算

或

5.近期治疗效果:

疗效评价设CR、PR、S和P四个等级、参照有关文献规定为CP为药后15天肿瘤完全消退、一个月内局部无复发.PR为药后第15夭肿瘤体积缩小大于50%、S为肿瘤体积缩小不足50写但大于25%.P为肿瘤体积缩小不足25%或持续长大。

6.统计处理:对观察指标的各组均数进行t检验.

7.结果

7.1人参皂甙组合物对紫杉醇治疗B16黑色素瘤的增敏效果

人参皂甙组合物对紫杉醇治疗荷B16黑色素瘤的増敏效果及肿瘤抑制率如表1

表1

（紫杉醇+人参皂甙）组*与单独紫杉醇组相比P＜0.05

7.2以药物注射后时间为横座标、以肿瘤相对增长速度(Vt/Vo)为纵坐标、绘制的各处理组肿瘤生长曲线如图1。

由图1可见、单独紫杉醇治疗可明显使肿瘤生长减慢、有明显的治疗效果、加用人参皂甙组合物后肿瘤生长速度进一步减慢。空白对照组肿瘤长大到原初体积四倍(Vt/Vo=4)

所需要时间为4天、而紫杉醇化疗组及紫杉醇加用人参皂甙组合物组则分别延迟6天和8.5天、明显抑制肿瘤的生长。

7.3人参皂甙组合物对5FU治疗荷Levis肺癌瘤的增敏效果及肿瘤抑制率如表2。

表2

（5FU+人参皂甙）组*与单独5-FU组相比P＜0.05

7.4以药物注射后时间为横座标、以肿瘤相对增长速度(Vt/V。)为纵坐标、绘制的各处理组肿瘤生长曲线如图2。

由图2可见、单5FU治疗可明显使肿瘤生长减慢、有明显的治疗效果、加用人参皂甙组合物后肿瘤生长速度进一步减慢。空白对照组肿瘤长大到原初体积2倍(Vt/Vo=2)所需要时间为4天、而5FU化疗组及5FU加用人参皂甙组合物组则分别延迟6天和10天、明显抑制肿瘤的生长。

7.5人参皂甙组合物对吉西他滨治疗荷EL-4淋巴瘤的增敏效果及肿瘤抑制率如表3

表3

（吉西他滨+人参皂甙）组*与单独吉西他滨组相比P＜0.05

7.6以药物注射后时间为横座标、以肿瘤相对增长速度(Vt/V。)为纵坐标、绘制的各处理组肿瘤生长曲线如图3。

由图3可见、单吉西他滨治疗可明显使肿瘤生长减慢、有明显的治疗效果、加用人参皂甙组合物后肿瘤生长速度进一步减慢。空白对照组肿瘤长大到原初体积4倍(Vt/Vo=4)、所需要时间为5天、而吉西他滨化疗组及吉西他滨加用人参皂甙组合物组则分别延迟6天和10天、明显抑制肿瘤的生长。

图6是实验荷瘤小鼠。

实施例4

人参皂甙组合物直接对肿瘤细胞杀伤抑制作用的实验研究

实验I.不同浓度的人参皂甙组合物对多种癌细胞增殖的杀死抑制效应

用比色法测定人参皂甙组合物对胃癌细胞AGS、乳腺癌细胞MCF-7、肺癌细胞A549、胰腺癌细胞BxPC-3的细胞毒性剂量效应。

实现将对数生长期的胃癌细胞AGS细胞按均数5x10⁵/孔接种于96孔板、每孔加细胞悬液10μl、待细胞贴壁融合率达70%～80%后实验组加入终浓度为2、5、10、15、20μg/ml人参皂甙组合物、每种浓度设5个复孔、同时设无添加物的空白对照组。二组同时在37°C、5%Co2培养每24h、加入MTT20μl继续培养4H、弃上清液、每孔加入120μlDMSO微量振荡10分钟、使结晶物充分溶解、在酶联免疫分析仪上测定570nm处吸光度（OD）值A、计算细胞存活率。细胞存活率=(实验组A值/对照组A值）x100%、细胞增殖抑制率%=1-细胞存活率、实验重复3次、取平均值为最终结果。

得到胃癌细胞AGS的实验结果后用乳腺癌细胞MCF-7、肺癌细胞A549、胰腺癌细胞BxPC-3重复上述实验。

II.结果：表4为不同浓度的人参皂甙组合物对四种癌细胞增殖抑制率%

表4

实施例5

实施例5中、所述的人参皂甙组合物为实施例1的产物。

人参皂甙组合物逆转癌细胞多药耐药的实验研究

人参皂甙组合物逆转胃癌细胞多药耐药的实验研究

1.材料

人胃癌细胞AGS(ATCC提供)、人胃癌多药耐药细胞AGS/Fu、人参皂甙组合物、盐酸阿霉素、紫杉醇、健择、5氟尿嘧啶、噻唑兰、二甲基亚砜、鼠抗人单抗、培养基及胎牛血清。

2.方法

2.1细胞培养

AGS细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基于37oC、5%Co2环境中培养。

AGS/Fu细胞培养液中需加入20、000ng/ml5-Fu以维持耐药性、实验前两周去除5-Fu以正常DMEM培养基培养、然后用于实验及检测。细胞每4天用25%胰蛋白酶联合0.053mmol/LEDTA消化传代一次。取对数生长期细胞进行实验。

2.2实验方法

2.2.1

比色法测定人参皂甙组合物对AGS/Fu细胞毒性的剂量效应和IC50

将对数生长期的AGS/Fu细胞按均数5x10⁵/孔接种于96孔板、每孔加细胞悬液10μl、待细胞贴壁融合率达70%~80%后加入终浓度为10、20、30、40、50μg/ml人参皂甙组合物、每种浓度设5个复孔、同时设无添加物的空白对照组、同时在37°C、5%Co2培养每24h、加入MTT20μl继续培养4H、弃上清液、每孔加入120μlDMSO微量振荡10分钟、使结晶物充分溶解、在酶联免疫分析仪上测定570nm处吸光度（OD）值A、计算细胞存活率。细胞存活率=(实验组A值/对照组A值）x100%、求出IC50、实验重复3次、取平均值为最终结果。

2.2.2

人参皂甙组合物对细胞内Rho123浓度的流式细胞分析及对细胞毒性的检测

取对数生长期的AGS/Fu细胞、按1x10⁶/ml接种于6孔板、每孔加入2ml培养12h、镜下观察细胞贴壁后将人参皂甙按终浓度为10、20、30、40、50μg/ml人参皂甙组合物加入到各孔中、继续培养24h、经过上述不同人参皂甙浓度处理后的细胞各分为两组、其中一组加入Rho123染液5μg/ml、另一组只加培养液、继续37°C避光培育30分钟。再经BPS清洗细胞两次、最终将细胞重悬于37°C、5%Co2细胞培养箱孵育60分钟、流式细胞仪检测人参皂甙作用后细胞内Rho123荧光强度、分析人参皂甙对细胞的毒性作用、实验重复3次、取平均值为最终结果。

2.2.3

MTT比色法测定AGS/Fu耐药细胞对各化疗药物的耐药倍数（耐药细胞IC50/敏感细胞IC50）

将对数生长期的AGS/Fu及AGS的细胞按5x10⁶/孔接种于96孔板、每孔加细胞悬液10μl、待细胞贴壁融合率达70%~80%后"加入化疗药物ADM、GEM、TAXOL、5-Fu、同时设无药物作用的对照组，同时在37°C、5%Co2培养每24h、加入MTT20μl继续培养4H、弃上清液、每孔加入120μlDMSO微量振荡10分钟、使结晶物充分溶解、在酶联免疫分析仪上测定570nm处吸光度（OD）值A、计算细胞存活率。细胞存活率=(实验组A值/对照组A值）x100%求出IC50、实验重复3次、取平均值为最终结果。

耐药倍数RF（Resistant factor）=[耐药细胞IC50/敏感细胞IC50]

2.2.4

测定人参皂甙组合物对AGS/Fu耐药细胞的逆转作用即逆转倍数RI(Reversal index)

实验分3大组、AGS、AGS/Fu、AGS/Fu+人参皂甙组合物组.

每一个大组用4种化疗药物测试和计算他们分别对、AGS、AGS/Fu和AGS/Fu+人参皂甙组合物组的IC50、方法同上（2.2.1）最后计算人参皂甙组合物对肿瘤耐药细胞的逆转倍数RI(Reversal index)=[使用逆转剂前IC50/使用逆转剂后IC50]。逆转剂=人参皂甙组合物。实验重复3次取平均值为最终结果

2.2.5

测定细胞中细胞膜转运蛋白P-gp的表达及人参皂甙组合物对AGS/Fu P-gp表达的影响接种AGS细胞和AGS/Fu细胞于6孔板调整细胞浓度为1x10⁶/ml、分对照组和实验组、实验组加30μg/ml的人参皂甙组合物、作用24小时、然后2组更换新鲜培养基、继续培养24小时。培养结束后每组加入20μl细胞裂解液、冰浴上超声粉碎、4℃离心8分钟。用BPS洗细胞2次、调整细胞浓度为2x10⁵/ml、加MDR-PE鼠抗人单抗(Santa Crμz)37℃下避光孵育40分钟、离心弃上清、PBS洗细胞1次以洗去游离荧光抗体、加入BPS重新悬浮细胞用流式细胞仪检测P-gp的表达。实验重复3次、取平均值为最终结果。

2.2.6

RT-PCR测定MDR1基因的表达

取数生长期的AGS和AGS/Fu细胞接种于六孔板中、其中1孔为阴性对照AGS、1孔为AGS/Fu阳性对照、1孔为AGS/Fu+人参皂甙(30μg/ml)、培养72小时后、采用Trlzol一步法(Invitrogen)提取各组细胞总RNA。

cDNA经AMV逆转录酶系统合成(Promega)。逆转录系统共包括:MgC122μl、10x RNA PCR Bμffer 1μl、dNTP mixtμre 1μl、Rnase0.25μl、反转录酶0.5μl、Random9mers0.5μl总RNA 1μg、DEPC水4μl、共10μl。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。PCR扩增、MDR1引物、引物序列:MDR-1：上游5'-CCCATCATTGCAATAGCAGG3'下游5'-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3'；扩增产物157bp。

β-actin引物：上游5'-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3'；下游5'-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3'、扩增产物120bp。

经:94℃预变性2分钟、进入循环94℃30s、55℃30s、72℃45s、共30个循环、最后72℃延伸5分钟、得到MDR和β-actin的扩增产物。

扩增产物的检测：

取10μl PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳分离、溴化乙锭染色、实验重复3次、μVP凝胶成像系统扫描、并计算曲线下峰面积作为PCR产物的含量、以MDR1与β-actin的RT-PCR产物吸光度比值作为MDR1基因的表达水平。

3.统计学处理

3.1

统计描述：计量资料数据统计用均数±标准差(x±s)

3.2

统计推断：两组均数之间比较用t检验；多组均数之间比较用方差分析（F检验）。

采用SPSS12.0软件对数据进行检验、P<0.05或P<0.01为统计学检验有显著性差异。

4.结果：

4.1

比色法测定人参皂甙组合物对AGS/Fu细胞毒性的剂量效应（抑制率）

人参皂甙组合物量从50μg/ml开始、稀释为5种浓度（10、20、30、40、50μg/ml）、人参皂甙组合物在10～30μg/ml以下对AGS/Fu细胞无明显毒性、超过此浓度、其毒性呈剂量效应。IC50为60μg/ml、见表5。

表5：不同浓度人参皂甙组合物对AGS/Fu的抑制率%

人参皂甙组合物浓度μg/ml	抑制率%
		10μg/ml	3.32±1.01
20μg/ml	5.21±1.12
		30μg/ml	7.02±2.03
40μg/ml	15.21±2.04
		50μg/ml	39.28±3.25

4.2

当人参皂甙组合物在10~30μg/ml浓度时细胞内Rho123荧光强度随人参皂甙的浓度的增强而升高、当人参皂甙组合物浓度超过40μg/ml时、细胞内RHo123荧光强度停止増强、显示人参皂甙组合物浓度在(30μg/ml)时逆转效率较高且对细胞的毒副作用非常小。

4.3

AGS/Fu耐药细胞对各化疗药物的耐药倍数（RF）及人参皂甙组合物对AGS/Fu耐药细胞的逆转作用即逆转倍数RI(Reversal index)、见表6；

表6：人参皂甙组合物对胃癌细胞耐药性的逆转作用

（AGS/Fu+人参皂甙组合物30μg/ml）组与AGS/5FU组对照P＜0.01

故人参皂甙组合物对胃癌细胞的耐药性有显著的逆转作用。

4.4人参皂甙组合物对AGS及AGS/Fu P-gp的表达及MDR1基因的表达的影响

细胞中细胞膜转运蛋白P-gp表达的检测结果：AGS、AGS/Fu、AGS/Fu+人参皂甙组合物组（人参皂甙作用24小时）的P-gp的表达率和MDR1基因的表达分别如表7、加入人参皂甙组合物后较单独AGS/Fu组的P-gp的表达率和MDR1基因的表达有明显下降。

表7

3组的P-GP表达率见图4、图4中、图4是AGS组、图4是AGS/Fu组、图4是AGS/Fu+人参皂甙组合物30μg/ml组。3组的MDR1表达见图5。

实验II

人参皂甙组合物逆转人乳腺耐药癌细胞MCF-7/ADM的耐药作用。

1.材料

人乳腺癌细胞MCF-7(ATCC 提供)、人乳腺癌细胞MCF-7/ADM(耐药细胞)、人参皂甙组合物、盐酸阿霉素、噻唑兰、二甲基亚砜、鼠抗人单抗、培养基及胎牛血清；

2.方法

细胞培养同上、只是用阿霉素（ADM）来培养人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADM。

实验方法

2.2.1

比色法测定人参皂甙组合物对人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADM的细胞毒性的剂量效应和

IC50、实验方法同上。

2.2.2

实验方法同上。

2.2.3

MTT比色法测定MCF-7/ADM耐药细胞对化疗药物ADM的耐药倍数（耐药细胞IC50/敏感细胞IC50）

实验方法同上。

2.2.4

测定人参皂甙对MCF-7/ADM耐药细胞的逆转作用即逆转倍数RI(Reversal index)

实验分4组、第一组：MCF-7和MCF-7/ADM，单独加阿霉素、第二到第四组分别在第一组的基础上先加入人参皂甙组合物10、20、30μg/ml、分别作用24h、再加入阿霉素、余同上（2.2.4）。最后计算人参皂甙组合物对耐药细胞的逆转倍数(Reversal index)=[使用逆转剂前IC50/使用逆转剂后IC50]。

实验重复3次取平均值为最终结果

2.2.5

细胞中细胞膜转运蛋白P-gp表达的检测及人参皂甙组合物对MCF-7及MCF-7/ADM的P-gp的表达的影响

实验方法同上。

2.2.6

RT-PCR检测MDR1基因的表达

实验方法同上。

3.3.统计学处理

同上

4.结果

我们得到如下实验结果:

4.1

比色法测定人参皂甙组合物对MCF-7/ADM细胞毒性的剂量效应

人参皂甙组合物量从50μg/ml开始、稀释为5种浓度（10、20、30、40、50μg/ml）、人参皂甙组合物在10~30μg/ml以下对MCF-7/ADM细胞无明显毒性、超过此浓度、其毒性呈剂量效应。见表8；

表8不同浓度人参皂甙组合物对乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADM的抑制率

人参皂甙组合物浓度μg/ml	抑制率%
		10μg/ml	3.01±0.91
20μg/ml	5.11±1.02
		30μg/ml	6.92±1.89
40μg/ml	15.02±2.01
		50μg/ml	37.19±3.02

IC50为64μg/ml

人参皂甙组合物在30μg/ml浓度以下时对MCF-7/ADM细胞基本无毒性、为安全有效的逆转剂量。

4.2

结果显示人参皂甙组合物浓度在(30μg/ml)时逆转效率较高且对细胞的毒副作用非常小。

4.3

阿霉素耐药细胞MCF-7/ADM对化疗药物ADM的耐药倍数

阿霉素对敏感细胞和耐药细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为（1.12±0.03）μmol/L和（23.85±5.34）μmol/L、耐药倍数约为21倍。

4.4

人参皂甙对阿霉素耐药细胞MCF-7/ADM的逆转作用

人参皂甙组合物能够逆转阿霉素(ADM)对MCF-7/ADM的细胞毒作用、人参皂甙组合物10、20、30μg/ml分别作用于MCF-7和MCF-7/ADM乳腺癌耐药细胞24h后、耐药细胞株的IC50由原来的（23.85±5.34）μmol/L分别降至（15.56±4.25）μmol/L、（11.21±4.06）μmol/L、（7.00±3.07）μmol/L。见表9；

表9

阿霉素+人参皂甙混合与阿霉素对照P＜0.05

阿霉素+不同剂量人参皂甙组合物组之间比较P＜0.05

故人参皂甙组合物对乳癌癌细胞的耐药性有显著的逆转作用。

4．5人参皂甙组合物对MCF-7和MCF-7/ADM的P-gp表达及MDR1基因的表达的影响人参皂甙组合物(30μg/ml)可下调多药耐药基因MDR-1及其表达的耐药蛋白P-gp的量。

MCF-7、MCF-7/ADM、MCF-7/ADM+人参皂甙组P-gp的表达率及多药耐药基因MDR-1的表达见表10；人参皂甙组合物作用24小时后较作用前明显下降。

表10

实验III

人参皂甙组合物逆转人肺癌耐药细胞株A549/cDDP的耐药的作用。

1．材料

肺癌细胞A549(sigma-aldrich提供)、肺癌耐药细胞株A549/cDDP、人参皂甙组合物、顺铂(cDDP)、噻唑兰、二甲基亚砜、鼠抗人单抗、培养基及胎牛血清。

2.方法

细胞培养同上、只是用顺铂(cDDP)来培养肺癌耐药细胞株A549/cDDP。

实验方法

2.2.1

比色法测定人参皂甙组合物对人肺癌耐药细胞株A549/cDDP的细胞毒性的剂量效应和IC50

实验方法同上。

2.2.2

人参皂甙组合物对细胞内Rho123浓度的流式细胞分析及对细胞毒性的检测实验方法同上。

2.2.3

MTT比色法测定A549/cDDP耐药细胞对化疗药物cDDP的耐药倍（数耐药细胞IC50/敏感细胞IC50）

实验方法同上。

2.2.4

测定人参皂甙组合物对人肺癌耐药细胞株A549/cDDP的逆转作用即逆转倍数(Reversal index)

实验分4组、第一组：肺癌细胞株A549和肺癌耐药细胞株A549/cDDP、只加顺铂、第二到第四组分别在第一组的基础上先加入人参皂甙组合物10、20、30μg/ml、分别作用24h、然后再加顺铂。余同上（2.2.4）、最后计算人参皂甙对耐药细胞的逆转倍数(Reversal index)=[使用逆转剂前IC50/使用逆转剂后IC50]。

实验重复3次取平均值为最终结果

2.2.5

测定细胞中细胞膜转运蛋白P-gp的表达及人参皂甙组合物对A549/cDDP+顺铂的P-gp表达的影响

2.2.6

RT-PCR检测MDR1基因的表达

3.统计学处理

同上

4.结果

我们得到如下实验结果:

4.1

比色法测定人参皂甙组合物对A549/cDDP细胞毒性的剂量效应

人参皂甙组合物量从50μg/ml开始、稀释为5种浓度（10、20、30、40、50μg/ml）、MTT测定结果：人参皂甙组合物在10～30μg/ml以下对A549/cDDP细胞无明显毒性、超过此浓度、其毒性呈剂量效应。见表11；

表11

人参皂甙组合物在30μg/ml浓度以下时对A549/cDDP细胞基本无毒性、为安全有效的逆转剂量。IC50为62μg/ml

4.2

人参皂甙组合物对细胞内Rho123浓度的流式细胞分析及对细胞毒性的检测结果显示人参皂甙组合物浓度在(30μg/ml)时逆转效率较高且对细胞的毒副作用非常小。

4.3

顺铂耐药细胞A549/cDDP对化疗药物的耐药倍数

顺铂对敏感细胞A549和耐药细胞A549/cDDP的半数抑制浓度(IC50)分别为（3.12±0.09） μmol/L和（37.43±0.94）μmol/L、耐药倍数约为12倍。

4.4

人参皂甙对肺癌耐药细胞A549/cDDP的逆转作用

人参皂甙组合物能够逆转顺铂（cDDP）对肺癌耐药细胞A549/cDDP的细胞毒作用、人参皂甙组合物10、20、30μg/ml分别作用于耐药细胞A549/cDDP24h后、耐药细胞株的IC50由原来的37.43±0.94μmol/L分别降至（18.34±0.87）μmol/L、（14.61±0.54）μmol/L、（9.52±0.43）μmol/L。见表12

表12

人参皂甙组合物组处理后+顺铂（cDDP）与单独顺铂（cDDP）的IC50对照P＜0.05各不同浓度的人参皂甙组合物组处理后肺癌耐药细胞对顺铂（cDDP）的IC50对照P＜0.05故人参皂甙组合物对肺癌细胞的耐药性有显著的逆转作用。

4．5人参皂甙组合物对A549和耐药细胞A549/cDDP的P-gp表达及MDR1基因的表达的影响

人参皂甙组合物(30μg/ml)可下调多药耐药基因MDR-1及其表达的耐药蛋白P-gp的量。A549、A549/cDDP、A549/cDDP+人参皂甙组合物组P-gp的表达率分别如表13、A549/cDDP+人参皂甙组（人参皂甙作用24小时后）较作用前A549/cDDP组明显下降。

人参皂甙组合物(30μg/ml)同时可下调多药耐药基因MDR-1的表达、见表13；

表13

实施例6

片剂：

制备方法：将活性成分与蔗糖、玉米淀粉混合、加水湿润、搅拌均匀、干燥、粉碎过筛、加入硬脂酸钙、混合均匀、压片。每片重290mg、活性成分含量为100mg。

实施例7

液体制剂.

每1000ml液体制剂中、含实施例1的人参皂甙15g、（Solutol HS-15）聚乙二醇十二羟基硬脂酸酯195g、无水乙醇150ml、余为注射用水。

具体步骤：

1：溶解：

称取所述人参皂甙、加入无水乙醇、待人参皂甙完全溶解后再加入（Solutol HS-15）聚乙二醇十二羟基硬脂酸酯、搅拌至完全溶解后加入注射用水至1000ml。

2：过滤保存：

Claims

1.人参皂甙组合物、其特征在于、包括如下重量百分比的组分：

2.根据权利要求1所述的人参皂甙组合物、包括如下重量百分比的组分：

3.据权利要求1所述的人参皂甙组合物、包括如下重量百分比的组分：

4.权利要求1～3任一项所述的人参皂甙组合物的制备方法、其特征在于、包括如下步骤：首先将从人参茎叶中获得的总皂甙混合物、溶于碱金属氢氧化物与高沸点脂肪醇类化合物组成的溶液中、在1～3mp压力下加热进行水解、水解温度为180～260℃、反应时间为4～8小时、然后从反应产物中收集所述的人参皂甙组合物。

5.根据权利要求4所述的方法、其特征在于、收集方法包括如下步骤：将反应产物冷却至室温后加水稀释至原体积的4～8倍、通过有机溶剂萃取或大孔树脂吸附、洗脱、收集洗脱物、即可获得产物。

6.根据权利要求4所述的方法、其特征在于、碱金属氢氧化物与高沸点脂肪醇类化合物组成的溶液中、碱金属氢氧化物的重量浓度为5%～40%；

在溶解了总皂甙的碱金属氢氧化物与高沸点脂肪醇类化合物组成的溶液中、总皂甙混合物的重量浓度为2.5%～20%；

所述的高沸点脂肪醇类化合物是指沸点高于180℃的脂肪醇；

所述的碱金属氢氧化物包括NaOH或KOH、所述萃取剂包括氯仿、乙酸乙酯或正丁醇。

7.一种药物制剂、包括治疗有效量的权利要求1～3任一项所述的人参皂甙组合物和医药学上可接受的载体。

8.权利要求1～3任一项所述的人参皂甙组合物在制备逆转肿瘤多药耐药的耐药逆转剂药物、制备増敏肿瘤化疗的増敏剂药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用、其特征在于权利要求1～3任一项所述的人参皂甙组合物在和目前临床上所用的抗肿瘤药制成一种复合药物或联合用药的应用。

10.权利要求1～3任一项所述的人参皂甙组合物在制备直接抑制杀死肿瘤细胞的细胞毒性药物中的应用。

11.根据权利要求8,9和10所述的应用、其特征在于、所述肿瘤为胃癌、食道癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、肝癌、白血病、鼻咽癌、血癌、骨癌、淋巴癌(包括何杰金淋巴瘤及非包括何杰金淋巴瘤)、盆腔癌(包括子宫癌,宫颈癌)、肺癌（包括纵隔癌）、脑癌、神经癌、鼻咽癌、喉癌、骨髓瘤、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、黑色素瘤、肾癌、胰腺癌、皮肤癌、甲状腺癌、平滑肌肉瘤、纤维肉瘤。神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、肾母细胞瘤、肌母细胞瘤、软骨母细胞瘤和骨母细胞瘤、恶性脑膜瘤或恶性神经鞘瘤。

12.根据权利要求8、9、10和11所述的应用、其特征在于、所述肿瘤包括原发性肿瘤、复发、转移及多药耐药性肿瘤。

13.一种人参皂甙组合物或其衍生物组合物的液体制剂、其特征是、每1000·2000ml液体制剂中、可含权利要求1～3任一项所述的人参皂甙或其衍生物5～40g、（SolutolHS-15）聚乙二醇十二羟基硬脂酸酯65～520g、无水乙醇50～400ml、余为注射用水。

14.根据权利要求13所述的液体制剂、其特征在于、是指静脉或肌肉注射液、口服液、液体胶囊、喷雾剂或滴剂。

15.人参植物是指亚洲（人参，高丽参，三七人参，刺五加参），北美（西洋参）。