KR20180081660A

KR20180081660A - 진세노사이드를 포함하는 금 나노입자 제조용 조성물 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR20180081660A
Application number: KR1020170002549A
Authority: KR
Inventors: 양덕춘; 김연주; 허준; 조수아
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2017-01-06
Filing date: 2017-01-06
Publication date: 2018-07-17
Also published as: KR101942634B1

Abstract

본 발명은 진세노사이드를 포함하는 금 나노입자 제조용 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 구체적으로 진세노사이드를 유효성분으로 포함하는 금 나노입자 제조용 조성물, 상기 조성물과 금 전구체를 반응시키는 단계를 포함하는 금 나노입자의 제조 방법, 상기 제조 방법에 의해 제조된 금 나노입자 및 상기 금 나노입자를 포함하는 항암 또는 항염증 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 금 나노입자의 제조방법은 중성의 pH 조건에서 환원제 또는 안정제의 부가 없이 금 나노입자를 제조할 수 있다. 또한, 상기 방법에 따라 제조된 금 나노입자는 생체 적합성이 우수하며 항암/항염증 활성이 우수하므로, 나노입자 산업뿐만 아니라 의약 산업에서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

진세노사이드를 포함하는 금 나노입자 제조용 조성물 및 이의 제조 방법 {A composition for producing gold nanoparticles comprising ginsenosides and preparation method thereof}

본 발명은 진세노사이드를 포함하는 금 나노입자 제조용 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 구체적으로 진세노사이드를 유효성분으로 포함하는 금 나노입자 제조용 조성물, 상기 조성물과 금 전구체를 반응시키는 단계를 포함하는 금 나노입자의 제조 방법, 상기 제조 방법에 의해 제조된 금 나노입자 및 상기 금 나노입자를 포함하는 항암 또는 항염증 조성물에 관한 것이다.

금속 나노입자는 입자 크기의 분포가 균일하고, 표면의 개질이 쉬우며, 우수한 안정성을 나타내는 등의 특징 덕분에 다양한 과학 분야에서 많은 관심을 받고 있다. 특히, 의료 분야에서는 나노스케일의 자기를 이용한 의료영상 및 바이오센서, 유전자 타겟 및 약물 전달 등에 적용될 수 있다는 장점이 있다. 금속 나노입자를 제조하기 위하여 일반적으로 화학적, 물리적 방법이 이용되고 있는데, 화학적 합성방법은 비교적 공정이 간단하나 비용이 많이 들고 시약의 부작용 등이 문제되고 있다. 또한, 물리적 방법은 나노입자의 크기 제어가 어렵고 고가의 제조 설비가 요구되는 등의 문제가 있어 효과적인 금속 나노입자의 제조가 어렵다는 단점이 있다.

이에 따라, 화학적인 환원제 또는 유기 용매를 사용하지 않는, 나노입자의 녹색 합성(green synthesis)에 대한 관심이 높아지고 있다. 식물 추출물이나 식물 영양소 단독이 환원제 또는 안정제로 사용될 수 있어, 환경 친화적이고 비용 면에서 효율적이다. 또한, 인간에 적용 시 긍정적인 생물학적 활성을 부여할 수 있는 이점을 가지고 있어, 생물의학 분야, 환경 분야 등 다양한 산업에서 활용성이 높을 것으로 기대된다.

상술한 자연 유래 물질을 통해 안정한 금속 나노입자가 합성되는 메커니즘은 구체적으로 밝혀진 바 없으나, 최근 플라보노이드, 알칼로이드, 폴리페놀, 테르페노이드, 폴리사카라이드, 아미노산, 유기산, 비타민 등의 물질들이 캐핑제 및 환원제로서의 역할을 수행한다는 연구 결과가 발표된바 있다(P. Singh, Trends in biotechnology, 2016, 34, 588-599.; V. Makarov, Acta Naturae, 2014, 6, 35-44.). 이와 관련하여, 식물에서 발견되는 다양한 유기 폴리머의 일종인 테르페노이드는 금 또는 은 이온을 나노입자로 환원시킬 수 있으며, 플라보노이드는 다양한 기능기를 가지고 있으므로 금속 이온을 나노입자로 환원시킬 수 있음이 보고되었다.

한편, 진세노사이드는 트리테르펜(triterpene) 사포닌으로, 항종양, 항염, 항비만 활성 및 알츠하이머병에 대한 보호 효과 등의 광대한 범위의 약리 효과를 나타낸다. 이에 따라, 진세노사이드 Rg5를 유효성분으로 함유하는 혈관형성 촉진용 조성물(한국 공개특허 제2016-0018974호), 진세노사이드 F2의 간 질환 예방 또는 치료 용도(한국 공개특허 제2016-0029894호) 등의 치료용 조성물을 비롯하여, 진세노사이드 Rd가 강화된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물의 제조방법(한국 공개특허 제2016-0018147호), 녹강균을 이용한 진세노사이드 함량이 증가된 홍삼 제제 및 이의 제조방법(한국 공개특허 제2015-0125785호) 등 진세노사이드 관련 기술의 개발이 활발히 이루어지고 있다. 그러나, 이러한 다양한 약리학적 활성에도 불구하고, 진세노사이드를 이용하여 금속 나노입자를 제조하는 방법에 대해서는 개발된 바 없었다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 진세노사이드를 이용하여 금속 나노입자를 제조하는 방법을 개발하고자 예의 노력 연구한 결과, 진세노사이드 컴파운드 K 또는 Rh2를 이용하면 중성의 pH 조건에서 빠른 시간 내에 안정한 금 나노입자를 제조할 수 있음을 확인하였으며, 또한 상기 진세노사이드에 유산균을 추가하여도 안정한 금 나노입자를 제조할 수 있다. 상기 방법으로 제조된 금 나노입자가 우수한 생체 적합성을 나타냄을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 진세노사이드를 유효성분으로 포함하는 금 나노입자 제조용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 조성물과 금 전구체를 반응시키는 단계를 포함하는 금 나노입자의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 제조 방법에 의해 제조된 금 나노입자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 금 나노입자를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 금 나노입자를 포함하는, 항염증용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 하나의 양태는 진세노사이드를 유효성분으로 포함하는 금 나노입자 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명의 금 나노입자 제조용 조성물은 천연 소재인 진세노사이드, 또는 진세노사이드와 유산균을 유효성분으로 포함하여, 별도의 환원제 또는 안정제의 부가 없이도 생체 적합성이 높은 금 나노입자를 제조하는데 사용할 수 있다.

본 발명의 용어, "진세노사이드(ginsenosides)"는 인삼에 있는 사포닌을 의미한다. 인삼 사포닌은 다른 식물에서 발견되는 사포닌과는 다른 특이한 화학구조를 가지고 있으며, 약리효능도 특이하여 인삼(Ginseng) 배당체(Glycoside)란 의미로 진세노사이드(ginsenosides)라 불린다.

본 발명에서, 상기 진세노사이드는 상업적으로 판매되는 것을 구입하거나 또는 자연계에서 재배 또는 채취한 인삼으로부터 분리된 것을 사용하거나, 또는 합성방법에 의해 합성된 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 진세노사이드는 진세노사이드 컴파운드 K(Compound K) 또는 진세노사이드 Rh2일 수 있다.

본 발명의 용어, "진세노사이드 컴파운드 K(Compound K)"는 인삼 자체에는 존재하지 않으나, 인삼 또는 홍삼에 존재하는 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd 등의 사포닌이 비피더스 균과 같은 장내 미생물 또는 토양미생물의 작용에 의하여 체내에서 흡수가능한 형태로 전환된 사포닌을 의미하며, 하기 화학식 1로 표시될 수 있다. 본 발명에서, 상기 진세노사이드 컴파운드 K(Compound K)는 "진세노사이드 C-K" 또는 "C-K"로 혼용되어 명명될 수 있다.

[화학식 1]

본 발명의 용어, "진세노사이드 Rh2"는 인삼으로부터 분리된 PPD(protopanaxadiol) 계열 사포닌을 의미한다. 20(S)-protopanaxdiol-3-O-β-D- glucopyranoside라고도 하고, C₃₆H₆₂O₈의 화학식으로 표시되며, 하기 화학식 2로 표시될 수 있다. 본 발명에서, 상기 진세노사이드 Rh2는 "Rh2"로 혼용되어 명명될 수 있다.

[화학식 2]

또한, 상기 진세노사이드는 본 발명의 조성물에 0.5 내지 2 mM, 구체적으로 0.5 내지 1.5 mM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 유산균을 추가로 포함할 수 있는데, 이 경우 상기 조성물은 인비보(in vivo)에서 이용되는 것일 수 있다.

본 발명의 용어, "유산균"은 젖산균이라고도 불리며, 당류를 발효하여 에너지를 획득하고 다량의 락트산을 생성하는 세균을 의미한다.

본 발명의 용어, "인비보(in vivo)"는 "생체 내"를 의미하며, 생체 내에서 생화학 또는 생물학적 반응이 진행되는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 인비보는 살아 있는 유산균 내에서 금 나노입자의 합성 또는 제조 반응이 진행되는 것을 의미한다.

구체적으로, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 페디오코커스(Pediococcus), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속에 속하는 균주일 수 있고, 더욱 구체적으로 락토바실러스 김치쿠스(Lactobacillus kimchicus), 락토바실러스 파낙시브레비스(Lactobacillus panaxibrevis)일 수 있으며, 가장 구체적으로 기탁번호 KCTC12041BP의 락토바실러스 김치쿠스(Lactobacillus kimchicus) DCY51 균주 또는 기탁번호 KCTC12806BP의 락토바실러스 파낙시브레비스(Lactobacillus panaxibrevis) DCY65 균주일 수 있으나, 본 발명의 금 나노입자를 제조할 수 있는 한, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 유산균이 기탁번호 KCTC12041BP의 락토바실러스 김치쿠스(Lactobacillus kimchicus) DCY51 균주인 경우, 상기 진세노사이드는 본 발명의 조성물에 0.5 내지 2 mM, 구체적으로 0.5 내지 1.5 mM, 더욱 구체적으로 1 mM 의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 유산균이 기탁번호 KCTC12806BP의 락토바실러스 파낙시브레비스(Lactobacillus panaxibrevis) DCY65 균주인 경우, 상기 진세노사이드는 본 발명의 조성물에 0.5 내지 2 mM, 구체적으로 0.5 내지 1.5 mM, 더욱 구체적으로 0.5 mM 의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, "금 나노입자"는 금으로 이루어진, 크기가 1~2500nm인 초미세 입자로서 작은 크기에 기인하는 특이하고도 다양한 성질을 보이는 입자를 의미한다. 본 발명의 금 나노입자는 제조방법에 따라 서로 다른 생리활성을 가질 수 있으며, 구체적으로 진세노사이드, 또는 진세노사이드와 유산균을 사용하여 제조된 본 발명의 금 나노입자는 진세노사이드의 생리활성 물질을 포함하고 있어, 다른 방법으로 제조된 금 나노입자보다 매우 우수한 생물학적 활성을 가질 수 있다.

본 발명에서, 진세노사이드를 이용하여 제조된 금 나노입자는 "진세노사이드-금 나노입자" 또는 "GNPs"로 혼용되어 명명될 수 있다. 또한, 진세노사이드 컴파운드 K(Compound K)를 이용하여 제조된 금 나노입자는 "C-K-GNPs", 진세노사이드 Rh2를 이용하여 제조된 금 나노입자는 "C-K-Rh2"로 혼용되어 명명될 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 1 mM의 진세노사이드 C-K 또는 Rh2를 이용하여 HAuCl₄·3H₂O로부터 금 나노입자를 제조하였고(도 1 및 2), 또한 상기 C-K; 및 락토바실러스 김치쿠스 DCY51 균주 또는 락토바실러스 파낙시브레비스 DCY65 균주를 이용하여 HAuCl₄·3H₂O로부터 금 나노입자를 제조하였다(도 11 및 13). 또한, 제조된 상기 금 나노입자는 반응 50분 또는 60분 후까지 응집되지 않고 안정한 상태를 나타냄을 확인하였고(도 5 및 도 6), 진세노사이드 단독에 비하여, 마우스 대식세포 RAW264.7 및 인간 각질세포 HaCaT에 대하여 더 낮은 세포 독성을 나타내며, RAW264.7 세포주의 생존율은 오히려 더 증가시킴을 확인하였다(도 10).

이는, 진세노사이드 또는 상기 진세노사이드에 유산균을 추가로 포함하는 본 발명의 조성물은 생체 적합성이 우수한 금 나노입자 제조에 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 조성물과 금 전구체를 반응시키는 단계를 포함하는, 금 나노입자의 제조 방법을 제공한다.

이때, 상기 "금 나노입자"의 정의는 전술한 바와 같다.

본 발명에서 제공하는 금 나노입자의 제조 방법은 천연 소재인 진세노사이드, 또는 진세노사이드와 유산균을 이용하기 때문에, 종래의 화학적 합성방법 또는 물리적 합성방법에 비해 친환경적이고, 별도의 환원제 또는 안정제의 부가 없이도 생체 적합성이 높은 금 나노입자를 제조할 수 있다.

본 발명의 용어, "금 전구체"는 금 나노입자를 제조하기 위하여 첨가하는 화합물을 의미한다. 상기 금 전구체는 환원반응에 의하여 금 나노입자를 형성할 수 있는 금속염 화합물이 될 수 있으며, 구체적으로, HAuCl₄, NaAuCl₃, AuCl₃ 등의 금염 화합물을 사용할 수 있고, 더욱 구체적으로 HAuCl₄을 사용할 수 있으나, 환원반응에 의하여 금 나노입자를 형성할 수 있는 한, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 제조 방법에서, 상기 금 전구체의 농도는 0.5 내지 1.5 mM일 수 있고, 구체적으로 0.7 내지 1.3 mM, 더욱 구체적으로 1 mM일 수 있으나, 본 발명의 금 나노입자를 제조할 수 있는 한, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 제조 방법에서, 상기 조성물과 금 전구체의 반응은 pH 6 내지 9, 구체적으로 pH 6.5 내지 8.5, 더욱 구체적으로 pH 7 내지 8에서 수행될 수 있으나, 본 발명의 금 나노입자를 제조할 수 있는 한, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 제조 방법에서, 상기 조성물과 금 전구체의 반응은 10 내지 100분, 구체적으로 20 내지 80분, 더욱 구체적으로 30 내지 70분 동안 수행될 수 있으나, 본 발명의 금 나노입자를 제조할 수 있는 한, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 제조 방법에서, 상기 조성물과 금 전구체의 반응은 70 내지 90℃, 구체적으로 75 내지 85℃, 더욱 구체적으로 80℃에서 수행될 수 있으나, 본 발명의 금 나노입자를 제조할 수 있는 한, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 제조 방법에서, 상기 조성물은 유산균을 추가로 포함하는 것일 수 있는데, 이 경우 상기 방법은 인비보(in vivo)에서 수행되는 것일 수 있다.

또한, 상기 제조 방법은 30 내지 45℃, 구체적으로 33 내지 42℃, 더욱 구체적으로 37℃에서 수행될 수 있으나, 본 발명의 금 나노입자를 제조할 수 있는 한, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 유산균의 구체적인 예로, 락토바실러스 김치쿠스(Lactobacillus kimchicus), 락토바실러스 파낙시브레비스(Lactobacillus panaxibrevis)일 수 있으며, 가장 구체적으로 기탁번호 KCTC12041BP의 락토바실러스 김치쿠스(Lactobacillus kimchicus) DCY51 균주 또는 기탁번호 KCTC12806BP의 락토바실러스 파낙시브레비스(Lactobacillus panaxibrevis) DCY65 균주일 수 있으나, 본 발명의 금 나노입자를 제조할 수 있는 한, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 제조 방법은 금 나노입자를 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 단계는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 구체적인 예로, 본 발명의 조성물과 금 전구체의 반응물을 원심분리할 수 있으며, 또는 상기 반응물을 원심분리한 이후 초음파분쇄할 수 있으나, 본 발명의 금 나노입자를 회수할 수 있는 한, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 진세노사이드 C-K는 1 mM의 농도로 1 mM의 염화금산 수용액과 pH 8, 80℃의 조건에서 반응 시 금 나노입자의 제조 효율이 우수함을 확인하였고, 반응 15분 후 금 나노입자가 생성되며, 생성된 금 나노입자는 반응 50분 후까지 응집되지 않고 안정한 상태를 나타냄을 확인하였다(도 5 및 도 6). 또한, 진세노사이드 Rh2는 1 mM의 농도로 1 mM의 염화금산 수용액과 pH 7, 80℃의 조건에서 반응 시 금 나노입자의 제조 효율이 우수함을 확인하였고, 반응 35분 후 금 나노입자가 생성되며, 생성된 금 나노입자는 반응 60분 후까지 응집되지 않고 안정한 상태를 나타냄을 확인하였다(도 5 및 도 6).

또한, 진세노사이드 C-K 또는 Rh2; 1 mM의 금염; 및 기탁번호 KCTC12041BP의 락토바실러스 김치쿠스 DCY51 균주 또는 기탁번호 KCTC12806BP의 락토바실러스 파낙시브레비 DCY65 균주를 37℃에서 함께 배양함으로써 금 나노입자를 제조하였다(도 11 내지 13). 아울러, 생성된 상기 금 나노입자는 진세노사이드 단독에 비하여, 마우스 대식세포 RAW264.7 및 인간 각질세포 HaCaT에 대하여 더 낮은 세포 독성을 나타내며, RAW264.7 세포주의 생존율은 오히려 더 증가시킴을 확인하였다(도 10). 마지막으로, 기탁번호 KCTC12041BP 또는 기탁번호 KCTC12806BP의 두 락토바실러스 균주를 이용하여 제조한 금 나노입자의 표면에는 진세노사이드가 캐핑되어 있음을 확인하였다(도 11 내지 13).

이는, 상기 조성물을 이용하는 본 발명의 제조방법은, 생체 적합성이 우수한 금 나노입자의 제조에 유용하게 활용될 수 있음을 시사하는 것이다.

또 다른 하나의 양태는 상기 제조 방법에 의해 제조된 금 나노입자를 제공한다.

이때, 상기 "금 나노입자"의 정의는 전술한 바와 같다.

본 발명의 금 나노입자는 생리학적으로 유효한 성분인 진세노사이드를 포함하며, 세포에 대하여 독성을 나타내지 않아 생체 적합성이 우수하므로, 이에 제한되지 않지만, 의료용, 생물학적 분석용 등의 용도로 사용될 수 있다.

본 발명의 제조방법에 의해 제조된 금 나노입자의 모양은, 일반적으로 구형, 삼각형 또는 육각형의 모양을 띨 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 인비트로 제조방법에 의해 제조된 금 나노입자의 결정의 크기는 C-K-GNPs의 경우 50 내지 600 nm, Rh2-GNPs의 경우 50 내지 350 nm일 수 있고, 인비보 제조방법에 의해 제조된 금 나노입자의 결정의 크기는 10 내지 25 nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또 다른 하나의 양태는 상기 금 나노입자를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

이때, 상기 "금 나노입자"의 정의는 전술한 바와 같다. 구체적으로, 상기 금 나노입자는 인비트로에서 진세노사이드 C-K 또는 Rh2를 이용하여 제조된 금 나노입자; 또는 인비보에서 진세노사이드 C-K 및 유산균, 구체적으로 기탁번호 KCTC12041BP의 락토바실러스 김치쿠스(Lactobacillus kimchicus) DCY51 균주 또는 기탁번호 KCTC12806BP의 락토바실러스 파낙시브레비스(Lactobacillus panaxibrevis) DCY65 균주를 이용하여 제조된 금 나노입자를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, "예방"은 상기 약학 조성물의 투여로 암을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어, "치료"는 상기 약학 조성물의 투여로 암의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.

상기 암은 폐암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 등일 수 있으며, 더욱 구체적으로 폐암 또는 대장암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.

상기 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체, 부형제 또는 희석제를 의미할 수 있으며, 구체적으로, 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)이 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

상세하게는, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.

상기 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 금 나노입자가 각각 1일 0.0001 내지 1000 mg/kg으로, 구체적으로는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여되도록, 상기 약학 조성물을 투여할 수 있다.

상기 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 약학 조성물을 매일 투여 또는 간헐적으로 투여해도 좋고, 1일 당 투여 횟수는 1회 또는 2~3회로 나누어 투여하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 조성물은 암의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 다른 약물 치료와 병용하여 사용할 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 용어, "개체"는 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 구체적으로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 GNPs는 A549 폐암 세포 및 HT29 대장암 세포에 대하여, 0.1 ㎍/ml의 낮은 농도에서도 높은 세포독성을 나타냄을 확인하였다(도 14). 이는, 상기 GNPs를 포함하는 조성물은 암의 예방 또는 치료에 우수한 효과를 나타낼 것임을 시사하는 것이다.

또 다른 하나의 양태는 상기 금 나노입자를 포함하는, 항염증용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어, "항염증"은 염증을 억제하는 작용을 의미한다. 염증반응의 조절은 생체 내 복구체계의 증강 및 손상을 감소시키기 위한 것으로서, 대단히 복잡한 것으로 알려져 있다. 염증 과정 중에는 많은 양의 염증유도 사이토카인(proinflammatory cytokines), 아질산(nitric oxide, NO) 그리고 프로스타글란딘(prostaglandin E2, PGE2)이 유도성 일산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS)와 사이클로옥시게나아제(cyclooxygenase-2, COX-2)에 의해 생성된다. 염증은 다양한 염증성 질환을 유발하는 원인으로서, 본 발명의 금 나노입자를 포함하는 조성물은 항염증 작용을 통해 다양한 염증성 질환에 대한 예방 및 개선 효과를 가질 수 있다.

상기 용어, "염증성 질환"은 염증에 의해 야기되는 질환을 의미한다. 구체적인 예로, 크론씨병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨씨 병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증과 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후군(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 백반증, 전신성 경피증 또는 궤양성 대장염일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 항염증용 조성물은 약학 조성물, 식품 조성물, 화장료 조성물 또는 의약외품 조성물의 형태일 수 있으나, 항염증 효과를 나타내는 한, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 GNPs는 LPS가 처리되어 염증상태로 활성화된 RAW 264.7 대식세포에 대하여, 0.1 ㎍/ml의 낮은 농도에서도 높은 NO 생산 억제 활성을 나타냄을 확인하였다(도 15). 이는, 상기 GNPs를 포함하는 조성물은 항염증 용도로 유용하게 활용될 수 있음을 시사하는 것이다.

본 발명에 따른 금 나노입자의 제조방법은 중성의 pH 조건에서 환원제 또는 안정제의 부가 없이 금 나노입자를 제조할 수 있다. 또한, 상기 방법에 따라 제조된 금 나노입자는 생체 적합성이 우수하며 항암/항염증 활성이 우수하므로, 나노입자 산업뿐만 아니라 의약 산업에서 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 진세노사이드를 이용하여 금 나노입자(gold nanoparticles, 이하, "GNPs"로 명명)를 합성하는 방법을 보여주는 개략도이다. a는 진세노사이드 컴파운드 K(Compound K)-금 나노입자(이하, "C-K-GNPs"로 명명), b는 진세노사이드 Rh2-금 나노입자(이하, "Rh2-GNPs"로 명명)에 관한 것이다.
도 2는 GNPs의 합성 결과를 보여주는 이미지로서, a는 C-K-GNPs 합성에 따른 색변화, b는 Rh2-GNPs 합성에 따른 색변화를 보여준다.
도 3은 pH 및 열에 의한 진세노사이드의 안정성을 분석한 TLC 결과로서, a는 C-K 및 b는 Rh2에 관한 것이다.
도 4는 GNPs의 합성 후 미반응된 진세노사이드를 분석한 TLC 결과로서, a는 C-K-GNPs 및 b는 Rh2-GNPs에 관한 것이다.
도 5는 pH 및 반응 온도에 따른 GNPs의 제조 효율을 분석한 UV-Vis 스펙트럼으로서, a는 C-K-GNPs 및 b는 Rh2-GNPs에 관한 것이다.
도 6은 반응 시간에 따른 GNPs의 형태를 분석한 결과로서, a 내지 d는 C-K-GNPs 및 b 내지 h는 Rh2-GNPs에 관한 것이다. a 및 e는 UV-Vis 각 GNPs의 스펙트럼을 보여주며, b는 반응 20분 후, c는 반응 50분 후, d는 반응 80분 후, f는 반응 35분 후, g는 반응 60분 후, 및 h는 반응 120분 후의 각 GNPs의 FE-TEM 이미지를 보여준다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된, GNPs의 형태, 원소 분포 및 순도 특성을 분석한 결과로서, a 내지 d는 C-K-GNPs 및 b 내지 h는 Rh2-GNPs에 관한 것이다. a 및 e는 FE-TEM 이미지, b 및 f는 원소 매핑(Elemental mapping) 분석에 따른 TEM 이미지, c 및 g는 EDX 스펙트럼, d 및 h는 X-ray 회절 스펙트럼을 보여준다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된, GNPs의 입자 크기 분포를 보여주는 그래프로서, a는 C-K-GNPs 및 b는 Rh2-GNPs에 관한 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된, GNPs의 진세노사이드 캐핑을 분석한 FT-IR 스펙트럼으로서, a는 C-K-GNPs 및 b는 Rh2-GNPs에 관한 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된, GNPs의 세포 독성을 분석한 MTT 어세이 결과로서, a는 C-K-GNPs 및 b는 Rh2-GNPs에 관한 것이다. 마우스 대식세포주 RAW 264.7, 또는 인간 각질세포주 HaCaT에 대한 독성을 분석하였으며, one-way ANOVA를 통해 통계적 유의성을 확인하였다. **는 P<0.05, ***는 P<0.001를 의미하며, 그래프 내 "-"는 미처리군을 의미한다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된, GNPs의 형태를 보여주는 FE-TEM 이미지로서, a는 기탁번호 KCTC12041BP의 락토바실러스 김치쿠스(Lactobacillus kimchicus) DCY51 균주에 의해 제조된 GNPs, 및 b는 기탁번호 KCTC12806BP의 락토바실러스 파낙시브레비스(Lactobacillus panaxibrevis) DCY65 균주에 관한 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된, GNPs의 진세노사이드 캐핑을 분석한 TLC 결과이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된, GNPs의 진세노사이드 캐핑을 분석한 HPLC 결과이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된, GNPs의 항암 활성을 보여주는 MTT 어세이 결과이다. 구체적으로, a는 A549 폐암 세포, b는 HT29 대장암 세포에 관한 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된, GNPs의 항염증 활성을 보여주는 NO 생산능 분석 결과이다. 구체적으로, LPS로 활성화된 RAW 264.7 대식세포에서 NO 생산능을 분석하였고, 양성 대조군으로서 50 μM의 L-NMMA(N-Methylarginine)를 사용하였다.

이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 인비트로 ( in vitro ) 제조된, 진세노사이드-금 나노입자의 특성

실시예 1-1. 진세노사이드-금 나노입자의 인비트로 제조

진세노사이드-금 나노입자(ginsenoside-GNPs; ginsenoside-gold nanoparticles)의 제조에 사용된 시약으로서, 테트라클로로금산(III) 수산화물(hydrogen tetrachloroaurate(III) hydrate; HAuCl₄·3H₂O; 염화금산)을 시그마-알드리치 사(Sigma-Aldrich)에서 구입하였다. 진세노사이드 컴파운드 K(이하, "C-K"로 명명) 및 진세노사이드 Rh2(이하, "Rh2"로 명명)는 인삼유전자원소재은행(수원, 한국)에서 구입하였다.

먼저, 진세노사이드를 이용하여 금 나노입자(gold nanoparticles; GNPs로 명명)를 합성하기 위하여, 도 1의 a 및 b에 나타낸 바와 같은 조건을 사용하였다. 구체적으로, 진세노사이드 C-K 또는 Rh2가 포함된 10 mM의 메탄올 진세노사이드 용액 200 ㎕를 1 mM의 염화금산 수용액 1.8 mL에 첨가하여 반응하는 진세노사이드의 농도는 1 mM가 되도록 하였다. Au³ ⁺를 Au⁰ 로 환원시키기 위하여 80℃의 유조에서 반응을 수행하였고, C-K의 경우 pH 8에서 20분, Rh2의 경우 pH 7에서 90분 동안 반응을 수행하였다.

그 결과, 도 2의 a 및 b에서 볼 수 있듯이, C-K-GNPs는 20분 내에 보라색으로, Rh2-GNPs는 90분 내에 루비레드(ruby red)색으로 색변화가 관찰되었으며, 이를 통해 각 금 나노입자의 합성은 상기 시간 내에 완성됨을 알 수 있었다. 또한, 이러한 반응 용액의 색변화는, GNPs의 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance; SPR) 진동에 의한 여기(excitation) 때문에 야기됨을 알 수 있었다.

이후, 혼합물을 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 미반응된 진세노사이드를 제거하였고, 상층액을 증류수에 재현탁하였다. GNPs 용액은 4℃에서 보관하였고, GNPs를 정제하기 위하여, 추가적인 미반응 입자를 제거하고자 반응 혼합액을 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 이후, 16,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛 형태의 나노입자를 수득하였고, 메탄올로 여러 번 헹구었다. 이후, 상기 입자를 건조시켜 파우더 형태로 수득하였으며, 상기 최종 생성물을 이후의 분석에 사용하였다.

실시예 1-2. 진세노사이드-금 나노입자의 최적의 제조 조건 확인

실시예 1-2-1. 진세노사이드의 안정성 확인

진세노사이드는 높거나 낮은 pH 및 고온에서 불안정하다고 알려져 있다. 이에 따라, 안정된 진세노사이드-금 나노입자를 최대의 수율로 제조하고자, 진세노사이드가 안정하게 존재할 수 있는 최적의 pH 및 온도 조건을 확인하였다.

구체적으로, C-K 또는 Rh2가 포함된 10 mM의 메탄올 진세노사이드 용액 100 ㎕를 pH 3 내지 10의 서로 다른 pH 버퍼 0.9 ㎖에 첨가하였다. 아세트산나트륨(sodium Acetate, pH 3-5), 소듐 포타슘 인산염(sodium potassium phosphate, pH 6-8) 및 탄산나트륨(sodium carbonate, pH 9-10)의 각 버퍼는 해당하는 pH 값에 사용하였다. 샘플을 90℃에서 3시간 동안 보관하였고, 이후 반응 혼합물로부터 진세노사이드를 추출하기 위하여 n-부탄올(n-butanol) 500 ㎕를 첨가하였고, 13500 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. n-부탄올 분획층의 분취물(3 ㎕)을 박층크로마토그래피(thin layer chromatogram; TLC) 판에 적용하여 분석하였다.

이후, 실리카 겔(Silica Gel) 60 플레이트와 이동상으로서 CHCl3CH3OH-H2O (65:35:10, v/v/v, lower phase) 용매 시스템을 이용하였다. TLC 판 위의 스팟을 10%(v/v) H₂SO₄를 뿌리고, 이어서 110℃에서 10분간 가열함으로써 밴드를 탐지하였다.

그 결과, 도 3의 a에서 볼 수 있듯이, 90℃에서 3시간 동안 열을 가열하는 경우, C-K는 pH 3 내지 5의 범위에서 여러 밴드를 나타냄을 확인하였다. 반면, 도 3의 b에서 볼 수 있듯이, Rh2는 상기의 pH 범위에서 다른 밴드를 나타내지 않음을 확인하였다. 이는, pH 3 내지 5의 범위에서는 C-K가 분해됨을 알 수 있었다.

상기 결과를 통해, 진세노사이드-금 나노입자의 최적 pH 조건은 pH 6 이상 10 이하임을 알 수 있었다.

실시예 1-2-2. 진세노사이드의 캐핑 (capping) 효율 확인

안정된 진세노사이드-금 나노입자를 최대의 수율로 제조하고자, GNPs에 진세노사이드가 최대로 캐핑될 수 있는 최적의 pH 및 온도 조건을 확인하였다.

구체적으로, C-K 또는 Rh2가 포함된 10 mM의 메탄올 진세노사이드 용액 200 ㎕를 pH 6, 8 및 10의 1 mM의 염화금산 수용액 1.8 mL에 첨가하여, 반응하는 진세노사이드의 농도는 1 mM가 되도록 하였다. pH는 0.1 N NaOH 및 0.1 N HCl로 조정하였으며, 반응 온도는 80℃에서 수행하였다. 일정한 반응 시간이 흐른 뒤, GNPs를 분리하기 위하여 반응 혼합액 200 ㎕를 12,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 1.5 mL 튜브에 옮긴 후, 200 ㎕ n-부탄올 분획층을 TLC(thin layer chromatogram)에 첨가하여 상기 실시예 1-2-1에 따른 방법으로 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, 반응 혼합물의 상층액에 포함된 진세노사이드의 양은 반응 시간이 지날수록 감소되며, pH 6 내지 8에서 모두 동일한 결과를 나타냄을 확인하였다.

구체적으로, 도 4의 a에서 볼 수 있듯이, C-K-GNPs의 경우, 80분의 반응 시간이 지난 후에는 TLC 판에 존재하는 C-K의 양은 현저히 감소함을 확인하였다. 반면에, Rh2-GNPs의 경우, 120분의 반응 시간이 지나도 TLC 판으로 탐지되는 Rh2의 양은 C-K보다 많음을 확인하였다.

상기 결과를 통해, C-K 및 Rh2는 금 나노입자 표면에 흡수되어 안정화된 캐핑층을 형성하며, Rh2 보다 C-K가 효율이 더 우수한 환원제/안정제임을 알 수 있었다.

실시예 1-2-3. GNPs의 제조 효율 확인

안정된 진세노사이드-금 나노입자를 최대의 수율로 제조하고자, 반응의 최적 pH 및 온도 조건을 확인하였다.

구체적으로, GNPs가 포함된 각각의 반응 용액을 400-800 nm의 범위에서 UV-Vis 분광 광도계(Ultrospec 2100 Pro, Amersham Biosciences)로 분석하였다.

그 결과, 도 5의 a 및 b에서 볼 수 있듯이, 중성의 pH 조건에서는 흡광도가 증가하지만, 9 이상의 높은 pH 조건에서는 흡광도가 감소함을 확인함으로써, C-K-GNPs 및 Rh2-GNPs 합성에 적절한 pH 조건은 각각 8 및 7임을 확인하였다. 또한, HAuCl₄은 pH 8에서 AuCl(OH)³ ^-, pH 7 에서 AuCl₂(OH)² ^-로 변환된다는 기존의 연구 결과를 통해, C-K 는 AuCl(OH)³ ^-에, Rh2 는 AuCl₂(OH)² ^-에 더욱 쉽게 결합함을 알 수 있었다.

상기 결과를 통해, 식물을 이용한 다른 금 나노입자의 합성 방법이 산성의 조건을 요구하는 것에 비하여, 중성의 pH 조건을 이용하는 본 발명은 pH 적정이 필요하지 않으므로, 기존 방법보다 더욱 우수한 방법임을 알 수 있었다.

실시예 1-3. GNP의 환원 반응속도 확인

GNPs의 제조에 요구되는, 금 이온으로부터 금 나노입자로의 환원 속도를 평가하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1-2-2에 따른 방법으로 UV-Vis 스펙트럼을 기록하였으며, 합성된 GNPs의 크기 및 모양을 FE-TEM으로 분석하였다.

그 결과, 도 6의 a에서 볼 수 있듯이, C-K-GNPs의 최대 흡광도는 반응 혼합물이 20분 동안 인큐베이션(incubation) 되었을 때 나타났다. 또한, 15분에서 80분까지 인큐베이션이 진행되는 동안, C-K-GNPs의 최대 SPR 파장은 590 nm에서 600 nm로 이동하였으며, 시간이 길어질수록, 피크는 현저히 감소함을 확인하였다. 또한, 도 6의 b 내지 d에서 볼 수 있듯이, 20분째에는 응집의 징후가 거의 없는 가변 모양의 GNP가 관찰되었으나, 50분 이상이 지난 후에는 나노입자가 응집되기 시작함을 확인하였다. 상기 결과를 통해, C-K-GNPs는 50분 이상의 시간이 지날수록 응집되며, 불안정해짐을 알 수 있었다.

반면에, 도 6의 e에서 볼 수 있듯이, Rh2-GNPs의 최대 흡광도는 반응 혼합물이 90분 동안 인큐베이션될 때 나타남을 확인하였고, 모든 시간에서 최대 흡광도 값은 550nm에서 기록되었으며, SPR 파장의 변화는 관찰되지 않음을 확인하였다. 상기 지속적으로 증가하여, 90분 이후에 최대에 도달하였는데, 120분 이후에 기록된 피크는 흡광도가 감소함을 확인하였다. 또한, 도 6의 f 내지 h에서 볼 수 있듯이, 35분째에는 응집의 징후가 거의 없는 가변 모양의 GNP가 관찰되었으나, 60분 이상이 지난 후에는 나노입자가 응집되기 시작함을 확인하였다. 상기 결과를 통해, Rh2-GNPs는 60분 이상의 시간이 지날수록 응집되며, 불안정해짐을 알 수 있었다.

상기 결과를 종합하여, C-K-GNPs의 최적 반응 시간 조건은 50분 이내, Rh2-GNPs의 최적 반응 시간 조건은 60분 이내임을 알 수 있었다.

실시예 1-3. GNP의 특성 확인

실시예 1-3-1. GNPs의 형태, 원소 분포 및 순도 특성 확인

본 발명에 따른 방법으로 제조한 진세노사이드-금 나노입자의 형태, 원소 순도 및 분포 특성을 분석하였다.

먼저, 합성된 GNPs의 크기 및 모양을 FE-TEM으로 분석하였다.

그 결과, 도 7의 a 및 e에서 볼 수 있듯이, C-K-GNPs 및 Rh2-GNPs는 다양한 모양을 나타냄을 확인하였다. 대부분은 구형의 모양이었고, 그 다음으로 삼각형이 관찰되었으며, 육각형의 모양은 드물게 관찰되었다.

이후, 합성된 GNPs에 포함된 원소의 분포를 분석하였다. 탄소가 코팅된 구리 그리드(copper grid) 위에 GNPs 나노입자의 방울을 분주하여 샘플을 준비하였고, 이를 60℃의 오븐에서 건조한 후, 200 kV로 작동한 JEM-2100F (JROL) 기기를 이용하여 원소의 분포를 분석하였다.

그 결과, 도 7의 b 및 f에서 볼 수 있듯이, GNPs에는 금 원소가 주요 원소로서 분포하고 있음을 확인하였다.

또한, 합성된 GNPs에 포함된 금 원소의 존재 여부를 EDX 스펙트럼을 통해 분석하였다.

그 결과, 도 7의 c 및 g에서 볼 수 있듯이, GNPs는 금속으로서의 금이 나타내는 특징적인 피크와 상응하는, 2.3 keV에서 가장 높은 광학 흡광 밴드를 나타냄을 확인하였고, 상기 결과를 통해, 금 원소가 주요 원소로서 포함되어 있음을 확인하였다.

또한, 합성된 GNPs의 결정성을 40 kV, 40mA CuKa, 방사선, 6°/분의 스캔 비율, 0.02의 결절점 거리, 20-80°의 2θ 범위 이상의 조건에서 작동된 X-ray 회절분석기(D8 Advance, Bruker, Germany)로 분석하였다.

그 결과, 도 7의 d 및 h에서 볼 수 있듯이, 네 개의 특징적인 회절 피크는 JCPDS(Joint Committee on powder diffraction Standards, No 04-0784)의 데이터베이스와 일치하는, 브래그 반사(Bragg's reflection)의 격자 평면(lattice plane)의 (111), (200), (220) 및 (311)에 할당됨을 확인하였다. 구체적으로, (111) 평면에서 측정된 강도는 다른 격자 평면에서 측정된 강도보다 훨씬 높음을 확인하였는데, 상기 결과를 통해 GNPs는 주로 (111) 방향으로 구성됨을 알 수 있었고, 높은 순도를 가지면서 결정형태로 존재함을 알 수 있었다.

실시예 1-3-2. GNPs의 입자 크기 확인

본 발명에 따른 방법으로 제조한 진세노사이드-금 나노입자의 크기를 확인하였다.

구체적으로, 입자 크기 분석기(Photal, Otsuka Electronics, Japan)를 이용한 동적 광산란(Dynamic Light Scattering, DLS) 기법을 이용하여 나노입자의 크기 분포 프로필을 분석하였다. 이때, z-평균 및 다분산 지수(z-average and polydispersity index; PDI)는 25℃에서 분석하였다.

그 결과, 도 8의 a에서 볼 수 있듯이, C-K-GNPs의 넓이 범위는 168 nm의 Z-평균값 및 0.155의 PDI를 가지며, 50-600 nm의 범위의 입자 크기를 나타냄을 확인하였다.

또한, 도 8의 b에서 볼 수 있듯이, Rh2-GNPs의 넓이 범위는 137.5 nm의 Z-평균값 및 0.186의 PDI를 가지며, 50-350 nm의 범위의 입자 크기를 나타냄을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 본 발명의 진세노사이드-금 나노입자는 기존의 나노입자와 유사한 범위의 크기를 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 1-3-3. GNPs의 진세노사이드 캐핑 확인

본 발명에 따른 방법으로 제조한 진세노사이드-금 나노입자에 진세노사이드의 캐핑 여부 및 정도를 확인하였다.

구체적으로, 4 cm^-1의 흡광도에서 4000-450 cm^-1 이상의 범위를 갖는 푸리에 변환 적외선(Fourier Transform-Infrared; FT-IR) 분광학 분석을 통해 분석하였고, PjerkinElmer Spectrum One FT-IR 분광광도계를 이용하였다.

그 결과, 도 9에서 볼 수 있듯이, C-K 및 C-K-GNPs, 또는 Rh2 및 Rh2-GNPs의 FT-IR 스펙트럼은 동일한 특징을 나타냄을 확인하였다.

구체적으로, 도 9의 a에서 볼 수 있듯이, C-K 및 C-K-GNPs의 O-H 밴드는 3390.69 cm^-1, C-H 스트레칭(stretching)은 2876.04-2945.20 cm^-1, C=C 이중결합 스트레칭은 1642.17 cm^-1, CH₃ 및 CH₂ 비대칭 변형(asymmetric deformation)은 1455.17 cm^-1, C-O 스트레칭은 1041.95-1308.67 cm^-1에서 관찰됨을 확인하였다.

또한, 도 9의 b에서 볼 수 있듯이, Rh2 및 Rh2-GNPs의 O-H 밴드는 3390.69 cm^-1, C-H 스트레칭(stretching)은 2876.04-2945.20 cm^-1, C=C 이중결합 스트레칭은 1642.17 cm^-1, CH₃ 및 CH₂ 비대칭 변형(asymmetric deformation)은 1455.17 cm^-1, C-O 스트레칭은 1041.95-1308.67 cm^-1에서 관찰됨을 확인하였다.

마찬가지로, 도 9의 b에서 볼 수 있듯이, Rh2 및 Rh2-GNPs의 O-H 밴드는 3390.36 cm^-1, C-H 스트레칭(stretching)은 2944.87 cm^-1, C=C 이중결합 스트레칭은 1644.70 cm^-1, CH₃ 및 CH₂ 비대칭 변형은 1453.23 cm^-1, C-O 스트레칭은 1163.57-1261.97 cm^-1에서 관찰됨을 확인하였다.

상기 결과를 통해, C-K 및 Rh2는 나노입자의 응집을 예방하고, 이의 주변에 캐핑 층을 형성함으로써 GNP를 안정화시킴을 알 수 있었다.

실시예 1-4. GNPs의 인비트로 세포 독성 확인

본 발명에 따른 방법으로 제조한 진세노사이드-금 나노입자의 세포 독성을 MTT(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H tetrazolium bromide) 어세이를 통해 확인하였다.

구체적으로, 인간 각질세포주 HaCaT Hek293 (ATCC) 세포 및 마우스 대식세포주 RAW 264.7를 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% P/S(penicillin/streptomycin)가 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagles Medium)에서 배양하였고, 5% CO₂를 포함하는 습한 조건의 37℃에서 배양하였다. 이후, 96-웰 플레이트(Corning Costar, Lowell, NY, USA)에 각 웰 당 5 X 10⁴의 밀도로 분주하여 48시간 동안 배양하였다.

이후, 웰에 존재하는 세포가 90%의 밀도(confluency)를 보일 때, 서로 다른 농도의 금 나노입자를 세포에 처리한 후, 37℃에서 24 h 배양하였다. 이후, MTT(5 mg/mL, PBS) 어세이 용액 10 ㎕을 각 웰에 기존 배양액 부피의 1/10에 해당하는 동등한 부피로 첨가한 후, 4시간 동안 배양하였다. 형성된 비수용성의 포마잔 결정체를 DMSO(dimethyl sulfoxide) 100 ㎕로 용해하였고, 이소프로판올(isopropanol)에 포함된 0.1M HCl 용액으로 세포를 용해하였다. 변환된 염색물질의 흡광도를 570 nm 에서 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 리더기(Bio-Tek Instruments, Inc., Vinooski, VT, USA)로 측정하였고 630 nm의 배경 흡광도를 제거하였다.

그 결과, 도 10의 a에서 볼 수 있듯이, 마우스 대식세포 RAW264.7에 대하여, Rh2가 56 ± 1%의 세포 생존율을 나타낸 반면에, C-K는 37%의 세포 생존율만을 나타내어, C-K는 Rh2보다 더 높은 세포 독성을 유도하며, C-K 및 Rh2는 20 ㎍/mL의 농도에서 상당한 세포 저해를 야기함을 확인하였다. 그러나, 동일한 농도에서 C-K-GNPs 및 Rh2-GNPs는 세포 독성을 야기하지 않았고, 오히려 세포 증식을 촉진함을 확인하였다.

또한, 도 10의 b에서 볼 수 있듯이, 인간 각질세포 HaCaT에 대하여, C-K 및 Rh2는 20 ㎍/mL의 농도에서 각각 30% 및 28%의 세포 생존율을 나타냄을 확인하였다. 그러나, 동일한 농도에서 C-K-GNPs 및 Rh2-GNPs는 상기 진세노사이드보다 더 낮은 세포 독성을 나타냄을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 진세노사이드가 캐핑된 GNPs 는 순수 진세노사이드 화합물에 비하여 정상 세포주에 대하여 독성을 야기하지 않으므로, 결과적으로, C-K 및 Rh2는 GNP의 합성에 환원제 및 안정제로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 2. 인비보 ( in vivo ) 제조된, 진세노사이드-금 나노입자의 특성

실시예 2-1. 진세노사이드-금 나노입자의 인비보 제조

기탁번호 KCTC12041BP의 락토바실러스 김치쿠스(Lactobacillus kimchicus) DCY51 균주 및 기탁번호 KCTC12806BP의 락토바실러스 파낙시브레비스(Lactobacillus panaxibrevis) DCY65 균주의 두 유산균을 이용하여 진세노사이드-금 나노입자를 제조하였다.

구체적으로, 상기 유산균을 37℃의 MRS 배지 100ml에서 하룻밤 동안 배양하였고, 상기 종배양액을 새로운 MRS 배지에 1%(v/v) 접종하여 12시간 배양하였다. 이후, 상기 균배양액을 100ml씩 튜브에 담아 5000rpm에서 20분간 원심분리하여 집균한 후, 10 ml 1X 인산염 버퍼(phosphate buffer, pH7.0)를 넣어 현탁하였다. 이후, 상기 현탁액에 1 mM 금염(10 ㎕)과 파우더 상태의 1 mM 진세노사이드 C-K(1.2 mg ~ 1.4 mg)를 넣어 혼합하였으며, 상기 혼합된 균체액을 37℃에서 진탕배양하였다.

그 결과, 배양액의 색이 짙은 보라색으로 전환됨을 확인함으로써 진세노사이드-금 나노입자가 형성됨을 확인하였다. 또한, 도 11에서 볼 수 있듯이, 유산균 체내에 합성된 GNPs의 모습을 FE-TEM을 통해 확인할 수 있었다.

실시예 2-2. 진세노사이드의 캐핑 여부 확인

상기 실시예 2-1에 따른 인비보 방법으로 제조한 진세노사이드-금 나노입자에 진세노사이드가 결합되어 있는지 확인하였다.

구체적으로, 상기 균주를 살균된 증류수로 한번 세척하고, PBS 완충액에 현탁한 후, 초음파를 이용하여 파쇄함으로써 유산균의 생체 내 포함된 GNPs를 수득하였다.

이후, 상기 실시예 1-2-1에 따른 방법으로 상기 GNPs에 대하여 TLC 분석을 수행한 결과, 도 12에서 볼 수 있듯이, 유산균 체내에서 합성된 GNPs는 C-K를 포함하고 있음을 확인하였고, DCY65 균주보다 DCY51 균주에 의한 합성의 효율이 더 우수함을 확인하였다.

또한, 상기 GNPs에 대하여 HPLC를 수행한 결과, 도 13에서 볼 수 있듯이, 유산균 체내에서 합성된 GNPs는 C-K를 포함하고 있음을 확인하였고, DCY65 균주보다 DCY51 균주에 의한 합성의 효율이 더 우수함을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 유산균을 이용하여 진세노사이드가 캐핑된 GNPs를 제작할 수 있으며, DCY51 균주를 이용하는 경우, 진세노사이드-금 나노입자를 우수한 수율로 수득할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3. 진세노사이드-금 나노입자의 항암 활성 확인

본 발명에 따른 인비트로 또는 인비보 방법으로 제조한 GNPs의 생물학적 활성을 확인하기 위하여, 이의 항암 활성을 분석하였다.

구체적으로, 폐암 세포주인 A549 또는 대장암 세포주인 HT29에 상기 GNPs를 0.01 내지 50 ㎍/ml의 농도로 처리하였고, 24시간 동안 배양하였다. 이후, MTT assay를 통해 상기 GNPs가 처리된 세포의 생존율을 측정하였다.

그 결과, 도 14에서 볼 수 있듯이, 10 ㎍/ml의 농도 처리 시, A549 또는 HT29 세포는 대조군에 비하여 20% 이상의 세포 독성을 나타냄을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 본 발명의 GNPs는 우수한 항암 활성을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 4. 진세노사이드-금 나노입자의 항염증 활성 확인

본 발명에 따른 인비트로 또는 인비보 방법으로 제조한 GNPs의 생물학적 활성을 확인하기 위하여, 이의 항염증 활성을 분석하였다.

구체적으로, LPS(1 ㎍/ml)가 처리되어 염증상태로 활성화된 RAW 264.7 대식세포의 NO 생산 억제 효율을 분석하였다. 양성 대조군으로서 iNOS 저해제인 L-NMMA을 사용하였다.

그 결과, 도 15에서 볼 수 있듯이, GNPs는 농도 의존적으로 활성화된 대식세포의 NO 생산을 억제함을 확인하였고, 0.1 ㎍/ml의 낮은 농도에서도 약 20%의 NO 생산 억제 효율을 나타냄을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 본 발명의 GNPs는 우수한 항염증 활성을 나타냄을 알 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예 및 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국생명공학연구원

KCTC12041BP

20111031

한국생명공학연구원

KCTC12806BP

20150428

Claims

진세노사이드를 유효성분으로 포함하는, 금 나노입자 제조용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 진세노사이드는 진세노사이드 컴파운드 K(Compound K) 또는 진세노사이드 Rh2인 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 진세노사이드는 0.5 내지 2 mM의 농도로 포함되는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 유산균을 추가로 포함하는, 조성물.
제4항에 있어서, 상기 유산균은 기탁번호 KCTC12041BP의 락토바실러스 김치쿠스(Lactobacillus kimchicus) DCY51 균주 또는 기탁번호 KCTC12806BP의 락토바실러스 파낙시브레비스(Lactobacillus panaxibrevis) DCY65 균주인 것인, 조성물.
제4항에 있어서, 상기 조성물은 인비보(in vivo)에서 이용되는 것인, 조성물.
제1항의 조성물과 금 전구체를 반응시키는 단계를 포함하는, 금 나노입자의 제조 방법.
제7항에 있어서, 상기 금 전구체는 HAuCl₄, NaAuCl₃, AuCl₃ 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
제7항에 있어서, 상기 금 전구체의 농도는 0.5 내지 1.5 mM인 것인, 방법.
제7항에 있어서, 상기 반응은 pH 6 내지 9에서 수행되는 것인, 방법.
제7항에 있어서, 상기 반응은 10 내지 100분 동안 수행되는 것인, 방법.
제7항에 있어서, 상기 반응은 70 내지 90℃에서 수행되는 것인, 방법.
제7항에 있어서, 상기 조성물은 유산균을 추가로 포함하는 것인, 방법.
제13항에 있어서, 상기 유산균은 기탁번호 KCTC12041BP의 락토바실러스 김치쿠스(Lactobacillus kimchicus) DCY51 균주 또는 기탁번호 KCTC12806BP의 락토바실러스 파낙시브레비스(Lactobacillus panaxibrevis) DCY65 균주인 것인, 방법.
제13항에 있어서, 상기 방법은 인비보(in vivo)에서 수행되는 것인, 방법.
제13항에 있어서, 상기 방법은 30 내지 45℃에서 수행되는 것인, 방법.
제7항에 있어서, 상기 방법은 금 나노입자를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제7항 또는 제13항의 제조 방법에 의해 제조된, 금 나노입자.
제18항의 금 나노입자를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제19항에 있어서, 상기 암은 폐암 또는 대장암인 것인, 조성물.
제18항의 금 나노입자를 포함하는, 항염증용 조성물.