KR101526852B1 - 항암 효능을 가진 생체적합성 금 나노입자 및 마이크로파를 이용한 이의 제조방법 - Google Patents

항암 효능을 가진 생체적합성 금 나노입자 및 마이크로파를 이용한 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

금 나노입자의 생체적합성 및 기능화 부여의 편이성은 바이오기술 및 바이오의학에 높은 적용 가능성을 보여준다. 본 발명에서는 6개의 상이한 단백질을 이용하여 수용액 상에서 마이크로파 조사를 통해 금 나노입자를 제조하였다. 금 나노입자는 서로 다른 pH 조건에 민감한 거동을 보였고, 이는 등전점이 다르게 나타남을 통해 보여졌다. 세포 독성 분석에서는 금 나노입자의 항암 효과를 보여주었으며, 캡핑제로 서로 다른 단백질을 사용하였기 때문에 특정 농도에서 암 세포의 성장을 억제하는 정도가 서로 다른 효과를 보여주었다. 양의 전하로 하전된 금 나노입자는 음의 전하를 띠는 금 나노입자에 비하여 세포 내 침투 정도가 더욱 컸다. 단백질을 캡핑제로 사용하여 제조된 금 나노입자는 항암제로서 유망하고, 나노입자의 새로운 활용 가능성을 보여준다.

Description

항암 효능을 가진 생체적합성 금 나노입자 및 마이크로파를 이용한 이의 제조방법{Biocompatible gold nanoparticle with anti-cancer efficacy, and the preparation method thereof}
생체적합성 금 나노입자는 생의학 분석 및 특히 암 진단과 치료의 분야에서 높은 활용도로 인해 상당한 관심을 받아왔다. 암 세포와 정상 세포의 pH 차이로 인해서, 정상 세포에는 영향을 미치지 않으면서 암 세포에는 피해를 줄 수 있는 pH 민감성 금 나노입자에 대한 수요가 높다. 따라서, 본 발명에서는 생체적합성 환원제 및 캡핑제인 단백질을 이용해서 다양한 pH 조건에 민감한 6가지 상이한 금 나노입자를 수용액에서 제조하였다. 제조공정이 간단하고 무독성(green)이라는 점 외에도, 이러한 금 나노입자는 치료 및 진단을 위한 항암제 개발에 크게 활용 가능하다.
바이오분자는 특이적인 인식 상호작용을 나타내는데, 몇 개의 결합 부위에서 이들은 물리적 흡착, 정전기적 결합 및 공유 결합을 통해 나노물질과 상호작용할 수 있으며, 이로써 이들은 나노구조화에서 유망한 빌딩 블록이 된다. 단백질, 펩티드, 아미노산, 당 그리고 심지어 식물 추출물도 클로로아우레이트(염화금산염) 이온을 AuNP로 환원시키는 것으로 나타났지만, 대부분의 사례에서 완전한 합성 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았다.
소 혈청 알부민, 실크 피브로인 단백질, 닭 난백 리소자임, α-아밀라아제, 녹색 형광 단백질 및 아포페리틴과 같은 단백질들이 AuNP의 합성에서 조사되었다. 그러나, 임의의 나노입자의 합성에 있어서 단일 프로토콜을 이용한 상이한 단백질들의 환원 및 봉쇄 능력은 조사되거나 보고된 적이 없다.
암은 현대 사회에서 조기 사망의 주요 원인 중 하나이다. 과학기술이 상당히 진보하면서 암에 대해 더욱 포괄적으로 이해할 수 있게 되었지만, 암의 진단 및 치료는 여전히 난제로 남아 있다. 많은 항암제들이 표적 특이적 부위에 도달할 수 없으며, 이러한 비특이성은 정상 조직과 세포의 성장을 방해하므로, 항암제들의 보편적인 전신 송달은 매우 우려되는 점이다.
나노기술의 출현으로 이 치명적인 질환의 진단 및 치료를 위한 광범한 도구가 제공되며, 새로운 영상화 기술 및 치료제의 표적 송달은 비용이 절감하고 부작용을 최소화한다. 귀금속 나노입자, 특히 AuNP는 생체적합성을 갖기 때문에 고도로 민감한 진단 분석, 열 절제, 방사선 요법 강화는 물론 표적화된 약물 및 유전자 송달을 포함하는 많은 생물의학 용도에서 더욱 바람직하다.
그러나, 수성 매체 중에서 가변적인 pH 조건에 민감한 특성을 보이는 AuNP에 대해서는 현재까지 보고된 바가 없다.
환원제 및 캡핑제로서 다양한 물질을 이용한 금 나노입자의 제조에 대해서는 선행 연구가 있었으나, 생체 내 적용이 가능한 생체적합성 금 나노입자의 제조에 대해서는 보고된 바가 거의 없다. 소듐 보로하이드라이드와 같은 강환원제를 사용하거나, 강 알칼리성 조건에서 반응을 수행하는 보고가 대부분이다. 이와 같이 독성 물질을 사용하거나 염기성 pH 조건을 채택함으로 인해서, 생체 내 적용에 한계가 있다.
생체적합성이 우수한 순수 금 나노입자 그 자체를 항암제로 사용하는 것에 대해 보고된 바가 없으며, 다만 항암제와 함께 사용하거나 또는 타겟 사이트에 전달하기 위해 사용되는 정도에 그쳤으며, 이 경우에는 정상 세포 및 암 세포에 모두 피해를 주게 된다.
암 세포는 정상 세포에 비해서 pH 값이 약간 산성을 띤다는 점이 보고되었다. 산성 조건에 있는 암 세포에만 피해를 주고 pH 값이 7.4로 알려진 정상 세포에는 영향을 미치지 않을 수 있는 pH 민감성 나노물질을 제조하는 것은 암 치료 분야에 중요하지만, 이에 관해 보고된 바는 없다.
따라서, 본 발명은 수용액에서 무독성이고 빠른 제조방법에 의해서 금 나노입자를 제조하는 방법을 개시하고자 한다. 이와 관련해서, 금 나노입자의 제조를 위해 생체적합하고 체내에 존재하는 단백질로서, 상이한 등전점 및 기능을 갖는 서로 다른 단백질을 분석하였다(표 1). 또한, 제조된 금 나노입자의 제타 포텐셜에 pH 값이 미치는 영향과 아세포와 암 세포에 대한 세포 독성에 pH 값이 미치는 영향을 MTT 분석을 통해 확인하였다.
본 발명의 일 측면은 금 나노입자 및 상기 금 나노입자를 둘러쌓고 있는 단백질로 구성된 단백질-지지 금 나노입자에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 여러 구현예에 따른 단백질-지지 금 나노입자를 활성성분으로 포함하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 (a) 단백질과 금 전구체를 포함하는 수용액을 제조하는 단계, 및 (b) 상기 수용액에 마이크로파를 조사하는 단계를 포함하는 단백질-지지 금 나노입자의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 단백질을 이용하여 수용액 내에서 금 나노입자를 제조할 수 있는 간단하고 빠르며 무독성(green)인 제조방법을 개시하는데, 여기서 단백질은 환원제와 캡핑제의 역할을 수행한다. 6개의 서로 다른 단백질로 지지된(protein-supported) 금 나노입자가 제조되었고, 다양한 pH에서 민감성을 보이는 것을 확인하였다. 본 발명에서는 또한 MTT 분석을 통해서 6개의 서로 다른 단백질-지지 금 나노입자가 3개의 상이한 암 세포 주에 대해 표면 전하에 의존적인 세포 독성을 보이는 것을 확인하였다. 양의 표면 전하를 띠는 금 나노입자는 음이 표면 전하를 띠는 금 나노입자에 비해서 세포 내로 더욱 많은 정도로 침투하였고, 이로 인해 더욱 높은 독성을 보였다. 다양한 pH 조건에 대한 금 나노입자의 민감성으로 인해서, 금 나노입자는 아세포에 거의 영향을 미치지 않으면서 암 세포에 따라 상이한 효능으로 암 세포의 성장을 억제함으로써 특정 마이크로 몰농도에서 항암 효능을 보여주었다. 본 발명에서는 다른 항암제와 결합된(conjugated) 상태가 아니더라도 단백질-지지 금 나노입자 그 자체로 항암제로 사용할 수 있다는 점을 개시한다.
6개의 상이한 단백질-지지 금 나노입자를 수용액 및 마이크로파 조사라는 간단하고 빠르며 독성이 없는 합성법에 의해 제조하였다. Ag 이온을 반응 혼합물에 첨가함으로써 금 나노입자의 수율을 높일 수 있었고, 이는 좁고 강한 SPR 밴드에 의해 확인되었다. 금 나노입자의 표면에 단백질이 코팅된 점은 유체역학적 사이즈에 의해 확인하였다. 단백질 코팅은 금 나노입자의 상이한 pH 조건에서의 거동에 영향을 미쳤다. 금 나노입자는 상이한 등전점 및 제타 포텐셜을 보였고, 이로 인해 MTT 분석에 의한 IC50 값 및 세포 생존율을 다양하게 보였다. 금 나노입자의 제타 포텐셜 및 IC50 값과의 관계를 통해서, 양의 표면 전하를 띠는 금 나노입자가 음의 표면 전하를 띠는 금 나노입자보다 더 높은 정도로 세포에 internalized 된다고 예측된다. MTT 분석에 의해 특정 금 나노입자는 아세포보다 암 세포(cancerous cells)에서 더욱 낮은 세포 생존율을 보여주었다. 따라서 금 나노입자의 농도를 조절함으로써 항암제를 수득할 수 있다는 점을 보여준다. 이러한 금 나노입자는 이들의 pH 민감성, 높은 안정성 및 생체적합한 표면으로 인해 진단 및 약물 전달 등의 생의학적 분야에 높은 활용도를 가질 수 있다.
표 1은 여러 단백질의 분자량, 등전점, 기능성을 보여준다.
표 2는 여러 담잭질을 이용하여 제조된 금 나노입자의 pH, 등전점, 제타 포텐셜, 크기를 보여준다.
표 3은 여러 단백질을 이용하여 제조된 금 나노입자의 4개의 세포 주 변형체(cell line variants)에 대한 IC50 값을 보여준다.
도 1은 여러 단백질을 이용하여 그들의 고유 pH 값에서(intrinsic pH) 제조된 금 나노입자의 UV-Vis 스펙트럼을 보여준다. (A) Ag 이온을 사용한 경우, (B) Ag 이온을 사용하지 않은 경우
도 2는 여러 단백질을 이용하여 제조한 금 나노입자의 TEM 이미지를 보여준다. (A) HIS, (B) LYS, (C) OVA, (D) BHG, (E) BSA 및 (F) BGG. (Scale bar: 20 nm for A-F)
도 3은 수용액의 pH 값과 여러 단백질을 이용하여 제조된 금 나노입자의 제타 포텐셜과의 관계를 보여준다.
도 4는 여러 단백질을 이용하여 제조된 금 나노입자로 처리된 세포 주의 세포 생존율을 보기 위한 MTT 분석 결과이다. (A) NIH-3T3, (B) HCT116, (C) HeLa, SCC-7 세포
도 5는 pH 5, pH 7, pH 9에서 여러 단백질을 이용하여 제조된 금 나노입자의 제타 포텐셜을 보여준다.
도 6은 여러 단백질을 이용하여 제조된 금 나노입자의 세포 생존율을 보여주고 있으며, 금 나노입자의 농도가 60 μg/mL일 때 다양한 세포 주에 대해 MTT 분석을 수행한 결과이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
본 발명의 일 측면은 금 나노입자 및 상기 금 나노입자를 둘러쌓고 있는 단백질로 구성된 단백질-지지 금 나노입자에 관한 것이다. 여기서 단백질은 환원제와 캡핑제 역할을 동시에 수행한다.
일 구현예에 있어서, 상기 단백질은 히스톤(HIS), 라이소자임(LYS), 오브알부민(OVA), 소 헤모글로빈(BHG), 소 혈장 알부민(BSA), 소 감마 글로불린(BGG) 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 단백질-지지 금 나노입자가 개시된다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 여러 구현예에 따른 단백질-지지 금 나노입자를 활성성분으로 포함하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에 있어서, 상기 단백질은 염기성 pH 조건에서 제타 포텐셜이 양의 값을 갖는 단백질이거나, 또는 음의 pH 값에서 등전점(isoelectric point)을 갖는 단백질인 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물이 개시된다. 양의 표면 전하를 띤 금 나노입자는 세포 내로 더욱 쉽게 침투할 수 있어, 더욱 높은 세포 독성을 보일 수 있다
다른 구현예에 있어서, 상기 단백질은 BSA인 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물이 개시된다. 다른 단백질로 지지된 경우에 비해, BSA로 지지된 금 나노입자는 정상 세포에 대한 IC50은 높은 수치를 보이는 반면, 암 세포에 대한 IC50은 낮은 수치를 보임을 확인하였다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 암은 HeLa 세포에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물이 개시된다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 암은 자궁 경부암인 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물이 개시된다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 단백질은 BHG이고, 상기 암은 HCT116 세포에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물이 개시된다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 암은 대장암인 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물이 개시된다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 단백질은 LYS이고, 상기 암은 SCC-7 세포에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물이 개시된다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 암은 편평 상피 세포 암인 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물이 개시된다.
본 발명의 또 다른 측면은 (a) 단백질과 금 전구체를 포함하는 수용액을 제조하는 단계, 및 (b) 상기 수용액에 마이크로파를 조사하는 단계를 포함하는 단백질-지지 금 나노입자의 제조방법에 관한 것이다. 이때, 상기 단백질-지지 금 나노입자는 금 나노입자 및 상기 금 나노입자를 둘러쌓고 있는 단백질로 구성된다.
종래 금 나노입자의 제조방법과는 달리, 본 발명에의 제조과정에서는 인체에 유해할 수 있는 물질이 전혀 사용되지 않아, 본 발명에 따른 단백질-지지 금 나노입자는 별도의 세척과정 등을 거치지 않더라도 생체적합하고 무독성을 나타내게 된다.
일 구현예에 있어서, 상기 수용액은 Ag 이온을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질-지지 금 나농입자의 제조방법에 관한 것이다. 금 이온에서 금 나노입자로의 전환율이 크게 늘어 단백질-지지 금 나노입자의 수득량이 크게 증가할 뿐만 아니라, 수득된 단백질-지지 금 나노입자의 크기가 더욱 균일해지는 효과가 있다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백하다.
실시예
1 mg/mL 단백질, KAuCl4(0.025mL,0.1M)및 AgNO3(0.005mL,0.1M)을 포함하는 5 mL 수용액을 10 mL 캡핑된 바이얼에 첨가하고, 마이크로파 시스템(250 W) 및 120 ℃ 조건에 10 분 동안 두었다. 이 단계 후에, 반응 혼합물을 샘플 분석 및 세포 독성 연구 수행 전에 25 ℃로 온도를 낮추었다. 반응은 또한 AgNO3가 없는 것을 제외하고는 나머지는 동일한 조건에서도 수행하였다.
Ag 이온의 첨가는 금 나노입자의 형성에 중요한 역할을 하는데, 이는 UV-Vis 스펙트럼(도 1)에서 명확히 확인할 수 있다. Ag 이온을 첨가해서 제조한 금 나노입자는 강하고 좁은 UV 흡광도 피크를 보이는 반면, Ag 이온을 첨가하지 않고 제조한 금 나노입자는 그렇지 않은데, Ag 이온이 Au 이온에서 금 나노입자로 전환하는데 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다.
상이한 단백질을 포함하는 금 나노입자에 대해서 TEM(도 2) 및 DLS을 이용하여 그들의 모폴로지와 사이즈를 분석하였다. 금 나노입자의 유체적학적(hydrodynamic) 크기는 TEM을 이용하여 계산된 크기(ImageJ software 이용, 표 2)보다 크게 확인되었다. 이러한 크기의 차이는 금 나노입자를 덮고 있는 단백질의 존재로 인한 것인데, 이는 TEM에서는 확인이 되지 않고 DLS 측정에서는 확인이 된다.
단백질의 아미노산 함량은 등전점(isoelectric points, IEPs)의 차이를 초래한다. 따라서, 단백질-지지 금 나노입자의 등전점을 확인하기 위해서, 제타 포텐셜 분석기를 이용하여 이들의 수용성 침전액으로 pH-의존성 제타 포텐셜 적정(titration)을 수행하였다. pH 및 제타 포텐셜과의 관계를 파악하는 것은 상이한 pH 조건을 보이는 인체 내에서 금 나노입자가 어떻게 거동할 지 이해하는데 중요하다. 도 3은 상이한 단백질-지지 금 나노입자의 결과를 보여준다. 금 나노입자의 등전점은 산성 pH 값에서 염기성 pH 값에 걸쳐 나타났다. OVA를 사용하여 제조한 금 나노입자는 산성의 5.08 등전점을 보였다. 염기성의 10.58 등전점이 HIS-금 나노입자에서 확인되었다(표 2). 나머지 금 나노입자의 등전점은 이 두 값의 사이에 위치하였다. 등전점 확인 결과, HIS-금 나노입자는 양의 표면 전하가 우세하고, 표면 전하를 제로로 하기 위해서는 잉여의 OH- 이온이 필요하다는 것을 확인하였다. 반면, OVA-금 나노입자는 pH 5.08에서 제로 표면 전하에 도달하였고, 따라서 고유 pH(intrinsic pH)에서는 음의 전하가 우세하다는 것을 보여준다. 나머지 4종 금 나노입자의 등전점은 중성이거나 또는 6-8.5 범위에 위치해 있었다.
금 나노입자의 세포 생존율을 조사하기 위해서, 쥐 배아 아세포(NIH-3T3)를 이용하여 MTT 분석을 수행하였는데, 이들에게 상이한 단백질을 이용해서 제조한 금 나노입자를 처리함으로써 수행하였다(도 4A). 금 나노입자는 캡핑에 사용된 단백질에 따라서 상이한 세포 생존율을 보여주었다. OVA-지지 금 나노입자는 가장 높은 IC50 값을 보여주었고, HIS-금 나노입자는 가장 낮은 값을 보여주었다. 나머지 단백질-지지 금 나노입자는 이들 사이에서 IC50 값을 보였다. pH-의존성 제타 포텐셜 적정 시험을 통해서(도 3), HIS-금 나노입자는 가장 높은 10.58의 등전점을 보였고, 이는 양의 표면 전하게 우세하다는 것을 보여준다. OVA-금 나노입자는 가장 낮은 5.08의 등전점을 보였고, 이는 음의 표면 전하가 우세하다는 것을 보여준다. 나머지 4종의 금 나노입자는 6-8.5 범위에 있는 등전점을 보였다. 상이한 금 나노입자의 IEP 및 IC50 값과의 관계를 통해서, 금 나노입자의 세포 생존율은 등전점이 증가할수록 감소한다는 것을 확인하였다. 따라서, 10.58의 등전점을 보이는 HIS-금 나노입자가 가장 낮은 세포 생존율, 즉 가장 높은 세포독성을 보임을 확인하였다. 5.08의 등전점을 보이는 OVA-금 나노입자는 가장 높은 세포 생존율을 보이면서, 특정 농도에서 가장 낮은 세포 독성을 보였다.
서로 상이한 단백질에 의해 지지된 금 나노입자가 서로 다른 세포 생존율을 보이는 이유는 세포 내로 금 나노입자가 세포 내 침투(internalization or endocytosis)하는 정도가 다르기 때문이고, 이는 제타 포텐셜 분석에 의해 확인되었다. 금 나노입자의 세포 내 침투는 금 나노입자의 표면 전하에 크게 의존한다. 따라서 생체 내 pH(physiological pH)인 pH 7에서 금 나노입자의 표면 전하를 pH-의존성 제타 포텐셜 적정 플롯에 기초해서 분석하였다(도 5). HIS-금 나노입자는 20 mV를 초과하는 강한 양의 제타 포텐셜을 보이고, 이는 양의 표면 전하와 대응된다. OVA-금 나노입자는 0(제로)에 근접하는 음의 제타 포텐셜을 보이고, 따라서 음의 표면 전하를 띤다.
따라서, 양의 전하를 띤 금 나노입자는 다른 타입의 금 나노입자에 비해서 더욱 쉽게 세포 내로 침투할 수 있다. HIS-금 나노입자는 높은 양의 표면 전하로 인해서 쉽게 세포 내로 침투할 수 있는데, 그리고 나서 세포는 금 나노입자의 코팅되지 않은 표면에 노출되므로 세포 사멸을 유발하게 된다. HIS는 금 나노입자와 비공유결합에 의해 결합되어 있고, 단백질은 이러한 과정에서 금 나노입자와 분리될 수 있는데, 이에 의해서 세포에 높은 독성을 보이게 된다. 음의 전하를 띤 세포 표면에 비해서, 양의 전하를 띤 표면 사이트는 원형질 막(plasma membrane)에서 더욱 보기가 드물지만, 앞선 연구에서는 음의 나노입자 흡수될 수 있다는 메커니즘을 보고하고 있다. 세포 표면을 접근하는 음의 나노입자는 음의 전하를 띠는 세포 표면에 의해 반발되는데, 이에 의해서 원형질 막의 양 이온 사이트에 비특이적으로(non-specifically) 결합하는 클러스터가 형성되게 되고, 그 결과 세포 내 침투로 이어지게 된다. 따라서, 음의 전하를 띤 나노입자는 양의 전하를 띤 나노입자에 비해서 낮은 정도로 세포 내로 침투하게 된다.
본 발명에서는, OVA-금 나노입자가 높은 세포 생존율을 보였으며, 이는 낮은 수준의 세포 상호작용(cellular interaction)으로 인해 상기 나노입자가 세포 내로 침투할 수 있는 능력이 낮기 때문이다. 세포 내로 침투한 이러한 금 나노입자는 OVA보다 더욱 적은 영향을 미치는데, OVA는 마이크로파 조사 과정에서 깨질 수 있는 디설파이드 결합을 포함한다. 디설파이드 결합이 깨짐으로서 2개의 황 그룹은 금 나노입자와 공유결합하게 되고, 금 나노입자의 표면이 세포에 노출되는 것을 낮춰주게 된다. 높은 농도의 OVA-금 나노입자는 낮은 세포 생존율을 보여주는데, 이는 높은 농도에서 세포 사멸을 유발하는 시그널링 프로세스(signaling process) 파열(disruption) 때문일 수 있다. 다른 4가지 단백질-지지 금 나노입자와 관련해서는, BSA-금 나노입자는 제타 포텐셜 값이 음이고, LYS-금 나노입자와 BHG-금 나노입자 및 BGG-금 나노입자는 양의 값을 보였다. 이들 모두의 제타 포텐셜 값은 모두 0(제로)에 가까운 값을 보였고, 따라서 이들의 IC50 값 역시 서로 비슷하다. 서로 다른 단백질-지지 금 나노입자의 IC50은 NIH-3T3 아세포에 대해서 OVA > BSA > BHG > LYS > BGG > HIS의 순서를 갖는다.
제조된 금 나노입자의 효과적인 항암제로서의 효과를 추가적으로 확인하기 위하여, 3가지 상이한 암 세포 주(cancer cells lines), 즉 인간 대장(colorectal) 암 세포(HCT116), 인간 자궁경부(cervical) 암 세포(HeLa), squamous carcinoma cells(SCC-7))에 대해서 금 나노입자를 처리함으로써 MTT 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 4B, 도 4C 및 도 4D에 각각 나타내었다.
산성 pH에서 금 나노입자의 표면 전하에 대해 조사하였고, 모든 금 나노입자가 pH 5에서 양의 표면 전하를 갖는다는 것을 확인하였다. HIS-금 나노입자 및 OVA-금 나노입자는 3가지 암 세포에 대해서 NIH-3T3에서와 동일한 거동을 보였다. HIS-금 나노입자는 가장 세포 독성이 강하였고, OVA-금 나노입자는 세포 독성이 가장 약하였다.
흥미롭게도, 그 순서는 다른 4개의 단백질-금 나노입자와 상이하였다. 어떤 단백질-지지 금 나노입자는 아세포보다도 암 세포에 더욱 독성을 보였으며(표 3), 예를 들어 NIH-3T3에 대해서 BSA-금 나노입자의 IC50 값은 68.20 μg/mL이고 HeLa의 IC50 값은 32.68 μg/mL인데, 이는 이러한 금 나노입자가 아세포와 비교해서 암 세포에 대해 더욱 낮은 50% 억제율을 보인다는 것을 보여주고, 아세포에 비하여 암 세포에 대해 더 높은 세포 독성을 보인다는 것을 의미한다. 이러한 결과는 상이한 pH 조건에서 표면 전하가 상이하다는 점에 기인한다. BSA-금 나노입자는 암 세포의 pH라고 여겨지는 산성 pH에서 양의 표면 전하를 보이고, pH 7에서 음의 표면 전하를 보인다(도 3). 따라서 중성의 pH에 비해서 산성의 환경에서 세포 침투가 더욱 많이 발생하고, 이에 의해서 세포 독성이 더욱 심하게 발생한다. 상이한 단백질-지지 금 나노입자의 IC50 값은 HCT116 세포 주에 대해서는 OVA > BGG > LYS > BSA > BHG > HIS의 순서를 보였고, HeLa 세포 주에 대해서는 OVA > BGG > LYS > BHG > BSA > HIS의 순서를 보였으며, SCC-7 세포 주에 대해서는 OVA > BGG > BSA > BHG > LYS > HIS의 순서를 보였다(표 3).
위 단백질-지지 금 나노입자는 특정 암 세포에 대해서 특이성(specificity)를 보였고, 이는 서로 다른 IC50 값이 관찰되는 결과로부터 확인되었다. BHG-금 나노입자는 HCT116 세포 주에 대해서 두 번째로 낮은 IC50 값을 보인 반면, BSA-금 나노입자는 HeLa 세포 주에 대해서 두 번째로 낮은 IC50 값을 보였으며, LYS-금 나노입자는 SCC-7 세포 주에 대해서 두 번째로 낮은 IC50 값을 보였다.
특정한 농도(60 μg/mL)에서의 상이한 세포 주에 대한 금 나노입자의 세포 생존율은 도 6에 제시되었고, 그들의 거동 차이점 및 특이성을 강조해서 표시하였다. 따라서, 제조된 금 나노입자의 적절한 농도가 정상 세포에 대한 피해를 차단하거나 최소화하면서 암 세포 치료에 사용될 수 있다.
세포 생존율 순서의 차이는 출발(origin)이 상이함에 따른 pH의 차이에 기인한다고 여겨지나, 다만 특이성에 대해서는 명확히 해석하기가 쉽지는 않다. MTT 분석에 따르면, 아세포와 암 세포 주에 대한 금 나노입자의 영향이 상이하다.
Figure 112013062161745-pat00001
* 상기 표 1은 상이한 단백질의 분자량, IEP, 기능에 대해 보여주고 있다.
Figure 112013062161745-pat00002
* 상기 표 2는 상이한 단백질을 이용하에 제조된 금 나노입자의 pH, IEP, 제타 포텐셜, 및 크기를 보여주고 있다.
Figure 112013062161745-pat00003
* 상기 표 3은 상이한 단백질을 이용하여 제조된 금 나노입자의 4가지 세포 주 변형체에 대한 IC50 값을 보여주고 있다.
본 발명에서 사용된 단백질은 모두 상이한 아미노산 서열을 가진 소수성 도메인과 친수성 도메인을 둘 다 함유하는 천연 폴리암폴라이트(여러 자리 양쪽성 전해질)일 뿐만 아니라, AuNP를 환원시켜 봉쇄하는데 가장 적합한 단백질임을 확인하였다. 단백질들의 등전점 차이로 인해 최종 수득된 AuNP는 가변적인 pH 조건에 민감하다는 점을 확인하였으며, 이로 인해 본 발명에서는 생체적합성 환원 봉쇄제인 단백질을 사용해서 수성 매체 중에서 가변적인 pH 조건에 민감한 6개의 상이한 AuNP를 개시한다.
6개의 AuNP 중에서 히스톤 지지된 AuNP는 pH 7에서 높은 표면 양전하를 지녔고, 오브알부민 지지된 AuNP는 음전하를 지녔다. 전자는 섬유 아세포와 암세포에 모두 가장 독성이었고, 후자는 최소한의 독성을 나타냈는데, 이것은 AuNP의 세포 내재화에서 표면 전하가 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다.
MTT 분석 연구에서는 6개의 단백질-지지된 AuNP가 모두 이들의 가변적인 pH 조건에 대한 민감성으로 인해 특정한 마이크로몰 농도에서 섬유아세포에 대한 손상을 줄이면서 상이한 효능으로 암세포의 성장을 억제함으로써 항암 효과를 드러냈다는 것이 확인되었다.

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  6. 금 나노입자 및 상기 금 나노입자를 둘러쌓고 있는 단백질로 구성된 단백질-지지 금 나노입자를 활성성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물로서,
    상기 단백질은 소 혈장 알부민(BSA)이고, 상기 암은 HeLa 세포에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 암은 자궁 경부암인 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학 조성물.
  8. 금 나노입자 및 상기 금 나노입자를 둘러쌓고 있는 단백질로 구성된 단백질-지지 금 나노입자를 활성성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물로서,
    상기 단백질은 소 헤모글로빈(BHG)이고, 상기 암은 HCT116 세포에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 암은 대장암인 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학 조성물.
  10. 금 나노입자 및 상기 금 나노입자를 둘러쌓고 있는 단백질로 구성된 단백질-지지 금 나노입자를 활성성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물로서,
    상기 단백질은 라이소자임(LYS)이고, 상기 암은 SCC-7 세포에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 암은 편평 상피 세포 암인 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학 조성물.
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Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ACS Nano, Vol. 4, pp. 365-379(2010) *
ACS Nano, Vol. 4, pp. 365-379(2010)*
Chem. Mater., Vol. 19, pp. 1592-1600(2007) *
Chem. Mater., Vol. 19, pp. 1592-1600(2007)*
Nanoscale, Vol. 4, pp. 2281-2287(2012) *
Nanoscale, Vol. 4, pp. 2281-2287(2012)*

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220145054A (ko) 2021-04-21 2022-10-28 경희대학교 산학협력단 박테리아 균주 및 암라 추출물을 이용한 금 나노입자의 제조방법 및 상기 금 나노입자를 포함하는 암 치료용 약학 조성물
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