KR20230016117A - 쿠르토박테리움 프로이뮨 k3 균주를 이용하여 제조된 금나노입자 및 이를 포함하는 항암용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 새롭게 분리 동정된 균주인 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주를 이용하여 생합성된 컴파운드-K(Compound K)를 포함하는 금 나노입자 항암용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주 (기탁번호: KCTC14591BP) 및 컴파운드 K 를 포함하는 금 나노입자는 제조가 용이하고, 독성 및 부작용이 없이 암 세포의 세포 사멸을 효과적으로 유도할 수 있으므로, 암 예방, 개선 또는 치료를 위한 다양한 의약, 식품, 화장료, 사료 분야에서 널리 활용될 수 있다.

Description

쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주를 이용하여 제조된 금나노입자 및 이를 포함하는 항암용 조성물 {Gold nanoparticles prepared by using the Curtobacterium proimmune K3 strain and anticancer composition comprising the same}
본 발명은 새롭게 분리 동정된 균주인 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주를 이용하여 생합성된 컴파운드-K(Compound K)를 포함하는 금 나노입자 항암용 조성물에 관한 것이다.
인삼은 두릅나무과 (Araliaceae)에 속하는 다년생 초본 Panax ginseng C.A. Meyer 의 뿌리를 이용한 생약으로 인삼의 어원을 보면 'Pan'은 모든 것 'Axos'는 의학 이라는 뜻으로 만병통치라는 의미를 가지고 있다. 인삼에는 다양한 약리 성분이 포함되어 있는 것으로 알려져 있고, 대표적인 약리성분으로 PPD (Protopanaxadiol)와 PPT (Protopanaxatriol)계열로 성분이 포함되어 있다. 이 중 PPD 계열은 3번, 12번 탄소에 두 개의 하이드록실기를 가진 다이올 형태를 의미하며, 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, F2, Rg3 및 컴파운드 K(Compound K)가 PPD 계열로 분류된다.
이 중 컴파운드 K 는 인삼의 활성형 사포닌이고, 인삼 자체에는 존재하지 않고 대사체로 발견되는 것으로 알려져 있다. 즉, 사람이 인삼을 섭취한 후, 장내 미생물의 베타-글리코시다아제에 의하여 체내에서 만들어 지는데, 이러한 컴파운드 K 의 전환과정은 체외 환경에서는 쉽게 구현되기 어려운 것으로 보고되고 있다.
이와 같이 컴파운드 K 를 제조하는데 어려움이 있어 컴파운드 K 의 가격은 상당히 고가이며, 부족한 원료로 인해 컴파운드 K 의 우수한 활성에도 불구하고 다양한 연구가 적절하게 이루어질 수 없었다. 또한, 이와 더불어 컴파운드 K 는 생체 이용률이 낮아 다양한 의약품, 식품, 화장품으로 활용되는데 한계가 있다.
한편, 금속 나노입자는 입자 크기의 분포가 균일하고, 표면의 개질이 쉬우며, 우수한 안정성을 나타내는 등의 특징 덕분에 다양한 과학 분야에서 많은 관심을 받고 있다. 특히, 의료 분야에서는 나노스케일의 자기를 이용한 의료영상 및 바이오센서, 유전자 타겟 및 약물 전달 등에 적용될 수 있다는 장점이 있다. 금속 나노입자를 제조하기 위하여 일반적으로 화학적, 물리적 방법이 이용되고 있는데, 화학적 합성방법은 비교적 공정이 간단하나 비용이 많이 들고 시약의 부작용 등이 문제되고 있다. 또한, 물리적 방법은 나노입자의 크기 제어가 어렵고 고가의 제조 설비가 요구되는 등의 문제가 있어 효과적인 금속 나노입자의 제조가 어렵다는 단점이 있다. 이에 따라, 화학적인 환원제 또는 유기 용매를 사용하지 않는, 나노입자의 제조 및 이의 활용에 대한 연구의 필요성이 있다.
본 발명자들은 전통 발효 인삼 음료로부터 유용 균주를 분리 연구하던 중, 분리 동정된 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주를 이용하면, 유용성분인 컴파운드 K 를 포함하는 금 나노 입자를 제조할 수 있고, 이들이 우수한 항암 활성을 나타낼 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주를 포함하는 금나노입자 제조용 조성물; 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3, 컴파운드 K 를 포함하는 금 나노입자, 이를 포함하는 항암용 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 (Curtobacterium proimmune K3) 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 현탁액; 및 컴파운드 K를 포함하는, 금 나노입자 제조용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 (Curtobacterium proimmune K3) 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 현탁액; 컴파운드 K 및 금 전구체를 혼합하는 단계; 를 포함하는 금 나노입자 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 (Curtobacterium proimmune K3) 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 현탁액 및 컴파운드 K를 포함하는 금 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 (Curtobacterium proimmune K3) 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 현탁액 및 컴파운드 K를 포함하는 금 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 개선용 건강기능 식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 (Curtobacterium proimmune K3) 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 현탁액 및 컴파운드 K를 포함하는 금 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 (Curtobacterium proimmune K3) 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 현탁액 및 컴파운드 K를 포함하는 금 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주 (기탁번호: KCTC14591BP) 및 컴파운드 K 를 포함하는 금 나노입자는 제조가 용이하고, 독성 및 부작용이 없이 암 세포의 세포 사멸을 효과적으로 유도할 수 있으므로, 암 예방, 개선 또는 치료를 위한 다양한 의약, 식품, 화장료, 사료 분야에서 널리 활용될 수 있다.
도 1은 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 의 16S rRNA 분석에 의한 계통도를 나타낸 도이다. 검은색 원은 해당 노드가 최대 간결성 및 최대 가능성 알고리즘에서 복구되었음을 의미하며, 복제 퍼센트로 표시되는 부트스트렙(Bootstrap) 값은 브랜치 포인트를 의미한다(Bar, 0.005 substitutions per nucleotide position).
도 2는 CCK-AuNP 의 제조 공정 및 이의 항암 기전을 나타낸 모식도이다.
도 3은 CCK-AuNP 의 최적 합성 조건을 확인하기 위하여, 반응 시간(A), 컴파운드 K (CK) 농도(B), 금염 농도 (C), pH (D) 를 달리하며 제조된 CCK-AuNP의 UV-스펙트럼 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 및 도 5는 CCK-AuNP의 물리화학적 특성을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 4의 (A) 형태학적 특성 확인을 위한 TEM 이미지; 도 4의 (B) CCK-AuNP 의 전자 매핑; 도 4의 (C) CCK-AuNP의 결정 구조를 결정하기 위해 TEM 분석에 의해 얻은 SAED (Selected area electron diffraction) 이미지; 도 4의 (D) 원소 분포를 결정하기 위한 EDX 스펙트럼; 도 4의 (E) 결정 구조의 형태학적 특성을 결정하기 위한 SEM 이미지.
도 5의 (A) 결정 구조 식별을 위한 X- 선 회절 (XRD) 스펙트럼; 도 5의 (B) 열 안정성 결정을 위한 열 중량 분석 (TGA); 도 5의 (C) CCK-AuNP의 강도 및 부피 분포를 결정하기 위한 DLS 스펙트럼.
도 6은 정상 세포인 HaCaT 세포 (A), NHDF 세포 (B), RAW264.7 (C) 및 인간 위암 세포인 AGS (D)에 대한 세포독성 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001. ns, not significant).
도 7은 CCK-AuNP 처리 후 AGS 세포의 콜로니 형성을 염색 및 콜로니 계수를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001. ns, not significant).
도 8은 CCK-AuNP에 의해 유도된 Apoptotic AGS 세포를 Hoechst(A), PI 염색(B) 및 Leica DM IRB 형광 현미경 (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 사용하여 확인한 결과 및 이를 Image J 소프트웨어로 정량화한 결과를 나타낸 도이다(녹색, 응축된 염색질이 있는 핵절편으로 손상된 핵을 나타냄). 도 8의 C 는 Mito-Tracker로 염색된 AGS 세포의 미토콘드리아 형태에 대한 형광 현미경 이미지를 나타낸 도이다(*, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001).
도 9는 AGS 세포에서 Bax/Bcl2, Cytochrome c, Caspase 9, Caspase 3, PI3K 및 Akt 를 포함한 세포 사멸(apoptosis) 관련 유전자의 발현에 대한 CCK-AuNP의 효과를 qPCR 을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다(*, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001).
도 10은 CCK-AuNP가 AGS 세포에서 Bax/Bcl2, Cytochrome c, Caspase 9, Caspase 3, 인산화된 PI3K 및 Akt 를 포함한 세포 사멸(apoptosis) 관련 단백질의 발현에 미치는 영향을 단백질 전기영동을 통해 확인한 결과 및 이를 Image J 소프트웨어로 정량화한 결과를 나타낸 도이다(*, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001).
본 발명은 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 (Curtobacterium proimmune K3) 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 현탁액; 및 컴파운드 K를 포함하는, 금 나노입자 제조용 조성물, 이의 제조방법, 상기 금 나노입자를 포함하는 암 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 "쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 (Curtobacterium proimmune K3)" 는 대한민국 남양주 농가 전통 발효 인삼 음료으로부터 분리된 균주로, 16s rRNA 서열 기반 분석 결과, 기존에 알려지지 않은 새로운 균주인 것이 확인되었다. 따라서 상기 균주를 2021.06.01일자로 한국생명공학연구원에 기탁하고, 기탁번호 KCTC14591BP 를 부여받았다. 본 균주의 16s rRNA 서열은 서열번호 1로 나타내었다.
본 발명의 "컴파운드 K(Compound K, CK)" 는 컴파운드 K 및 이의 유도체를 모두 포함할 수 있고, 본 발명의 컴파운드 K 는 하기와 같은 화학식 1로 표시할 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00001
.
컴파운드 K는 발효 인삼 추출물에 존재하는 소량의 진세노사이드로, 다양한 약리학적 효능이 있음에도 불구하고 낮은 수용성 및 낮은 투과성으로 활용이 매우 제한적인 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 CK 의 이와 같은 한계점을 개선하기 위하여, CK 를 금 염과 결합하여, 발효 인삼 음료에서 분리된 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 에서 생물학적으로 합성하였으며, 이를 통해 제조된 금 나노입자를 “CCK-AuNP” 로 명명하고 이의 항암 효과를 확인하였다.
본 발명의 금 나노입자 제조를 위해 사용되는 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 (Curtobacterium proimmune K3) 균주 (기탁번호: KCTC14591BP)는 균주 자체뿐만 아니라 이의 배양액 또는 현탁액 상태; 또는 균주 파쇄액 상태로 포함되어 금 나노입자 제조에 사용될 수 있으며, 이들은 금 이온 및 컴파운드 K의 의 담체로 이용될 수 있다.
본 발명의 금 나노입자 조성물 제조를 위하여 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주는 1x101 CFU/mL 내지 1x104 CFU/mL 로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1x102 CFU/mL 내지 1x104 CFU/mL, 더욱 바람직하게는 1x103 CFU/mL 로 포함될 수 있다.
또한, 컴파운드 K는 상기 금 나노입자 제조용 조성물에 0.1mM 내지 3mM 로 포함될 수 있고, 바람직하게는 0.2mM 내지 1mM, 더욱 바람직하게는 0.25mM 의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 금 나노입자 제조용 조성물에 의하여 제조된 금 나노입자인 CCK-AuNP 는 암세포 사멸, 증식 억제 효과가 우수한 바, 암 예방 또는 치료용으로 활용될 수 있다.
또한 본 발명은 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 (Curtobacterium proimmune K3) 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 현탁액; 컴파운드 K 및 금 전구체를 혼합하는 단계; 를 포함하는 금 나노입자 제조방법을 제공한다.
본 발명의 금 나노입자 제조방법에 있어, 상기 금 전구체는 0.5 내지 5mM 의 농도로 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주, 이의 배양액 또는 현탁액; 및 컴파운드 K 와 혼합될 수 있으며, 바람직하게는 1mM 내지 3mM, 더욱 바람직하게는 1.5mM 내지 2.5mM 의 농도로 혼합될 수 있다. 상기 금 전구체는 금 나노입자를 제조하기 위하여 첨가되는 화합물을 의미하고, 환원 반응에 의하여 금 나노입자를 형성할 수 있는 금 염의 형태로 혼합될 수 있다. 예컨대 HAuCl4, NaAuCl3, AuCl3 등의 금 염 화합물을 사용할 수 있고, 본 발명의 바람직한 일 구현예에서는 HAuCl4를 혼합하여 CCK-AuNP를 생합성하여 제조하였다.
본 발명의 CCK-AuNP를 제조하기 위한 혼합 단계는 pH5 내지 7에서 수행될 수 있으며, pH 6에서 수행되는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서는 1x103 CFU/mL 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3, 2일 배양, 0.25mM의 CK 농도, 2mM의 HAuCl4, pH6 조건을 CCK-AuNP 제조에 가장 효과적인 제조 조건으로 수립하였으며, 본 발명에 따르면, 쿠르토박테리움 바이오 매스로부터 금 나노입자를 매우 간편하고 용이하게 제조할 수 있다.
또한 본 발명은 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 (Curtobacterium proimmune K3) 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 현탁액 및 컴파운드 K 를 포함하는 금 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 약학적 조성물, 건강기능식품 조성물, 화장료 조성물, 사료 조성물을 제한없이 포함할 수 있다.
상기 항암 효과를 나타내는 금 나노입자는 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 (Curtobacterium proimmune K3) 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 현탁액, 컴파운드 K 및 금 전구체를 혼합하여 제조되는 것일 수 있고, 금 나노입자 제조에 관한 구체적인 내용은 앞서 금 나노입자 제조용 조성물 및 제조방법에서 개시한 내용을 동일하게 적용할 수 있다.
본 발명의 CCK-AuNP 를 이용하여 예방, 치료, 개선 될 수 있는 암은 이에 제한되는 것은 아니나, 뇌종양, 흑색종, 골수종, 비소세포성폐암, 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 CCK-AuNP는 컴파운드 K 의 전달 효율을 개선하고, 이들이 유발할 수 있는 세포독성 문제를 해결하였으며, 암세포의 세포 사멸(apoptosis)를 유도하거나 암세포 미토콘드리아 손상을 유도할 수 있는 것을 특징으로 한다.
상기 식품 또는 건강기능식품 조성물은 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제, 천연 탄수화물, 영양제, 비타민제, 증점제, pH 조절제, 방부제 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food)및 식품 첨가제(food additives)등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강 식품으로는 상기 조성물 자체를 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마말레이드 등), 어류, 육류, 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등)등에 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 식품용 조성물 중 CCK-AuNP의 바람직한 함량은 식품용 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50% 일 수 있으며, 바람직하게는 0.01 내지 30% 범위로 함유될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 건강 기능성 식품 조성물은 정제, 환제, 과립제, 분말제, 액제, 경질캅셀제, 연질캅셀제 등과 같은 일반적인 제형으로 제조될 수 있으며, 죽, 빵, 음료, 바, 초콜릿, 쿠키, 차, 드링크제, 비타민 복합제, 육류, 소시지, 캔디, 면, 젤리 등과 같은 임의의 형태로 제조될 수 있다.
상기와 같은 여러 제형 또는 형태를 제조하기 위해, 전술한 부형제들과 같은 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 사용할 수 있으며, 제조하고자 하는 제형 또는 형태의 제조에 당해 기술 분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다.
또한 본 발명의 CCK-AuNP 가 사료 조성물 형태로 제공되는 경우, 상기 사료용 조성물은 공지의 사료 보조제, 식품 첨가제 또는 사료 첨가제를 추가적으로 포함할 수 있으며, 발효사료, 배합사료, 펠렛형태 및 사일리지 등의 형태로 제조될 수 있다.
또한 본 발명의 CCK-AuNP 가 화장료 조성물로 제공되는 경우, 상기 화장료 조성물은 상기 유효성분 이외에 통상적으로 허용되는 성분들을 제한 없이 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물은 피부 건강을 위한 다양한 소재를 제한없이 포함하는 의미로 해석될 수 있다.
또한 본 발명의 CCK-AuNP 가 약학적 조성물로 제공되는 경우, 상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화되어 사용할 수 있고, 제형화를 위하여 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기 담체 또는, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리게이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제는 상기 CCK-AuNP에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용하는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등을 사용할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해서 투여할 수 있다.
이하, 발명의 구체적인 실시예를 통해, 발명의 작용 및 효과를 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 이러한 실시예는 발명의 예시로 제시된 것에 불과하며, 이에 의해 발명의 권리범위가 정해지는 것은 아니다.
실험재료
진세노사이드 화합물 K (CK; C36H62O8, Mw 622.85, CAS NO. 39262-14-1)는 경희대 학교 인삼은행(대한민국 수원)에서 수득하여 이용하였다. LB 배지와 한천은 Oxoid (Hampshire, England)에서 구입하여 사용하였고, 분석등급의 gold (III) chloride trihydrate (HAuCl43 H2O)및 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), DMSO, Hoechst 33258 는 Sigma에서 구입하였다. RPMI, DMEM, 소 태아 혈청 (FBS) 및 페니실린-스트렙토마이신 (PS)은 GenDEPOT (Katy, TX, USA)에서 구입하여 사용하였다. 인산염 완충 식염수는 바이오세상 (대한민국 성남)에서 구매하였고, Propidium iodide (PI) 및 MitoTracker Green FM은 Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 입수하였다. PI3K, Akt, Bax, Bcl-2, 사이토크롬 C, caspase 9, caspase 3 및 β은 Abcam (Cambridge, UK)에서 구입하여 이용하였다.
통계 분석
실험 결과는 3번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차 (SD)로 표시하였다. GraphPad Prism 8 (San Diego, CA, USA)을 사용하여 통계 계산을 수행했으며 Student 's t-test를 사용하여 유의한 차이를 평가하였다. p <0.05에서 유의한 것으로 평가하였다.
실시예 1. 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 의 분리 동정
대한민국 남양주 농가의 전통 발효 인삼 음료로부터 균주를 분리하였다. 분리된 균주의 16S rRNA 염기 서열을 기반으로 한 계통수 분석 결과, 분리 균주가 쿠르토박테리움 속인 것으로 확인되었으며, 종래 알려진 균주와 상이한 16S rRNA 서열을 갖는 새로운 균주인 것을 확인하였다.
계통수를 구축하기 위하여, 16S rRNA 서열을 Genotech (대한민국, 대전)에서 분석하였고, Genbank 데이터베이스에서 연관 분류군을 확인하기 위한 다중 정렬을 실시하였다. 진화 거리는 Kimura 2 파라미터 방법을 이용하여 계산하였고, 사이트당 염기 대체 수 유닛으로 표현하였다. 분리된 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 의 계통수를 도 1에 나타내었다.
분리된 균주인 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3를 한국생명공학연구소원에 2021.06.01 일자로 기탁하고 KCTC14591BP 번호를 부여받았다. 해당 균주의 유전자 분석을 수행한 16S rRNA 서열을 서열번호 1에 표시하였다.
균주를 활성화하기 위하여, 하나의 콜로니를 LB 배지에 접종하고 24시간 동안 37℃에서 배양하였다.
실시예 2. 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 나노입자 제조
쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 를 25g / L LB 배지 (Bioscience, San Jose, CA, USA) 및 15g/L 한천 (BD Biosci-ence)을 함유하는 고체 영양 배지에서 37℃에서 24 시간 동안 성장시켰다. 박테리아 펠렛을 100 mL의 LB 배지에 접종하고 37℃에서 24 시간 동안 배양 하였다. 10 mL의 배양액을 부드럽게 흔들어 준 후 15 분 동안 4000g에서 원심분리 하였다. 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 및 진세노사이드 컴파운드 K(CK) 를 사용한 AuNP의 생물학적 합성은 다음의 방법을 통해 수행하였다. 요약하면, 수집된 쿠르토박테리움 펠렛을 1mM PBS (pH 7.2)로 2 회 세척한 다음 10mL의 PBS에 재현탁시켰다. 다양한 농도의 HAuCl4·3H2O 및 CK를 박테리아 현탁액과 개별적으로 혼합한 다음 어두운 조건에서 진탕 배양기 (Vision Scientific Co (주), 대한민국 대전)에서 37℃로 서로 다른 간격으로 배양하였다. 쿠르토박테리움 바이오 매스로부터 생합성으로 제조된 CK-금 나노 입자 (CurtoCK-AuNPs, CCK-AuNPs)를 시각적으로 관찰하여 최적의 합성 조건을 확립하였다. 그 후, 짙은 자주색 혼합물을 40 분 동안 초음파 처리 한 다음 4000rpm에서 15분 동안 원심분리하여 상청액 및 부유 물질을 다시 제거하였다. 박테리아 세포에 의해 형성된 나노 입자는 13000 rpm에서 20분 동안 원심 분리하여 수집하였다. 수집된 펠렛을 증류수로 2회 세척하고 생성 된 CCK-AuNP를 밤새 공기 건조하여 고체 시료를 얻었다. CCK-AuNP 의 합성 과정을 도 2에 간략하게 나타내었으며, 반응시간, CK 농도, 금 염의 농도 및 pH 조건을 달리하며, CCK-AuNP 생성 정도를 UV-스펙트럼으로 확인하여, 최적의 조건을 탐색한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이 반응시간(A), CK 농도(B), 금 염의 농도(C) 및 pH 조건(D)을 달리한 결과, CCK-AuNP 생성이 진행될수록 노란색에서 진한 보라색으로 색상 변화가 육안으로 관찰되었고, 1x103 CFU/mL 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3, 2일 배양, 0.25mM 의 CK 농도, 2mM 의 HAuCl4, pH6 의 조건이 가장 최적의 합성 조건임을 확인하였다. CCK-AuNP 최대 흡광도를 관찰하기 위한 UV-Vis 분광법에서 λ 는 545nm임을 확인하였다.
실시예 3. CCK-AuNP 물리화학적 특성 분석
실시예 2에서 제조된 금 나노 입자 형성을 300-800 nm 범위에서 UV-Vis 분광 광도계 (Spectronic Genesys 6, Cortson, UK)에 의해 관찰된 피크에 의해 확인하였다. 나노 입자의 모양, 분자 크기 및 분포는 다기능 200kV 작동 JEM-2100F (JEOL, Akishima, Tokyo, Japan) 및 주사 전자 현미경 (SEM)을 사용하여 FE-TEM으로 시각적으로 확인하였다. 입자 이미지는 합성된 나노 입자 한 방울을 첨가하여 구리 그리드에서 관찰하였다. 금 나노 입자의 품질을 결정하기 위해 EDX를 사용하였고, 합성된 금 분포를 관찰하기 위하여, Quantax EDX 분광법 (Bruker, Ewing, NJ, USA)을 수행하였다.
열 중량 분석 (TGA)은 CCK-AuNP 표면의 폴리머 함량을 측정하기 위해 0-600 ℃ 범위의 온도에서 작동하는 Baxit 열 중량 분석기 (중국 상하이)를 사용하여 수행하였다. 금 나노 입자의 결정 구조, 위상 특성, 격자 특성 및 결정 입자 크기에 대한 정보를 X-ray 회절 분석 (XRD)을 통해 확인하였다. 기기 조건은 40kV 및 40mA였으며, 20 ~ 80의 2θ범위에서 Cu-Kα 방사선 (λ = 1.54Å)을 사용하였고 금 나노 입자의 평균 결정 직경을 계산하는 데 Scherrer 방정식(D = k λ/ βcosθ 여기서 D는 입자의 결정 크기를 강조; k는 셰러 상수로 형상 계수 0.9와 동일; λ는 빛 회절의 파장(λ = 1.54 Å); β는 FWHM(full width at half maximum)의 전체 너비; θ는 브래그 굴절각)을 사용하였다. ELSZ-2000 시리즈 (Otsuka Electronics Co., Osaka, Japan)를 사용하여 나노 입자의 부피와 강도를 조사하기 위해 동적 광산란 (DLS)을 수행하였다. 합성된 CCK-AuNP 의 물리화학적 특성 분석 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4의 A 에 나타낸 바와 같이, CCK-AuNP 의 입자 크기가 200nm 이고 구형을 나타내는 것을 FE-TEM 분석을 통해 확인하였다. 도 4의 B에 나타낸 바와 같이, 원소 맵핑 분석 결과 금속 금의 광범위한 분포가 CCK-AuNP 상에서 빨간 점으로 확인되었고, 도 4의 C 에 나타낸 바와 같이, 구형의 단일 결정이 SAED 스펙트럼을 통해 기록됨을 확인하여, CCK-AuNP 의 결정 구조를 확인하였다. 도 4의 D 에서는 EDX 스펙트럼을 통해 CCK-AuNP 가 특히 1.9keV와 2.1keV에서 가장 높은 신호를 나타내는 것을 확인하였고, 이는 전형적인 금 나노입자 금속 결정임을 보여주는 결과이다. 한편 가장 높은 흡수 피크는 8.0keV 에서 확인되었는데, 이는 전형적으로 구리 원자에 해당하는 것으로 TEM 구조 분석을 위해 사용되는 구리 그리드에 의해 유도된 것으로 해석되었다. 도 4의 E 에 나타낸 바와 같이, SEM 이미지를 통해 결정 구조의 형태적 특징을 확인한 결과, 박막 구리 그리드에 탄소 코팅에 의한 CCK-AuNP가 형성되었고, 이들이 80-87nm 평균 크기를 갖는 다른 모양 (원형, 길쭉한 형태, 막대 형태) 를 갖는 것을 확인하였다.
CCK-AuNP 의 결정 구조를 결정하기 위하여 XRD 를 수행하고, CCK-AuNP 의 열 안정성을 측정하기 위한 TGA 측정을 0 내지 600℃에서 수행하였으며, 크기 분포 프로파일을 측정하기 위하여 DLS 분광기를 사용하였다. 각각의 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5의 A에 나타낸 바와 같이, XRD 측정결과, 111, 200, 220 및 311의 2θ각도에서 4 개의 주요 피크가 관찰되었으며, 이는 Bragg 반사의 금 격자 평면의 면 중심 입방 결정 구조에 해당함을 보여주는 결과이다. 도 5의 B 에 나타낸 바와 같이, CCK-AuNPs의 중량 손실은 50℃ 내지 250℃ 사이의 온도에서는 약간 감소했지만 400℃ 내지 550℃ 의 온도 범위에서 급격히 감소하였으며, 500℃에서 60 % 감소하는 것을 확인하였다. 또한 도 5의 C 에 나타낸 바와 같이, DLS 분광기를 사용한 CCK-AuNPs의 강도 및 부피 측면에서 CCK-AuNP의 강도 및 부피 분포는 각각 약 85-800 nm 및 30-190 nm인 것을 확인하였다.
실시예 5. CCK-AuNP 의 세포 독성 확인
CCK-AuNP 및 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 의 세포독성을 확인하기 위하여, 정상 세포인 RAW264.7 및 정상 인간 각질 세포(HaCaT), 정상 인간 진피 섬유아세포(NHDF) 와 인간 위암 세포인 AGS (ATCC; Manassas, VA, USA) 에 처리하였다. AGS 세포는 RPMI 배지에서 배양하였고, 나머지 세포들은 DMEM 배지에서 배양하였다. 모든 배지는 10% FBS 및 1% PS를 포함하는 배지를 이용하였고, 모든 세포들은 5% CO2 및 95 % 공기가 있는 가습 인큐베이터에서 37℃ 로 유지하였다.
암세포에 대한 세포 독성 확인을 위해서 세포를 96 웰 플레이트에 1 x 104 세포/웰의 초기 밀도로 접종하여 안정화시키고, 배양 24시간 후 PBS 를 2회 처리하여 세척하였으며, 다양한 농도의 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 및 CCK-AuNP 를 세포에 처리하고, 이들의 생존율을 24시간 배양 후 MTT 분석을 통해 확인하였다.
각 실험군의 세포 생존율은 배지만 처리한 대조군 세포의 백분율로 평가하고 각 실험군의 농도 및 억제율을 사용하여 생성된 선형 회귀 방정식을 통해 각 실험군의 IC50 값을 측정하였다. 정상 세포 및 암세포에 대한 각 실험군의 세포 독성 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6의 A 내지 C 에 나타낸 바와 같이, CCK-AuNP와 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 는 100 내지 400 ㎍/ml 농도 범위에서 모두 정상 세포에 대해 유의한 세포 독성을 나타내지 않았다.
반면 도 6의 D 에서 확인할 수 있는 바와 같이, CCK-AuNP는 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 와 달리 농도의존적으로 AGS 세포에 대한 억제 활성을 나타내었으며, 이는 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 는 그 자체로는 뚜렷한 항암 활성을 나타내지 않으나, CCK-AuNP는 항암 활성을 나타낼 수 있음을 보여주는 결과이다. CCK-AuNP 는 300㎍/ml 및 400㎍/ml 농도에서는 각각 50% 및 70% 의 세포독성을 나타내었다.
CCK-AuNP 가 AGS 에 세포 독성을 나타내는 것을 확인하였고, 추가적으로 CCK-AuNP 처리된 AGS 세포의 콜로니를 확인하여, 세포 독성을 확인하였다. 먼저 CCK-AuNP 200㎍/ml 및 400㎍/ml 로 AGS 세포를 처리하고, 세포를 크리스탈 바이올렛 염료로 염색하였다. 음성 대조군으로는 미처리 배지를 이용하였고, 양성 대조군으로는 50μM 시스플라틴을 이용하였다. 보다 상세하게 AGS 세포 (1x104 세포/웰)를 6개의 웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 안정화시켰다. 배지를 PBS로 2 회 세척 한 후 CCK-AuNP 200㎍/ml 및 400㎍/ml 를 포함하는 신선한 무혈청 배지로 교체하였다. 3 일 동안 배양한 후 세포를 PBS로 2 회 세척하고 콜로니를 0.1 % 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하였다. PBS로 3 회 세척 한 후, 세포 사진을 역광 현미경 (Leica DMi8, Wetzlar, Germany)으로 캡처하고 콜로니를 계수하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 미처리 대조군 세포와 비교하여 CCK-AuNPs 처리는 양성 대조군으로 사용된 50μM 시스플라틴 처리 세포에서 관찰된 것과 유사한 정도로 AGS 세포에 대해 유의한 독성 효과를 유도하는 것을 확인하였다.
실시예 6. CCK-AuNP 의 세포 사멸 기전 확인
6.1 암세포 사멸 효과 확인
CCK-AuNP 의 암세포 사멸 효과와 관련하여, CCK-AuNP 처리에 의한 세포 사멸 효과를 비교 분석하기 위해 세포 사멸 세포 수 및 세포의 형태를 관찰하기 위한 실험을 수행하였다. AGS 세포를 6웰 플레이트에 1X106 세포로 분주하고 CCK-AuNP 200㎍/ml 및 400㎍/ml 를 포함하는 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 추가적으로 24시간 배양한 후, 세포를 PBS 로 2회 세척하고, Hoechst 33258 및 PI로 실온에서 30 분 동안 염색 하였다. 살아있거나 죽은 세포를 Hoechst, PI 염색 및 Leica DM IRB 형광 현미경 (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 사용하여 확인한 결과를 도 8의 A 및 B 에 나타내었다.
또한, 미토콘드리아 손상은 세포사멸을 포함하는 프로그램화된 세포 사멸의 초기 단계에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으므로, AGS 세포의 형태학적 변화 관찰을 통해 CCK-AuNP 유도 세포 독성이 미토콘드리아 손상과 관련이 있는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 미토콘드리아를 국소화하고 형태 변화를 확인하기 위해 Mito-Tracker Green 염색 시약 (Abcam, Cambridge, UK)을 사용하였다. AGS 세포를 22mm2 커버슬립위에서 하룻밤 동안 배양하고, PBS 로 2회 세척한 후 CCK-AuNP 200㎍/ml 및 400㎍/ml 로 처리하였다. 24시간 배양한 후 PBS 로 2회 세척하였으며 50nM 의 Mito-Tracker ™ Green solution 염색 시약을 포함하는 예열된 배지 1ml 로 30분 동안 염색을 수행하였다. Leica DM IRM inverted modulation contrast microscope (Leica Microsystems, Bustleton Pike Feasterville, PA, USA) 을 이용하여 염색된 세포를 시각적으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 8의 C 에 나타내었다.
도 8의 A 및 B에 나타낸 바와 같이, 대조군 세포에서는 형광 변화가 거의 관찰되지 않았지만 CCK-AuNP 처리군에서는 양성 대조군인 시스플라틴 처리군과 유사하게, 하늘색 및 적색을 뚜렷하게 나타내었으며, 이는 세포 사멸 세포가 증가되었음을 보여주는 결과이다.
또한 도 8의 C 에 나타낸 바와 같이, CCK-AuNP 처리에 의해 AGS 세포에서 녹색으로 염색된 미토콘드리아 수가 대조군에 비하여 급격히 감소하는 것을 확인하였다. 미토콘드리아에서의 형태학적인 변화는 CCK-AuNP 의 처리가 AGS 세포의 미토콘드리아 손상 및 변화를 유도할 수 있음을 보여주는 결과이다.
6.2 CCK-AuNP 유도 세포사멸 (apoptosis) 기전 확인
추가적으로 CC-AuNP가 AGS 세포의 Bax/Bcl2, Cytochrome c, Caspase 9 및 Caspase 3, PI3K, Akt 를 포함한 세포 사멸 관련 유전자 및 단백질 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 각 실험군에서 상기 유전자들의 발현 수준을 qRT-PCR을 통해 확인하고, 단백질 발현 수준의 변화를 단백질 전기영동으로 확인하였다. 시스플라틴은 양성 대조군으로 사용하였고, 사용한 qPCR 프라이머 서열을 표 1에 나타내었다.
Figure pat00002
세포사멸 관련 유전자 발현 분석 결과를 도 9에 나타내었고, 단백질 발현 분석 및 이의 정량화 결과를 도 10에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, CCK-AuNP 처리군은 모두 Bax/Bcl-2, Cytochrome c, Caspase 9, Caspase 3을 포함한 세포사멸 자극 유전자의 발현을 농도 의존적으로 유의하게 상향 조절하고 조절 유전자 PI3K 및 AKt 의 발현을 유의하게 하향 조절하는 것을 확인하였다.
또한 도 10에 나타낸 바와 같이, 세포사멸 관련 단백질 수준은 유전자 발현 변화와 유사한 경향을 나타내는 것을 확인하였다. 구체적으로 CCK-AuNP 처리에 의하여 용량 의존적으로 Bax/Bcl-2, Cytochrome c, Caspase 9, Caspase 3의 유의한 상향 조절이 관찰된 반면, 인산화된 PI3K 및 Akt 는 CCK-AuNP로 처리된 AGS 세포에서 유의하게 하향 조절되었다. 이러한 결과는 AGS 세포에 대한 CCK-AuNP의 항 증식 활성이 세포 사멸 신호 전달 경로와 매우 관련이 있으며 Bax, Bcl2, Cytochrome c, Caspase 9 및 Caspase 3 유전자 시그널링 조절을 통해 암세포의 세포 사멸을 유도할 수 있음을 보여주는 결과이다.
한국생명공학연구원 KCTC14591BP 20210601
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Claims (14)

  1. 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 (Curtobacterium proimmune K3) 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 현탁액; 및 컴파운드 K를 포함하는, 금 나노입자 제조용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주는 1x101 CFU/mL 내지 1x104 CFU/mL 로 포함된 것인, 금 나노입자 제조용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 컴파운드 K 는 0.1mM 내지 3mM 의 농도로 포함된 것인, 금 나노입자 제조용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 금 나노입자는 암 예방 또는 치료용인, 조성물.
  5. 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 (Curtobacterium proimmune K3) 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 현탁액; 컴파운드 K 및 금 전구체를 혼합하는 단계; 를 포함하는 금 나노입자 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 금 전구체는 0.5 내지 5mM 의 농도로 혼합되는 것인, 금 나노입자 제조 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 혼합은 pH 5 내지 7 에서 수행되는 것인, 금 나노입자 제조방법.
  8. 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 (Curtobacterium proimmune K3) 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 현탁액; 및 컴파운드 K 를 포함하는 금 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 금 나노입자는 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 (Curtobacterium proimmune K3) 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 현탁액; 컴파운드 K 및 금 전구체를 혼합하여 제조되는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 암은 뇌종양, 흑색종, 골수종, 비소세포성폐암, 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 상기 금 나노입자는 암세포의 세포 사멸(apoptosis)을 유도하거나 암세포 미토콘드리아 손상을 유도하는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 (Curtobacterium proimmune K3) 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 현탁액; 및 컴파운드 K 를 포함하는 금 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 개선용 건강기능 식품 조성물.
  13. 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 (Curtobacterium proimmune K3) 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 현탁액; 및 컴파운드 K 를 포함하는 금 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 개선용 사료 조성물.
  14. 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 (Curtobacterium proimmune K3) 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 현탁액; 및 컴파운드 K 를 포함하는 금 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
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