KR101741827B1

KR101741827B1 - 파낙스속 식물 추출물을 포함하는 피부암 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 그를 이용한 개체의 피부암을 예방 또는 치료하는 방법

Info

Publication number: KR101741827B1
Application number: KR1020150098474A
Authority: KR
Inventors: 함정엽; 김태정; 김관태; 최필주; 황병수; 김영석
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2015-07-10
Filing date: 2015-07-10
Publication date: 2017-05-31
Also published as: US10004776B2; KR20170006970A; US20170007653A1

Abstract

파낙스속 식물 추출물을 유효 성분으로 포함하는 피부암 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 그를 이용한 개체의 피부암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

Description

파낙스속 식물 추출물을 포함하는 피부암 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 그를 이용한 개체의 피부암을 예방 또는 치료하는 방법{Pharmaceutical composition for preventing or treating skin cancer comprising Panax spp. plant extact and method for preventing or treating skin cancer in a subject using the same}

본 발명은 피부암의 예방, 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 본 발명은 가공 파낙스속 식물 추출물에 관한 것으로, 파낙스속 식물 추출물을 마이크로웨이브 가공처리하여 진세노시드 Rb1, Rc, Rb2, Rd, Rg3, Rk1 및 Rg5의 중량에 대하여 Rg3, Rk1 및 Rg5가 90%이상 함유된 가공 파낙스속 식물 추출물과 그로부터 분획한 진세노시드 추출물을 활성성분으로서 포함하는 피부암의 예방, 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

피부는 몸의 최외각에서 장벽과 같은 역할을 하여 외부 환경으로부터 몸 안의 각종 기관과 근육 등을 보호하는 조직이다. 인간의 신체 기관 중 가장 무거운 기관으로 단열과 체온 조절 기능도 가지고 있다. 온도와 압력, 통증 등 여러 자극에 대한 감각 기관으로의 역할도 하며 지질과 수분의 저장, 비타민 D의 합성에도 관여한다. 피부암이란 피부 조직에 형성되는 모든 악성 종양을 총칭하여 일컫는 용어이다. 피부암은 주로 자외선 등의 환경적인 외부 자극 또는 유전적 요인들에 의해 유발된다. KIT 유전자 등 몇 가지 유전자에서의 가족력이 피부암에 영향이 있다는 것이 알려져 있다. 하지만 무엇보다 큰 영향을 미치는 것으로 알려진 요인은 자외선과 같은 외부 자극으로, 서구식 생활 습관의 도입으로 야외 활동이 잦아진 점, 선탠 및 태닝 기구의 사용이 늘어난 점, 오존층의 약화로 투과 자외선 양이 늘어난 점 등에 의해 피부암 발생율이 점차 증가되는 추세이다. 많은 양의 자외선에 노출되어 세포 내부의 DNA에 티미딘 이량체(thymidine dimer)가 형성되거나 이중가닥 절단(double-strand breakage)이 일어날 수 있다. 손상된 DNA가 제대로 복구되지 못하게 되면 원발암 유전자가 발암 유전자로 바뀌고, 종양억제 유전자가 제 기능을 못하게 될 수 있다. 이 경우 피부 세포 내부의 분열 조절 기전이 정상적으로 작동하지 않아 증식이 제한되지 않고 결국 정상 세포가 종양 세포로 변이된다. 암화된 조직은 호르몬 분비 등을 통해 주변부의 혈관을 끌어들여 영양분을 공급받는 동시에 암화된 세포들 자체도 림프절과 혈관을 통해 몸의 다른 곳으로 전이 되게 된다. 피부에서 종양 발생을 시작한 경우를‘원발성’피부암으로 분류하고, 다른 장기에서 종양 발생을 시작한 후 전이되어 피부에 새로이 정착한 경우는‘전이성’피부암이라고 분류하는데, 일반적으로 사용되는 정의의 피부암은 원발성 피부암을 의미한다. 코카서스 계통의 사람들에겐 상당히 흔한 암이지만, 일반적으로는 내부 장기에 생기는 암에 비해 치사율이 낮기 때문에 아직까지 활발히 연구되지 않고 있다. 2012년 통계 기준으로 국내 발병 전체 암 중 2.0%를 차지하고 있다. CT, 초음파 등의 검진기기뿐 아니라 육안이나 조직검사를 통해서도 진단할 수 있으나 징후들을 가볍게 넘기다 초기 발견이 늦는 경우가 많아 완치율과 생존율이 높지 않다. 피부암은 피부 조직을 구성하는 세포들 중 어떤 세포로부터 유래했는가에 따라 편평상피세포암, 기저세포암, 흑색종 등으로 나누어진다. 표피의 각질형성세포로부터 유래한 악성종양인 편평상피세포암과, 표피의 최하인 기저층이나 모낭의 세포가 악성종양화한 기저세포암은 우리나라에서 유병하는 피부암 중에서는 상당히 흔한 피부암이나 상대적으로 치사율이 낮다. 반면 악성 흑색종(malignant melanoma)은 피부의 색을 결정하는 멜라닌 세포에서 유래한 암이며 악성도가 가장 높고 침윤과 전이가 잘되어 생존율이 낮은 위험한 암이다.

인삼(Panax ginseng)은 식물 분류학상 파낙스(Panax)속 오가피과(Araliaceae)에 속하는 다년생 식물로서, 인삼과 유사한 효능을 갖는 파낙스속 식물로는 화기삼(Panax quinquefolia), 전칠삼(삼칠, Panax notoginseng), 죽절삼(Panax japonica), 삼엽삼(Panax trifolia), 히말라야삼(Panax pseudoginseng), 베트남삼(Panax vietnamensis) 등이 있다. 이러한 파낙스속 식물에는 다른 식물과는 달리 담마란(dammarane) 골격에 1-4개의 당이 결합되어 있는 담마란계 사포닌을 공통으로 함유하고 있다. 특히 인삼에 함량이 높은 사포닌은 진세노시드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg1, Re 등이며, 이러한 사포닌 성분들은 다양한 약효를 나타내는데 그 구조에 따라 약효의 종류와 강도가 매우 다르다.

(식1)

파낙스속 식물의 담마란계 사포닌은 프로토파낙사디올 (protopanaxadiol: PPD) 또는 프로토파낙사트리올 (protopanaxatriol: PPT)을 모핵으로 가지며, 식 1과 같이 표시될 수 있다. 식 1 중 R₁, R₂, 및 R₃에 따라 담마란계 사포닌은 다음과 같이 분류될 수 있다.

그룹	진세노시드	R₁	R₂	R₃
프로토파낙사디올	Ra1	-Glc-Glc	-H	-Glc-Ara(pyr)-Xyl
	Ra2	-Glc-Glc	-H	-Glc-Ara(fur)-Xyl
	Ra3	-Glc-Glc	-H	-Glc-Glc-Xyl
	Rb1	-Glc-Glc	-H	-Glc-Glc
	Rb2	-Glc-Glc	-H	-Glc-Ara(pyr)
	Rb3	-Glc-Glc	-H	-Glc-Xyl
	Rc	-Glc-Glc	-H	-Glc-Ara(fur)
	Rd	-Glc-Glc	-H	-Glc
	Rg3(20-R,S)	-Glc-Glc	-H	-H
	Rh2(20-R,S)	-Glc	-H	-H
	Rs1	-Glc-Glc-Ac	-H	-Glc-Ara(pyr)
	Rs2	-Glc-Glc-Ac	-H	-Glc-Ara(fur)
	Rs3	-Glc-Glc-Ac	-H	-H
	malonyl-Rb1	-Glc-Glc-malonyl	-H	-Glc-Glc
	malonyl-Rc	-Glc-Glc-malonyl	-H	-Glc-Ara(fur)
	malonyl-Rd	-Glc-Glc-malonyl	-H	-Glc
	pseudoginsenoside F2	-Glc	-H	-Glc
	notoginsenoside Fe	-Glc	-H	-Glc-Ara(fur)
프로토파낙사트리올	Re	-H	-OGlc-Rha	-Glc
	Ff	-H	-OGlc-Glc	-H
	Rg1	-H	-OGlc	-Glc
	Rg2(20-R,S)	-H	-OGlc-Rha	-H
	Rh1(20-R,S)	-H	-OGlc	-H
	notoginsenoside R1	-H	-OGlc-Xyl	-Glc
	notoginsenoside R2	-H	-OGlc-Xyl	-H
	pseudoginsenoside F1	-H	-OH	-Glc
	pseudoginsenoside F8	-Glc-GlcAc	-OH	-Glc-Glc
	pseudoginsenoside F3	-H	-OH	-Glc-Ara(pyr)
	Rh4	-H	-OGlc	-methyl

Rg5와 Rk1은 각각 식 2 및 식 3으로 표시될 수 있는 화합물로서, 식 중 R₁은 -Glc-Glc이고, R₂는 -H이다.

(식 2)

(식 3)

프로토파낙사디올계 진세노시드인 Rb1과 Rb2는 20번 위치에서 -Glc-Glc 또는 -Glc-Ara(pyr)의 이탈에 의하여 20(S)-Rg3 또는 20(R)-Rg3가 생성될 수 있다. 또한, 20(S)-Rg3 또는 20(R)-Rg3는 20번 위치에서 H₂O의 이탈에 의하여 Rg5 및 Rk1이 생성될 수 있다. 진세노시드 Rg5는 항산화효과, 뇌기능 및 인지기능 개선효과, 혈관이완 효과, 혈소판 응집억제 효과, 피부염 및 건선 개선 효과, 및 항염증 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 진세노시드 Rk1은 혈관이완 효과, 혈소판 응집억제 효과, 뇌기능 및 인지기능 개선효과가 있는 것으로 알려져 있다. 진세노시드 Rg5 및 Rk1의 함량 비율을 충분히 증가시킨 인삼 추출물에 대한 연구가 필요하다. 또한, 진세노시드 Rg5 및 Rk1은 진세노시드 Rg3로부터 유래할 수 있으므로, 진세노시드 (Rg5 + Rk1)/(Rg3)의 비율은 Rg5 및 Rk1의 함량증가를 정의하는데 있어서 중요하다.

이러한 종래 기술에 의하더라도, 진세노시드 Rb1, Rc, Rb2, Rd, Rg3, Rk1 및 Rg5의 중량에 대하여 Rg3, Rk1 및 Rg5가 90%이상 함유된 파낙스속 식물 추출물을 포함하는 조성물이 피부암 예방 또는 치료에 효과가 있는지에 대하여는 알려진 바 없다.

이에 본 발명자들은 부작용이 적고, 흑색종 암세포를 효과적으로 제거하는 예방 또는 치료제를 발명하고자 노력한 결과, 마이크로웨이브 조사를 통해 진세노시드 Rg5 + Rk1+ Rg3의 함량비율이 증가된 파낙스속 식물 추출물을 포함하는 약학 조성물을 통해 피부암 세포의 아폽토시스를 통한 세포 사멸을 유도하여 피부암 세포의 생존을 억제하는 효과가 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하게 된 것이다. 따라서 본 발명은 아폽토시스를 유발하여 피부암 세포의 생존을 저해하는, 마이크로웨이브 가공 처리된 파낙스속 식물 추출물로 피부암 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 그를 이용한 피부암 예방 또는 치료방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.

본 발명의 파낙스속 식물 또는 그 추출물을 마이크로웨이브 조사하여 얻어진 진세노시드 Rb1, Rc, Rb2, Rd, Rg3, Rk1 및 Rg5의 중량에 대하여 Rg3, Rk1 및 Rg5가 90%이상 함유된 파낙스속 식물 추출물을 유효 성분으로 포함하는 피부암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 파낙스속 식물 또는 그 추출물을 마이크로웨이브 조사시킴으로써 진세노시드 Rg3+Rg5+Rk1의 함량 비율을 증가하는 것을 확인하였다. 상기 파낙스속 식물 추출물을 마이크로웨이브 조사시켜 얻어진 추출물 또는 파낙스속 식물을 마이크로웨이브 조사시킨 다음 추출용매로 추출하여 얻어진 파낙스속 식물 추출물은, 파낙스속 식물 추출물을 단순히 열처리하는 경우에 비해 파낙스속 식물 또는 그 추출물을 마이크로웨이브 조사하여 얻어진 진세노시드 Rb1, Rc, Rb2, Rd, Rg3, Rk1 및 Rg5의 중량에 대하여 Rg3, Rk1 및 Rg5가 90%이상 함유할 수 있다. 예를 들면, 진세노시드 Rb1, Rc, Rb2, Rd, Rg3, Rk1 및 Rg5의 함량에 대하여 Rg3, Rk1 및 Rg5가 90% 내지 100%, 95% 내지 100%, 98% 내지 100%, 또는 100%인 것일 수 있다. 또한, 상기 마이크로웨이브 조사 가공물은 진세노시드 (Rg5 + Rk1)/(Rg3)의 비율이 현저히 높으며, 예를 들면, (Rg5+Rk1)/(Rg3)가 2 이상, 3 이상, 4 이상 또는 5 이상일 수 있다. 상기 마이크로웨이브 조사 가공물은 단순 열처리 가공물에 비해 진세노시드 Rg3+Rg5+Rk1, 특히 Rg5 및 Rk1의 함량이 높으므로 증강된 진세노시드 Rg3+Rg5+Rk1, 특히 Rg5 및 Rk1의 약효를 가질 수 있다. 진세노시드 Rg3는 신경보호 작용, 혈소판 응집 억제, 항산화 효과, 항염증 작용, 신장 보호 작용, 및 항피로 효과를 가지고 있다고 알려져 있으며, 진세노시드 Rg5는 항산화효과, 뇌기능 및 인지기능 개선효과, 혈관이완 효과, 혈소판 응집억제 효과, 피부염 및 건선 개선 효과, 및 항염증 효과를 가지고 있고, 진세노시드 Rk1은 혈관이완 효과, 혈소판 응집억제 효과, 및 뇌기능 및 인지기능 개선 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 마이크로웨이브 가공 처리된 파낙스속 식물 또는 그의 추출물은 Rg3, Rg5, Rk1 함량이 증가된 것으로서, 발명자들은 마이크로웨이브 조사 가공물을 피부암 세포주에 처리하여 세포 생존율 등을 통해 항암 억제 효과를 입증하였다.

상기 마이크로웨이브 조사는 파낙스속 식물 또는 파낙스속 식물 추출물에 마이크로웨이브를 조사하여 가열하는 열적 반응(thermal reaction)을 의미한다. 마이크로웨이브는 1m 내지 1mm의 파장을 갖는 라디오파, 또는 300MHz 내지 300GHz의 주파수를 갖는 라디오일 수 있다. 마이크로웨이브에 의한 가열은 반응물의 양이나 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 마이크로웨이브 조사는 150℃ 내지 190℃, 예를 들면, 160℃ 내지 190℃, 170℃ 내지 190℃, 180℃ 내지 190℃, 150℃ 내지 180℃, 150℃ 내지 170℃, 150℃ 내지 160℃, 170℃ 내지 180℃, 또는 160℃ 내지 170℃에서 수행될 수 있다. 또한, 마이크로웨이브 조사는 30 분 내지 90 분, 30 분 내지 80 분, 30분 내지 70 분, 30분 내지 60 분, 30 분 내지 50, 30 분 내지 40 분, 40 분 내지 90 분, 50 분 내지 90 분, 60분 내지 90 분, 70분 내지 90 분, 80 분 내지 90, 50 분 내지 80 분, 60 분 내지 80 분, 70 분 내지 80 분, 또는 50 분 내지 70 분 동안 수행할 수 있다. 마이크로웨이브 조사는 가압 하에서, 예를 들면, 1 기압 내지 100 기압, 2 기압 내지 100기압, 5 기압 내지 100기압, 7 기압 내지 100기압, 10 기압 내지 100기압, 15 기압 내지 100기압, 1 기압 내지 80기압, 2 기압 내지 80기압, 5 기압 내지 80기압, 7 기압 내지 80기압, 10 기압 내지 80 기압, 15 기압 내지 80기압, 1 기압 내지 50기압, 2 기압 내지 50기압, 5 기압 내지 50기압, 7 기압 내지 50기압, 10 기압 내지 50기압, 15 기압 내지 50기압, 1 기압 내지 30기압, 2 기압 내지 30기압, 5 기압 내지 30 기압, 7 기압 내지 30기압, 10 기압 내지 30기압, 또는 15 기압 내지 30기압의 압력 하에서 수행되는 것일 수 있다. 마이크로웨이브 조사는 중성 용액, 예를 들면, 수성 용액 중에서 조사되는 것일 수 있다. 마이크로웨이브의 출력은 특별히 한정되는 것은 아니며, 반응물의 양에 따라 적절히 증감될 수 있고 예를 들어 50 내지 1000W, 예를 들면, 100 내지 700W의 마이크로웨이브가 사용될 수 있다. 상기 마이크로웨이브 조사 조건은 특별히 한정되는 것은 아니며, 마이크로웨이브 조사에 의해 진세노시드 Rb1, Rc, Rb2, Rd, Rg3, Rk1 및 Rg5의 중량에 대하여 Rg3, Rk1 및 Rg5가 90%이상 함유되도록 하는 임의의 반응 조건을 포함할 수 있다. 또한, (Rg5 + Rk1)/(Rg3)의 비율이 2 이상, 3이상, 4이상 또는 5 이상이 되도록 할 수 있는 임의의 반응을 포함할 수 있다. 상기 마이크로웨이브 조사의 생성물은 그대로 사용될 수도 있으나, 건조물 또는 동결건조물로서 함유될 수도 있다. 일 구체 예에서, 마이크로웨이브 조사는 파낙스 속 식물 또는 파낙스 속 식물 추출물을 포함하는 수성 용액에 대하여, 30분 내지 90 분 동안 150 내지 190℃에서 가압 하에서 예를 들면 1 기압 내지 100기압, 2 기압 내지 100기압, 5 기압 내지 100기압, 7 기압 내지 100기압, 10 기압 내지 100기압, 15 기압 내지 100기압, 1 기압 내지 80기압, 2 기압 내지 80기압, 5 기압 내지 80기압, 7 기압 내지 80기압, 10 기압 내지 80기압, 15 기압 내지 80기압, 1 기압 내지 50기압, 2 기압 내지 50기압, 5 기압 내지 50기압, 7 기압 내지 50기압, 10 기압 내지 50기압, 15 기압 내지 50기압, 1 기압 내지 30기압, 2 기압 내지 30기압, 5 기압 내지 30기압, 7 기압 내지 30 기압, 10 기압 내지 30기압, 또는 15 기압 내지 30기압에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 파낙스속 식물은 진세노시드 Rb1, Rb2, Re, Rg1, Rc, 및 Rd 중 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 이러한 파낙스속 식물로는 인삼(Panax ginseng), 화기삼(Panax quinquefolia), 전칠삼(Panax notoginseng), 죽절삼(Panax japonica), 삼엽삼(Panax trifolia), 히말라야삼(Panax pseudoginseng), 베트남삼(Panax vietnamensis), 이들의 배양근, 열처리 또는 효소처리 가공물, 또는 이들의 조합이 이용될 수 있다. 상기 열처리 가공물은 홍삼, 흑삼을 포함한다. 바람직하게는 인삼이 사용될 수 있다.

상기 마이크로웨이브 조사의 반응물에 해당하는 파낙스속 식물 추출물은 진세노시드 Rb1, Rb2, Rc, 및 Rd 중 하나이상을 포함하는 임의의 파낙스속 식물의 추출물일 수 있다. 또한, Re, 및/또는 Rg1을 더 포함하는 것일 수 있다. 파낙스속 식물 추출물은 조추출물일 수도 있으며 추가적인 용매 분획이나 크로마토그래피에 의해 정제된 정제물일 수도 있다. 예를 들어 파낙스속 식물의 물, C1-C4 알콜, 또는 이들의 혼합물의 조추출물; 그 조추출물의 n-헥산, 메틸렌클로리드, 에틸아세테이트, 부탄올 또는 이들의 혼합물의 용매 분획물; 또는 그 용매 분획물의 정제물일 수 있다. 상기 물, C1-C4 알콜, 또는 이들의 혼합물의 조추출물은 예를 들면, 메탄올 또는 에탄올의 조추출물일 수 있다. 추출 시 용매를 식물 분량의 약 5 내지 15배 첨가하여 추출하는 것, 예를 들면, 약 10 배 첨가하여 추출하는 것 일 수 있다. 상기 용매를 가한 후 가열 추출, 초음파 추출, 환류 추출 등의 통상의 방법으로 추출할 수 있으며, 바람직하게는 초음파 추출이 이용될 수 있다. 추출시 용매의 온도는 약 50 내지 200℃, 예를 들면, 120℃일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 약 2 내지 4 시간, 예를 들면 약 3 시간일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 아울러, 추출 회수는 1 내지 5 회, 예를 들면 3 회 반복 추출하는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 방법에 의하여 얻어진 조추출물을 상기 파낙스속 식물 추출물로서 사용할 수도 있으나, 상기 조추출물을 추가적으로 유기용매로 추출한 용매 분획물이 이용될 수도 있다. 상기 유기용매 분획물은 상기 조추출물을 메틸렌클로리드, 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 또는 이들의 혼합물 등으로 추출한 분획물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 유기 용매 분획물을 더욱 정제한 정제물을 상기 파낙스속 식물 추출물로서 사용할 수도 있으며, 예를 들어 칼럼 크로마토그래피에 의해 진세노시드 Rb1, Rb2, Re, Rg1, Rc, 및 Rd 중 하나이상을 더욱 정제할 수 있다. 상기한 마이크로웨이브 조사 가공물은 얻어진 추출물 중 진세노시드 총 중량에 대하여 Rg3, Rk1 및 Rg5가 90% 이상, 95%이상, 또는 98%이상 함유된 것일 수 있다. 상기 진세노시드 총 중량은 Rb1, Rc, Rb2, Rd, Rg3, Rk1 및 Rg5 또는 Re, Rg1, Rb1, Rc, Rb2, Rd, Rg3, Rk1 및 Rg5의 중량일 수 있다. 상기한 마이크로웨이브 조사 가공물은 용매에 의하여 추출된 것으로서, 분획되지 않은 상태의 것일 수 있다.

상기 조성물에 있어서, 상기 피부암은 편평상피세포암, 기저세포암, 또는 흑색종일 수 있다. 상기 피부암은 악성 흑색종일 수 있다. 악성 흑색종은 전이가 상당히 잘 일어나는 종류의 종양으로, 전이가 일어나게 되면 환자의 향후 5년 생존율이 높지 않다. 일반적으로 치료 시에는 절제 등 외과적 수술이 치료의 근본이 되어 경계부 조직까지 모두 절제하여 확인되지 않은 암세포의 확산까지 최대한 제거하는 것이 최우선적인 목표이다. 흑색종은 방사선 치료나 항암 화학 요법 등이 효과가 크지 않고, 현존하는 거의 모든 항암제에 저항성을 보이는 암종이다. 여타 다른 암들의 경우, 이미 혈관이나 림프절에 들어가버려 수술로 제거하기 어려운 암세포들에게 아폽토시스를 유도하여 사멸시키는 약물들이 상당수 개발되어 있지만, 흑색종에서는 아직 이러한 특징의 약물들이 부족한 편이다. 따라서 초기에 진단하여 수술적 제거를 통해 치료하지 못하고, 전이가 되어 신체 내부의 다른 장기로 퍼지게 되면 환자의 생존율을 담보할 수 없는 상황이다. 이에 악성흑색종을 표적으로 제거할 항암제의 필요성이 크게 대두되고 있다고 할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 아폽토시스를 유도하여 피부암 세포의 생존을 감소시키는 기작을 통해 피부암 예방 또는 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약제학적 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적 제형은 경구 투여제제, 주사제, 좌제, 경피 투여제제, 및 경비 투여제제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 임의의 제형으로 제제화되어 투여될 수도 있으나, 바람직하게는 액제, 유제, 현탁제, 엑스제, 또는 시럽제와 같은 액상 제제 및 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 또는 환제와 같은 고형 제제를 포함한 경구 투여용 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 각각의 제형으로 제제화 시, 각각의 제형의 제조에 필요한 약제학적으로 허용 가능한 부형제 또는 첨가제를 부가하여 제조할 수 있다. 대표적으로 경구 투여용 고형 제제로 제제화 시 상기 부형제로서 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 및 방부제 중에서 1 종 이상을 선택하여 사용할 수 있다. 상기 부형제는 약제학적으로 허용 가능한 것은 모두 가능하며, 구체적으로 희석제로는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘 또는 탈크, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필셀룰로오스가 바람직하다. 또한, 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는 크로스포비돈이 바람직하다. 경구 투여용 액상 제제로 제제화 시 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 상기 감미제로는 백당, 과당, 솔비톨, 또는 아스파탐, 안정제로는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사이클로덱스트린, 백납, 또는 잔탄검, 보존제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는 솔빈산칼륨이 바람직하다. 또한, 고형 및 액상 경구제제의 첨가제로는 향료, 비타민류, 및 항산화제 중에서 1 종 이상을 선택하여 사용할 수 있다. 상기 성분 이외에도 공지의 첨가제로서 미각을 돋구기 위하여, 매실향, 레몬향, 파인애플향, 허브향 등의 천연향료, 천연과즙, 클로로필린, 플라보노이드 등의 천연색소, 과당, 벌꿀, 당알코올, 설탕과 같은 감미성분, 또는 구연산, 구연산 나트륨과 같은 산미제를 혼합하여 사용할 수도 있다. 상기 통상적인 약제학적 제형은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 방법에 따라 당업자가 적절한 제조할수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분으로서 성인을 기준으로 1 일 총 투여량이 상기 마이크로웨이브 조사 가공물을 약 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg, 바람직하게는 약 1 mg/kg 내지 1 g/kg이 되도록 임의로 수회 나누어서 투여할 수 있다. 상기 투여량은 투여 경로, 질병의 진행 정도, 성별, 나이, 체중 등에 따라, 또는 전문가의 임상적 판단에 따라 적절히 증감될 수 있다. 상기 본 발명에 따른 약학 조성물은 피부암 예방 또는 치료 및 개선 효과를 위해 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 상기 조성물을 피부암을 가진 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 피부암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 당업자는 투여시 투여경로는 환자의 상태에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 투여는 경구, 비경구, 또는 국부 투여일 수 있다. 상기 투여는 피부암을 포함하는 조직에 국소적으로 투여하는 것일 수 있다. 상기 투여는 피부 조직에 국소적으로 투여하는 것일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 투여량은 전술한 바와 같이 환자의 상태, 투여 경로, 주치의의 판단 등과 같은 다양한 인자들에 따라서 다양해진다. 효과적인 투여량은 체외실험 또는 동물 모델 시험에서 얻어진 용량-반응곡선으로부터 추정할 수 있다. 투여되는 조성물에 존재하는 본 발명의 화합물의 비율 및 농도는 화학적 특성, 투여 경로, 치료적 투여량 등에 따라 결정될 수 있다. 상기 투여량은 개체에게 약 1 μg/kg 내지 약 1 g/kg per day, 또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 500 mg/kg per day의 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 용량은 개체의 나이, 체중, 감수성, 또는 증상에 따라 변경될 수 있다. 상기 개체는 사람일 수 있다.

일 측면에 따른 피부암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 의하면, 개체의 피부암을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.

다른 측면에 따른 개체의 피부암을 예방 또는 치료하는 방법에 따르면, 개체의 개체의 피부암을 예방 또는 치료할 수 있다.

도 1과 같이, 진세노시드 함량을 증가시킨 본 발명의 조성물이 농도 의존적으로 인간 흑색종 세포의 생존율을 억제하는 것을 확인하였다.
도 2에서는 본 발명의 조성물의 IC50 값을 확인하였다.
도 3에서는 본 발명의 조성물을 처리한 인간 흑색종 세포의 세포 형상을 확인하여 아폽토시스가 진행됨을 살펴보았다.
도 4에서는 웨스턴 블롯(western blot)에 의해 본 발명의 조성물이 피부암세포의 표적 단백질인 Bax (Bcl-2-associated X protein)와 PARP (poly ADP ribose polymerase)를 거쳐 카스파제-3(caspase-3)를 활성화 시키는 미토콘드리아 연관의 아폽토시스(apoptosis, 세포자멸사)를 유도하는 것을 확인하였다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 인삼 추출물의 마이크로웨이브 가공 제조법

건조 인삼 (Panax ginseng) 뿌리는 금산 인삼시장 한약재상에서 구입하여 사용하였다. 세절된 분말 건조 인삼 뿌리 300 g에 50% 에탄올 6.0 L를 넣고 80℃에서 3시간 환류 추출하여 50% 에탄올 추출물을 수득하고, 수득한 50% 에탄올 추출물을 감압 하에서 용매를 증발 건조하여 진세노시드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg1, 및 Re를 포함하는 건조 추출물 76g을 수득하였다. 위에서 얻어진 50% 에탄올 추출물을 열처리 가공하였다. 구체적으로는, 인삼 건조 추출물 25 g을 미국 CEM사에서 제조된 마이크로웨이브 조사기 MARS5의 100 mL 용기 중의 50% 에탄올 50 mL를 첨가하고 용기를 밀봉한 상태에서 약 150℃로 1200W에서 60분 동안 마이크로웨이브 조사시킨 후, 동결 건조하여 마이크로웨이브 조사된 가공물을 수득하였다. 마이크로웨이브 조사 시 최대 압력은 8.1 기압이었다. 얻어진 인삼추출물 마이크로웨이브 가공물에서 용매를 증발 건조하여 진세노시드 Rg3, Rk1, 및 Rg5를 포함하는 건조 가공물 23 g을 수득하였다. 제조된 추출물의 Rb1, Rc, Rb2, Rd, Rg3, Rk1 및 Rg5의 중량에 대하여 Rg3, Rk1 및 Rg5 함량은 표 2에 나타낸 바와 같이, 90%이상이었다.

실시예 2: 마이크로웨이브 가공 인삼으로부터 진세노시드 분리법

실시예 1에서 얻어진 마이크로웨이브 조사된 인삼 가공물 3g에 5배 용적의 물을 가하여 충분히 희석시킨 후, 물로 평형화된 비극성 흡착 수지인 DIAION™ HP 20 수지 (Samchun Chemicals)가 충진된 칼럼을 통과시켜 사포닌 성분을 흡착시켰다. DIAION™ HP 20 수지는 폴리스티렌 수지로서, 입자의 표면이 소수성 (hydrophobic)을 띠고 있어서 유기물이 흡착될 때 유기 분자 중의 소수성기가 흡착된다. 폴리스티렌 수지는 상대적으로 큰 표면적 (전형적으로 450-900 m²/g), 높은 다공성 (porosity) (포어 부피, 전형적으로 0.6-1.8 mL/g) 및 큰 평균 포어 크기 (전형적으로 100-800 Å)을 갖고 있어, 거친 입자 크기 (전형적으로 20-60 메쉬, wet)와 조합되어 높은 추출물 흐름 속도 (extract flow rate)와 표적 화합물의 보류 (retention)를 위한 큰 능력 (capacity)을 제공한다. 따라서, 소수성기의 소수성이 큰 유기 화합물, 예를 들면, 진세노시드, 지용성 비타민, 항생물질, 효소 및 페놀성 화합물 등이 잘 흡착될 수 있다. 다음으로, 상기 수지 용적의 약 5배의 증류수를 상기 칼럼을 통하여 흘려주어 얻어진 수용성 성분을 모아 동결 건조하여 HP-20 수지 비흡착 수용성 성분 1.22g을 수득하였다. 수용성 성분이 제거되고 HP-20 수지 흡착 성분, 예를 들면, 소수성 사포닌계 성분과 항산화 성분, 그리고 기타 소수성 성분이 흡착되어 있는 수지에 상기 수지의 5 내지 10 배 부피의 20 내지 50 v/v% 에탄올을 상기 칼럼에 통과시켜 용출시키고, 건조하여 유효 성분을 제외한 소수성 성분 분획 0.93g을 얻었다. 다음으로 상기 수지 용적의 5 내지 10 배 부피의 60 내지 100 v/v% 에탄올을 상기 칼럼에 통과시켜 용출시키고, 건조하여 유효 성분 함유 분획 0.61 g을 얻었다. 제조된 추출물의 Rb1, Rc, Rb2, Rd, Rg3, Rk1 및 Rg5의 중량에 대하여 Rg3, Rk1 및 Rg5 함량은 표 2에 나타낸 바와 같이 90% 이상이었다.

비교예 1: 정관장 홍삼정플러스 ™ 동결 건조물의 제조

실시예1 및 2에서 제조된 마이크로웨이브 조사된 생성물과 시중의 열처리 가공 인삼과의 성분차이를 비교하기 위해 다음과 같이 정관장 홍삼정플러스™ 동결 건조물을 제조하였다. 시중에서 판매 중인 정관장 홍삼정 플러스™ 홍삼농축액을 동결 건조하여 정관장 홍삼 추출물의 동결 건조물을 수득하였다. 제조된 추출물의 Rb1, Rc, Rb2, Rd, Rg3, Rk1 및 Rg5의 중량에 대하여 Rg3, Rk1 및 Rg5 함량은 90% 미만이었다.

실시예 3: 세포 생존율 측정

1. 세포배양

SK-MEL-2 인간 흑색종은 한국세포주은행 (Seoul, Republic of Korea)에서 구입한 것을 사용하였다. SK-MEL-2 인간 흑색종 세포는 10% FBS (fetal bovine serum, HyClone), 200 IU/ml 페니실린, 200 mg/ml 스트렙토미신, 25 mM 소듐 비카르보네이트, 및 25 mM HEPES를 포함하는 RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute medium, HyClone)에서 5% CO₂/95% 공기를 공급하는 가습 배양기에서 37℃ 온도 조건으로 배양하였다. 배양 배지는 2일에 한 번씩 갈아주었다.

2. 세포 생존율 측정 ( MTT 분석)

인간 흑색종 세포 생존율은 MTT 염색 방법에 의해 수행되었다 (J Immunol Methods, 141, 15-22, 1991). 인간 흑색종 세포를 96-웰 플레이트에 2×10⁴ 세포/웰의 밀도로 분주하여 24 시간 안정화시킨 후 실험하였다. 각 웰의 배지 용량은 0.1 mL로 동일하게 만들었다. 실험군에는 각각의 인삼 추출물을 디메틸술폭시드(DMSO)에 녹여 500, 400, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 및 25 ug/mL 농도로 첨가하였고 대조군에는 인삼 추출물을 첨가하지 않고 DMSO만 넣어 24 시간 배양하였다. 이때 최종 DMSO 함량은 0.5%가 되도록 하였다. 24 시간이 지난 후 10㎕의 MTT (5 mg MTT/1 mL in PBS)를 배지에 첨가하고, 2 시간 더 인간 흑색종 세포를 배양하였다. 각 웰에서 배지를 제거한 후, 100 ㎕ DMSO를 넣어 환원된 MTT 결정을 용해하기 위해 피펫팅으로 혼합하였다. 540 nm 필터를 가진 마이크로플레이트 리더 (Powerwave XS, Bio-tek)로 각 웰에 대하여 스캐닝하여 발광되는 형광을 측정함으로써, 상대적인 인간 흑색종 세포 생존율을 계산하였다.

도 1은 여러 타입의 인삼 추출물의 존재하에서 배양된 경우 인간 흑색종 세포의 생존율을 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 도 1에서, WG은 백삼 (white ginseng)을 나타내는 것으로서, 금산 인삼시장 한약재상에서 구입한 건조 인삼 (Panax ginseng) 뿌리 300 g에 50% 에탄올 6.0 L를 넣고 80℃에서 3 시간 환류 추출하여 50% 에탄올 추출물을 수득하고, 수득한 50% 에탄올 추출물을 감압 하에서 용매를 증발 건조하여 제조된 건조 추출물이며, 진세노시드 Rb1, Rc, Rb2, Rd, Rg3, Rk1 및 Rg5의 중량에 대하여 Rg3, Rk1 및 Rg5 함량은 90% 미만이다. RG는 홍삼(red ginseng)을 나타내는 것으로서, 비교예1에서 제조된 정관장 홍삼 추출물의 동결 건조물을 나타낸다. MG는 실시예1에 기재된 바와 같이 제조된 마이크로웨이브 조사된 인삼(microwaved ginseng)을 나타낸다. GF는 실시예2에 기재된 바와 같이 제조된 마이크로웨이브 조사된 인삼의 분획(ginsenoside fraction)을 나타낸다. 도 1에서, 가로축은 인삼 추출물의 농도를 나타내고, 세로축은 대조군 대비 세포 생존율(%)을 나타낸다. 도 1에 나타난 바와 같이 마이크로웨이브 가공 처리된 파낙스속 식물 추출물은 대조군, 백삼 또는 홍삼에 비하여, 예기치 않게 현저하게 효율적으로 농도 의존적으로 피부암 세포의 생존율을 억제하였다. 도 1에 나타낸 결과로부터 얻어진 인간 흑색종 세포(SK-MEL-2)에 대한 각 인삼 추출물의 IC₅₀ 값은 표 3에 기재하였다. 표 2는 각 인삼 추출물의 진세노시드 함량 (ug/ml)을 나타낸다. 표 2 및 3에서 WG,RG, MG, 및 GF는 도 1에 대하여 설명된 바와 동일하다.

구분	Rb1	Rc	Rb2	Rd	Rg3	Rk1	Rg5	(Rg5+Rk1) /Rg3	함량^*
WG	91.66	75.24	43.72	24.02	N.D^**	N.D^**	N.D^**	0	0
RG	8.53	5.13	2.14	1.10	3.29	0.84	1.83	0.81	26.07
MG	6.21	3.68	3.83	2.39	60.86	43.90	91.49	2.22	92.41
GF	N.D^**	N.D^**	N.D^**	N.D^**	164.48	115.90	231.60	2.11	100

* Rb1, Rc, Rb2, Rd, Rg3, Rk1 및 Rg5의 중량에 대하여 Rg3, Rk1 및 Rg5의 함량(%)

** N.D: Not Detected

인삼 추출물	IC₅₀(ug/mL)
WG	500>
RG	500>
MG	217.3
GF	64.8

표 3에서 IC₅₀는 half maximal inhibitory concentration을 나타낸다.

표 3에 나타낸 바와 같이, MG 및 GF의 IC₅₀는 WG 및 RG에 비하여 1/2이상 낮은 농도이어서, 인간 흑색종에 대하여 2배 이상 세포 독성이 높았다. 이는 통상의 기술자에게 예기치 않은 현저한 효과이다.

3. 세포 형상 측정

인간 흑색종 세포를 6-웰 플레이트에 1×10⁵ 세포/웰의 밀도로 분주하여 24시간 안정화시킨 후 실험하였다. 각 웰의 배지 용량은 1 mL로 동일하게 만들었다. 대조 실험군으로, 인삼 추출물을 첨가하지 않은 것을 제외하고는 동일한 배지에서 성장한 인간 흑색종 세포를 사용하였다. 여러 타입의 인삼 추출물을 GF의 경우 60ug/mL, 그 외의 WG, RG, 및 MG는 200ug/mL 농도로 6-웰에 첨가하고 24 시간 배양한 후, 광학현미경 (DM IL microscope (Leica, Wetzlar, 독일))을 이용하여 인간 흑색종 세포의 형상을 관찰하였다.

도 2는 여러 타입의 인삼 추출물의 존재하에서 배양된 경우 인간 흑색종 세포의 모양을 광학현미경을 사용하여 관찰 결과를 나타낸 도면이다. 도 2에서 WG,RG, MG, 및 GF는 도 1에 대하여 설명된 바와 동일하다. 도 2에 나타낸 바와 같이, MG 및 GF를 사용한 경우, 그렇지 않은 경우에 비하여 아폽토틱 버블 형상이 생기는 것이 현저하게 많았다.

실시예 4: 웨스턴 블롯팅

실시예3에서 배양된 인간 흑색종 세포에 대하여 웨스턴 블롯팅 분석을 수행하였다. 배양딘 인간 흑색종 세포는 PBS 용액으로 세정하고, 3,000 rpm에서 3분 동안 원심분리하였다. 세포 펠렛은 RIPA 세포추출물 버퍼에서 4℃, 20분 동안 파쇄(lysis)하였다. 세포 용해물(lysate)은 4℃, 10분 동안 13,000 rpm에서 원심분리하고, 상등 단백질은 10% 소듐 도데실술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 겔에서 분리하고 2시간 동안 200mA에서 니트로셀룰로오스 막(Pall, Port Washington, NY, USA)으로 전이시켰다. 그 막은 트윈-20 함유 트리스 버퍼드 셀라인(TBST, 20 mM 트리스-HCl(pH 7.6))에서 5% 탈지 우유로 블로킹하고, 5% 탈지 우유를 함유하는 TBST에서 일차 항-인간 Bax, Bcl-2, PARP, 카스파즈-3, GAPDH 항체 (Santa Cruz Biotechnology, California, USA)와 배양하였다. 2차 HRP-접합된 항-IgG 항체 (horseradish peroxidase-conjugated anti-IgG antibody)와 배양한 후, 면역 탐지된 단백질을 인핸스드 화학발광 분석 키트 (Amersharm Life Science, Buckinghamshire, England)를 이용하여 가시화하였다.

도 3은 여러 타입의 인삼 추출물의 존재하에서 배양된 경우의 인간 흑색종 세포에 대하여 웨스턴 블롯팅 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 도 3에서 WG,RG, MG, 및 GF는 도 1에 대하여 설명된 바와 동일하며, Normal은 DMSO만 처리한 대조군을 의미한다. 도 3에 기재된 농도는 세포에 최종 처리된 농도를 의미한다. 도 3에 나타낸 바와 같이, MG 및 GF를 사용한 경우, 아폽토시스에 관여하는 Bax, Caspase-3 및 PARP가 발현되는 것을 확인하였다. 따라서, 마이크로웨이브 가공 처리된 파낙스속 식물 추출물에 의해 Bax와 PARP를 거쳐 카스파제-3(caspase-3)를 활성화시키는 미토콘드리아 연관의 아폽토시스를 유도하는 것을 확인하였다.

Claims

파낙스속 식물 또는 그 추출물을 마이크로웨이브 조사하여 얻어진 진세노시드 Rb1, Rc, Rb2, Rd, Rg3, Rk1 및 Rg5의 중량에 대하여 Rg3, Rk1 및 Rg5가 90%이상 함유된 파낙스속 식물 추출물을 유효 성분으로 포함하는 피부암 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 상기 파낙스속 식물은 고려인삼(Panax ginseng), 화기삼(Panax quinquefolia), 전칠삼(Panax notoginseng), 죽절삼(Panax japonica), 삼엽삼(Panax trifolia), 히말라야삼(Panax pseudoginseng),베트남삼(Panax vietnamensis), 이들의 배양근, 이들의 열처리 또는 효소처리 가공물, 또는 이들의 조합이고, 상기 피부암은 흑색종인 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 파낙스속 식물 추출물은 파낙스속 식물을 마이크로웨이브 조사한 후 용매를 사용하여 추출된 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 파낙스속 식물 추출물은 진세노시드 (Rg5 + Rk1)/(Rg3)의 비율이 2 이상인 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 마이크로웨이브 조사는 가압하에서 150℃ 내지 190℃에서 30분 내지 90 분 동안 수행하는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 마이크로웨이브 조사는 2 기압 내지 100 기압하에서 수행하는 것인 조성물.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 파낙스속 식물 추출물은 파낙스속 식물의 물, C1-C4 알콜, 또는 이들의 혼합물의 조추출물; 그 조추출물의 n-헥산, 메틸렌클로리드, 에틸아세테이트, 부탄올 또는 이들의 혼합물의 용매 분획물; 또는 그 용매 분획물의 정제물인 것인 조성물.
삭제
청구항 1 내지 5 및 7 중 어느 하나의 조성물을 피부암을 가진 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 피부암을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 상기 개체는 사람이 아닌 동물인 것인 방법.